Summary
여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
드롭릿 디지털 연쇄 반응 (ddPCR)은 나노 크기의 물에서 기름 개별 반응의 수천에 샘플 분류에 따라 매우 민감한 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법. 최근에, ddPCR는 순환 종양 DNA (ctDNA) 검색에 대 한 가장 정확 하 고 중요 한 도구 중 하나가 되고있다. 표준 ddPCR 기술의 주요 한계 중 하나는 각 가능한 유전자 버전을 인식 하는 특정 가수분해 프로브는 필요 반응, 당 상영 될 수 있는 돌연변이의 제한 수입니다. 다른 방법론, 드롭 오프 ddPCR만 한 쌍의 프로브를 감지 하 여 잠재적으로 모든 유전 변경 대상된 지역에서 계량 하므로 처리량을 증가 합니다. 드롭 오프 ddPCR 단일 반응에서 돌연변이의 더 많은 수를 감지의 장점과 함께 기존의 ddPCR 분석 실험에 유사한 감도 표시 합니다. 그것은 비용 효율적인, 귀중 한 시료를 보존 이며 또한 경우 사용할 수 있습니다 검색 도구로 돌연변이 선험적으로알려져 있지 않습니다.
Introduction
암 개발에 관련 된 체세포 돌연변이의 수천 보고 된1되었습니다. 이 중, 몇 가지 예측 마커 타겟된 치료 2,3 의 효능 이며 상영이 돌연변이의 유전은 이제 일상적인 임상 연습. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 기술은 높은 검색 정확도로 유무의 변이 대 한 모니터링에 사용할 수 고 매우 비 침략 적 액체 biopsies4,5와 호환 합니다. 그러나, 현재 ddPCR 분석 실험은 주로 선험적으로알려진 돌연변이 감지 하도록 설계 되었습니다. 이 심각 하 게 돌연변이 알 수 없는 경우 검색 도구로 ddPCR 사용 하 여를 제한 합니다. 실제로, 기존의 ddPCR 디자인, 야생 형 대립 유전자 (WT 프로브)를 인식 하는 가수분해 프로브 인식 하는 돌연변이 체 대립 유전자 (MUT 프로브) (그림 1A) 특정 조사와 경쟁 한다. 높은 선호도 조사 서식 파일을 hybridizes 하 고 해당 대립 유전자의 성격을 나타내는 그것의 fluorophore를 해제 합니다. 각 작은 물방울에 대 한 얻은 형광 데이터 WT 및 MUT 프로브 다른 차원에 의해 방출 하는 형광을 나타내는 산 점도에 구상 될 수 있다. 기존의 ddPCR 분석 결과 대 한 일반적인 결과의 도식 표현 그림 1A에 제공 됩니다. 이 예제에서는 블루 클라우드 빨간 구름 방울 있는 MUT 대립 유전자 증폭 되었고 MUT 프로브에 의해 식별에 해당 하는 반면 WT 프로브로 식별 하는 WT 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 반응에서 로드 하는 DNA의 양에 따라서 WT와 MUT amplicons 포함 된 더블 긍정적인 방울 (녹색 구름) 나타날 수 있습니다. 빛 회색 구름 빈 물방울에 해당합니다.
대부분의 플랫폼 fluorophores (보통 2, 최대 5만)의 제한 된 수의 검출에 대 한 허용, 기존의 ddPCR의 처리량 제한 됩니다. 따라서, 여러 개의 인접 한 돌연변이와 영역을 대상으로 기술적으로 도전적인 멀티플렉스 ddPCR 분석 실험 또는 동시에 각 돌연변이 대상으로 하는 여러 반응의 사용의 디자인을 필요 합니다. 그것은 잠재적으로 독특한 WT 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 대상 지역 내에서 어떤 유전 변경 감지 수 있습니다 드롭 ddPCR 전략이이 제한 극복. 첫 번째 프로브 (Probe 1) 커버 비 변수 시퀀스, 대상 지역 및 두 번째 프로브 (Probe 2)은 돌연변이 대상 영역의 WT 시퀀스에 보완 예정 (그림 1B). 첫번째 조사 반응에 amplifiable 분자의 총 금액을 단정, 하는 동안 두 번째 프로브 WT 및 MUT 대립 유전자 돌연변이 시퀀스에 최적의 교 잡에 의해 차별. 프로브 2 대상 지역 (단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드 대체, 삭제, 등)6에 돌연변이의 여러 종류를 식별할 수 있습니다. 기존의 ddPCR에서 빛 회색 구름 없는 DNA 분자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 이 유형의 분석 결과에 WT MUT 구름의 최적의 분리는 DNA WT와 MUT 대상 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울만 WT를 포함 하는 작은 물방울에서 구분할 수 없습니다 이후 반응, 로드의 수량에 따라 기억 하는 것이 중요 하다 양식입니다. 따라서,이 분석 결과 대부분 물방울 타겟된 유전자의 둘 이상의 복사본을 포함 해야 합니다.
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Protocol
여기에 제시 된 프로토콜 인 퀴리의 윤리 지침을 따릅니다. 모든 인간의 샘플 동의 연구 인 퀴리에 기관 검토 위원회에 의해 승인 후 등록 환자에서 얻은 했다.
1. 혈액 수집, 플라즈마 저장 및 셀 무료 DNA 추출
참고: 모든 유형의 "조직"에서 추출한 DNA를 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 신선한 또는 포름알데히드 고정 파라핀 (FFPE) 조직, 문화 또는 혈액 샘플 셀 포함). 여기, 우리는 혈, 플라즈마 격리 및 저장 및 세포 없이 DNA (cfDNA) 추출에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.
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혈액 수집 및 플라즈마 스토리지 (그림 2B)
- 7 mL EDTA 튜브에 혈액 샘플을 수집 합니다. 두 개의 튜브 플라즈마의 주위 4 mL를 수집 하는 것이 좋습니다.
- 혈액 무승부 적혈구 (RBC), 백혈구 (WBC)와 플라즈마의 820 x g 3 h 이내에서 10 분 동안 튜브 원심 샘플링은 원심 분리 사이의 시간이 고품질 cfDNA (WBC에서 발표 하는 DNA로 오염 되지즉, cfDNA)를 얻기 위해 중요 합니다.
- 조심 스럽게 피펫으로 WBC 레이어;를 건드리지 않고 1 mL를 피펫으로 사용 하 여 상쾌한 (플라즈마) 플라즈마의 약 2 mL EDTA 튜브 당 일반적으로 복구 됩니다.
- 2 mL 튜브에 플라즈마를 전송 하 고 원심 16000 x g 세포 파편을 제거 하는 15 ° C에서 10 분 동안에 aliquots.
- 조심 스럽게 피펫으로 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 (플라즈마). 2 mL 저온 관에 플라즈마를 배포 하 고 필요할 때까지-80 ° C에서 저장 합니다.
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cfDNA 추출 (그림 2B)
참고: 여기, 우리가 현재 수동 추출 키트를 사용 하 여 프로시저. 제조업체의 지침에 따라 하는 자동화 된 버전 cfDNA 격리에 대 한 수행할 수 있습니다.- 가수분해 K의 400 µ L 50 mL 튜브에 넣어. 키트에서 플라즈마 (일상적으로 사용 되는 볼륨)의 4 mL와 세포의 용 해 버퍼 ACL (1.0 µ g 캐리어 RNA 포함)의 3.2 mL를 추가 합니다. 튜브를 닫고 30에 대 한 vortexing에 의해 혼합 균질 솔루션을 얻기 위해 s. 30 분 동안 60 ° C에서 품 어.
- 실리 카 막에 순환 핵 산의 바인딩을 최적화 하 여 15-30 미 품 얼음에 5 분에 대 한 튜브에 대 한 vortexing에 의해 혼합 lysate를 (kit)에서 버퍼 ACB의 7.2 mL를 추가 합니다.
- 진공 펌프에 있는 열과 20 mL extender를 놓습니다. 진공 흡 인을 허용 하도록 사용 하지 않는 위치를 닫습니다.
- 신중 하 게 튜브 extender (짧게 원심 분리기 튜브 lysate 버퍼 ACB 혼합물의 최대 수집)에 lysate 버퍼 ACB 혼합물을 적용 진공 펌프에 전환 하 고 완전히 열을 통해 얻을 수 lysate 허용. 제거 하 고 튜브 extender를 삭제.
- 버퍼 ACW1의 600 µ L 열에 적용 됩니다. 버퍼 ACW1 열 통해 그려 있다, 750 µ L 추가 버퍼 ACW2 마지막으로 에탄올 (96-100%)의 750 µ L을 추가 하 고. 다음, 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브와 에탄올을 제거 하기 위해 3 분 최고 속도 (20000 x g)에서 원심 분리기에 열을 배치 합니다.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 열을 놓습니다. 뚜껑 열고 완전히 막 건조 10 분 동안 56 ° C에서 품 어.
- 깨끗 한 1.5 mL DNA 낮은 바인딩 튜브로 열을 놓습니다. 신중 하 게 36 µ L RNase 무료 물 0.04% 나트륨 아 지 드 (버퍼 AVE)와 함께 적용 합니다. 뚜껑 닫고 3 분 동안 실 온에서 품 어.
- 최고 속도로 (20000 x g) 핵 산을 elute 필요할 때까지-20 ° C에서 저장을 1 분 동안 원심.
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cfDNA 정량화
참고: cfDNA 정량화 fluorometer 추출 또는 실 온 (RT)에서 샘플을 녹고 후 즉시 사용 하기 전에 제조업체의 프로토콜을 사용 하 여 수행 됩니다. 여러 동결/해 동 주기를 하지 마십시오.- 높은 민감도 분석 결과 일반적으로 100 ng/mL 플라즈마 예상된 cfDNA 양에 따라 사용 합니다. cfDNA 농도 2-10 ng/mL에서 건강 한 기증자에 대 한 하지만 전이성 질병을 가진 환자에서 100 ng/mL로 높은 수 있습니다.
- 모든 시 약에 RT 하 고 반응 (N 수 샘플 + 보정은 fluorometer 2 기준) 당 1 µ L의 염료 (200 x)와 fluorometer 희석 버퍼의 199 µ L를 혼합 작업 솔루션을 얻을.
- CfDNA 솔루션 동질성을 확인 하 고 간단히 튜브의 하단에 내용을 수집 하 원심을 철저 하 게 소용돌이.
- 믹스 5 µ L의 각 cfDNA 샘플 작업 솔루션의 195 µ L로.
- 혼합 10 µ L 각 표준의 작업 솔루션의 190 µ L와.
- 철저 하 게 모든 소용돌이 튜브 동질성을 확인 하 고 수집 튜브의 하단에 내용을 간단히 원심을 2-3 s에 대 한 합니다.
- 어둠 속에서 2 분 RT에서 품 어.
- ' Ng / µ L ' 출력 모드를 사용 하 여 fluorometer에 튜브를 읽으십시오
- 플라즈마의 ng/mL에서 최종 농도 다음과 같이 계산: ng / µ L x 36 (cfDNA eluate 볼륨) / 4 (추출 하는 플라즈마의 볼륨).
2. ddPCR 프로브 및 뇌관 디자인 (그림 2A)
참고: 이탈 ddPCR 분석 결과에서 대상된 분자의 증폭 정량의 비슷한 원칙을 다음과 같습니다. 각 뇌관 및 프로브는 기존의 전용된 소프트웨어 Primer37 (http://primer3.ut.ee/)와 함께 설계 되었습니다.
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뇌관 디자인
- 일반 설정 창에서 '3.8, 'dNTPs의 농도'를 ' divalent 양이온의 농도 0.8, 그리고 올바른 조직에 ' mispriming/반복 도서관 ' 으로 변경 합니다.
- 사전 설정 창에서 산타 루시아 1998 년 '열역학 매개 변수 테이블' 과 '소금 농도 수식' 을 변경 합니다.
- Tm 55와 70 ° C 사이 선택 (소금 농도 및 300 50mm와 oligonucleotide 농도 대 한 nM).
- PrimerBlast와 같은 도구를 사용 하 여 뇌관의 특이성을 확인 하십시오.
- 보조 구조를가지고 있는 영역을 하지 마십시오.
- 50-60%의 GC 함량이 시퀀스를 선택 합니다.
- Gs와 Cs 3 기지 이상 반복을 하지 마십시오.
- 그들의 3' 끝에 가능 하면 Gs와 Cs 뇌관을 선택 합니다.
- 3' 짝된 뇌관의 끝 뇌관 이합체를 피하기 위해 상당한 complementarity 필요가 없습니다 확인 합니다. Amplicons 150 보다 작아야 혈압을 효율적으로 cfDNA를 증폭 (크기는 170 bp8의미)와 종종 조각화 FFPE에서 추출 된 DNA.
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프로브 설계
참고: 가수분해 프로브 5' 끝에 형광 기자와 3' 끝에 끄는 표시 되어 있습니다. 그들은 높은 특이성을 제공 높은 신호 대 잡음 비율 및 필요한 경우 다중화 허용. 2 채널 드롭릿 독자 팸/16 진수의 분석 뿐만 아니라 식구 들 하 고 16 진수 또는 빅 염료와 호환 또는 프로브를 결합 하는 식구 들/빅.- 가수분해 조사 대상 지역 및 인접 한 비 변수 지역 WT 시퀀스에 보완을 디자인 합니다.
- 둘 다 이전 설계 뇌관 쌍에 의해 정의 하는 amplicon 내에 위치한 프로브를 선택 합니다. 비록 그들은 서로 옆에 앉아 수 있습니다 입문서 시퀀스 프로브 시퀀스와 겹칠 수 없습니다.
- Gs 프로브 30-80%의 GC 내용이 있어야 보다 더 Cs는 가닥을 선택 하십시오.
- 프로브 길이 13 그리고 30 뉴클레오티드 사이 선택 합니다. 더 높은 배경 형광 표시 하는 경향이 더 이상 프로브는 fluorophore는 끄는 사이의 거리에 영향을 미치는 fluorophore 기자의 냉각 때문에.
- Tm 프로브 뇌관 어 닐 링 및 확장 하는 동안 프로브 가수분해 되도록 뇌관의 Tm 보다 높은 3 ~ 10 ° c를 선택 합니다. Tm 강화는 짧은 프로브 차별 단일 염기 변형을 효율적으로 짧은, 프로브를 유지 하면서 필요한 Tm 를 도달 하는 것이 좋습니다. 프로브 하지 말았어야 G 5' 끝이 가수분해 후에 형광 신호를 냉각 하기 때문에.
- 다음과 같이 감소 프로브 디자인: 5'-(VIC)-돌연변이의 보완 WT 시퀀스-(MGB NFQ)-3' 기준으로 조사 하 고: 5'-(6-FAM)-비 변수 영역의 보완 시퀀스-(MGB NFQ)-3'. 기자/끄는의 다른 조합 수 있습니다.
3. ddPCR 반응 (그림 2A)의 최적화
참고:이 단계에서 사용 되는 야생 형 및 돌연변이 DNA 컨트롤 얻어질 수 있다 세포, 종양 샘플 또는 상용 DNA 참조 표준, 예를 들면.
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기존의 PCR 뇌관 설계에 의해 증폭 PCR 제품의 특이성을 확인 하기 위해 열 그라디언트 기능을 사용 하 여 열 cycler에 수행 합니다.
- 8 반응 온도 당 하나 이상 반응을 최소 야생-타입 DNA 컨트롤 서식 파일 (프로브) 없이 4.1 단계에서 아래와 같이 독특한 PCR 반응 혼합을 준비 합니다.
- 증폭 단계 4.3.2와 주위 이론적인 어 닐 링 온도 뇌관의 어 닐 링 온도 범위에서 설명 하는 프로그램을 사용 하 여 실행 합니다.
- 어 닐 링 온도 제공 하는 특정 제품에 대 한 선택 3 %agarose 젤에 PCR 제품을 로드 합니다.
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드롭 오프 ddPCRs 위에서 설명한 매개 변수를 사용 하 여 하지만 두 프로브를 포함 하 여이 이번의 일련을 수행 합니다.
- 100% WT DNA, 100% MUT DNA와 WT와 MUT DNA의 혼합물을 사용 하 여 (예를 들어, 50% MUT/50% WT) WT MUT 물방울 구름의 분리에 대 한 최상의 조건을 결정 하.
- 4.1 단계에서 선택 하는 온도 이상 어 닐 링 온도 범위를 선택 합니다.
- 어 닐 링 온도 100% WT DNA 또는 100% MUT DNA와 WT MUT 물방울 구름의 최고의 분리를 사용 하 여 신호 WT 또는 MUT의 특정 검색에 대 한 허용을 선택 합니다.
- 어 닐 링 시간 및 뇌관/프로브 농도 또한 조정할 수 있습니다 구름의 분리를 개선 하 고 중간 형광 (비 효과)와 방울의 수를 감소.
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배경이 나도 빈 (LOB)의 평가 분석 결과의.
- 어 닐 링 매개 변수 및 3.2에서 선택한 프라이 머/프로브 농도 사용 하 여 DNA WT 컨트롤과 48 개별 드롭 ddPCR 반응의 최소를 수행 합니다.
- 각 반응에 대 한 다음과 같은 계산 돌연변이 체 대립 유전자 주파수 (농림 부): (채워진된 방울 방울/수 돌연변이의 숫자) x 100.
참고: LOB 긍정 MAF 의미로 정의 되 고 관련 된 SD는 95% 신뢰 구간 (95 %CI) 계산 됩니다. LOB (긍정 MAF의 평균) = + 95 %CI.
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분석 결과의 검색 (LOD)의 평가 합니다.
- 드롭 오프 ddPCR 반응 5%에서 0.01% 사이의 MAFs와 WT DNA에 MUT DNA의 직렬 희석을 사용 하 여 수행 (조건 당 ≥ 8 복제). 3.2에서 선택한 어 닐 링 매개 변수 및 프라이 머/프로브 농도 사용 합니다.
주: LOD 정의 작은 MAF 값으로는 현재 평균 값과 LOB 위에 SD 복제 (Decraene 외. 참조 6 대 한 자세한 내용은)입니다.
- 드롭 오프 ddPCR 반응 5%에서 0.01% 사이의 MAFs와 WT DNA에 MUT DNA의 직렬 희석을 사용 하 여 수행 (조건 당 ≥ 8 복제). 3.2에서 선택한 어 닐 링 매개 변수 및 프라이 머/프로브 농도 사용 합니다.
4. ddPCR 프로토콜 (그림 2B)
참고: 기존의 유사한 ddPCR, 드롭 오프 ddPCR 프로토콜 구성 4 단계: (i) PCR 혼합 준비, (ii) 물방울 생성, (iii) PCR 증폭 및 (iv) 데이터 수집.
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PCR 혼합 준비
- 표준 예방 조치에 따라, 깨끗 한 PCR 후드, 깨끗 한 펫, RNase를 사용 하 여 장갑을 끼고 같은 DNase 무료 증류수 오염을 피하기 위하여.
- 해 동 하 고 실시간에 반응 구성 요소 equilibrate
- 20 x 18 µ M에 뇌관 및 5 µ M에서 프로브와 증류수에 프라이 머/프로브 믹스를 준비 합니다.
- 모든 개별 PCR 반응에 대 한 샘플 혼합 2 x ddPCR supermix (10 μ), 20 그리고 10 ng DNA 샘플 qsp 20 µ L의 증류수 프라이 머/프로브 믹스 x 1 µ L를 결합 하 여 준비 합니다.
- 소용돌이 반응 동질성을 보장 하기 위해 철저 하 게 혼합 하 고 짧게 전에 분배 튜브의 하단에 내용을 수집 하 원심. 이 단계를 반복 하 여 사용 하기 전에 각 반응 혼합물에 대 한 주저 하지 마십시오.
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드롭릿 세대
- 홀더 ddPCR 카트리지를 삽입 하 고 로드 방울 세대 (녹색 위치 그림2b에서)에 대 한 카트리지의 중간 우물에 샘플을 포함 하는 반응 혼합의 20 μ는 8-채널 피 펫을 사용 하 여.
- 하단 웰 스 (노란색 위치)에 방울 생성기 기름의 70 μ를 추가 합니다.
- 방울 발생기; 가스 켓, 카트리지 삽입 방울은 카트리지 (파란색 위치)의 최고 우물에서 제작 됩니다.
- 발음 하 고 천천히 그리고 부드럽게 분배 ()을 피하기 위해 전단 96 잘 PCR 격판덮개로 카트리지에서 물방울의 40 μ. 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 작은 물방울 전송 최적화.
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PCR 증폭
- 증발을 피하기 위해 방울을 전송 후 바로 접시 마감재를 사용 하 여 알루미늄 호 일로 최종 PCR 접시를 봉인. 짧게 우물의 아래에 내용을 수집 하 격판덮개 원심.
- 다음 프로그램을 사용 하 여 열 cycler에 기존의 PCR 증폭을 실행: 95 ° C 10 분의 40 주기 [94 ° C 30 초, 60에 대 한 어 닐 링 T ° 검증 s], 98 ° C 10 분 (램프 2.5 ° C/s). 각 실행에 입력된 DNA 및 야생 유형 DNA (≥3 복제) 컨트롤을 포함 합니다.
- 실행이 완료 되 면, 간단히 원심 우물의 아래에 내용을 수집 하는 접시.
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데이터 수집
- PCR 확대 후 수 PCR 양성 및 PCR 음수가 방울 방울 리더 제조업체의 지침에 따라 사용 합니다.
참고: 드롭릿 리더는 일반적으로 식구 들, 피해자 또는 16 진수 fluorophores 호환 2-컬러 광학 탐지 시스템을 제공합니다.
- PCR 확대 후 수 PCR 양성 및 PCR 음수가 방울 방울 리더 제조업체의 지침에 따라 사용 합니다.
5. 데이터 분석 (그림 2C 및 그림 3)
참고: PCR 양성 및 PCR 음수가 방울은 MUT 및 대상된 지역에 WT 대립 유전자의 절대 정량화를 제공 하기 위해 계산 됩니다. 할당 된 방울에 각 잘 MAF를 계산 하는 데 사용 됩니다. 드롭릿 정량화 및 분석의 이탈 분석 개발한 탈리와 동료9,10ddPCR R 패키지 (https://github.com/daattali/ddpcr)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 R 패키지 (때문에 비효율적인 증폭), "비"의 빈, 부분 또는 가득 진짜 긍정적인 신호 (그림 3) 방울을 자동으로 분류합니다. 분석의 다른 단계를 제시 하는 다음 섹션 (https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ 알고리즘을 참조 하십시오 그것의 저자에 의해 쓰여진 알고리즘의 설명 소품의 간단한 버전입니다. 자세한 내용은 Rmd). 데이터는 쉼표로 구분 된 값 파일 (FileName_Amplitude.csv)에 수출 하 고 R 또는 전용된 웹 인터페이스를 통해 직접 분석할 ddPCR 패키지에 업로드.
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매개 변수 조정
참고: 각 이탈 분석 결과 디자인 특정 최종 방울 배포판에 결과 그리고 클라우드 폼, 분판 또는 위치에 변화 예정 이다. 효율적인 자동화 된 분석을 위해 매개 변수 집합이 조정 될 필요가 있다. 예기치 않은 프로필 잘 있다면, 그것은 오류 메시지가 결과 실패, 전체 판의 분석을 발생할 수 있습니다. 문제가 잘 해야한다 식별 하 여 자동된 분석에서 제거.- 실패 한 우물 (REMOVE_FAILURES)를 사용 하 여 식별 합니다. TOTAL_DROPS_T를 사용 하 여 (기본값은 5000)에 각 잘 방울의 최소 수를 조정 하려면. EMPTY_LAMBDA_LOW_T를 사용 하 여 (기본값은 0.3)와 EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (기본값은 0.99) 예상된 물방울 구름 (빈, MUT, WT)를 평가 하는 지표를 조정 하 고 그들의 품질.
참고: 기호는 거기 아니었다 충분 한 amplifiable 서식 파일 반응에는 데 너무 많은 빈 방울입니다. - 국외 자 방울 (REMOVE_OUTLIERS)를 사용 하 여 식별 합니다. TOP_PERCENT를 사용 하 여 (기본값은 p = 1%)에서 전체 접시에 방울 방울 각 신호 차원 (식구 들, 빅/16 진수)에 있는 가장 높은 신호 값의 상위 p % 조정. CUTOFF_IQR를 사용 하 여 (기본값은 5) 높은 신호의 상위 p %의 국외 자 임계값을 조정.
- 빈 방울 (REMOVE_EMPTY)를 사용 하 여 식별 합니다. CUTOFF_SD를 사용 하 여 (기본값은 7) 프로브 1 값의 낮은 (빈 방울) 가우스 분포의 표준 편차를 조정.
- 게이트 방울 (분류)를 사용 하 여입니다. CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD를 사용 하 여 (기본값은 3) 프로브 1 값의 높은 (채워진된 방울) 가우스 분포의 표준 편차를 조정. ADJUST_BW_MIN를 사용 하 여 (기본값은 4) 및 ADJUST_BW_MAX (기본값은 20) 프로브 2 값의 커널 밀도 추정을 차별는 MUT, WT 구름 방울의 k_min 및 k_max 매개 변수를 조정.
- SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ를 사용 하 여 (기본값은 p = 1%)와 SIGNIFICANT_P_VALUE (기본값은 의미 수준 s=0.01%) 돌연변이 또는 wildtype 우물을 분류.
참고:이 알고리즘에서 돌연변이 잘 정의 됩니다 MAF p % 보다 통계적으로 크게 높은 것으로.
- SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ를 사용 하 여 (기본값은 p = 1%)와 SIGNIFICANT_P_VALUE (기본값은 의미 수준 s=0.01%) 돌연변이 또는 wildtype 우물을 분류.
- 실패 한 우물 (REMOVE_FAILURES)를 사용 하 여 식별 합니다. TOTAL_DROPS_T를 사용 하 여 (기본값은 5000)에 각 잘 방울의 최소 수를 조정 하려면. EMPTY_LAMBDA_LOW_T를 사용 하 여 (기본값은 0.3)와 EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (기본값은 0.99) 예상된 물방울 구름 (빈, MUT, WT)를 평가 하는 지표를 조정 하 고 그들의 품질.
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자동된 분석
참고:이 섹션에 각 매개 변수에 대해 ddPCR R 패키지의 작성자는 그들의 지식과 그들의 데이터에 따라 제안 된 기본 값 있어야 합니다. 그러나, 분석 (그림 3)의 품질을 높이기 위해 모든 매개 변수를 수정할 수 있습니다.- 실패 한 우물을 식별 합니다.
- 4 품질 관리 통계를 사용 하 여 (설정: REMOVE_FAILURES) 실패 한 우물;을 식별 하 첫번째는 잘 포함 한다 작은 물방울의 최소 수입니다. 빈, 아마도 식구 들 +와 16 진수에 대 한 유효한 후보 인구를 식별에 초점을 다른 3 + 빅 + 방울. 다운스트림 분석에서 이러한 기준을 만족 하지 못하는 우물을 제거 합니다.
- 국외 자 방울을 식별 합니다.
- 드롭릿 게이팅 기울이기 피하려면 outliers (즉, 16 진수/빅 또는 식구 들 값이 비정상적으로 높은 방울)에서 제거 추가 분석 상한 임계값 설정 (설정: REMOVE_OUTLIERS).
- 빈 방울을 식별 합니다.
- 데이터의 크기를 줄이기 위해 빈 방울을 식별 (전형적인 잘 그들은 계정을 작은 물방울의 대부분)만 서식 파일에 포함 된 물방울 남아 (쓸모 없는 정보의 큰 부분을의 존재로 인해 통계 바이어스를 제거 하 고 설정: REMOVE_EMPTY).
- 드롭릿 게이팅을 수행 합니다.
- 돌연변이, wildtype 또는 비로 나머지 방울을 분류 (설정: 분류).
- 비가 방울을 식별 합니다.
- 비가 방울 비효율적인 증폭에서 발생, 식구 들 + 또는 16 진수에서 제외 + 빅 + 구름. 프로브 1 값을 사용 하 여 그들의 클러스터의 테두리를 확인 (설정: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
- 야생-타입 방울 대 돌연변이 식별 합니다.
- 분석의 하이라이트는 돌연변이 wildtype 템플릿 사이 차별,이 단계 중 하나 또는 다른에서 모든 나머지 방울을 식별 합니다. 이후 그들은 비슷한 프로브 1 값 한다, 가장 그들의 각각 특성을 예측에 프로브 2 값을 사용 (설정: ADJUST_BW_MIN 및 ADJUST_BW_MAX).
- 야생-타입 대 돌연변이로 우물을 분류.
- 어느 작은 물방울은 MUT와 WT를 결정 한 후는 MAF를 계산 합니다. 돌연변이 주파수와 각 잘의 관련된 p-값을 사용 하 여, 그것은 그들을 분류할 수 (설정: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) WT (주로 WT 방울 포함) 또는 MUT 웰 스 (MUT의 통계적으로 뜻깊은 수를 포함 하 방울)입니다.
- 실패 한 우물을 식별 합니다.
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탐색 및 데이터 내보내기
- 탐구 하 고 방울, outliers, 빈 방울, 농도 또는 최적의 표현에 대 한 추가 사용자 정의할 수 있는 그래프 수로 데이터를 내보낼.
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Representative Results
개념 증명 연구에서 KRA exon 2 돌연변이 (codons 12, 13)와 EGFR exon 19 삭제 FFPE 직물 및 드롭 오프 ddPCR 전략6을 사용 하 여 암 환자에서 혈장 샘플에 조사 되었다.
KRA 이탈 프로브 심문 알려진된 KRA 돌연변이 인간 암11의 95% 이상 항구는 KRA 유전자의 엑손 2에서에서 여러 돌연변이 포괄 16 bp 지역. 참조 조사 이었다 20 길이 위치 3에서 혈압 혈압 하류. 우리의 분석 결과 최적화 하려면 사용 하는 가장 자주 돌연변이 KRA 아미노산의 2를 포함 하는 셀 라인에서 추출한 DNA: G12V (c.35GT, SW480)와 G13D (c.38GA, HCT 116).
EGFR 이탈 분석 결과 EGFR exon 19의 모든 활성화 삭제에 대 한 검색 하도록 설계 되었습니다. 21의 참조 프로브를 함께 재발 삭제 된 영역 위에 25 bp 긴 드롭 프로브를 사용 하는 분석 결과 혈압, 31 위치 같은 amplicon 하류 bp. 우리는 EGFR 을 포함 하 여 cfDNA 참조 표준 집합을 사용 하는 우리의 분석 결과 최적화 하려면 exon 19 삭제 c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.
감도, 특이성 및 물방울 구름의 위치 제어 MUT 예제와 같이 그림 4A WT PBMC genomic DNA KRA에 대 한 정의 되어 있습니다. 우리 여러 유형의 단일 대체, 등 여러 대체 삭제 (그림 4B) 유전 변경 뿐만 아니라 다양 한 샘플 종류6에 작동 하는 이러한 유형의 분석 결과 입증 되었습니다.
그림 1: 이탈 ddPCR 필요 가수분해 올리고 프로브 핫스팟 지역의 모든 변이 검사의 독특한 쌍. 도식 결과 2 차원 분산형 플롯 보여주는 물방울 형광 강도 표시와 함께 디자인을 시험. (A) 기존의 ddPCR 돌연변이 (MUT 프로브)와 야생-타입 (WT 프로브) 프로브 정확한 동일한 지역 타겟팅. (B) 드롭 오프 ddPCR 참조 프로브를 (조사 1) 비 변수 영역에 anneals와 같은 amplicon 내 WT 시퀀스를 보완 하지만 돌연변이 지역 타겟팅 이탈 조사 (조사 2) 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 플라즈마 DNA 돌연변이 프로 파일링에 대 한 드롭 ddPCR 워크플로. 5 주요 단계 전체 워크플로 구성 됩니다: (A) (1) 프라이 머 및 프로브, (2) 분석 결과, (B) (3) 플라즈마 절연 및 cfDNA 추출, (4) ddPCR 실행 및 (C) (5) 데이터 분석의 최적화의 디자인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 드롭 ddPCR 분석. 드롭 오프 ddPCR 분석 워크플로 괜찮을 해야 하는 중요 한 매개 변수를 강조. 이렇게 하면 이상 값, 빈의 효율적인 자동된 식별, 비 또는 긍정적인 방울; MUT 또는 WT 방울을 할당 하 고 각 잘 MAF 컴퓨팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표적인 결과- KRA 와 EGFR 드롭 ddPCR 분석 실험. 드롭 ddPCR 분석 결과의 최적화 단계 동안 얻은 결과의 (A) 예. 100% MUT DNA, 5% MUT DNA와 100% WT DNA를 포함 하는 반응에서 야생-타입 DNA 돌연변이의 탐지. (B) 예 플라즈마 샘플 KRA 와 EGFR 분석의 감소 ddPCR exon KRA 와 EGFR exon 19에서에서 삭제 2에서에서 단일 뉴클레오티드 및 여러 대체의 탐지를 보여주는 분석 실험. 이 그림은 Decraene 그 외 여러분 에서 적응 되었습니다. 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
효율적인 감소 ddPCR 분석 결과, 디자인에 최적화는 중요 한, 그리고 프로토콜을 신중 하 게 따라야 합니다. 뇌관 및 프로브 각 조합의 고유 PCR 반응 효율이 있다. 따라서, 개별 분석 결과 신중 하 게 유효성을 검사할 컨트롤 샘플에 귀중 한 테스트 샘플에 사용 되 고 있다. 최적화 및 유효성 검사 증명 피크 신호 검출 및 특이성 및 감도 평가에 중요 하다. 프로토콜에 설명 된 대로 모든 돌연변이 "프로브 2"에 의해 보호 대상 지역에 있는 잠재적으로 심문 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 유효성 검사 것이 좋습니다 "프로브 2", 5' 또는 3' 끝에 있는 돌연변이 때문에 이러한 이탈 분석 결과의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.
여기에 제시 된 방법 FFPE 직물, 문화 또는 혈액 샘플에 있는 셀을 포함 하 여 "조직"의 모든 종류에서 추출 된 DNA와 함께 수행할 수 있습니다. 그러나, 핵 산 추출의 품질 ddPCR 결과 영향을 크게 수 있습니다. 헤 파 린, 단백질, 헤, 페 놀, 프로 테아 제, 콜라겐, 멜 라 닌, 세제 또는 소금 같은 PCR 억제제 샘플링과 정화 단계 동안 가능한 한 많이 제거 될 필요가 있다. DNA 샘플은 ddPCR에 PCR 억제제의 영향을 줄이기 위해 희석 수 있습니다, 비록 희석 반응 당 대상의 적은 복사본을 테스트 것입니다 때문에 감도 감소 합니다. 이 해야 될 고려 때의 감도 일정 수준에 도달 해야 복사본의 최소를 테스트 해야 합니다.
드롭 오프 ddPCR 분자 변경 (단일 및 다중 뉴클레오티드 대체, 삭제, 등)의 많은 종류에 적용할 수 있습니다. 두 개의 프로브를 사용 하 여 모든 변경 (따라서 실용성과 비용 효과 분석 결과의 증가)를 감지 하, 외 이탈 ddPCR 적은 배경 잡음6 를 생성 하 고 다중 분석 실험에 비해 증가 감도 보여줍니다. 또한, 단일 반응에서 수행 이후 환자 샘플의 최소한의 금액은 사용 됩니다. 이 분석 결과 ctDNA의 크기는 종종 이러한 샘플 때문에 액체 생의 맥락에서 특히 매력적입니다.
사실, 여기에 제시 된 방법 돌연변이 검사에 대 한 적용 액체 생 검 재료에 이며 이미 임상 연습 (ESR1 돌연변이 검사에서-1 임상 시험-NCT03079011)에 대 한 자사의 유틸리티 입증. 그러나, 그것은 cfDNA8의 조각화로 인해이 설정에서 가능한 한 짧게 amplicons를 사용 하 여 중요 한.
다운스트림 특성화 여전히 돌연변이 체 대립 유전자에 의해 수행 하는 정확한 돌연변이 식별 하기 위해 별도로 수행 해야 합니다. 그러나, 치료 결정 주로 핫스팟 지역 대상 oncogenes (WT vs 돌연변이)의 mutational 상태 기반으로, 돌연변이 즉시 식별 드롭 ddPCR 수 없으므로 그것은 강력한 진단 도구. 또한, 정확한 돌연변이 선험적으로 현재 상용 솔루션을 먹기에 분석 결과 디자인 알려져 필요가 없습니다. 또한, 드롭 ddPCRs 결합 수 있습니다 증가에 특정 기존의 ddPCR 분석 실험으로 돌연변이 (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 검사의 수 있습니다. 마지막으로, 드롭 오프 ddPCR 연구의 다른 분야에 적용할 수 있습니다. 특히, 그것 게놈 편집 실험에서 긍정적인 식민지를 심사를 위한 유용한 도구가 될 증명할 수 있습니다.
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Disclosures
몇몇 저자는 ctDNA 검출 관련 2 개의 특허 출원 (EP17305920.5, EP18305277.8)의 발명가 이름이 지정 됩니다.
Acknowledgments
이 작품은 인 퀴리 SiRIC (그랜트 잉카-DGOS-4654)에 의해 지원 되었다. 저자 또한 비디오에 그녀의 기여에 대 한 캐롤라인 Hego을 감사 하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
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- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
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