Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Abstract

Droplet דיגיטלי תגובת שרשרת פולימראזית (ddPCR) היא שיטה תגובת שרשרת (PCR) רגישה מאוד פולימראז כמותי המבוסס על מדגם fractionation לאלפי בגודל ננו תגובות בודדות מים בתוך שמן. לאחרונה, ddPCR הפך להיות אחד הכלים הכי מדויק ורגיש עבור מחזור הגידול זיהוי ה-DNA (ctDNA). אחת המגבלות הגדולות של הטכניקה ddPCR רגיל הוא מספר מוגבל של מוטציות יכולים להיות מוקרן לכל תגובה, כנדרש הגששים הידרוליזה ספציפי לזהות כל גירסה allelic אפשרי. מתודולוגיה חלופיים, ddPCR מסירה, מגדיל את התפוקה, מכיוון שהיא דורשת רק זוג אחד של הגששים כדי לזהות ולכמת באופן פוטנציאלי כל שינויים גנטיים באזור ממוקד. מסירה ddPCR מציג רגישות דומה ddPCR קונבנציונאלי מבחני עם היתרון של זיהוי מספר רב יותר של מוטציות בתגובה אחת. שזה חסכוני, חוסך חומר מדגם היקר, יכול לשמש גם ככלי גילוי כאשר מוטציות לא ידועים א-פריורי.

Introduction

אלפי סומאטית מוטציות הקשורות להתפתחות סרטן כבר דווח על¹. בין אלה, כמה סמנים חזוי יעילות של טיפול ממוקד ^2,3 , גנטית ההקרנה של מוטציות אלו היא עכשיו שגרתית הקלינית. הטכנולוגיה הדיגיטלית droplet PCR (ddPCR) יכול לשמש כדי לפקח על הנוכחות או העדר של מוטציות עם דיוק זיהוי גבוהה והוא מאוד תואם עם ביופסיות נוזלי לא פולשנית^4,5. עם זאת, מבחני ddPCR הנוכחי נועדו בעיקר כדי לזהות מוטציות ידוע א-פריורי. קשות, זה מגביל את השימוש ddPCR ככלי גילוי כאשר המוטציה לא ידוע. אכן, עיצוב ddPCR המקובלת, בדיקה הידרוליזה להכרת אלל פראי-סוג (WT העצמית) מתחרה עם בדיקה ספציפית להכרת אלל mutant (בדיקה MUT) (איור 1 א'). החללית עם זיקה גבוהה יותר hybridizes על תבנית ומשחרר שלה fluorophore, המציין את אופי אלל המתאימים. ניתן לאבחן את נתוני קרינה פלואורסצנטית השיג עבור כל droplet בחלקה פיזור המייצג את קרינה פלואורסצנטית הנפלטת את הגששים WT ו MUT בממדים שונים. ייצוג סכמטי של תוצאה אופיינית עבור assay ddPCR המקובלת מוצג איור 1A. בדוגמה זו, הענן הכחול מקביל טיפות המכילות אללים WT המזוהה על-ידי החללית WT, ואילו הענן האדום מקביל טיפות בו אלל MUT יש כבר מוגבר, מזוהה על ידי החללית MUT. תלוי בכמות הדנ א שטעון התגובה, טיפות חיובית כפולה המכילה amplicons WT והן MUT יכולים להופיע (ענן ירוק). ענן אפור בהיר מקביל טיפות ריק.

מאז רוב פלטפורמות לאפשר הגילוי של מספר מוגבל של fluorophores (בדרך כלל 2, אבל עד 5), התפוקה של ddPCR המקובלת היא מוגבלת. לכן, מיקוד באזורים בעלי מוטציות סמוכים מרובים דורשת תכנון טכנית מאתגר מבחני ddPCR מולטיפלקס או השימוש של מספר תגובות מיקוד כל מוטציה במקביל. האסטרטגיה ddPCR מסירה, מתגבר על מגבלה זו, כפי שעשוי להיות ניתן לזהות כל שינוי גנטי בתוך אזור היעד באמצעות זוג ייחודי של WT הידרוליזה הגששים. הכריכה בדיקה (בדיקה 1) הראשון שרצף שאינו משתנה, סמוך לאזור היעד המכשיר השני (המכשיר 2) הוא משלים הרצף WT של אזור היעד שבו מוטציות הם צפויים (איור 1B). בעוד החללית הראשונה מכמת את הסכום הכולל של המולקולות amplifiable של התגובה, המכשיר השני מפלה אללים WT ו MUT על ידי הכלאה תת אופטימלית כדי mutant רצפי. בדיקה 2 ניתן לזהות מספר סוגים של מוטציות בהיעד אזור (נוקלאוטיד בודד או מספר החלפות, מחיקה וכו ')⁶. כמו ddPCR רגיל, ענן אפור בהיר מקביל טיפות המכילה מולקולות DNA אין. חשוב לזכור כי בסוג זה של assay, ההפרדה אופטימלית של עננים WT ו MUT הוא תלוי כמות ה-DNA שטעון התגובה, שכן לא ניתן להבחין בין טיפות המכילות WT והן MUT אללים היעד של טיפות המכיל רק את WT טופס. לכן, וזמינותו זו דורשת רוב טיפות יכיל לא יותר מעותק אחד של הגן יישוב.

Protocol

פרוטוקול המובאת כאן מנחים את האתיקה של ובמכון קירי. כל הדגימות האנושי התקבלו מחולים שהשתתפו, לאחר הסכמה מדעת, בלימודים שאושרו על-ידי ועדת הבדיקה מוסדיים ב ובמכון קירי.

1. דם איסוף, אחסון פלזמה והפקת DNA ללא תא

הערה: DNA שחולצו מן סוג של "רקמה" יכול לשמש (למשל, פרפין טריים או פורמלדהיד-קבוע מוטבע (FFPE) רקמות, תאים בדגימות תרבות או דם). כאן, אנו מספקים הוראות מפורטות עבור איסוף דם, בידוד פלזמה, אחסון ללא תא מיצוי הדנ א (cfDNA).

1. דם איסוף ואחסון פלזמה (איור 2B)
   1. לאסוף דגימות דם 7 mL EDTA צינורות. שני צינורות מומלץ לאסוף בסביבות 4 מ ל פלסמה.
   2. Centrifuge צינורות 10 דקות ב x 820 גרם בתוך 3 שעות חוסר דם כדי להפריד בין תאי דם אדומים (RBC), כדוריות הדם הלבנות (WBC), פלזמה. הזמן בין הדוגמאות צנטריפוגה את חיוני להשגת איכות גבוהה cfDNA (קרי, cfDNA לא מזוהם עם ה-DNA שוחררו WBC).
   3. Pipet בקפידה תגובת שיקוע (פלזמה) באמצעות pipet 1 מ"ל מבלי לגעת השכבה WBC; בסביבות 2 מ ל פלסמה בדרך כלל התאוששו למחזור EDTA.
   4. הפלזמה להעביר צינורות 2 מ"ל, centrifuge את aliquots ב 16,000 x g 10 דקות-15 ° C כדי להסיר שאריות תאים.
   5. בזהירות pipet תגובת שיקוע (פלזמה) מבלי להפריע בגדר. להפיץ פלזמה 2 mL צינורות קריוגני ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שהוא נדרש.
2. cfDNA החילוץ (איור 2B)
   הערה: כאן, אנו מציגים את ההליך באמצעות ערכת חילוץ ידני. גרסה אוטומטית בעקבות הוראות היצרן יכול להתבצע גם לבידוד cfDNA.
   1. לשים µL 400 של Proteinase K לתוך צינור 50 מ. להוסיף 4 מ ל פלסמה (נפח בשימוש שגרתי) ו- mL 3.2 פירוק מאגר ה-ACL (מכיל µg 1.0 המוביל RNA) הערכה. לסגור את הצינור ומערבבים על ידי vortexing ב-30 s כדי להשיג פתרון הומוגני. דגירה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. להוסיף 7.2 מ של מאגר ACB (מתוך הערכה) lysate כדי למטב את הכריכה של חומצות גרעין במחזור למוח סיליקה ומערבבים על ידי vortexing עבור 15-30 ס Incubate הצינור עבור 5 דקות על קרח.
   3. למקם את העמודה ואת 20 מ ב- extender משאבת ואקום. סגור את עמדות שאינן בשימוש כדי לאפשר השאיפה ואקום.
   4. בזהירות החל את התערובת ACB lysate-buffer לתוך הצינור ב- extender (בקצרה צנטריפוגה הצינור לאיסוף המרבי של תערובת ACB lysate-buffer), להחליף את משאבת ואקום ולאפשר את lysate נמשך דרך העמודים לחלוטין. להסיר ולמחוק את הצינור ב- extender.
   5. µL 600 מאגר ACW1 חלות על העמודה. כאשר מאגר ACW1 משך באמצעות המדור, להוסיף 750 µL ACW2 מאגר ולהוסיף סוף סוף µL 750 של אתנול (96-100%). אז, במקום העמודה נקי mL 2 אוסף שפופרת, צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות לחסל אתנול.
   6. מקם את העמודה לתוך צינור חדש אוסף 2 מ"ל. פתח את המכסה, דגירה ב 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להתייבש הקרום לגמרי.
   7. מקם את העמודה לתוך צינור נקי mL 1.5 DNA קשירה נמוכה. בזהירות החלת 36 µL של מים נטולי RNase עם אזיד הנתרן 0.04% (מאגר AVE). סגור את המכסה, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
   8. צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) עבור 1 דקות elute חומצות גרעין ולאחסן ב-20 ° C עד שהוא נדרש.
3. cfDNA כמת
   הערה: cfDNA כמת מבוצע עם fluorometer באמצעות הפרוטוקול של היצרן מיד לאחר מיצוי או מפשיר את הדגימות בטמפרטורת החדר (RT), לפני השימוש. הימנע מספר מחזורים ההקפאה/ההפשרה.
   1. השתמש וזמינותו רגישות גבוהה לפי הכמות cfDNA הצפוי, אשר בדרך כלל פחות מ 100 ננוגרם למ"ל פלזמה. ריכוזי cfDNA נעות בין 2 – 10 ng/mL עבור התורמים בריא אבל יכול להיות גבוה ככל 100 ננוגרם למ"ל בחולים עם מחלה גרורתית.
   2. להבטיח ריאגנטים כל הינם RT ומערבבים µL 199 מאגר דילול fluorometer עם µL 1 של צבע (200 x) לכל תגובה (N מספר דוגמאות + 2 תקנים כדי לכייל את fluorometer) כדי לקבל את הפתרון עובד.
   3. מערבולת הפתרון cfDNA ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף תוכן בתחתית הצינורית.
   4. מיקס 5 µL של כל מדגם cfDNA עם µL 195 של הפתרון עובד.
   5. מיקס 10 µL של כל תקן עם µL 190 של הפתרון עובד.
   6. מערבולת באופן יסודי את כל צינורות עבור 2-3 s להבטיח הומוגניות בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף תוכן בחלק התחתון של הצינורות.
   7. דגירה-RT למשך 2 דקות בחושך.
   8. לקרוא את צינורות fluorometer, באמצעות מצב הפלט ' ng/µL'
   9. לחשב את הריכוז הסופי ב- ng/mL של פלזמה כדלקמן: ng/µL x 36 (נפח של cfDNA eluate) / 4 (נפח של פלסמה חילוץ).

2. ddPCR בדיקה ועיצוב פריימר (איור 2 א)

הערה: ההגברה של המולקולות יישוב של מסירה ddPCR וזמינותו בעקבות עקרונות דומים של qPCR. כל פריימר המכשיר מתוכנן עם התוכנה ייעודי קונבנציונלי Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. העיצוב תחל
   1. בחלון הגדרות כלליות, לשנות 'ריכוז של קטיונים דו ערכיים' ל 3.8, 'ריכוז dNTPs' 0.8, ' mispriming/חזור לספריה ' לאורגניזם הנכון.
   2. בחלון הגדרות מראש, לשנות של 'שולחן של פרמטרים תרמודינמי' וגם 'ריכוז המלחים הנוסחה' סנטה לוסיה 1998.
   3. לבחור T_m בין 55 ל 70 מעלות C (עם 50 מ"מ עבור ריכוז מלח ו- 300 nM ריכוז oligonucleotide).
   4. בדוק יחודיות של תחל בכלים כגון PrimerBlast.
   5. להימנע אזורים בעלי מבנים משניים.
   6. לבחור רצף של תוכן GC של 50 – 60%.
   7. למנוע חזרה של Gs ו Cs יותר מ 3 בסיסים.
   8. לבחור תחל עם Gs ו Cs 3' בסוף כאשר הדבר אפשרי.
   9. ודא כי 3' קצוות תחל לזווג אין משלימים את החסר משמעותי להימנע פריימר-הדימרים. Amplicons אמור להיות קטן יותר 150 bp להגביר יעילות cfDNA (אומר גודל הוא 170 bp⁸) ו- DNA שחולצו מן FFPE, אשר לעיתים קרובות פיצול קבצים.
2. עיצוב המכשיר
   הערה: הידרוליזה הגששים מסומנות עם עיתונאי פלורסנט בקצה 5' ו כ'חטיף בקצה 3'. הן מספקות ירידה לפרטים גבוה, יחס אות לרעש גבוה ולאפשר ריבוב במידת הצורך. שני ערוצים droplet הקוראים תואמים עם צבעי FAM ו HEX או ויק, כמו גם ניתוח של המשפחה/HEX או FAM/ויק מצמידים הגששים.
   1. עיצוב הידרוליזה הגששים משלים הרצף WT של אזור היעד ואת האזור משתנה-שאינם סמוכים.
   2. לבחור הגששים שניהם ממוקמים במרחק אמפליקון שהוגדרו על-ידי הזוג פריימר קודם לכן תוכנן. פריימר רצפים אינם יכולים להיות חופפים עם הרצפים בדיקה, למרות שהם יכולים לשבת אחד ליד השני.
   3. לבחור סטרנד זאת יש Cs יותר מאשר Gs. הגששים חייב להיות תוכן GC של 30-80%.
   4. בחר הגששים שבין נוקלאוטידים 13 ו 30 אורך. הגששים יותר נוטים להציג פלורסצנטיות רקע גבוה יותר כי המרחק בין את fluorophore את כ'חטיף משפיע שכבתה של הכתב fluorophore.
   5. בחר T_m הגששים להיות 3 עד 10 ° C גבוה יותר מאשר T_m תחל כדי להבטיח בדיקה הידרוליזה במהלך פריימר חישול וסיומת. משפרי_m T מומלץ להגיע T_ז הנדרש תוך שמירה על המכשיר קצר, כמו הגששים קצר יותר להפלות גרסאות נוקלאוטיד יחיד ביעילות רבה יותר. הגששים לא צריך G בקצה 5' כי זה מרווה את האות פלורסצנטיות גם לאחר הידרוליזה.
   6. עיצוב מסירה הגששים כדלקמן: 5'-(VIC) -WT משלימים, רצף האזור מוטציה-(MGB NFQ)-3' והפניה בדיקה כמו: 5'-(6-FAM) -משלימה רצף של אזור שאינו משתנה--(MGB NFQ)-3'. שילובים אחרים של הכתב/כ'חטיף הינן גם אפשריות.

3. אופטימיזציה של ddPCR התגובה (איור 2 א)

הערה: פקדי ה-DNA פראי-סוג של מוטציה המשמשים בשלב זה ניתן לקבל שורות תאים, דגימות הגידול או סטנדרטים זמינים מסחרית דנ א, לדוגמה.

1. מבצע של PCR המקובלת הצנטרפוגה תרמי באמצעות התכונה הדרגתיות תרמית כדי לאמת את ייחודה של המוצר PCR מוגבר על ידי תחל תוכנן.
   1. להכין תערובת ייחודית של תגובת ה-PCR כפי שמתואר להלן בשלב 4.1 (ללא הגששים) על תבנית שליטה DNA פראי-סוג מינימום של 8 תגובות יש תגובה אחת לפחות לכל טמפרטורה.
   2. הפעל הגברה באמצעות התוכנית שתואר שלב 4.3.2 ומגוון רחב של טמפרטורות מחזק סביב הטמפרטורה מחזק תיאורטי של תחל.
   3. לטעון את ה-PCR מוצרים ב- 3% agarose ג'ל כדי לבחור עבור חישול טמפרטורות ומספקת מוצרים ספציפיים.
2. לבצע סדרה של ddPCRs מסירה באמצעות הפרמטרים המתוארים לעיל אבל הפעם כולל שני רגשים.
   1. להשתמש DNA WT 100%, 100% MUT DNA ו תערובת של WT MUT DNA (למשל, 50% MUT/50% WT) כדי לקבוע את התנאים הטובים ביותר להפרדה ברורה של WT ו MUT עננים droplet.
   2. בחר טווח טמפרטורות מחזק מעל הטמפרטורה שבחרת בשלב 4.1.
   3. בחר את הטמפרטורה מחזק אשר מאפשר זיהוי ספציפי של WT או MUT אותות בעת שימוש DNA WT 100% או 100% MUT DNA והפרדה הטוב ביותר של עננים droplet WT ו MUT.
   4. חישול ריכוז וזמן פריימר/בדיקה יכולה גם להיות מותאם כדי לשפר את ההפרדה של עננים וכדי להקטין את מספר טיפות עם פלורסצנטיות ביניים (אפקט גשם).
3. להעריך את הרקע או הגבלה של ריק (LOB) של וזמינותו.
   1. לבצע מינימום של 48 תגובות ddPCR מסירה אישית עם פקד WT הדנ א באמצעות פרמטרים מחזק ריכוזים תחל/רגשים נבחר ב 3.2.
   2. עבור כל תגובה, לחשב את תדירות אלל mutant (MAF) כדלקמן: (מספר מוטציות טיפות/מספר טיפות מלא) x 100.
      הערה: ה-LOB הוא הגדיר את הממוצע MAF חיובי-false ומקושרת SD שממנו מחושב מרווח הביטחון 95% (95% CI). איוב = (ממוצע של חיובי-false MAF) + 95% CI.
4. להעריך את הגבול של זיהוי (לוד) וזמינותו.
   1. לבצע מסירה ddPCR תגובות באמצעות דילולים טורי של ה-DNA MUT ב- DNA WT, עם MAFs ועד 5% 0.01% (≥ 8 משכפל לכל תנאי). השתמש ריכוזים פרמטרים וזונדים/תחל מחזק נבחר ב 3.2.
      הערה: לוד מוגדר הערכים MAF הקטן ביותר שעבורו משכפל לממוצע הנוכחי ו- SD מעל ה-LOB (ראה Decraene. et al. ⁶ לפרטים נוספים).

4. ddPCR פרוטוקול (איור 2B)

הערה: ddPCR הדומה קונבנציונאלי, פרוטוקול מסירה ddPCR מורכב מ 4 שלבים: (i) PCR לערבב הכנה, (ii) droplet הדור, הגברה (iii) PCR (iv) קירור והקפאה.

1. הכנת תערובת PCR
   1. נקטו סטנדרטיים, כגון כפפות, באמצעות ברדס PCR נקי, נקי פיפטות RNase, DNase מזוקקים מים כדי למנוע זיהום.
   2. להפשיר, equilibrate את הרכיבים התגובה-RT.
   3. להכין 20 x תחל/רגשים לערבב במים מזוקקים, עם תחל ב 18 מיקרומטר וזונדים ב 5 מיקרומטר.
   4. עבור כל תגובות PCR בודדים, להכין תערובת לדוגמה על ידי שילוב של 2 x ddPCR supermix (10 μL), µL 1 של 20 x מיקס תחל/רגשים ועד 10 ng DNA מדגם qsp 20 µL של מים מזוקקים.
   5. מערבולת התגובה לערבב ביסודיות כדי להבטיח הומוגניות, בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף תוכן בתחתית השפופרת לפני dispensing. אל תהססו כדי לחזור על שלב זה עבור כל תערובת התגובה לפני השימוש.
2. Droplet דור
   1. הכנס את מיכל הדיו ddPCR בעל וטען μL 20 של תערובת התגובה המכיל דוגמאות לתוך הבארות האמצעי של מיכל הדיו לדור droplet (ירוק בתפקידים איור 2B) באמצעות פיפטה של ערוץ 8.
   2. להוסיף 70 μL של שמן מחולל droplet לתוך הבארות התחתון (עמדות צהוב).
   3. הכנס את מיכל הדיו, עם אטם, בגנרטור droplet; טיפות יופק הבארות העליון של המחסנית (עמדות כחול).
   4. האחות, לוותר על אט ובעדינות (כדי למנוע הטיה) μL 40 של טיפות מכלי לתוך צלחת PCR 96-ובכן. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לייעל את העברת טיפות.
3. PCR-הגברה
   1. חותם את הצלחת ה-PCR הסופי עם רדיד אלומיניום באמצעות סילר לאיטום של צלחת מיד לאחר העברת טיפות כדי למנוע התאיידות. Centrifuge בקצרה את הצלחת לאסוף תוכן בתחתית הבארות.
   2. לרוץ עם הגברה PCR המקובלת על הצנטרפוגה תרמי באמצעות התוכנית הבאה: 95 מעלות 10 דקות, 40 מחזורי [94 ° C 30 s, מאומת מחזק T ° 60 s], 98 מעלות 10 דקות (שיפוע 2.5° C/s). לכלול פקדים עם אין DNA קלט ו DNA פראי סוג (≥ 3 משכפל) כל הפעלה.
   3. כאשר ההפעלה הושלם, centrifuge בקצרה את הצלחת לאסוף תוכן בתחתית הבארות.
4. חדרי קירור והקפאה
   1. לאחר הגברה PCR, להשתמש בקורא droplet כדי הספירה PCR-חיוביים של טיפות PCR שלילי, ההוראות של היצרן.
      הערה: הקורא droplet מציע בדרך כלל מערכת זיהוי אופטי של שני צבעים תואמים fluorophores FAM, ויק או משושה.

5. נתונים ניתוח (2C איור , איור 3)

הערה: טיפות PCR חיובי ו- PCR שלילי נספרים לספק כימות מוחלטת את MUT, של אללים WT ב אזור ממוקד. טיפות שהוקצו משמשים לחישוב את MAF כל היטב. כימות droplet וניתוח של מסירה מבחני יכול להתבצע באמצעות החבילה ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) שפותח על ידי אטלי ועמיתיו^9,10. חבילה זו R מסווג באופן אוטומטי טיפות כחלק ריק, "הגשם" (בגלל ההגברה לא יעיל), או בתור מילוי עם קליטה מאוד חיובי (איור 3). הסעיף הבא מציג את השלבים השונים של הניתוח הוא גרסה קצרה של פינות כהות תיאוריים של האלגוריתם נכתב על ידי המחברים (ראה https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ אלגוריתם. Rmd לפרטים נוספים). נתונים לייצא קבצי ערכים מופרדים באמצעות פסיק (FileName_Amplitude.csv), שהועלו בחבילה ddPCR כדי להיות מנותח ישירות ב- R או באמצעות ממשק אינטרנט ייעודי.

1. פרמטר התאמות
   הערה: לכל עיצוב assay מסירה תוצאות בהתפלגויות droplet הסופי ספציפיים, וריאציות של הטופס ענן, הפרדות או עמדות צפוי. כדי להבטיח יעילות ניתוח אוטומטיות, סט של פרמטרים צריך להיות מותאם. אם טוב יש פרופיל לא צפוי, זה עלול לגרום הניתוח של צלחת מלאה להיכשל, וכתוצאה מכך הודעת שגיאה. בעייתי טוב יצטרך להיות ולהסרה מניתוח אוטומטי.
   1. לזהות בארות שנכשלו באמצעות (REMOVE_FAILURES). השתמש TOTAL_DROPS_T (ערך ברירת המחדל הוא 5,000) כדי להתאים את מספר מינימלי של טיפות כל היטב. השתמש EMPTY_LAMBDA_LOW_T (ערך ברירת המחדל הוא 0.3) ו EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (ערך ברירת המחדל הוא 0.99) כדי להתאים את המדדים להעריך את העננים droplet הצפוי (ריק, MUT, WT) והאיכות שלהם.
      הערה: יש טיפות ריק מדי הוא סימן שלא היה מספיק amplifiable תבנית בהתגובה.
   2. זיהוי טיפות חריג חשוד טעות באמצעות (REMOVE_OUTLIERS). השתמש TOP_PERCENT (ברירת המחדל היא p = 1%) להתאמת האחוזים העליונים p של טיפות בעל הערך האות הגבוה ביותר בכל ממד אות (FAM, ויק/HEX) מחוץ טיפות בצלחת כולו. השתמש CUTOFF_IQR (ברירת המחדל היא 5) כדי להתאים את סף חריג חשוד טעות העליון p אחוזים האות הגבוה ביותר.
   3. זיהוי טיפות ריקה באמצעות (REMOVE_EMPTY). השתמש CUTOFF_SD (ברירת המחדל היא 7) כדי להתאים את סטיית התקן של ההתפלגות Gaussian (טיפות ריק) נמוכה יותר של ערכי בדיקה 1.
   4. טיפות השער באמצעות (CLASSIFY). השתמש CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (ברירת המחדל היא 3) כדי להתאים את סטיית התקן של ההתפלגות Gaussian (מלא טיפות) גבוה יותר של ערכי בדיקה 1. השתמש ADJUST_BW_MIN (ברירת המחדל היא 4) ו- ADJUST_BW_MAX (ברירת המחדל היא 20) כדי להתאים את הפרמטרים k_min ו- k_max כדי להעריך את צפיפות הליבה של ערכי בדיקה 2 ולהבחין את MUT והענן WT של טיפות.
      1. השתמש SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (ברירת המחדל היא p = 1%) ו SIGNIFICANT_P_VALUE (ברירת המחדל היא ברמת מובהקות s=0.01%) כשידור בארות או מוטציה או wildtype.
         הערה: אלגוריתם זה, מוטציה טוב מוגדר כבעל MAF סטטיסטית משמעותית גבוה יותר p %.
2. ניתוח אוטומטיות
   הערה: עבור כל פרמטר שהוצגו בסעיף זה, המחברים של החבילה ddPCR R יש ערכי ברירת מחדל המוצע מבוסס על המומחיות שלהם ואת הנתונים שלהם. עם זאת, ניתן לשנות כל הפרמטרים כדי להגדיל את האיכות של הניתוח (איור 3).
   1. לזהות בארות שנכשלו.
      1. השתמש ארבעה מדדים בקרת איכות (הגדרות: REMOVE_FAILURES) כדי לזהות בארות נכשל; הראשון הוא המספר המינימלי של טיפות טוב צריך להכיל. שלושת האחרים להתמקד בזיהוי אוכלוסיות המועמד חוקי עבור ריק, אולי FAM + ו- HEX + / ויק + טיפות. הסר בארות אשר אינם עונים על קריטריונים אלה מניתוח במורד הזרם.
   2. לזהות את טיפות חריג חשוד טעות.
      1. כדי למנוע הטיית droplet gating, להסיר ליניאריים (קרי, טיפות עם ערך הקסדצימאלי/ויק או FAM גבוהות באופן חריג) ניתוח נוסף על-ידי הגדרת על סף גבול עליון (הגדרות: REMOVE_OUTLIERS).
   3. זיהוי טיפות ריק.
      1. לזהות טיפות ריק כדי להפחית את הממד של הנתונים (ב באר אופייני, הם יעבור לחשבון עבור רוב טיפות) ולחסל הטיה סטטיסטית בשל נוכחותם של חלק גדול של מידע חסר תועלת כמו טיפות המכילות רק תבנית נשארים ( הגדרות: REMOVE_EMPTY).
   4. לבצע droplet gating.
      1. לסווג את טיפות הנותרים מוטציה, wildtype או גשם (הגדרות: לסווג).
   5. זיהוי טיפות הגשם.
      1. כמו טיפות הגשם כתוצאה הגברה לא יעיל, לא לכלול FAM + או משושה + / ויק + עננים. לקבוע גבולות שלהם אשכולות באמצעות ערכי בדיקה 1 שלהם (הגדרה: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. זיהוי המוטציה לעומת טיפות פראי-סוג.
      1. גולת הכותרת של הניתוח הוא אפליה בין תבניות מוטציות ובני wildtype, לזהות כל טיפות הנותרים בשלב זה אחד או אחר. מאז הם צריכים ערכי בדיקה 1 דומים, להשתמש בערכי בדיקה 2 בצורה הטובה ביותר לנבא את הטבע בהתאמה שלהם (הגדרות: ADJUST_BW_MIN ו- ADJUST_BW_MAX).
   7. כשידור בארות החשבונאי לעומת פראי-סוג.
      1. לאחר קביעת אילו טיפות MUT הינם WT, לחשב את MAF. באמצעות את תדירות מוטציה והערך המשויך p-של כל טוב, זה אפשרי לסווג אותם (הגדרות: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) WT (מכיל בעיקר WT טיפות) או בארות MUT (המכיל מספר משמעותי סטטיסטית של MUT טיפות).
3. לחקור ולייצא את הנתונים
   1. לחקור, לייצא את הנתונים מספר טיפות, ליניאריים, טיפות ריק, ריכוז או גרפים הניתנים להתאמה אישית נוספת לייצוג אופטימלית.

Representative Results

במחקר הוכחה הרעיון, קראס אקסון 2 מוטציות (codons 12 ו 13) ומחיקות EGFR אקסון 19 נחקרו FFPE רקמות ו פלזמה דגימות חולי סרטן באמצעות אסטרטגיה ddPCR⁶מסירה.

המכשיר מסירה קראס חקרו אזור bp 16 המקיף מספר מוטציות ב אקסון 2 של הגן קראס , אשר הנמל יותר מ 95% של מוטציות קראס ידוע סרטן אנושיים¹¹. החללית ההפניה היה 20 bp ב אורך ו-3 bp במורד הזרם. כדי למטב את assay שלנו, השתמשנו DNA מופק שורות תאים המכילים 2 חומצות אמינו קראס מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר: G12V (c.35GT, SW480), G13D (c.38GA, של HCT 116).

EGFR מסירה וזמינותו תוכנן כדי לסרוק ולאתר כל הפעלת מחיקות של EGFR אקסון 19. וזמינותו המשמש מכשיר בדיקה מסירה bp באורך 25 הניח על האזור שנמחקו חוזרים ונשנים יחד עם מכשיר בדיקה הפניה של 21 bp, הממוקם 31 bp במורד הנהר ב- אמפליקון אותו. כדי למטב את assay שלנו, השתמשנו cfDNA התייחסות ערכה רגילה כולל את EGFR אקסון 19 מחיקת c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

רגישות, ירידה לפרטים ומיקום של עננים droplet הוגדרו ועם שליטה MUT דגימות DNA גנומי WT PBMC, כפי שמוצג באיור 4A עבור קראס. אנחנו עוד הוכיח כי סוג זה של assay עובד על מספר סוגים של שינויים גנטיים כגון החלפת יחיד, מספר החלפות או מחיקות (איור 4B) כמו גם על סוגים שונים של מדגם⁶.

איור 1: ddPCR מסירה נדרש זוג ייחודי הידרוליזה oligo-הגששים לסרוק כל המוטציות של אזור חמה. Assay עיצובים עם תוצאה סכמטית שיוצג מתווה דו מימדי פיזור עוצמת קרינה פלואורסצנטית droplet בסה כ מציג. (א) ddPCR קונבנציונאלי עם מוטציה (בדיקה MUT) וזונדים פראי-סוג (WT העצמית) פילוח מדויק באותו האזור. DdPCR (B) המשלוח מכיל בדיקה הפניה (בדיקה 1) זה anneals לאזור שאינו משתנה-בדיקה מסירה (המכשיר 2) פילוח האזור מוטציה משלים הרצף WT, בתוך אמפליקון אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: מסירה ddPCR זרימת עבודה עבור פלזמה מוטציה פרופיל הדנ א. זרימת העבודה המלא מורכב 5 שלבים עיקריים: (א) (1) עיצוב של תחל ואת הגששים, (2) אופטימיזציה של assay, (B) (3) פלזמה בידוד, cfDNA החילוץ, (4) ddPCR להפעיל ניתוח נתונים (5) (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: ניתוח ddPCR מסירה. מסירה ddPCR ניתוח זרימת סימון פרמטרים חשובים שצריכים להיות מכויל. פעולה זו מבטיחה זיהוי אוטומטי יעילה של ליניאריים, ריק, בגשם או טיפות חיובי; הקצאת טיפות MUT או WT ומיחשוב את MAF במשך כל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: נציג תוצאות - קראס ו- EGFR מסירה ddPCR מבחני. (א) דוגמה של תוצאות שהתקבל במהלך השלבים אופטימיזציה של מסירה ddPCR וזמינותו. גילוי המוטציה ו/או פראי-סוג DNA בתגובה המכילה DNA MUT 100%, 5% MUT DNA ו 100% WT DNA. (B) דוגמאות של דגימות פלסמה ניתח את קראס , של EGFR מבחני מסירה ddPCR מציג את הגילוי של נוקלאוטיד יחיד ותחליפי מרובים ב אקסון 2 קראס , מחיקה ב אקסון EGFR 19. איור זה כבר ממאמרו של. Decraene et al. ⁶. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כדי לעצב assay ddPCR יעילה מסירה, אופטימיזציה הוא מכריע, הפרוטוקול צריך להתבצע בזהירות. כל שילוב של צבעי יסוד וזונדים יש יעילות התגובה הייחודי של ה-PCR. לפיכך, וזמינותו הפרט חייב לאשר בקפידה על דגימות הבקרה לפני בשימוש על ערך הבדיקה דוגמאות. אופטימיזציה ובדיקת חשובים לאשר את שיא אות זיהוי והערכת ירידה לפרטים ורגישות. כמפורט בפרוטוקול, יכול כל המוטציות ממוקם באזור היעד מכוסה על ידי "החללית 2" פוטנציאל להיחקר. למרות זאת, אימות מומלצת מוטציות ממוקם בקצה 5' או 3' של "בדיקה 2", שכן אלה עלולים להשפיע על יעילות וזמינותו מסירה.

השיטה המוצגת כאן יכול להתבצע עם ה-DNA שחולצו מן סוג של "רקמה", כולל FFPE רקמות, תאים בדגימות תרבות או דם. עם זאת, האיכות של החילוץ חומצת גרעין עלולה באופן דרמטי על תוצאות ddPCR. PCR מעכבי כמו הפארין, חלבונים, heme, פנול, פרוטאזות, קולגן, מלנין, דטרגנטים או מלחי צריך לסלק ככל האפשר במהלך הדגימה והשלבים טיהור. למרות דגימות די אן איי יכולים לדלל כדי להפחית את ההשפעה של מעכבי ה-PCR-ddPCR, דילול מקטין את רגישות כי פחות עותקים של היעד ייבדק לכל תגובה. זה צריך לקחת בחשבון כאשר רמה מסוימת של רגישות עומד להגיע, כמו מינימום של עותקים חייב להיבדק.

ניתן להחיל מסירה ddPCR לסוגים רבים של שינויים מולקולריים (החלפות נוקלאוטיד מרובות, מחיקות, וכו '). מלבד השימוש רק שני רגשים כדי לזהות כל שינוי (ובכך מגדיל המעשיות וחסכון של וזמינותו), מסירה ddPCR מייצר פחות רעש רקע⁶ ומראה לרגישות מוגברת בהשוואה מבחני מולטיפלקס. בנוסף, מאז זה מבוצע בתגובה יחיד, צורכים כמויות מינימליות של דגימות החולה. Assay הזה הוא מושך במיוחד בהקשר של נוזלי ביופסיה כי כמות ctDNA לעתים קרובות נמוכה בדגימות אלה.

ואכן, השיטה המובאת כאן היא ישימה להקרנה מוטציה בחומר נוזלי-ביופסיה, כבר הוכיח את השירות שלה עבור התמחות קלינית (הקרנה מוטציהESR1 בניסוי הקליני PADA-1 - NCT03079011). עם זאת, חשוב להשתמש amplicons קצר ככל האפשר בהגדרה זו בגלל חלוקת cfDNA⁸.

אפיון במורד הזרם עדיין צריך להתבצע בנפרד כדי לזהות את המוטציה המדויק שישאו אללים mutant. עם זאת, כי החלטות טיפוליות מבוססות בעיקר על המצב mutational של נקודה חמה מחוזות targetable oncogenes (WT לעומת מוטציה), היכולת של מסירה ddPCR מיד לזהות מוטציות הופכת כלי אבחון רב-עוצמה. יתר על כן, המוטציה המדויק אינו צריך ידועה אפריורי לעיצוב של assay כהבחנה פתרונות מסחריים הנוכחי. בנוסף, מסירה ddPCRs יכול להיות משולב עם מבחני ddPCR המקובלת ספציפיים כדי להגדיל עוד יותר את מספר מוטציות איבחון (נתונים לא מוצג). לבסוף, ניתן להחיל מסירה ddPCR לשדות אחרים של מחקר. בפרט, היא עשויה להיות כלי שימושי עבור הקרנת מושבות חיוביות בניסויים העריכה הגנום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer