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Biology

Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos

Published: July 21, 2018 doi: 10.3791/58049

Summary

Aqui, descrevemos um novo método que permite o cultivo de longo prazo anaeróbico de linhagens celulares estabelecidas. O tempo máximo de sobrevivência que foi testado é 17 dias. Este método é adequado para o teste de agentes citotóxicos e explorando a fisiologia da anoxically replicação de células.

Abstract

Mais superfícies mucosas, juntamente com os pontos médios em tumores e nichos de células-tronco são áreas geográficas do corpo que são anóxica. Estudos anteriores mostram que a incubação em normoxic (5% CO2 no ar) ou hipóxia condições (baixos níveis de oxigênio) seguiram por um resultados de incubação anóxica (ausência de oxigênio livre) na viabilidade limitada (2 – 3 dias). Uma nova metodologia foi desenvolvida que permite a um cultivo celular anóxica (pelo menos 17 dias, o tempo máximo testado). O aspecto mais importante desta metodologia é garantir que não há oxigênio é introduzido no sistema. Isso é obtido, a desgaseificação de mídia e por tubos de irrigação, pratos, balões e pipetas com uma mistura de gás anaeróbio (H2, CO2, N2) seguido por permitir que os materiais para equilibrar ao ambiente anóxico (não-oxigênio) antes do uso. Cuidados adicionais devem ser exercido quando adquirir fotomicrografias para garantir que as micrografias obtidas não contêm artefatos. Na ausência de oxigênio, a morfologia celular é significativamente alterada. Dois morfotipos distintos são anotados para todas as células cultivadas anaerobicamente. A capacidade de crescer e manter pilhas mamíferas na ausência de oxigênio pode ser aplicada à análise da fisiologia celular, interações polymicrobial e a caracterização das vias biossintéticas para desenvolvimento de drogas câncer romance.

Introduction

Existem células de tumores sólidos, nichos de células-tronco e aqueles que revestem as superfícies mucosas em ambientes que experimentam níveis reduzidos de oxigênio, incluindo anóxia1,2,3,4. Em Estados fisiológicos normais, oxigenação varia além da hipóxia, anóxia (completa ausência de oxigênio)5,6. A realização que oxigênio atmosférico afeta negativamente a replicação de células de mamíferos e o crescimento de células em vitro pode ser otimizado sob condições de oxigênio empobrecido foi relatada na década de 1970. Richter et al . 7 mostrou que 1-3% dos níveis de oxigênio (hipóxia) reforçada chapeamento eficiência em comparação com o oxigênio atmosférico (20%). A expectativa de vida de célula diploide humana também é estendida na cultura hipóxica condições8.

In vivo, hipóxicos condições ocorrem quando oxigênio lojas estão esgotados (por exemplo, durante o exercício intenso), no qual a produção de ATP é alternada no músculo esquelético da respiração aeróbia de fermentação (respiração anaeróbia) com o produto final de ácido láctico9. Patologicamente, em tumores cancerosos, o interior do tumor, massa é hipóxica para anóxica devido à pobre vascularização10. O efeito da perfusão limitada no interior do tumor independente é validado pelos interiores de tumor colonizadas por anaeróbios obrigatórios1. Mecanicamente, a sobrevivência de células de tumor em hipóxia é pensada para ser unicamente dependente da expressão do gene hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF1-alfa), que é a resposta inicial espontânea de hipóxia4,11 , 12. HIF1-alfa é induzida em condições de hipóxicos por proteínas de choque do calor que ligam o HIF1-alfa promotor e upregulate de transcrição do gene12. Estas proteínas de choque do calor são acreditadas para ajudar na indução dos vários fenótipos visto no microambiente hipóxico do tumor. Estes fenótipos apresentam um aumento da expressão dos transportadores de glicose a membrana celular e a taxa de glicólise (o efeito Warburg)13. O resultado é um interruptor da fosforilação oxidativa mitocondrial para fermentação de lactato.

Anóxica sobrevivência também pode utilizar alternativas para glicose para apoiar o fenômeno de sobrevivência14,15. O melhor exemplo de mamíferos estudado é a toupeira, que podem sobreviver por quase 20 min sem oxigênio através de uma fermentação glicolítico orientado a frutose via14. Uma alternativa adaptação ocorre em certos peixes (por exemplo, carpa [SP.Carassius ], que pode sobreviver por significativamente mais períodos de tempo usando a glicólise com etanol como subproduto o terminal)15. Em ambos os casos, a fermentação impulsiona o metabolismo, permitindo a sobrevivência na ausência de oxigênio. A hipótese atual para sobrevivência anóxica é que tanto tempo como HIF1-alfa é ativado durante a hipóxia, respiração mitocondrial, sem a necessidade de oxigênio, ocorre sob condições anaeróbicas16. Além disso, postula-se que o uso de uma via fermentativa para sobrevivência hipóxica/anóxica aumenta sobrevivência do tumor, desde que as células evitar stress oxidativo que poderia para ser prejudicial para a célula de sobrevivência17. Este postulado é suportado por um estudo recente que mostra que em cardiomyocytes, hipóxia reduz o estresse oxidativo, colocado sobre o tumor de célula17.

Até à data, a natureza essencial de uma via fermentativa para a sobrevivência da pilha mamíferas anóxica tem sido entranhada na literatura, devido, em grande parte, a uma incapacidade de células de mamíferos de cultura na ausência completa de oxigênio por mais de 3 dias. No entanto, uma alternativa à glicólise para a sobrevivência anaeróbica ocorre em bactérias. Em certas bactérias, nitrogênio ou sulfato (entre outros compostos) pode servir como aceitadores de electrões terminal para o sistema do citocromo oxidase na ausência de oxigênio18. Embora a evolução bacteriana e eucariótica ocorreu em paralelo desde divergindo o último ancestral comum universal, estima-se que as mitocôndrias foram fornecendo energia para as células para 1,542 milhões de anos antes da oxigenação dos oceanos19 . Desde que os pesquisadores têm mostrado que as mitocôndrias isoladas podem produzir ATP na ausência de oxigênio, com nitrito como o aceitador terminal do elétron, é razoável supor que as células poderiam funcionar por períodos de tempo mais de 3 dias na ausência de oxigênio 20 , 21 , 22 , 23. a metodologia descrita neste estudo tem uma utilidade para o crescimento da pilha mamífera anaeróbico de numerosas linhas de célula.

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Protocol

1. preparar a mídia para cultura anaeróbia de várias linhas de células de mamíferos

  1. Fazer o meio de PS-74656 completo para uma cultura de célula anóxica25.
    1. Faça a solução estoque de nitrito estéril (5m; x 100) dissolvendo 17,25 g de nitrito em 50 mL de água destilada deionizada e, em seguida, filtrar para esterilizá-lo.
    2. Adicionar 0,5 mL da solução estoque de nitrito por 50 mL de glicose baixa DMEM (1 g/L de glicose) com 110 mg/L de L-glutamina, 584 mg/L de piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino (FBS; inactivadas pelo calor).
      Nota: O uso de concentrações de FBS maiores do que 10% são tóxicos. Digno de nota, uma linhagem de células de câncer testada tinha uma baixa tolerância à mídia com nitrito (MDA-MB-231, linha de células de câncer de mama) e, assim, foi cultivada na ausência de nitrito. Além disso, embora o PS-74656 médio suportado o crescimento de todas as linhas de células que foram testadas (n = 9), certas linhas de células (por exemplo, células Vero) exibiram concentrações mais elevadas de célula e uma maior viabilidade no PS-74656 com glicose alta (4,5 g/L) DMEM 25.
    3. Coloca 20 mL do meio em um tubo de centrifuga conico estéril 50 mL. Não aperte a tampa; deve ser solto.
    4. De gás do meio, colocando o tubo em uma redoma de vidro a vácuo em um ângulo de 45 ° aproximadamente, para maximizar a área de superfície média.
    5. Aplica um vácuo usando uma bomba de vácuo, ou seu equivalente, à temperatura ambiente. Manter o vácuo até que as bolhas já não são observadas (24-48 h).
    6. Retire o tubo do frasco e fechar imediatamente a tampa, vedação do tubo para minimizar a introdução de ar no meio de.
    7. Coloca o tubo na câmara anaeróbica comercial.
    8. Solte a tampa do tubo e permitir que a atmosfera no tubo para equilibrar com o da mistura de gás anaeróbio na câmara pelo menos 24 h.
      Nota: O meio deve permanecer na câmara até é usado. Para acelerar o processo de descarga, tubo de pelo menos 3 x com a mistura de gás anóxica usando uma pipeta de transferência estéril cheia de gás anóxico, que consiste de H2, CO2e N2.
    9. Desgaseifica todos os tubos (10-15 min) colocados na câmara anaeróbica, como descrito acima, antes da selagem do tubo e colocar na câmara. Antes da utilização, nivelá-lo com a mistura de gás anaeróbio usando pipetas de transferência de 1,5-2 mL ou pontas de pipetas que tem sido lavadas com anóxica gás pelo menos 3x.
    10. Enquanto na câmara anaeróbica, remover 100 µ l do meio de um tubo estéril de microcentrífuga desgaseificado e testá-lo para o oxigênio dissolvido usando uma sonda de oxigênio dentro da câmara.
      Nota: O eletrodo de oxigênio é calibrado por prévia de protocolo do fabricante para usar. Leituras da mídia mistura gás anaeróbio corretamente desgaseificado e equilibrada são 0.
      Atenção: Se as leituras estiverem acima de 0,3 ppm de oxigênio, continue a incubar os meios de comunicação na câmara anaeróbica, já que mais uma vez para equilibrar o meio é necessária.

2. anóxico cultivo de várias linhas de células de mamíferos

  1. Designado dia -1
    1. Desenvolvem-se células (37 ° C, 5% CO2) num balão T150 a confluência de 90% para o controle de cultura anóxica e normoxic fornecer um número suficiente de células para três placas de 24 poços (80% confluência).
      Nota: Para este estudo, foram utilizadas células HeLa 229 e Vero. Este protocolo também foi testado e provou ser bem sucedido para o crescimento e a manutenção de sete outras células linhas25.
    2. Remover o meio do balão por aspiração e lavá-lo com 10 mL de HBSS.
    3. Substitua o meio com 5 mL de tripsina. Agite o frasco até que as células visualmente desanexar do plástico. Aspire a maior parte da tripsina, em seguida, toque o balão para desalojar as células aderentes. Adicionar 10 a 15 mL de glicose alta DMEM (4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de L-glutamina, 10% FBS, 50 µ g/mL de gentamicina) para inactivar a tripsina.
    4. Triture as células usando uma pipeta de 25 mL, até que todos os grupos de célula são rompidos.
    5. Contar as células e determinar a viabilidade usando o padrão hemocytometer e o método de exclusão do corante azul de Tripan ou o equivalente automatizado.
    6. Suspenda as células a glicose alta DMEM como mencionado acima, a densidade celular de 2,24 x 105 células/mL.
    7. Adicione 1 mL da suspensão celular aos poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (2,24 x 105 células/poço; 80% confluência). Placa de semente 1 para a cultura anóxica e outro para uma cultura de normoxic de controle.
    8. Incube as células a 37 ° C em condições de normoxic (5% CO2) por 24 h.
      Nota: As células podem ser chapeadas em várias placas bem dimensionadas. No entanto, semear as células de crescimento anóxica em balões corre o risco de introdução de oxigênio no sistema, a menos que cuidado para limpar completamente o gás atmosférico.
  2. Designado dia 0
    1. Após 24h de incubação a normoxic, colocar as placas para o crescimento anóxica na câmara anaeróbia (uma câmara anaeróbica comercial; A Figura 1).
    2. Imediatamente altere o meio para sem antibióticos de intoxicar médio PS-74656 que tem sido aclimatado para 24h à câmara anaeróbica. Colocar a placa em um recipiente com uma toalha úmida e vagamente fechá-lo para manter a umidade.
      Nota: As placas de crescimento normoxic são manipuladas com a exceção de que todos os tratamentos são feitos sob condições atmosféricas de maneira idêntica.
  3. Designado dia 1
    1. 1 dia de incubação anaeróbica inicia após 24h de incubação na câmara anaeróbica comercial que contém a mistura de gás anaeróbio padrão de 10% H2, 10% CO2e 80% N2.
    2. Incube as celulas por vários períodos de tempo.
    3. Monitore o meio anaeróbio para a mudança de cor ao longo do tempo.
      Nota: Uma mudança de cor do vermelho-alaranjado para magenta sinaliza o tempo para mudar o meio. Isto pode demorar até 2 semanas para ocorrer. Uma mudança de cor no meio de vermelho-laranja para amarelo indica a presença de uma contaminação bacteriana.
    4. Quando o meio muda de vermelho para magenta, remova as células runagate por aspiração.
    5. Lugar aspirada mídia gastava com as células runagate desgaseificado e anaeróbia gás incubado tubos de microcentrífuga, feche os tubos ao mesmo tempo certificando-se que o selo é seguro e em seguida centrifugá-los (326 x g; à temperatura ambiente durante 10 minutos). Substitua imediatamente os meios de comunicação aspirados no poço com 1 mL de meio de PS-74656 desgaseificado novo.
    6. Coloca o tubo de microcentrífuga com células peletizadas na câmara anaeróbia antes de abri-lo. Aspirar o gasto médio e substituí-lo por meio de PS-74656 desgaseificado fresco para um volume total de 1 ml no tubo de microcentrífuga.
    7. Retorno as células do tubo para um poço na placa de cultura de tecidos de 24-bem.

3. avaliação da diferenciação fenotípica celular pela microscopia de pilhas cultivadas anaerobicamente

  1. Enquanto na câmara anaeróbica, colocar a placa numa caixa resealable liberada com a mistura de gás anaeróbio e fechar a caixa.
    Nota: A caixa deve conter uma toalha de papel úmida para fornecer a umidade e impedir que a placa de secagem. Para a microscopia, sacos do sanduíche o melhor trabalham desde que eles são finos.
    1. Para observar as células sob o microscópio, completamente selar o saco e removê-lo da câmara.
    2. Cuidadosamente esticar o saco de plástico sobre a placa, examinar células usando um microscópio de contraste de fase invertido com o acessório de câmera e levar fotomicrografias em várias ampliações.
    3. Devolve a chapa no saco selado para a câmara e continuar a incubação, conforme descrito na etapa 2.3.3.
    4. Para analisar separadamente as células runagate que estão em suspensão, siga as etapas descritas na etapa 2.3.5.
      Nota: Estas células podem ser usadas para o teste aeróbio ou podem ser devolvidas à câmara anaeróbia para o teste desta população específica.

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Representative Results

A força deste protocolo encontra-se em seu apoio a longevidade e o crescimento de várias linhagens celulares e o reconhecimento de que há uma alteração profunda e divergência na morfologia celular25. O elemento mais crítico deste estudo é a transferência e a manutenção das células sob anaerobiose estrita. Isto requer uma câmara anaeróbica organizada para maximizar o protocolo (Figura 1) e a garantia de que as células removidas para microscopia ou outros testes são mantidos em um ambiente fechado. Até à data, a gama de sobrevivência anóxica foi 15 – 17 dias para câncer imortal linhas celulares e acima de 17 dias para transformada linhas celulares (nove linhas celulares selecionadas para crescimento anóxico). Os níveis de células viáveis, uma vez que estas células foram transferidas para condições anóxica, recusou pelo menos 10%, até um máximo de 90%, antes de eles estabilizaram. Todas as linhas de célula reverteram para os fenótipos duas (amarrados e runagate) com a proporção de células na suspensão aumentando ao longo do tempo. Mesmo após uma incubação prolongada de várias semanas, restava algumas células amarradas, mas a maioria das células estava na morfologia arredondada runagate (Figura 2). Conforme relatado, estas células runagate são viáveis e começou por meio de seu ciclo celular. Note-se que as variáveis que precisam ser ajustados incluem os níveis de glicose e a concentração de nitrito. Dito isto, desde as formulações de mais de 60 diferentes meios de comunicação que foram testadas na sua capacidade de suportar tanto normoxic e incubação anóxica, o meio de PS-74656 foi capaz de sustentar a sobrevivência e replicação de quase todas as linhas celulares testados.

Uma observação essencial foi a diferenciação das células anóxica, independentemente da célula testado, em dois fenótipos distintos, amarrados e runagate (Figura 2). Análogas às células normoxic monocamada, as células amarradas foram anexadas ao plástico de cultura de tecidos. No entanto, o acessório foi mais fraco, mais fácil de trypsinize ou desalojar por raspagem, que o acessório que ocorreram nas condições normoxic. Além disso, a morfologia celular foi menor com mais extensões de eixo (dendríticas)26. O segundo Morfotipo celular observado foram as células em suspensão (ou seja, as células runagate). Estas células espontaneamente convertido em suspensões de unicelulares flutuantes na presença de plástico tratados com cultura de tecidos, que foram arredondadas com um tamanho de célula menor e menos citoplasma. Eles diferem das células de cultura clássica suspensão, que normalmente exigem uma adaptação enzimática, crescem em agregados, exigem recipientes de cultura de tecidos não-tratados e são maiores do que suas contrapartes de normoxic27. Ao longo do tempo, as populações de célula anóxica podem ser observadas de mudar de uma monocamada predominantemente amarrada para que as células runagate em suspensão. Estas células em suspensão foram viáveis e replicação; assim, cuidado tinha que ser exercido deve ser removido o sobrenadante. Também digno de nota é que o meio não exigiam mudança ao longo do período de incubação anaeróbica toda. O indicador de pH médio sob a incubação anóxica, em contraste com seu controle normoxic, também foi inalterado (isto é, permanecido vermelho). Se o investigador deseja colher as células runagate, ou mudar o meio, as células podem ser obtidas usando anaeróbicos gás liberado microtubos de centrífuga que estão fechados firmemente dentro da câmara anaeróbica. Para a célula de lavagem das células amarradas, o procedimento também deve ser realizado na câmara para eliminar qualquer exposição de oxigênio.

A viabilidade celular final para um cultivo de longa duração foi, em grande medida, dependente da célula que está sendo usado e a confluência para que o balão ou os poços foram inicialmente semeado (figuras 3 e 4). Dito isto, um bom ponto de partida é de 80%, que teve a maior chance de crescimento ideal. Além disso, uma perda de linha dependente de célula de 10% a 60% de viabilidade pode ocorrer ao inicial 2 – 4 dias. No entanto, durante a realização deste experimento, as células restantes reciclados através do ciclo celular e replicados28. O efeito de confluência semeadura sobre a longevidade do cultivo celular pode ser visto nas figuras 3 e 4. Células HeLa 229 tanto Vero foram semeadas em placas de 24 poços para 40%, 60% e 80% de confluência inicial (confluência 100% = 2,8 x 105 células/poço) e então incubadas na ausência de oxigênio durante 17 dias. O crescimento de anóxica células HeLa 229 foi otimizado em uma confluência de semeadura inicial de 80%. Em contraste, as células Vero ideais de semeadura confluência foi 60%. Isto demonstra a necessidade de otimizar inicialmente a densidade de semeadura dependente da linhagem celular usada.

Figure 1
Figura 1 : Modelo de câmara anaeróbica set-up para cultura de células de mamíferos. O material mínimo necessário inclui placas de cultura de tecidos, pipetas de transferência estéril, sacos de risco biológico, intoxicado de mídia, um tubo para o descarte de mídia ou de outros líquidos e sacos resealable para a transferência das placas para o microscópio, mantendo condições anaeróbicas.

Figure 2
Figura 2: Diferenciação morfológica das células de HeLa anóxica. (A), este painel mostra o microscópio de contraste de fase dos controles de célula HeLa normoxic 4 dias após a inoculação, com uma ampliação de 20 X. (B) este painel mostra as células HeLa anóxica 17 dias após inoculação (com o inalterado do dia 1 PS-74656 meio, confluência semeado de 80% e uma ampliação X 20). (C), este painel mostra artefatos de microscopia de gotículas de água no interior de um saco plástico selado, contendo uma placa de 24 poços anóxica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Relação de anóxica para normoxic HeLa 229 viável células post-17 dias de incubação. Este painel mostra o efeito da densidade semeadura sobre a viabilidade de célula HeLa 229 a PS-74656 médio em comparação com o controle normoxic. Os resultados são mostrados como a média ± SEM.

Figure 4
Figura 4: Relação de anóxica para normoxic Vero viável células 17 dias de pós-incubação no. Este painel mostra o efeito da densidade semeadura sobre a viabilidade de células Vero no PS-74656 médio em comparação com o controle normoxic. Os resultados são mostrados como a média ± SEM.

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Discussion

Este método representa pela primeira vez células mamíferas que foram cultivadas por longos períodos de tempo na ausência de oxigênio. Baseado nas observações atuais, o crescimento anóxica capacidade através de um caminho não-fermentativa parecem ser universal entre linhas de células de mamíferos28, onde o crescimento anaeróbico resultou em divergência de fenótipo. Isto foi observado para todas as linhas celulares testadas. Com o cultivo de anaeróbio, aumentar as proporções das células tornou-se arredondado, desenvolveu uma suspensão como população e foram capaz de replicar. O tipo de célula secundário permanecido associado ao substrato; no entanto, a morfologia celular revertido a uma forma de fuso (dendríticas). Esses achados apontam um erro comum em análises e observações no que se refere a cultivo de cultura de tecidos anóxica. É geralmente aceite que, quando células de mamíferos cultivadas sob condições normoxic (5% CO2) reunir e separar, eles estão morrendo. O contrário parece ser correto para células cultivadas na ausência de oxigênio, nesse caso, as células que têm arredondado e destacado, são simplesmente uma subpopulação de células morfologicamente divergentes.

A otimização das condições de crescimento anóxica é dependente da linhagem de células. PS-74656 médio global suportado o crescimento de célula de todas as linhas normoxic e condições de crescimento anóxica, com excepção do MDA-MB-231, uma linhagem de células de câncer de mama que preferiu o crescimento na ausência de nitrito. Uma observação encorajador é que mesmo com uma mortandade de 98% de células por poço, o restante Replica, resultando em uma população altamente adaptada. A ação crítica é manter culturas mesmo quando apenas algumas células são observadas diretamente por microscopia. Assim, deve-se ter cuidado para garantir que as células desanexadas estão mortas, por exclusão de corante azul de Tripan ou por um método de deteção de viabilidade celular alternativo. Note-se que com uma grande diminuição no número de células, devem ser semeados poços suficientes para ter números de celular total adequada para experiências posteriores. A perda esperada de células viáveis é linha celular e semeadura confluência dependente; assim, números de célula ideal, ao longo do tempo, devem ser determinados experimentalmente e não podem ser extrapolados de descobertas com outras linhas de célula. Dito isto, um bom ponto de partida é uma confluência de 80%, o que tem a maior chance de crescimento ideal. Deve-se notar que qualquer exposição ao oxigênio durante as etapas anaeróbias no procedimento, não importa o quão breve, irá comprometer os resultados devido a celular espontânea relatada HIF-1-alfa resposta11,12.

Para este procedimento, o passo mais crítico é a desgaseificação do meio, tubos e todos os outros aparelhos e materiais utilizados. A introdução do mesmo muito baixos níveis de oxigênio poderia parar a transição do metabolismo da fermentação para a respiração anaeróbica. Alternativamente, ele poderia prolongar o metabolismo fermentativa para que quaisquer experiências resultam na medição de hipóxia, anóxia não. A utilização deste procedimento romance para medir citotoxicidade e atividade quimioterápico poderia ajudar a explicar o fracasso de drogas no tratamento de tumores sólidos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer o centro-oeste Universidade escritório de pesquisa e programas patrocinados pelo seu apoio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whitney A35 anaerobic chamber Don Whitley Scientific  Microbiology International The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator Fisher Scientific 3531
Tissue Culture Hood Labconco DO55735
pipet aid Drummond 4-000-100
sterile transfer pipets Santa Cruz sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes DOT 451-PG
vaccum jar Nalgene 111410862889 BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L) CellGro 10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L) CellGro 10-014-CV
FBS VWR 1500-500
HBSS VWR 20-021-CV
trypsin VWR 25-052-CI
gentamicin Gibco 15750-060
sterile pipets CellTreat 229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150) Santa Cruz sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes DOT 667124
glad ziplock sandwich bags Ziploc Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) Nikon Eclipse TS100
trypan blue Invitrogen T10282
hemocytometer Invitrogen C10283
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000
Rainin microtiter pipets Mettler Toledo Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips Santa Cruz Biotechnology sc-213233 & sc-201717 
test tube rack (50cc tubes) The Lab Depot HS29050A
sodium nitrite Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids Rosti Mepal Rubber maid
paper towels In House
cell scraper CellTreat 229310
PBS In house prepared
70% Ethanol Fisher Scientific 64-17-5
microcentrifuge tubes sterile Santa Cruz sc-200273
biohazard bags with holder (desktop) Heathrow Scientific HS10320
Nitrile Gloves VWR 89428
oxygen electrode eDAQ EPO354
pH meter Jenway 3510
pH paper/ pHydrion Sigma Aldich Z111813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia questão 137 anóxia anaerobiose variação fenotípica linhas de células de mamíferos as células HeLa células Vero cultura a longo prazo
Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M.,More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines. J. Vis. Exp. (137), e58049, doi:10.3791/58049 (2018).

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