Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å nøyaktig kvantifisere flere genetiske endringer av målet regionen i en enkelt reaksjon drop-off ddPCR og en unik par hydrolyse sonder.

Abstract

Slippverktøy digital polymerasekjedereaksjons (ddPCR) er en høylig følsom kvantitative polymerase kjedereaksjon (PCR) metode basert på prøve fraksjoneres til tusenvis av nano-størrelse vann-i-olje personlige reaksjoner. Nylig har ddPCR blitt en av de mest nøyaktige og følsom verktøyene for sirkulerende svulst DNA (ctDNA) oppdagelsen. En av de store begrensningene av standard ddPCR teknikken er begrenset antall mutasjoner som kan bli vist per reaksjon, som bestemt hydrolyse sonder anerkjenne hver mulig allel versjon kreves. En alternativ metode, drop-off-ddPCR øker gjennomstrømning, siden det krever bare et enkelt par sonder for å oppdage og kvantifisere potensielt alle genetiske endringer i regionen målrettet. Drop-off ddPCR viser sammenlignbare følsomhet til konvensjonelle ddPCR analyser med fordelen av å oppdage flere mutasjoner i en enkelt reaksjon. Det er kostnadseffektivt, sparer dyrebare utvalget materialet og kan også brukes som et funn verktøy når mutasjoner ikke er kjent en priori.

Introduction

Tusenvis av somatiske mutasjoner knyttet til hudkreft har vært rapportert¹. Blant disse, noen er prediktiv markører av effekten av målrettet terapi ^2,3 og genetiske screening av disse mutasjoner er nå rutinemessige klinisk praksis. Slippverktøy digital PCR (ddPCR) teknologien kan brukes til å overvåke for tilstedeværelse eller fravær av mutasjoner med høy oppdagelsen nøyaktighet og er høyst kompatibel med ikke-invasiv flytende biopsier^4,5. Imidlertid er gjeldende ddPCR analyser hovedsakelig laget for å oppdage mutasjoner kjent en priori. Dette begrenser sterkt bruk av ddPCR som et funn verktøy når mutasjon er ukjent. Faktisk i tradisjonell ddPCR design konkurrerer en hydrolyse sonde erkjenner det vill-type allelet (WT sonde) med en bestemt sonde erkjenner det muterte allelet (MUT sonde) (figur 1A). Sonde med høyere affinitet arten i malen og utgivelser sin fluorophore, som indikerer det tilsvarende allelet. Fluorescens dataene innhentet for hver dråpe kan visualiseres i et spredningsdiagram som representerer fluorescens slippes ut av WT og MUT sonder i ulike dimensjoner. En skjematisk fremstilling av en typisk resultat for en konvensjonell ddPCR analysen er presentert i figur 1A. I dette eksemplet tilsvarer blå skyen dråpestørrelse inneholder WT alleler identifisert av WT proben, mens røde skyen tilsvarer dråper der MUT allelet har blitt forsterket og identifisert av MUT sonden. Avhengig av antall DNA i reaksjonen, kan dobbel positiv dråpestørrelse inneholder både WT og MUT amplicons vises (grønn Sky). Lys grå skyen tilsvarer tom dråper.

Siden de fleste plattformer tillater påvisning av et begrenset antall fluorophores (vanligvis 2, bortsett fra til 5), er gjennomstrømningen av konvensjonelle ddPCR begrenset. Derfor krever målretting med flere tilstøtende mutasjoner utformingen av teknisk utfordrende multiplex ddPCR analyser eller bruk av flere reaksjoner målretting hver mutasjon parallelt. Drop-off ddPCR strategi, seirer denne begrensningen som det kan potensielt oppdage eventuelle genetiske endringer innenfor et mål område med en unik WT hydrolyse sonder. Første sonde (sonde 1) dekker en ikke-variabel sekvens, målregion og andre sonden (sonde 2) er utfyllende til WT sekvensen av målregion der mutasjoner er forventet (figur 1B). Mens den første romsonden kvantifiserer totalbeløpet for amplifiable molekyler i reaksjonen, diskriminerer andre proben WT og MUT alleler av sub-optimale hybridisering i mutant sekvenser. Sonden 2 kan identifisere flere typer mutasjoner i målet regionen (ett eller flere nukleotid erstatninger, sletting, etc.)⁶. Som vanlig ddPCR tilsvarer lys grå skyen dråpestørrelse inneholder ingen DNA molekyler. Det er viktig å huske at i denne analysen, optimal separasjon av WT og MUT skyer er avhengig av antallet DNA lastet i reaksjonen, siden dråpestørrelse inneholder både WT og MUT målet alleler ikke kan skilles fra dråpestørrelse inneholder bare WT skjemaet. Derfor krever denne analysen at de fleste dråpestørrelse inneholder mer enn én kopi av målrettet genet.

Protocol

Protokollen presenteres her følger etiske retningslinjene Institut Curie. Alle menneskelige prøver ble innhentet fra pasienter registrert, etter samtykke, i studier godkjent av institusjonelle Review Board på Institut Curie.

1. blod samling, Plasma lagring og Cell-free DNA utvinning

Merk: DNA utvunnet fra alle typer "tissue" kan brukes (f.eks friske eller formaldehyd-fast parafin embedded (FFPE) vev, celler i kultur-eller blod). Her gir vi detaljerte instruksjoner for blod samling, plasma isolasjon og lagring og celle-gratis DNA (cfDNA) utvinning.

1. Blod samling og plasma (figur 2B)
   1. Samle blodprøver i 7 mL EDTA rør. To rør anbefales å samle rundt 4 mL plasma.
   2. Sentrifuge rør i 10 min 820 x g i 3t av blod trekningen skille røde blodlegemer (RBC), hvite blodlegemer (WBC) og plasma. Tiden mellom prøvetaking og sentrifugering er avgjørende for å få høy kvalitet cfDNA (dvs. cfDNA ikke forurenset med DNA fra WBC).
   3. Nøye Pipetter nedbryting (plasma) ved hjelp av en 1 mL Pipetter uten berørende det WBC laget. rundt 2 mL plasma er vanligvis utvinnes per EDTA rør.
   4. Overføre plasma til 2 mL rør og sentrifuge dele 16.000 x g i 10 min på 15 ° C fjerne celle rusk.
   5. Nøye Pipetter nedbryting (plasma) uten å forstyrre pellet. Distribuere plasma i 2 mL kryogene rør og lagre på-80 ° C inntil nødvendig.
2. cfDNA utvinning (Figur 2B)
   Merk: Her presenterer vi prosedyren bruker manuell utvinning kit. En automatisert versjon etter produsentens instruksjoner kan også utføres cfDNA isolering.
   1. Sette 400 µL proteinasen k i en 50 mL tube. Legge til 4 mL plasma (volum rutinemessig brukes) og 3.2 mL lyseringsbuffer ACL (inneholder 1.0 µg carrier RNA) fra kit. Lukk røret og bland ved vortexing for 30 å få en homogen løsning. Ruge på 60 ° C i 30 min.
   2. Legge til 7,2 mL bufferen ACB (fra kit) i det lysate å optimalisere binding av sirkulerende nukleinsyrer til silica membranen og bland ved vortexing for 15 – 30 s. Incubate røret i 5 min på is.
   3. Plass kolonnen og 20 mL Extender-enheten i vakuumpumpe. Lukk ubrukte posisjoner for å tillate vakuum aspirasjon.
   4. Forsiktig bruk lysate-buffer ACB blandingen inn i røret extender (kort sentrifuge røret for å samle maksimal lysate-buffer ACB blanding), slå på vakuumpumpe og la den lysate skal trekkes gjennom kolonnene helt. Fjerne og slette tube Extender-enheten.
   5. Bruke 600 µL av buffer ACW1 kolonnen. Når bufferen ACW1 har trukket gjennom kolonnen, legge til 750 µL Buffer ACW2 og til slutt legger 750 µL av etanol (96-100%). Deretter plassere kolonnen i en ren 2 mL samling rør og sentrifuger i full fart (20 000 x g) for 3 min å eliminere etanol.
   6. Plass kolonnen i en ny 2 mL samling rør. Åpne lokket og ruge på 56 ° C i 10 min å tørke membranen.
   7. Plass kolonnen i en ren 1,5 mL DNA lav bindende rør. Forsiktig gjelde 36 µL RNase-gratis vann med 0,04% Natriumazid (buffer AVE). Lukk dekslet og ruge ved romtemperatur for 3 min.
   8. Virvel i full fart (20 000 x g) for 1 min elute nucleic syrer og lagre på 20 ° C til nødvendig.
3. cfDNA kvantifisering
   Merk: cfDNA kvantifisering utføres med en fluorometer bruker produsentens protokollen umiddelbart etter uttrekking eller tining prøvene ved romtemperatur (RT), før bruk. Unngå flere fryse/tine sykluser.
   1. Bruk høy følsomhet analysen i henhold til forventet cfDNA antallet som er vanligvis mindre enn 100 ng/mL plasma. cfDNA konsentrasjonene varierer fra 2-10 ng/mL for sunn donorer, men kan være så høyt som 100 ng/mL hos pasienter med metastatisk sykdom.
   2. Reagenser på RT og bland 199 µL fluorometer fortynning bufferen med 1 µL fargestoff (200 x) per reaksjon (N antall prøver + 2 standarder for å kalibrere fluorometer) å få en fungerende løsning.
   3. Vortex cfDNA løsningen grundig å sikre homogenitet og kort sentrifuge for å samle innholdet på bunnen av røret.
   4. Mix 5 µL av hver cfDNA prøve med 195 µL av arbeider løsningen.
   5. Bland 10 µL av hver standard med 190 µL av arbeider løsningen.
   6. Vortex grundig alle rør for 2-3 s å sikre homogenitet og kort sentrifuge for å samle innholdet nederst på rørene.
   7. Ruge på RT i 2 minutter i mørket.
   8. Lese rør i fluorometer, ved hjelp av output-modus er ' ng/µL'
   9. Beregn siste konsentrasjonen i ng/mL plasma som følger: ng/µL x 36 (volum av cfDNA eluate) / 4 (volum plasma utdraget).

2. ddPCR sonde og Primer Design (figur 2A)

Merk: Forsterkning av målrettet molekyler i drop-off ddPCR analysen følger lignende prinsipper for qPCR. Hver primer og sonde er utformet med konvensjonelle dedikert programvare Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Primer design
   1. I vinduet generelle innstillinger endre "konsentrasjonen av divalent kasjoner" til 3.8, "konsentrasjon av dNTPs" til 0,8, og ' mispriming/gjenta bibliotek ' å riktig organismen.
   2. I vinduet forhånd innstillinger kan du endre både "Tabell termodynamisk parametere" og "saltkonsentrasjon formel" Santa Lucia 1998.
   3. Velg en T_m mellom 55 og 70 ° C (med 50 mM for saltkonsentrasjon og 300 nM for oligonucleotide konsentrasjon).
   4. Sjekk spesifisiteten av primere med verktøy som PrimerBlast.
   5. Unngå områder som har sekundære strukturer.
   6. Velg en sekvens som har en GC-innhold på 50-60%.
   7. Unngå gjentakelser av Gs og Cs lenger enn 3 baser.
   8. Velg primere med Gs og Cs på 3 slutten når mulig.
   9. Kontroller at 3 endene av sammenkoblede primere ikke har betydelig komplementaritet å unngå primer-dimers. Amplicons bør være mindre enn 150 bp å effektivt forsterke cfDNA (mener er 170 bp⁸) og DNA utvunnet fra FFPE, som er ofte fragmentert.
2. Sonden design
   Merk: Hydrolyse sonder er merket med fluorescerende reporter på 5' slutten og avsluttes på slutten 3. De gir høy spesifisitet, høy signal-til-støy-forhold og tillate multipleksing hvis nødvendig. To-kanals slippverktøy lesere er kompatibel med FAM og HEX eller VIC fargestoffer samt analyse av FAM/HEX eller FAM/VIC kombinert sonder.
   1. Utforme hydrolyse sonder utfyllende til WT sekvensen målregion og tilstøtende ikke variabel regionen.
   2. Velg sonder begge ligger innenfor amplicon definert av primer paret forhånd. Primer sekvenser kan ikke overlappe med sonde sekvenser, selv om de kan sitte ved siden av hverandre.
   3. Velg stranden som har flere Cs enn Gs. sonder må ha en GC innholdet i 30-80%.
   4. Velg sonder mellom 13 og 30 nukleotider i lengde. Lengre sonder tendens til å vise høyere bakgrunn fluorescens fordi avstanden mellom fluorophore og avsluttes påvirker slukke av reporteren fluorophore.
   5. Velg T_m sonder skal 3 til 10 ° C høyere enn T_m primerne å sikre sonde hydrolyse under primer avspenning og utvidelse. T_m enhancers anbefales å nå de nødvendige T-_m samtidig sonden kort, som kortere sonder diskriminere single nukleotid varianter mer effektivt. Sonder bør ikke ha en G på 5' slutten fordi dette slukker fluorescens signalet selv etter hydrolyse.
   6. Utforme drop-off sonder som følger: 5'-(VIC) -utfyllende WT rekke regionen muterte-(MGB NFQ)-3 "og undersøke som: 5'-(6-FAM) -utfyllende sekvens av en ikke-variabel region-(MGB NFQ)-3". Andre kombinasjoner av reporter/avsluttes er også mulig.

3. optimalisering av ddPCR reaksjon (figur 2A)

Merk: Vill-type og mutant DNA-kontroller som brukes i dette trinnet kan fås fra cellelinjer, svulst prøver eller kommersielt tilgjengelig DNA referanse standarder, for eksempel.

1. Utføre en konvensjonell PCR på en termisk cycler bruke termisk gradient funksjonen for å validere spesifisiteten av PCR produktet forsterkes av primerne designet.
   1. Forberede en unik PCR reaksjonen blanding som beskrevet nedenfor i trinn 4.1 (uten sonder) på en vill-type DNA kontrollmal for minimum 8 reaksjoner å ha minst én reaksjon per temperatur.
   2. Kjør forsterkning ved hjelp av programmet som beskrevet i trinn 4.3.2 og en rekke annealing temperaturer rundt teoretisk annealing temperaturen primerne.
   3. Last PCR-produkter på en 3% agarose gel å velge for avspenning temperaturer gir bestemte produkter.
2. Utføre en rekke drop-off ddPCRs med parameterne som er beskrevet ovenfor, men denne gangen inkludert både sonder.
   1. Bruke 100% WT DNA, 100% MUT DNA og en blanding av WT og MUT DNA (f.eks 50% MUT/50% WT) å finne de beste forholdene for klart separasjon av WT og MUT slippverktøy skyer.
   2. Velg en rekke annealing temperaturer over temperaturen valgt i trinn 4.1.
   3. Velg annealing temperaturen som tillater spesifikk påvisning av WT eller MUT signaler ved 100% WT DNA eller 100% MUT DNA og beste separasjon av WT og MUT slippverktøy skyer.
   4. Avspenning tid og primer/probe konsentrasjoner kan også justeres forbedre separasjon av skyer og redusere antall dråper med middels fluorescens (regneffekt).
3. Evaluere bakgrunnen eller grensen av Tom (LOB) til analysen.
   1. Utføre minimum 48 personlige drop-off ddPCR reaksjoner med WT kontroll DNA annealing parametere og grunning/sonder konsentrasjoner valgt i 3.2.
   2. Hver reaksjon, beregne mutant allelet frekvensen (MAF) som følger: (antall mutant dråper/nummeret fylt dråper) x 100.
      Merk: LOB er definert som den falske positive MAF og tilknyttet SD som beregnes til 95% konfidensintervall (95% CI). LOB = (gjennomsnitt av falske positive MAF) + 95% CI.
4. Evaluere grensen for påvisning (LOD) til analysen.
   1. Utføre drop-off ddPCR reaksjoner med føljetong fortynninger av MUT DNA i WT DNA, med MAFs varierer fra 5% til 0,01% (≥ 8 replikerer per betingelse). Bruk annealing parametere og grunning/sonder konsentrasjoner valgt i 3.2.
      Merk: LOD er definert som minste MAF som replikerer stede gjennomsnittsverdier og SD over LOBEN (se Decraene et al. ⁶ for mer informasjon).

4. ddPCR protokollen (figur 2B)

Merk: Ligner på konvensjonelle ddPCR, drop-off ddPCR protokollen består av 4 trinn: (i) PCR bland forberedelse, (ii) slippverktøy generasjon, (iii) PCR forsterkning og (iv) datainnsamling.

1. PCR blanding forberedelse
   1. Følge vanlige forholdsregler, som bruker hansker, ren PCR hette, ren Pipetter og RNase, DNase-fri destillert vann for å unngå forurensning.
   2. Tine og equilibrate reaksjon komponentene på RT.
   3. Forberede 20 x primere/sonder blanding i destillert vann, primere på 18 µM og sonder på 5 µM.
   4. For alle personlige PCR reaksjoner, forberede en prøve blanding ved å kombinere 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µL av 20 x primere/sonder blanding og opptil 10 ng DNA prøve qsp 20 µL destillert vann.
   5. Vortex reaksjonen bland godt for å sikre homogenitet og kort sentrifuge for å samle innholdet på bunnen av røret før utlevering. Nøl ikke å gjenta dette trinnet for hver reaksjonen blanding før bruk.
2. Slippverktøy generasjon
   1. DdPCR kassetten inn i holderen og laste 20 μL reaksjonen blanding som inneholder eksempler i midten brønnene standardkassetten for slippverktøy generasjon (grønn posisjoner i figur 2B) med en 8-kanals pipette.
   2. Legge til 70 μL slippverktøy generator olje i bunnen brønnene (gul posisjoner).
   3. Sette inn kassett, med en pakning, i slippverktøy generator; vanndråper vil bli produsert i toppen brønnene av kassetten (blå posisjoner).
   4. Sug opp og dispensere sakte og forsiktig (for å unngå klipping) 40 μL dråper fra blekkpatronene inn en 96-brønns PCR plate. Bruk en flerkanals pipette for å optimalisere overføringen av dråpene.
3. PCR forsterkning
   1. Forsegle finalen PCR plate med en aluminiumsfolie bruker en plate sealer umiddelbart etter overføring dråper for å unngå fordampning. Kort sentrifuge platen for å samle inn innholdet på bunnen av brønnene.
   2. Kjøre en konvensjonell PCR forsterkning på en termisk cycler bruker følgende program: 95 ° C 10 min, 40 sykluser av [94 ° C 30 s, godkjent annealing T ° 60 s], 98 ° C 10 min (rampen 2,5 ° C/s). Omfatte kontroller uten input DNA og vill type DNA (≥3 gjentak) i hvert løp.
   3. Når kjøringen er fullført, kort sentrifuge platen for å samle inn innholdet på bunnen av brønnene.
4. Datainnsamling
   1. Etter PCR forsterkning, kan du bruke slippverktøy leseren å greven PCR-positive og PCR-negativ dråper, følg produsentens instruksjoner.
      Merk: Dråpe leseren vanligvis tilbyr en tofarget optisk oppdagelsen system kompatibel med FAM, VIC eller HEX fluorophores.

5. data analyse (figur 2C og Figur 3)

Merk: PCR-positive og PCR-negative dråper telles for å gi en absolutt kvantifisering MUT og WT alleler på målrettingsområde. De tildelte dråpene brukes til å beregne MAF i hver brønn. Slippverktøy kvantifisering og analyse av drop-off analyser utføres med ddPCR R pakken (https://github.com/daattali/ddpcr) utviklet av Attali og kolleger^9,10. Denne R pakken klassifiserer automatisk dråper som tom, del av "regn" (på grunn av ineffektiv forsterkning), eller som fylt med en virkelig positivt signal (Figur 3). Nedenfor presenterer de ulike trinnene i analysen er en kort versjon av beskrivende vignett av algoritmen skrevet av forfatterne (se https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ algoritmen. RMD for mer informasjon). Data er eksportert til kommadelt filer (FileName_Amplitude.csv) og lastet opp i ddPCR pakken som skal analyseres direkte i R eller gjennom dedikert web-grensesnitt.

1. Parameteren justeringer
   Merk: Hver drop-off analysen design resultater i bestemte siste dråpe distribusjoner og variasjoner i Sky skjemaet, separasjoner eller posisjoner er å forvente. For å sikre effektiv automatisk analyse, må et sett med parametere justeres. Hvis en har en uventet profil, kan det forårsake analyse av hele platen mislykkes, som resulterer i en feilmelding. Den problematiske må godt identifiseres og fjernes fra automatisk analyse.
   1. Identifisere mislykkede brønner bruker (REMOVE_FAILURES). Bruk TOTAL_DROPS_T (standardverdien er 5000) å justere minimalt antall dråper i hver brønn. Bruk EMPTY_LAMBDA_LOW_T (standardverdien er 0,3) og EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (standardverdien er 0,99) å justere beregningene som evalueres forventet slippverktøy skyene (tom, MUT, WT) og deres kvalitet.
      Merk: Å ha for mange tomme dråper er et tegn på at det ikke var nok amplifiable mal i reaksjonen.
   2. Identifisere avvikende dråper bruker (REMOVE_OUTLIERS). Bruk TOP_PERCENT (standard er p = 1%) til å justere øverste p prosent av dråper har den høyeste signal verdien i hver signal dimensjon (FAM, VIC/HEX) av dråper i hele platen. Bruk CUTOFF_IQR (standard er 5) å justere avvikende terskelen til toppen p prosent av høyeste signal.
   3. Identifisere tom dråper bruker (REMOVE_EMPTY). Bruk CUTOFF_SD (standard er 7) til å justere standardavviket for lavere (tom dråper) Gaussian fordelingen av sonde 1-verdier.
   4. Gate dråper bruker (KLASSIFISERE). Bruk CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (standard er 3) til å justere standardavviket for høyere (fylt dråper) Gaussian fordelingen av sonde 1-verdier. Bruk ADJUST_BW_MIN (standard er 4) og ADJUST_BW_MAX (standard er 20) til å justere parameterne k_min og k_max for å anslå kjernen tettheten av sonde 2-verdier og diskriminere MUT og WT skyen av dråper.
      1. Bruk SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (standard er p = 1%) og SIGNIFICANT_P_VALUE (standard er signifikansnivået s=0.01%) å klassifisere brønner som mutant eller wildtype.
         Merk: I denne algoritmen, en mutant godt definert som å ha en MAF som er statistisk signifikant høyere enn p %.
2. Automatisk analyse
   Merk: For hver parameter som presenteres i denne delen, forfatterne av ddPCR R pakken har foreslått standardverdier basert på sin kompetanse og dataene. Alle parameterne kan imidlertid endres for å øke kvaliteten på analyse (Figur 3).
   1. Identifisere mislykkede brønner.
      1. Bruke fire kvalitetskontroll beregninger (innstillinger: REMOVE_FAILURES) å identifisere mislykkede brønner; den første er minimum antall dråper som en brønn skal inneholde. Tre andre fokusere på å identifisere gyldig kandidat befolkninger tom, muligens FAM + og HEX / VIC + dråper. Fjerne brønner som ikke oppfyller disse kriteriene fra nedstrøms.
   2. Identifisere avvikende dråper.
      1. For å unngå forvrenger slippverktøy gating, fjerne outliers (dvs. dråper med en unormalt høy HEX/VIC eller FAM) fra videre analyse ved å angi en øvre grense terskelen (innstillinger: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identifisere tom dråper.
      1. Identifisere tom dråper for å redusere dimensjonen av data (i en typisk godt, vil de står for mesteparten av dråpene) og eliminere statistiske skjevhet av en stor del av unyttig beskjed som bare malen inneholder dråper fortsatt () innstillinger: REMOVE_EMPTY).
   4. Utføre slippverktøy gating.
      1. Klassifisere gjenværende dråpene som mutant, wildtype eller regn (innstillinger: KLASSIFISERE).
   5. Identifisere regn dråper.
      1. Som regn dråper skyldes ineffektiv forsterkning, hindre FAM + eller HEX / VIC + skyer. Fastslå grensene av klaser bruker standardverdiene Probe 1 (innstillingen: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identifisere mutant versus vill-type dråper.
      1. Høydepunktet av analysen er diskriminering mellom mutant og wildtype maler, identifisere alle gjenværende dråper på dette stadiet som enten den ene eller den andre. Siden de burde ha lignende Probe 1-verdier, bruke Probe 2 verdier best forutsi deres respektive natur (innstillinger: ADJUST_BW_MIN og ADJUST_BW_MAX).
   7. Klassifisere brønner som mutant versus vill-type.
      1. Etter bestemmer hvilke dråper beregne MUT og WT, MAF. Bruke mutant frekvens og tilknyttede p-verdien for hver brønn, er det mulig å klassifisere dem (innstillinger: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) som WT (inneholder hovedsakelig WT dråper) eller MUT brønner (inneholder en statistisk signifikant antall MUT dråper).
3. Utforske og eksportere data
   1. Utforsk og eksportere data som antall dråper, outliers, tom dråper, konsentrasjoner eller grafer som kan være mer tilpasset for optimal representasjon.

Representative Results

I en proof-of-concept studie, ble KRAS ekson 2 mutasjoner (kodon 12 og 13) og EGFR ekson 19 slettinger undersøkt i FFPE vev og plasmaprøver fra pasienter bruker drop-off ddPCR strategi⁶.

KRAS drop-off sonden avhørt en 16 bp regionen omfatter flere mutasjoner i ekson 2 av KRAS genet, som havn mer enn 95% av kjente KRAS mutasjoner i kreft hos mennesker¹¹. Referanse sonden var 20 bp i lengde og ligger 3 bp nedstrøms. For å optimalisere analysen vår, vi brukte DNA utvunnet fra linjer som inneholder 2 av de mest mutert KRAS aminosyrene: G12V (c.35GT, SW480) og G13D (c.38GA, HCT 116).

EGFR drop-off analysen var utformet for å søke etter alle aktivere sletting av EGFR ekson 19. Analysen brukt en 25 bp lange drop-off sonde plassert over regionen tilbakevendende slettet sammen med en referanse sonde 21 bp, ligger 31 bp nedstrøms i den samme amplicon. For å optimalisere analysen vår, vi brukte et standardsett med cfDNA referanse inkludert EGFR ekson 19 sletting c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Følsomhet, spesifisitet og plassering av slippverktøy skyer er definert med kontroll MUT prøver og WT PBMC genomisk DNA som vist i figur 4A for KRAS. Vi viste videre at denne typen analysen fungerer på flere typer genetiske endringer som enkelt substitusjon, flere erstatninger eller slettinger (figur 4B) og på ulike utvalg typer⁶.

Figur 1: drop-off ddPCR krever en unik par hydrolyse oligo-sonder skanne alle mutasjoner av hotspot regionen. Analysen design med en skjematisk resultat som todimensjonale scatter tomter viser slippverktøy fluorescens intensitet. (A) konvensjonelle ddPCR mutant (MUT sonde) og vill-type (WT sonde) sonder målretting nøyaktig samme område. (B) drop-off ddPCR inneholder en referanse sonde (sonde 1) som anneals til en ikke-variabel region og en drop-off sonde (sonde 2) rettet mot muterte regionen men utfyllende til WT sekvensen, i den samme amplicon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Drop-off ddPCR arbeidsflyt for plasma genetisk mutasjon fingeravtrykk. Hele arbeidsflyten består av 5 hovedtrinn: (A) (1) design av primer og sonder, (2) optimalisering av analysen, (B) (3) plasma isolasjon og cfDNA utvinning, (4) ddPCR kjøre og (C) (5) data analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Drop-off ddPCR analyse. Drop-off ddPCR analyse arbeidsflyt fremheve viktige parametere som må finjusteres. Dette sikrer effektiv automatisk identifikasjon av outliers, tom, regn eller positiv dråper; Tilordne MUT eller WT dråper og databehandling MAF for hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Representant resultater - KRAS og EGFR drop-off ddPCR analyser. (A) eksempel på resultater oppnådd under optimering skritt til drop-off ddPCR analysen. Gjenkjenning av mutant og/eller vill-type DNA i en reaksjon som inneholder 100% MUT DNA, 5% MUT DNA og 100% WT DNA. (B) eksempler på plasmaprøver analysert med KRAS og EGFR drop-off ddPCR søk viser påvisning av single nukleotid og flere erstatninger i ekson 2 KRAS og sletting i EGFR ekson 19. Dette tallet er tilpasset fra Decraene et al. ⁶. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Hvis du vil utforme en effektiv drop-off ddPCR analysen, optimalisering er avgjørende, og protokollen må følges nøye. Hver kombinasjon av primere og sonder har en unik PCR reaksjon effektivitet. Dermed har individuelle analysen godkjennes nøye på kontroll prøver før den brukes på verdifulle test prøver. Optimalisering og godkjenningen er viktig å sertifisere peak signalgjenkjenning og vurdere spesifisitet og følsomhet. Som beskrevet i protokollen, kan alle mutasjoner i et mål område dekket av "sonden 2" potensielt bli avhørt. Likevel validering anbefales for mutasjoner på 5 eller 3 endene av "probe 2", siden dette kan påvirke effektiviteten av drop-off analysen.

Metoden som presenteres her kan utføres med DNA utvunnet fra alle typer "vev", inkludert FFPE vev, celler i kultur eller blod prøver. Imidlertid kan kvaliteten av nukleinsyre utvinning dramatisk påvirke ddPCR resultater. PCR-hemmere som heparin, proteiner, måltema, fenol, proteaser, kollagen, melanin, vaskemidler eller salter må elimineres som mulig under prøvetaking og rensing trinnene. Selv om DNA-prøver kan bli utvannet for å redusere virkningen av PCR-hemmere på ddPCR, reduserer fortynning følsomheten fordi færre kopier av målet testes per reaksjon. Dette bør tas i betraktning når et visst nivå av følsomhet er nås, som et minimum av Kopier må testes.

Drop-off ddPCR kan brukes til mange typer molekylær endringer (eller flere nukleotid erstatninger, slettinger, osv.). Dessuten bruker bare to sonder for å oppdage alle endringer (og dermed øke praktisk og kostnadseffektiviteten av analysen), drop-off ddPCR genererer mindre bakgrunnen støy⁶ og viser økt følsomhet sammenlignet multiplex analyser. Siden den utføres i en enkelt reaksjon forbrukes i tillegg minimale mengder pasientprøvene. Denne analysen er spesielt tiltalende i sammenheng med flytende biopsi fordi ctDNA er ofte lav i prøvene.

Faktisk metoden presenteres her gjelder for mutasjon screening i væske-biopsi materiale og har allerede bevist sin nytteverdi for klinisk praksis (ESR1 mutasjon screening i krig-1 klinisk studie - NCT03079011). Det er imidlertid avgjørende bruker amplicons så kort som mulig i denne innstillingen fragmentering av cfDNA⁸.

Nedstrøms karakterisering trenger fortsatt utføres separat for å identifisere nøyaktig mutasjon båret av mutant alleler. Men fordi terapeutiske beslutninger er primært basert på mutational status hotspot regioner i targetable oncogenes (WT vs mutant), gjør evne til drop-off ddPCR umiddelbart identifisere mutasjoner det en kraftige diagnoseverktøy. Dessuten trenger ikke nøyaktig mutasjon kjent en priori å designe en analysen i heksameteret til gjeldende kommersielle løsninger. I tillegg kombineres drop-off ddPCRs med bestemte konvensjonelle ddPCR analyser å ytterligere øke antall mutasjoner vist for (data ikke vist). Endelig kan drop-off ddPCR brukes på andre felt av forskning. Spesielt kan det vise seg for å være et nyttig verktøy for screening positiv koloniene i genomet redigering eksperimenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer