Summary
Här beskriver vi en ny metod som möjliggör långsiktiga anaerob odling av etablerade cellinjer. Den maximala överlevnadstid som testades är 17 dagar. Denna metod är lämplig för testning av cytotoxiska medel och utforska fysiologi anoxically replikera celler.
Abstract
Mest slemhinnorna tillsammans med mittpunkterna i tumörer och stamceller nischer är geografiska områden av kroppen som är syrefria. Tidigare studier visar att inkubering i normoxic (5% CO2 i luften) eller hypoxisk (låg syrehalt) villkor följt av en anoxiska inkubation (frånvaro av fritt syre) resultat i begränsad viabilitet (2 – 3 dagar). En ny metodik utvecklades som möjliggör en anoxiska cell odling (för minst 17 dagar, den maximala tid testat). Den mest kritiska aspekten av denna metod är att säkerställa att inget syre tillförs systemet. Detta erhålls genom avgasning av media, och genom spolning rör, rätter, kolvar och pipetter med en anaerob gasblandningen (H2, CO2, N2) följt av tillåter material temperera anoxiska (icke-syre) miljön före användning. Ytterligare försiktighet måste iakttas när förvärva mikrofotografier för att säkerställa att de micrographs som erhålls inte innehåller artefakter. I frånvaro av syre, är cellmorfologi signifikant. Två olika morphotypes är kända för alla anaerobt odlade celler. Förmågan att växa och bibehålla däggdjursceller i frånvaro av syre kan tillämpas på analysen av cellfysiologi, polymikrobiella interaktioner och karakterisering av biosyntetiska vägar för romanen cancer läkemedelsutveckling.
Introduction
Det finns celler från solida tumörer, stamceller nischer och de foder slemhinnorna i miljöer som upplever minskad syrehalt, inklusive anoxia1,2,3,4. I normala fysiologiska staterna varierar syresättning utöver hypoxi anoxia (komplett frånvaro av syre)5,6. Insikten att luftens syre inverkar negativt på däggdjursceller replikering och att in vitro- celltillväxt kan optimeras enligt utarmat Syreförhållandena rapporterades under 1970. Richter et al. 7 visade att 1 – 3% av syrebrist (hypoxi) förbättrad plätering effektivitet jämfört med luftens syre (20%). Den humana diploida cell livslängden förlängs också i hypoxisk kultur villkor8.
In vivo, hypoxisk tillstånd uppstå när syre butiker är utarmat (t.ex., under intensiv träning), vari ATP produktionen slås i skelettmuskulaturen från aerob respiration att jäsning (anaerob respiration) med den slutprodukten av mjölksyra9. Patologiskt, i cancertumörer, interiören av tumören massan är hypoxisk att syrefria på grund av dålig vaskularisering10. Effekten av begränsad perfusionen på tumör interiörer valideras självständigt av tumör interiörer koloniserats av obligata anaerober1. Slentrianmässigt, tumör cellöverlevnad i hypoxi tros vara uteslutande är avhängig av uttrycket av genen hypoxi-inducerbara faktor 1-alpha (HIF1-alpha), vilket är det första spontana svaret hypoxi4,11 , 12. HIF1-alpha framkallas hypoxisk villkor av värma chockar proteiner som binder den HIF1-alfa promotorn och upregulate den gen transkription12. Dessa värma chockar proteiner tros stöd i induktion av de olika fenotyperna sett i den tumör hypoxisk mikromiljö. Dessa fenotyper uppvisar ett ökat uttryck av cellens membran glukostransportörer och graden av glykolys (Warburg effekten)13. Resultatet är en switch från mitokondriell oxidativ fosforylering till laktat jäsning.
Syrefria överlevnad kan också utnyttja alternativ till glukos att stödja överlevnad fenomen14,15. De bäst studerade däggdjur exemplet är mullvad råtta, som kan överleva i nästan 20 min utan syre genom en fruktos-driven glycolytic jäsning väg14. En alternativ anpassning sker i vissa fisk (t.ex., karp [Carassius sp.], som kan överleva för betydligt längre tidsperioder med glykolys med etanol som terminal biprodukt)15. I båda fallen driver jäsning den metabolism som möjliggör överlevnad i frånvaro av syre. Den aktuella hypotesen för anoxiska överlevnad är att så länge HIF1-alpha är aktiverad under hypoxi, mitokondriell respiration, utan behov av syre, sker under anaeroba förhållanden16. Dessutom är det förutsatte att användningen av en fermentativa väg för hypoxisk/anoxiska överlevnad ökar tumör överlevnad eftersom cellerna undvika oxidativ stress som kan visa sig vara skadligt för den cell överlevnad17. Detta postulat stöds av en studie som visar att hypoxi i hjärtmuskelceller, minskar oxidativ stress placeras på tumör cell17.
Hittills har har oumbärliga ett fermentativa utbildningsavsnitt för anoxiska däggdjursceller överlevnad varit ingrodd i litteraturen, vederbörlig, till stor del, till en oförmåga att kultur däggdjursceller i fullständig avsaknad av syre i mer än 3 dagar. Ett alternativ till glykolys för anaerob överlevnad sker dock i bakterier. I vissa bakterier, kan kväve eller sulfat (bland andra föreningar) fungera som terminal Elektronacceptorer för cytokrom oxidas systemet i frånvaro av syre18. Även om den bakteriella och eukaryota utvecklingen skett parallellt sedan avvika från den senaste universal gemensamma förfadern, uppskattas det att mitokondrierna var att ge energi till cellerna i 1.542 miljoner år innan syresättning av haven19 . Eftersom forskare har visat att isolerade mitokondrierna kan producera ATP i frånvaro av syre, nitrit som den terminal Elektronacceptor, är det rimligt att anta att celler skulle kunna fungera under perioder längre än 3 dagar i frånvaro av syre 20 , 21 , 22 , 23. den metod som beskrivs i denna studie har ett verktyg för anaerob däggdjursceller tillväxt av flera cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered för anaerob kultur av olika däggdjur cellinjer
-
Göra det komplett PS-74656 mediet för en anoxiska cell kultur25.
- Se sterila nitrit stamlösning (5 M; 100 x) genom upplösning 17.25 g av nitrit i 50 mL destillerat avjoniserat vatten och sedan filtrera för att sterilisera den.
- Tillsätt 0,5 mL nitrit stamlösning per 50 mL låg glukos DMEM (1 g/L av glukos) med 110 mg/L av L-glutamin, 584 mg/L av natrium pyruvat och 10% fetalt bovint serum (FBS; Värmeinaktiverade).
Obs: Användning av FBS koncentrationer större än 10% är giftiga. Notera, en cancer cellinje testade hade en låg tolerans för media nitrit (MDA-MB-231, breast cancer cell linje) och, således, odlades i avsaknad av nitrit. Dessutom, även om PS-74656 medium stöds tillväxten av alla cellinjer som testades (n = 9), vissa cellinjer (t.ex., veroceller) uppvisade högre cell koncentrationer och en högre lönsamhet i PS-74656 med hög glukos (4,5 g/L) DMEM 25. - Häll 20 mL av medium i ett sterilt 50 mL koniskt centrifugrör. Dra inte åt den gemensamma jordbrukspolitiken. Det bör vara löst.
- Avinstallation gas mediet genom att placera röret i en vakuum glaskupa på ett ungefär 45 ° vinkel, att maximera medium yta.
- Applicera ett vakuum med hjälp av en vakuumpump, eller motsvarande, i rumstemperatur. Upprätthålla vakuum tills bubblor observeras längre (24 – 48 h).
- Ta bort röret från burken och omedelbart stänga locket, tätning röret för att minimera införsel av luft till mediet.
- Placera röret i kommersiella anaerob kammaren.
- Lossa röret locket och låt atmosfären i röret temperera med det anaeroba gasblandningen i kammaren under minst 24 h.
Obs: Medium bör förbli i kammaren tills den används. För att påskynda processen, spola röret minst 3 x med syrefria gasblandningen med sterila pipett fylld med syrefria gas, som består av H2, CO2och N2. - Degas alla rör (10 – 15 min) placeras i anaerob kammaren som beskrivs ovan innan tätning röret och placera i kammaren. Före användning, spola det med anaerob gasblandningen med 1,5 – 2 mL överföring pipetter eller pipettspetsar som har rensats med syrefria gas minst 3 x.
- Medan i anaerob kammaren, ta bort 100 µL av medellång till en steril avgasade mikro-centrifugrör och testa den för den upplöst syrgas med en syre-sond i kammaren.
Obs: Syre elektroden är kalibrerad per tillverkarens protokollet före användning. Avläsningar av korrekt avgasade och skakad anaerob gas blandning media är 0.
FÖRSIKTIGHET: Om avläsningarna är över 0,3 ppm syre, fortsätta att Inkubera media i anaerob kammaren eftersom mer tid temperera mediet krävs.
2. anoxiska odling av olika däggdjur cellinjer
-
Utsedda dag -1
- Odla cellerna (37 ° C, 5% CO2) i en T150 kolv till 90% sammanflödet för anoxiska och normoxic kultur kontroll att tillhandahålla ett tillräckligt antal celler för tre 24 brunnar (80% confluence).
Obs: För denna studie användes HeLa 229 och Vero celler. Detta protokoll var också testats och visat sig framgångsrikt för tillväxt och underhåll av sju andra cell linjer25. - Ta bort mediet från kolven genom aspiration och tvätta det med 10 mL HBSS.
- Ersätta mediet med 5 mL av trypsin. Skaka kolven tills cellerna visuellt loss från plasten. Sug ut de flesta av trypsin och tryck på kolven för att rubba de vidhäftande cellerna. Tillsätt 10 – 15 mL hög glukos DMEM (4,5 g/L av glukos, 110 mg/L av L-glutamin, 10% FBS, 50 µg/mL gentamicin) att inaktivera trypsin.
- Pulverisera cellerna med 25 mL pipett tills alla cell klumpar störs.
- Räkna cellerna och avgöra lönsamheten med hjälp av de vanliga hemocytometer och metoden trypan blått färgämne uteslutning eller automatiserade motsvarande.
- Avbryta cellerna i hög glukos DMEM som nämnts ovan att en cell densiteten av 2.24 x 105 celler/mL.
- Tillsätt 1 mL cellsuspension till brunnarna 24-väl vävnadsodling platta (2.24 x 105 celler per brunn; 80% confluence). Frö 1 platta för den syrefria kulturen och en annan för en kontroll normoxic kultur.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under normoxic förhållanden (5% CO2) för 24 h.
Obs: Cellerna kan beläggas i olika stora plattor. Dock löper sådd cellerna för anoxiska tillväxt i kolvarna risk att införandet av syre in i systemet, om inte vården utövas helt spola ut atmosfärisk gas.
- Odla cellerna (37 ° C, 5% CO2) i en T150 kolv till 90% sammanflödet för anoxiska och normoxic kultur kontroll att tillhandahålla ett tillräckligt antal celler för tre 24 brunnar (80% confluence).
-
Utsedda dag 0
- Efter 24 h av normoxic ruvning, placera plåtarna för anoxiska tillväxt in i anaerob kammaren (en kommersiell anaerob kammare; (Se figur 1).
- Omedelbart ändra mediet till antibiotikum-fria de gasade PS-74656 medium som har acklimatiserats för 24 h till anaerob kammaren. Placera plattan i en behållare med en fuktig handduk och löst Stäng det för att behålla fukten.
Obs: Plattorna för normoxic tillväxt hanteras identiskt med undantaget att alla behandlingar görs under atmosfäriska förhållanden.
-
Utsedda dag 1
- Dag 1 av anaerob inkubering börjar efter 24 timmars inkubering i kommersiella anaerob kammaren som innehåller standard anaerob gasblandningen 10% H2, 10% CO2och 80% N2.
- Inkubera cellerna i olika tidsperioder.
- Övervaka det anaeroba mediet för färgen förändras över tid.
Obs: En färg förskjutning från röd-orange till magenta signaler tid att ändra mediet. Detta kan ta upp till 2 veckor att uppstå. En färg förskjutning i mediet från röd-orange till gult anger förekomsten av en bakteriell kontamination. - När mediet ändras från rött till magenta, ta bort de runagate cellerna genom aspiration.
- Plats aspirerade använt media med runagate celler i avgasade och anaeroba gas jämviktas microfuge rör, nära rören medan att se till att tätningen är säkert, och sedan Centrifugera dem (326 x g; i rumstemperatur i 10 min). Omedelbart ersätta aspirerade media i brunnen med 1 mL ny avgasade PS-74656 medium.
- Placera mikrofugrör med pelleterat celler i anaerob kammaren innan du öppnar den. Aspirera använt medlet och ersätta det med frisk avgasade PS-74656 medium till en total volym om 1 ml i mikrofugrör.
- Returnera cellerna från röret till en brunn i 24-väl vävnadsodling plattan.
3. bedömning av fenotypiska celldifferentiering genom mikroskopi av anaerobt odlade celler
-
Medan i anaerob kammaren, placera plattan i en återförslutbar box spolas med anaerob gasblandningen och stänga rutan.
Obs: Rutan måste innehålla en fuktig pappershandduk för att ge fukt och förhindrar uttorkning av plattan. För mikroskopi fungerar smörgås väskor bäst eftersom de är tunna.- För att observera cellerna under mikroskopet, helt Förslut påsen och ta bort den från kammaren.
- Försiktigt sträcka plastpåsen över plattan, undersöka celler med en inverterad fas kontrast Mikroskop med kamera kvarstad och ta mikrofotografier vid olika förstoringar.
- Returnera plattan i den förslutna påsen till kammaren, och fortsätta ruvning som beskrivs i steg 2.3.3.
- Separat analysera de runagate celler som är i suspension, Följ stegen som beskrivs i steg 2.3.5.
Obs: Dessa celler kan sedan användas för testning av aerob eller kan returneras till anaerob avdelningen för provning av denna särskilda population.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Styrkan i detta protokoll ligger i sitt stöd av livslängden och tillväxt av flera cellinjer och erkännandet att det finns en djupgående förändring och divergens i cell morfologi25. Den mest kritiska delen av denna studie är det överföring och underhåll av cellerna under strikt anaerobiosis. Detta kräver en anaerob kammare organiserat för att maximera protokollet (figur 1) och en försäkran om att cellerna bort för mikroskopi eller andra provning hålls i en sluten miljö. Hittills har utbudet av anoxiska överlevnad var 15 – 17 dagar för odödliga cancer cellinjer och upp till 17 dagar för förvandlade cellinjer (nio cellinjer screenas för anoxiska tillväxt). Nivåerna av viabla celler, minskat när dessa celler flyttades till syrefria förhållanden, minst 10%, till högst 90%, innan de stabiliseras. Alla cellinjer återgått till de dubbla fenotyperna (uppbundna och runagate) med andelen celler i avstängning ökar med tiden. Även efter en utökad inkubation av flera veckor, det återstod några uppbundna celler, men flesta av cellerna var rundade runagate morfologi (figur 2). Som rapporterats, är dessa runagate celler livskraftig och fortsatte genom deras cell cykel. Det bör noteras att glukosnivåerna och nitrit koncentrationen ingår i de variabler som kan behöva justeras. Som sagt, från över 60 olika medier formuleringar som testades för sin förmåga att stödja både normoxic och anoxiska inkubation, PS-74656 mediet kunde stödja överlevnad och replikering av nästan alla cellinjer testade.
En grundläggande iakttagelse var differentiering av syrefria celler, oavsett cellen testade, i två distinkta fenotyper, uppbundna och runagate (figur 2). Analogt med normoxic enskiktslager cellerna, uppbundna cellerna fästes vävnadsodling plast. Den bifogade filen var dock svagare, lättare att trypsinize eller få bort genom att skrapa, än den bifogade filen som inträffade på normoxic villkor. Cellmorfologi var dessutom mindre med mer spindel (dendritiska) tillägg26. Den andra cellulära morphotype observerade var celler i suspension (dvs, runagate celler). Dessa celler omvandlas spontant friflytande enda cellsuspensioner i närvaro av vävnadsodling-behandlade plast, som var rundade med en mindre Cellstorlek och mindre cytoplasman. De skilde sig från de klassiska suspension kultur celler, som vanligtvis kräver en enzymatisk anpassning, växa i aggregat, kräver icke-vävnadsodling-behandlade behållare och är större än deras normoxic motsvarigheter27. Över tiden, kunde de syrefria cellpopulationer observeras för att skifta från en huvudsakligen uppbundna enskiktslager av runagate celler i suspension. Dessa celler i suspension var livskraftig och replikerande; Således, vård hade utövas bör supernatanten avlägsnas. Notera är också att mediet inte behövde förändras över hela anaerob inkubationstiden. Den medelstora pH-indikatorn under syrefria ruvning, i motsats till dess normoxic kontroll, var också oförändrad (dvs.förblev röd). Bör utredaren vill skörda runagate cellerna, eller ändra mediet, kan cellerna erhållas med anaerob gas-spolas mikro-centrifugrör som försluts tätt inom anaerob kammaren. För cellen tvättning av uppbundna celler, måste förfarandet också utföras i kammaren för att eliminera eventuella syrgasexponeringen.
Den slutliga cellviabiliteten för en långsiktig odling var i stor utsträckning, beroende av cellen som används och sammanflödet som brunnar eller kolven var ursprungligen seedade (figur 3 och 4). Som sagt, en bra utgångspunkt är 80%, som hade störst chans att optimal tillväxt. Dessutom kan en cell linje-beroende förlust av 10% till 60% av lönsamheten uppstå i de inledande 2 – 4 dagarna. Dock under utförandet av detta experiment, återstående cellerna cyklade genom cellcykeln och replikeras28. Sådd sammanflödet effekt på livslängden av cell odlingen kan ses i figur 3 och 4. Både HeLa 229 och Vero celler var seedad i 24 brunnar till 40%, 60% och 80% av inledande sammanflödet (100% sammanflödet = 2,8 x 105 celler per brunn) och sedan inkuberas i frånvaro av syre i 17 dagar. HeLa 229 cell anoxiska tillväxten var optimerad på en initial sådd sammanflödet av 80%. Däremot i Vero-celler optimal sådd sammanflödet var 60%. Detta visar behovet av att initialt optimera sådd densiteten beroende av den cellinje som används.
Figur 1 : Modell av anaerob kammare set-up för kultur av däggdjursceller. Det minimala material krävs innehålla vävnadsodling plattor, sterila pipetter, biohazard väskor, de gasade media, ett rör för kassering av media eller andra vätskor och återförslutningsbara påsar för överföring av plattorna till mikroskopet bibehållen anaeroba förhållanden.
Figur 2: Anoxiska HeLa cells morphologic differentiering. (A) denna panel visar fas kontrast microscopyen normoxic HeLa cellen kontroller 4 dagar efter inympningen, med en 20 X förstoring. (B) i denna panel visas de syrefria HeLa cellerna 17 dagar efter inympningen (med den oförändrade från dag 1 PS-74656 medium, 80% seedade sammanflödet och en 20 X förstoring). (C), denna panel visar mikroskopi artefakter av vattendroppar på interiören i en förseglad plastpåse som innehåller en 24-väl anoxiska tallrik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förhållandet mellan anoxiska till normoxic HeLa 229 livskraftiga celler post-17 dagars inkubation. Denna panel visar effekten av sådd tätheten på de HeLa 229 cellviabiliteten PS-74656 medium jämfört med kontrollen normoxic. Resultaten redovisas som det medelvärde ± SEM.
Figur 4: Förhållandet mellan anoxiska till normoxic Vero livskraftiga celler 17 dagar efter inkubation. Denna panel visar effekten av sådd tätheten på de Vero cellviabiliteten PS-74656 medium jämfört med kontrollen normoxic. Resultaten redovisas som det medelvärde ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod motsvarar första gången däggdjursceller som odlades för längre tidsperioder i frånvaro av syre. Baserat på aktuella observationer, verkar den syrefria tillväxt kapacitet via en icke-fermenterande väg vara universell bland däggdjursceller linjer28, där anaeroba tillväxten resulterade i fenotyp divergens. Detta observerades för alla cellinjer som testas. Öka andelen cellerna med anaerob odling, blev rundade, utvecklat en suspension-liknande befolkning och kunde replikera. Den sekundära celltypen förblev knuten till substratet; dock återgått cellmorfologi till en spindel (dendritiska) form. Dessa fynd påpeka ett vanligt fel i analyser och observationer när det gäller anoxiska vävnadsodling odling. Det är allmänt accepterat att när däggdjurs-celler odlas under normoxic förhållanden (5% CO2) runda upp och lossa, de dör. Tvärtom verkar vara korrekt för celler odlade i frånvaro av syre, i vilket fall, celler som har avrundat uppåt och fristående, är helt enkelt en morfologiskt skilda cellen subpopulation.
Optimering av anoxiska tillväxt villkorar är cellinje beroende. Medium PS-74656 övergripande stödde tillväxten av alla cell linjer under normoxic och anoxiska tillväxt villkorar, med undantag av MDA-MB-231, en breast cancer cellinje som föredragit tillväxt i avsaknad av nitrit. En uppmuntrande observation är att även med en 98% die-off av celler per brunn, resten replikerar, vilket resulterar i en mycket anpassade befolkning. Den kritiska åtgärden är att upprätthålla kulturer även när endast ett fåtal celler observeras direkt av mikroskopi. Således måste försiktighet iakttas för att säkerställa att de fristående cellerna är döda, antingen genom trypan blått färgämne uteslutning eller genom en alternativa cell livskraft detektionsmetod. Det bör noteras att med sådan en stor minskning i cell nummer, tillräcklig brunnar måste vara seedad för att ha tillräcklig totala cell nummer för efterföljande experiment. Förväntade förlusten av viabla celler är både cellinje och seedning sammanflödet beroende; Således, optimal cell nummer, över tid, måste bestämmas experimentellt och inte kan extrapoleras från resultaten med andra cellinjer. Som sagt, en bra utgångspunkt är ett 80% confluence, som har störst chans att optimal tillväxt. Det måste noteras att all exponering för syre under anaeroba stegen i förfarandet, oavsett hur kort, kommer att äventyra resultaten på grund av den rapporterade spontana cellulära HIF-1-alpha svar11,12.
För detta förfarande är det mest kritiska steget den avgasning av mediet, rör, och alla andra apparaturar och material som används. Införandet av även mycket låga halter av syre kunde stoppa övergången från jäsning metabolism till den anaerob respirationen. Alternativt kan det förlänga fermentativa ämnesomsättningen så att några experiment resultera i mätningen av hypoxi, inte anoxi. Användningen av detta nya förfarande att mäta cytotoxicitet och kemoterapeutiska aktivitet kan bidra till att förklara drog misslyckande för behandling av solida tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Midwestern University kontor för forskning och sponsrade program för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
