Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Summary

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Abstract

Druppel digitale polymerase-kettingreactie (ddPCR) is een zeer gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) methode gebaseerd op monster fractionering in duizenden nano-sized water-in-olie individuele reacties. Onlangs, ddPCR is uitgegroeid tot een van de meest nauwkeurige en gevoelige instrumenten voor circulerende tumor (ctDNA) DNA detectie. Een van de belangrijkste beperkingen van de standaard ddPCR-techniek is het beperkte aantal mutaties die kan worden gescreend per reactie, zoals specifieke hydrolyse sondes herkennen van elke mogelijke allèlique versie nodig zijn. Een alternatieve methode, de drop-off ddPCR, verhoogt de doorvoer, omdat het vereist slechts een paar van sondes voor het detecteren en kwantificeren van potentieel alle genetische veranderingen in het gerichte gebied. Drop-off ddPCR toont vergelijkbare gevoeligheid aan conventionele ddPCR testen met het voordeel van het opsporen van een groter aantal mutaties in een enkele reactie. Het is rendabel, conserveert kostbare monstermateriaal, en kan ook worden gebruikt als een ontdekkingshulpmiddel mutaties zijn niet bekend een priori.

Introduction

Duizenden van somatische mutaties die betrekking hebben op kankerontwikkeling zijn gerapporteerde¹. Daaronder een paar zijn voorspellende markers van de werkzaamheid van gerichte therapie ^2,3 en genetische screening van deze mutaties is nu gangbare klinische praktijk. Droplet-technologie voor digitale PCR (ddPCR) kan worden gebruikt om te controleren op de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties met weetje speurder nauwkeurigheid en is zeer compatibel met niet-invasieve vloeibare biopsieën^4,5. Huidige ddPCR testen zijn echter voornamelijk ontworpen om mutaties bekend een prioridetecteren. Dit beperkt ernstig het gebruik van ddPCR als een ontdekkingshulpmiddel wanneer de mutatie onbekend is. Inderdaad, in het ontwerp van de conventionele ddPCR, een sonde van de hydrolyse herkennen van het wild-type allel (WT sonde) concurreert met een specifieke sonde herkennen de mutant allel (MUT sonde) (figuur 1A). De sonde met hogere affiniteit aan de sjabloon hybridizes en haar fluorophore, met vermelding van de aard van de overeenkomstige allel releases. De gegevens van de fluorescentie verkregen voor elke druppel kunnen worden gevisualiseerd in een scatterplot vertegenwoordigen de fluorescentie die wordt uitgestoten door de WT en MUT sondes in verschillende dimensies. In figuur 1Ais een schematische weergave van een typisch resultaat voor een conventionele ddPCR assay gepresenteerd. In dit voorbeeld, de blauwe wolk komt overeen met de druppels met WT allelen geïdentificeerd door de WT sonde, overwegende dat de rode wolk correspondeert met druppels waarin de MUT-allel is versterkt en geïdentificeerd door de MUT-sonde. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie, dubbele positieve druppels met zowel WT en MUT waarbij kunnen worden weergegeven (groene wolk). De licht grijze wolk komt overeen met lege druppels.

Aangezien de meeste platformen toestaan voor de detectie van een beperkt aantal fluorophores (meestal 2, maar maximaal 5), is doorvoer van conventionele ddPCR beperkt. Targeting van regio's met meerdere aangrenzende mutaties vereist daarom ontwerp van technisch uitdagende multiplex ddPCR testen of het gebruik van meerdere reacties gericht op elke mutatie in parallel. De drop-off ddPCR strategie, overwint deze beperking zoals het potentieel kan detecteren elke genetische wijziging binnen de regio van een doel met behulp van een uniek paar WT hydrolyse sondes. De eerste sonde (sonde 1) omvat die een reeks van de niet-variabele, grenzend aan de target-regio en de tweede sonde (sonde 2) is een aanvulling op de WT-volgorde van de doel-regio waar de mutaties zijn verwacht (figuur 1B). Terwijl de eerste sonde de totale hoeveelheid amplifiable moleculen in de reactie kwantificeert, discrimineert de tweede sonde WT en MUT allelen door suboptimale hybridisatie aan mutant sequenties. Sonde 2 herkent meerdere soorten mutaties in de regio (enkelvoudige of meervoudige nucleotide vervangingen, verwijdering, enz.) van doelstelling⁶. Zoals in conventionele ddPCR correspondeert de licht grijze wolk druppels met geen DNA-moleculen. Het is belangrijk eraan te herinneren dat in dit type van test, optimale scheiding van WT en MUT wolken afhankelijk van de hoeveelheid DNA geladen in de reactie is, omdat druppels met zowel WT en MUT doel allelen niet kunnen worden onderscheiden van druppels met alleen de WT formulier. Deze test vereist daarom bevatten de meeste druppels niet meer dan één exemplaar van de gerichte gen.

Protocol

Het hier gepresenteerde protocol volgt de richtlijnen van de ethiek van het Institut Curie. Alle menselijke specimens zijn verkregen van patiënten ingeschreven, na de geïnformeerde toestemming, in studies die zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board op Institut Curie.

1. het bloed van verzameling, Plasma opslag en cel-gratis DNA-extractie

Opmerking: DNA geëxtraheerd uit elk type "weefsel" kan worden gebruikt (bijvoorbeeld vers of formaldehyde-vaste paraffine ingebedde (FFPE) weefsels, cellen in cultuur of bloed monsters). Hier, bieden wij gedetailleerde instructies voor bloedinzameling, plasma isolatie en opslag en cel-vrij (cfDNA) DNA-extractie.

1. Blood collectie en plasma opslag (figuur 2B)
   1. Verzamelen van bloedmonsters in 7 mL EDTA buizen. Twee buizen worden aanbevolen voor het verzamelen van ongeveer 4 mL plasma.
   2. Centrifugeer de buizen voor 10 min op 820 x g binnen 3 uur van de trekking van bloed om rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC) en plasma te scheiden. De tijd tussen de monsterneming en de centrifugeren is cruciaal voor het verkrijgen van hoge kwaliteit cfDNA (dat wil zeggen, cfDNA niet verontreinigd met DNA vrijgelaten uit de WBC).
   3. Pipetteer zorgvuldig de bovendrijvende substantie (plasma) met behulp van een pipet 1 mL zonder te raken de WBC laag; ongeveer 2 mL plasma zijn meestal hersteld per EDTA buis.
   4. Het plasma overbrengen in 2 mL buizen en centrifugeer de aliquots bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 15 ° C tot cel puin te verwijderen.
   5. Zorgvuldig Pipetteer de bovendrijvende substantie (plasma) zonder de pellet te verstoren. Distribueren van het plasma in 2 mL cryogene buizen en opslaan bij-80 ° C totdat het nodig is.
2. cfDNA extractie (Figuur 2B)
   Opmerking: Hier, presenteren we de procedure met behulp van manuele extractie kit. Een geautomatiseerde versie na instructies van de fabrikant kan ook worden uitgevoerd voor cfDNA isolatie.
   1. 400 µL van proteïnase K in een tube van 50 mL gebracht. Voeg 4 mL plasma (volume dat routinematig wordt gebruikt) en 3.2 mL lysisbuffermengsel ACL (met 1.0 µg vervoerder RNA) uit de kit. Sluit de buis en meng door de vortexing voor 30 s tot het verkrijgen van een homogene oplossing. Incubeer bij 60 ° C gedurende 30 minuten.
   2. 7,2 mL buffer ACB (uit de kit) toevoegen aan de lysate te optimaliseren de binding van de circulerende nucleic zuren aan de silica-membraan en meng door de vortexing voor 15 – 30 s. Incubate de buis gedurende 5 minuten op het ijs.
   3. De kolom en de extender 20 mL in de leegte pomp plaatsen. Sluit de ongebruikte posities zodat vacuüm aspiratie.
   4. Zorgvuldig breng het lysate-buffer ACB mengsel in de buis extender (kort centrifuge de buis te verzamelen van het maximum van lysate-buffer ACB mengsel), zet de vacuümpomp en de lysate volledig worden getrokken door de kolommen toestaan. Verwijderen en verwijderen van de buis-extender.
   5. Breng 600 µL buffer ACW1 naar de kolom. Wanneer de buffer ACW1 heeft getrokken door de kolom, voeg 750 µL Buffer ACW2 en tot slot Voeg 750 µL van ethanol (96-100%). Plaats vervolgens de kolom in een schone 2 mL collectie buis en centrifuge op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 minuten aan het elimineren van ethanol.
   6. Plaats de kolom in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Open het deksel en Incubeer bij 56 ° C gedurende 10 min het membraan volledig drogen.
   7. Plaats de kolom in een schone 1,5 mL DNA lage bindende buis. Breng zorgvuldig 36 µL RNase-gratis water met 0,04% natriumazide (buffer AVE). Sluit het deksel en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
   8. Centrifugeer bij volledige snelheid (20.000 x g) voor 1 min elueer de nucleïnezuren en opslaan bij-20 ° C totdat het nodig is.
3. kwantificering van de cfDNA
   Opmerking: cfDNA kwantificering is uitgevoerd met een Fluorimeter met behulp van de fabrikant protocol onmiddellijk na de extractie of de monsters bij kamertemperatuur (RT), ontdooien voor gebruik. Vermijd meerdere vorst/dooi cycli.
   1. Gebruik de ultragevoelige bepaling volgens de hoeveelheid van de verwachte cfDNA, die meestal minder dan 100 ng/mL plasma is. cfDNA concentraties variëren van 2 tot en met 10 ng/mL voor gezonde donors maar kunnen oplopen tot 100 ng/mL bij patiënten met gemetastaseerde ziekte.
   2. Zorgen alle reagentia op RT en meng 199 µL van fluorescentiespectroscopie verdunning buffer met 1 µL van kleurstof (200 x) per reactie (N aantal monsters + 2 normen om te kalibreren de Fluorimeter) te verkrijgen van een werkende oplossing.
   3. Vortex de oplossing van de cfDNA grondig te waarborgen homogeniteit kort centrifugeren voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de buis.
   4. Meng 5 µL van elk monster cfDNA met 195 µL van de werkoplossing.
   5. Mix 10 µL van elke standaard met 190 µL van de werkoplossing.
   6. Vortex grondig alle buizen voor 2 – 3 s kort centrifugeren voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de buizen te waarborgen van homogeniteit.
   7. Incubeer bij RT gedurende 2 min. in het donker.
   8. Lees de buizen in de Fluorimeter, met behulp van de 'ng/µL'-uitgang
   9. De uiteindelijke concentratie in ng/mL van plasma als volgt berekenen: ng/µL x 36 (deel van cfDNA eluaat) / 4 (hoeveelheid plasma gewonnen).

2. ddPCR sonde en Primer Design (figuur 2A)

Opmerking: De versterking van de gerichte moleculen in de drop-off ddPCR assay volgt dezelfde principes van qPCR. Elke primer en de sonde is ontworpen met de conventionele dedicated software Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Primer ontwerp
   1. In het venster ' algemene instellingen ' omzetten 'concentratie van divalente kationen' 3.8, "concentratie van dNTPs" 0,8, en ' mispriming/herhalen bibliotheek ' aan het juiste organisme.
   2. In het venster instellingen voorschot wijzigen in zowel de 'Tafel van de thermodynamische parameters' en de 'zoutconcentratie formule' Santa Lucia 1998.
   3. Kies een T_m tussen 55 en 70 ° C (met 50 mM voor de zoutconcentratie en 300 nM voor oligonucleotide concentratie).
   4. Controleer de specificiteit van de inleidingen met behulp van tools zoals PrimerBlast.
   5. Regio's die het hebben van secondaire structuren voorkomen.
   6. Kies een reeks met een GC-inhoud van 50-60%.
   7. Het vermijden van herhalingen van Gs en Cs langer dan 3 honken.
   8. Kies inleidingen met Gs en Cs aan hun einde 3' indien mogelijk.
   9. Ervoor zorgen dat 3' einden van gepaarde inleidingen geen aanzienlijke complementariteit te vermijden inleidingsdimeer. Waarbij moet kleiner zijn dan 150 bp om efficiënt versterken cfDNA (gemiddelde grootte is 170 bp⁸) en DNA geëxtraheerd uit FFPE, die is vaak versnipperd.
2. Sonde ontwerp
   Opmerking: Hydrolyse sondes worden aangeduid met een fluorescerende verslaggever bij het 5'-eind en een quencher aan de 3'-eind. Zij bieden hoge specificiteit, hoge signaal-/ ruisverhouding en laat multiplexing indien nodig. Twee-kanaals druppel lezers zijn compatibel met de FAM en HEX of VIC kleurstoffen alsmede analyse voor FAM/HEX of FAM/VIC combinatie sondes.
   1. Het ontwerp van hydrolyse sondes ter aanvulling van de WT-volgorde van het doel en de aangrenzende niet-variabele-regio.
   2. Kies sondes die beide gevestigd binnen de amplicon die zijn gedefinieerd door de combinatie van de primer eerder ontworpen. Primer sequenties niet kunnen overlappen met de sonde sequenties, hoewel ze naast elkaar kunnen zitten.
   3. Kies het onderdeel dat meer Cs heeft dan Gs. sondes een GC-inhoud van 30-80 moet %.
   4. Selecteer sondes die tussen 13 en 30 nucleotiden in lengte. Langere sondes neigen om hogere fluorescentie van de achtergrond weer te geven omdat de afstand tussen de fluorophore en de quencher beïnvloedt het blussen van de verslaggever van de fluorophore.
   5. Selecteer T_m van de sondes worden van 3 tot en met 10 ° C hoger dan de T-_m van de inleidingen om sonde hydrolyse tijdens primer gloeien en uitbreiding. T_m versterkers worden aanbevolen om te bereiken van de vereiste T_m terwijl de sonde korte, zoals kortere sondes één nucleotide varianten efficiënter discrimineren. Sondes moet niet een G eind 5' omdat dit het signaal van de fluorescentie zelfs na hydrolyse lest.
   6. Ontwerp drop-off sondes als volgt: 5'-(VIC) -bijkomende WT opeenvolging van de gemuteerde regio-(MGB NFQ)-3' en sonde als referentie: 5'-(6-FAM) -bijkomende opeenvolging van een niet-variabele-regio-(MGB NFQ)-3'. Andere combinaties van verslaggever/quencher zijn ook mogelijk.

3. optimalisatie van de ddPCR reactie (figuur 2A)

Opmerking: Wild-type en mutant DNA besturingselementen die zijn gebruikt in deze stap kunnen worden verkregen cellijnen, tumor monsters of verkrijgbare DNA referentie standaarden, bijvoorbeeld.

1. Een conventionele PCR uitvoeren op een thermische cycler de thermische kleurovergang gebruiken voor het valideren van de specificiteit van het PCR-product versterkt door de inleidingen ontworpen.
   1. Een unieke mix van de PCR reactie voor te bereiden zoals hieronder beschreven in stap 4.1 (zonder sondes) op een wild-type DNA controle sjabloon voor een minimum van 8 reacties te hebben van ten minste één reactie per temperatuur.
   2. Voer de versterking met behulp van het programma beschreven bij stap 4.3.2 en een scala aan onthardende temperaturen rond de theoretische onthardende temperatuur van de inleidingen.
   3. Laden van PCR producten op een 3% agarose gel om voor onthardende temperaturen leveren van specifieke producten te selecteren.
2. Het uitvoeren van een reeks van drop-off ddPCRs met de parameters die hierboven beschreven maar dit keer met inbegrip van beide sondes.
   1. 100% WT DNA, 100% MUT DNA en een mengsel van WT en MUT DNA gebruiken (bijvoorbeeld 50% MUT/50% WT) om te bepalen van de beste voorwaarden voor een duidelijke scheiding van WT en MUT druppel wolken.
   2. Kies een scala aan onthardende temperaturen boven de temperatuur gekozen in stap 4.1.
   3. Selecteer de onthardende temperatuur waarmee specifieke detectie van WT of MUT signalen bij het gebruik van 100% WT DNA of 100% MUT DNA en beste scheiding van WT en MUT druppel wolken.
   4. Gloeien tijd en primer/sonde concentraties kan ook worden aangepast om scheiding van wolken en te verlagen van het aantal druppels met tussenliggende fluorescentie (regen effect).
3. Evalueren van de achtergrond of de termijn van blanco (LOB) van de test.
   1. Voer een minimum van 48 individuele drop-off ddPCR reacties met een WT besturingselement DNA met behulp van de onthardende parameters en de inleidingen/sondes concentraties in 3.2 gekozen.
   2. Voor elke reactie, berekenen de mutant allel frequentie (MAF) als volgt: (aantal mutant druppels/aantal gevulde druppels) x 100.
      Opmerking: De LOB is gedefinieerd als het gemiddelde van de MAF vals-positieve en bijbehorende SD waaruit het 95% betrouwbaarheidsinterval (95% CI) wordt berekend. LOB = (gemiddelde van vals-positieve MAF) + 95% CI.
4. Bepaal de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor de bepaling.
   1. Uitvoeren van drop-off ddPCR reacties met seriële verdunningen van MUT DNA in WT DNA, met MAFs variërend van 5% tot 0,01% (≥ 8 repliceert per voorwaarde). Gebruik onthardende parameters en inleidingen/sondes concentraties in 3.2 gekozen.
      Opmerking: De LOD wordt gedefinieerd als de kleinste MAF waarden waarvoor repliceert huidige gemiddelde waarden en SD boven de LOB (Zie Decraene et al. ⁶ voor meer details).

4. ddPCR Protocol (figuur 2B)

Opmerking: Vergelijkbaar met conventionele ddPCR, het protocol drop-off ddPCR bestaat uit 4 stappen: (i) PCR Meng voorbereiding, (ii) druppel generatie, (iii) PCR versterking en (iv) data-acquisitie.

1. PCR mix voorbereiding
   1. Volg standaard voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, met behulp van een schone PCR kap, schone pipetten en RNase, DNase-vrij gedistilleerd water om besmetting te voorkomen.
   2. Ontdooien en equilibreer van de onderdelen van de reactie op RT.
   3. 20 x inleidingen/sondes mix in gedistilleerd water, met inleidingen op elk 18 µM en sondes op elke 5 µM te bereiden.
   4. Voor alle individuele PCR reacties, bereiden u een monster mix door een combinatie van 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µL van 20 x inleidingen/sondes mix en maximaal 10 ng DNA monster qsp 20 µL van gedistilleerd water.
   5. Vortex de reactie Meng teneinde homogeniteit te waarborgen en kort centrifugeren voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de buis alvorens de verstrekking. Aarzel niet om deze stap te herhalen voor elke reactie mengsel vóór gebruik.
2. Druppel generatie
   1. Plaats van de ddPCR-cartridge in de houder en 20 μL van reactie mix met monsters in de middelste putjes van de cartridge voor druppel generatie (groene posities in figuur 2B) te laden met behulp van een precisiepipet 8-kanaals.
   2. Voeg 70 l druppel generator olie in de onderste putten (gele posities).
   3. Plaats de cartridge, met een pakking, in de droplet-generator; druppels zal worden geproduceerd in de boven putten van de cartridge (blauwe posities).
   4. Gecombineerd en afzien van langzaam en zachtjes (om te voorkomen schuintrekken) 40 μL van de druppels van de cartridges in een 96-Wells PCR plaat. Gebruik een meerkanaals-pipet voor het optimaliseren van de overdracht van de druppels.
3. PCR versterking
   1. Verzegel de definitieve PCR-plaat met een aluminiumfolie met een sealer plaat onmiddellijk na het overbrengen van druppels om verdamping. Kort centrifugeren de plaat voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de putten.
   2. Een conventionele PCR versterking worden uitgevoerd op een thermische cycler met behulp van het volgende programma: 95 ° C 10 min, 40 cycli van [94 ° C 30 s, gevalideerd onthardende T ° voor 60 s], 98 ° C 10 min (oprit 2,5 ° C/s). Besturingselementen zonder input DNA en wild type DNA (≥3 wordt gerepliceerd) opnemen in elke serie.
   3. Wanneer de run is voltooid, kort centrifugeren de plaat voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de putten.
4. Data-acquisitie
   1. Na PCR versterking, gebruiken de lezer van de druppel om te tellen PCR-positieve en PCR-negatief droplets, na instructies van de fabrikant.
      Opmerking: De druppel lezer biedt meestal een twee kleuren optische detectiesysteem compatibel met FAM, VIC of HEX fluorophores.

5. data-analyse (figuur 2C en Figuur 3)

Opmerking: Druppeltjes van de PCR-positief en PCR-negatief worden geteld om een absolute kwantificering van de MUT en de WT allelen in het gerichte gebied. De toegewezen druppels worden gebruikt voor het berekenen van het MAF in elk putje. Druppel kwantificering en analyse van drop-off testen kunnen worden uitgevoerd met behulp van de ddPCR R-pakket (https://github.com/daattali/ddpcr), ontwikkeld door Attali en collega's^9,10. Deze R-pakket classificeert automatisch druppels als leeg, onderdeel van de "rain" (als gevolg van inefficiënte versterking), of als gevuld met een echte positief signaal (Figuur 3). De volgende sectie presenteren de verschillende stappen van de analyse is een korte versie van de beschrijvende vignet van het algoritme dat is geschreven door de auteurs ervan (zie https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ algoritme. RMD voor meer details). Gegevens zijn geëxporteerd naar de CSV waarden-bestanden (FileName_Amplitude.csv) en geüpload in het ddPCR pakket rechtstreeks in R of via de specifieke web-interface worden geanalyseerd.

1. Met de parameter aanpassingen
   Opmerking: Elk drop-off assay ontwerp resulteert in specifieke laatste druppel distributies en variaties in de vorm van de wolk, scheidingen of posities is te verwachten. Om ervoor te zorgen efficiënte geautomatiseerde analyse, moet een aantal parameters worden aangepast. Als een goed een onverwachte profiel heeft, kan dit leiden tot de analyse van de hele plaat te mislukken, wat resulteert in een foutbericht. De problematische zal Nou moeten worden geïdentificeerd en verwijderd uit de geautomatiseerde analyse.
   1. Identificeren van mislukte wells (REMOVE_FAILURES) gebruiken. Gebruik TOTAL_DROPS_T (standaardwaarde is 5000) aan te passen van het minimale aantal druppels in elk putje. Gebruik EMPTY_LAMBDA_LOW_T (standaardwaarde is 0,3) en EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (standaardwaarde is 0.99) om de statistieken die de verwachte druppel wolken (leeg, MUT, WT) evalueren en hun kwaliteit.
      Opmerking: Met teveel lege druppels is een teken dat er niet genoeg amplifiable sjabloon in de reactie was.
   2. Identificeren uitbijter druppels gebruiken (REMOVE_OUTLIERS). TOP_PERCENT gebruiken (standaard is p = 1%) aan te passen van de bovenste p procent van druppeltjes met de hoogste waarde van de signaal in elke dimensie van het signaal (FAM, VIC/HEX) uit druppels in de hele plaat. CUTOFF_IQR gebruiken (standaard is 5) om de drempel van de uitbijter van de bovenste p procent hoogste signaal.
   3. Identificeren van lege druppels gebruiken (REMOVE_EMPTY). CUTOFF_SD gebruiken (standaard is 7) aan te passen van de standaardafwijking van de lagere (lege druppels) Gaussiaanse distributie van de waarden van de sonde 1.
   4. Gate druppels (CLASSIFY) gebruiken. CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD gebruiken (standaard is 3) om de standaarddeviatie van de hogere (gevulde druppels) Gaussiaanse distributie van de waarden van de sonde 1. ADJUST_BW_MIN gebruiken (standaard is 4) en ADJUST_BW_MAX (standaard is 20) aanpassen van de parameters van het k_min en k_max de kernel dichtheid van de waarden van de sonde 2 schatten te discrimineren de MUT en de WT wolk van druppels.
      1. SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ gebruiken (standaard is p = 1%) en SIGNIFICANT_P_VALUE (standaard is significantieniveau s=0.01%) te classificeren wells als mutant of wildtype.
         Opmerking: In dit algoritme, een mutant goed gedefinieerd als zijnde een MAF dat statistisch significant hoger is dan p %.
2. Geautomatiseerde analyse
   Opmerking: Voor elke parameter die in dit hoofdstuk, zijn de auteurs van de ddPCR R-pakket voorgestelde standaardwaarden op basis van hun expertise en hun gegevens. Alle parameters kunnen echter worden gewijzigd om de kwaliteit van de analyse (Figuur 3) te verhogen.
   1. Identificeren van mislukte wells.
      1. Gebruik vier kwaliteitscontrole statistieken (instellingen: REMOVE_FAILURES) te identificeren mislukte putten; de eerste is het minimum aantal druppeltjes die een goed moet bevatten. De andere drie concentreren op het identificeren van geldige kandidaat-populaties voor lege, eventueel FAM + en HEX +/ VIC + druppels. Verwijder putten die niet voldoen aan deze criteria van downstream-analyse.
   2. Vaststellen van de uitbijter druppels.
      1. Om te voorkomen dat scheeftrekken druppel gating, verwijderen uitschieters (dat wil zeggen, de druppels met een abnormaal hoge HEX/VIC of FAM waarde) uit verdere analyse door de instelling van een drempel van de bovenste grens (instellingen: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identificeren van lege druppels.
      1. Identificeren van lege druppels ter vermindering van de dimensie van de gegevens (in een typische goed, zij zal goed zijn voor de meeste van de druppels) en statistische vooringenomenheid als gevolg van de aanwezigheid van een groot deel van de nutteloze informatie te elimineren, zoals alleen sjabloon-bevattende druppeltjes blijven () instellingen: REMOVE_EMPTY).
   4. Druppel gating uitvoeren
      1. De resterende druppels te classificeren als mutant, wildtype of regen (instellingen: CLASSIFICEREN).
   5. Regen druppels te identificeren.
      1. Zoals regen druppels uit inefficiënte amplificatie voortvloeien, uitsluiten van FAM + of HEX +/ VIC + wolken. Bepalen van de grenzen van hun clusters met behulp van de standaardwaarden van de sonde 1 (instelling: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identificeren van mutant versus wild-type druppels.
      1. Als het hoogtepunt van de analyse discriminatie tussen de mutant en wildtype sjablonen is, identificeren alle resterende druppels in dit stadium als het een of het ander. Aangezien zij soortgelijke sonde 1-waarden moeten, sonde 2 waarden gebruiken om te voorspellen beste hun respectieve aard (instellingen: ADJUST_BW_MIN en ADJUST_BW_MAX).
   7. Classificeren wells als mutant versus wild-type.
      1. Nadat u hebt bepaald welke druppels zijn berekenen MUT en WT, het MAF. Met behulp van de mutantfrequentie en bijbehorende p-waarde van elk putje, het is mogelijk om het classificeren van hen (instellingen: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) als WT (met meestal WT druppels) of MUT wells (met een statistisch significant aantal MUT druppels).
3. Verkennen en de gegevens exporteren
   1. Verken en de gegevens exporteren als aantal druppels, uitschieters, lege druppels, concentraties of grafieken die verder kunnen worden aangepast voor optimale weergave.

Representative Results

KRAS exon 2 mutaties (codonen 12 en 13) en EGFR exon 19 verwijderingen in een bewijs-van-concept studie, werden in FFPE weefsels en plasma monsters van kankerpatiënten met behulp van de drop-off ddPCR strategie⁶onderzocht.

De KRAS drop-off sonde ondervraagd een 16 bp regio omvat meerdere mutaties in exon 2 van de KRAS -gen, die meer dan 95% van de bekende KRAS mutaties in menselijke kankers¹¹haven. De referentie-sonde was 20 bp in lengte en gelegen 3 bp stroomafwaarts. Voor het optimaliseren van onze assay, gebruikten we DNA geëxtraheerd uit cellijnen met 2 van de meest voorkomende gemuteerde KRAS -aminozuren: G12V (c.35GT, SW480) en G13D (c.38GA, HCT 116).

De EGFR drop-off assay werd ontworpen om te zoeken naar alle activerend verwijderingen van EGFR exon 19. De test gebruikt een 25 bp durende drop-off sonde geplaatst over de terugkerende verwijderde regio samen met een sonde van de verwijzing van 21 bp, gelegen 31 bp stroomafwaarts in de zelfde amplicon. Voor het optimaliseren van onze assay, gebruikten we een cfDNA referentie standaardset met inbegrip van de EGFR exon 19 verwijdering c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Gevoeligheid, specificiteit en locatie van druppel wolken hebben met MUT controlemonsters en WT PBMC genomic DNA zoals afgebeeld in figuur 4A voor KRAS zijn gedefinieerd. We verder aangetoond dat dit type van test op meerdere soorten genetische veranderingen zoals één vervanging, meerdere vervangingen of verwijderingen (figuur 4B) alsmede op verschillende typen van het monster^{6 werkt}.

Figuur 1: de drop-off ddPCR vereist een unieke paar hydrolyse oligo-sondes voor het scannen van alle mutaties van een hotspot regio. Assay ontwerpen met een schematische resultaat weergegeven als tweedimensionale scatter weergegeven: druppel fluorescentie intensiteit percelen. (A) conventionele ddPCR met mutant (MUT sonde) en wild-type (WT sonde) sondes gericht op exacte dezelfde regio. (B) de drop-off ddPCR bevat een referentie-sonde (sonde 1) die anneals naar een niet-variabele-regio en een drop-off-sonde (sonde 2) gericht op de gemuteerde regio maar complementair aan de WT-reeks, binnen de dezelfde amplicon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Drop-off ddPCR workflow voor plasma DNA mutatie profiling. De volledige workflow bestaat uit 5 belangrijke stappen: (A) (1) ontwerp van inleidingen en sondes, (2) de optimalisatie van de bepaling, (B) (3) plasma isolatie en cfDNA extractie, (4) de ddPCR uitvoeren en (C) (5) data-analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: analyse van Drop-off ddPCR. Drop-off ddPCR analyse werkstroom markeren van belangrijke parameters die moeten worden verfijnd. Dit zorgt voor een efficiënte automatische identificatie van uitschieters, leeg, regen of positieve druppels; MUT of WT druppels toe te wijzen en het MAF voor elk putje computing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Representatieve resultaten - KRAS en EGFR drop-off ddPCR testen. (A) voorbeeld van resultaten verkregen tijdens optimization stappen van de drop-off ddPCR bepaling. Detectie van mutant en/of wild-type DNA in een reactie met 100% MUT DNA, 5% MUT DNA en 100% WT DNA. (B) voorbeelden van plasma monsters geanalyseerd met de KRAS en de EGFR drop-off ddPCR testen de detectie van één nucleotide en meerdere vervangingen in exon 2 van KRAS en een schrapping in EGFR exon 19 tonen. Dit percentage is aangepast van Decraene et al. ⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Voor het ontwerpen van een efficiënte drop-off ddPCR assay, optimalisatie is cruciaal, en het protocol moet zorgvuldig worden gevolgd. Elke combinatie van primers en sondes heeft een unieke PCR reactie efficiëntie. Een afzonderlijke bepaling moet dus zorgvuldig worden gevalideerd op controlemonsters alvorens te worden gebruikt op waardevolle proefmonsters. Optimalisatie en validatie zijn belangrijk voor het certificeren van piek signaal detectie en beoordelen van de gevoeligheid en specificiteit. Zoals beschreven in het protocol, kunnen alle mutaties zich in een gebied van de doelstelling het "probe 2" vallende potentieel worden ondervraagd. Niettemin, validatie wordt aanbevolen voor mutaties gelegen op 5' of 3' einden van "probe 2", aangezien deze van invloed kunnen zijn op de efficiëntie van de drop-off-bepaling.

De methode die hier gepresenteerd kan worden uitgevoerd met DNA geëxtraheerd uit elk type "tissue", met inbegrip van FFPE weefsels, cellen in cultuur of bloed monsters. Echter, de kwaliteit van de extractie van de nucleïnezuur kan drastisch invloed ddPCR resultaten. PCR-remmers zoals heparine, eiwitten, Heem, fenol, proteasen, collageen, melanine, detergenten of zouten moeten tijdens de bemonstering en de zuivering stappen zoveel mogelijk worden weggenomen. Hoewel de DNA-monsters kunnen worden verdund om de impact van PCR-remmers op de ddPCR te verminderen, vermindert verdunning gevoeligheid omdat minder exemplaren van het streefcijfer zal worden getest per reactie. Dit moet rekening worden gehouden wanneer een zekere mate van gevoeligheid is te bereiken, zoals een minimumaantal exemplaren moet worden getest.

Drop-off ddPCR kan worden toegepast op vele soorten moleculaire veranderingen (enkelvoudige en meervoudige nucleotide vervangingen, verwijderingen, enz.). Naast alle wijzigingen (waardoor uitvoerbaarheid en de kosteneffectiviteit van de assay) met behulp van slechts twee sondes, drop-off ddPCR genereert minder achtergrond lawaai⁶ en verhoogde gevoeligheid ten opzichte van multiplex assays toont. Bovendien, aangezien het wordt uitgevoerd in een enkele reactie, worden minimale bedragen van patiënt monsters verbruikt. Deze test is vooral aantrekkelijk in de context van vloeibare biopsie omdat de hoeveelheid ctDNA vaak laag in deze monsters is.

Inderdaad, de methode die hier gepresenteerd is van toepassing voor mutatie screening in vloeistof-biopsie materiaal en heeft al bewezen nut ervan voor de klinische praktijk (ESR1 mutatie screening in de klinische proef PADA-1 - NCT03079011). Het is echter cruciaal te gebruiken waarbij zo kort mogelijk in deze instelling vanwege de versnippering van de cfDNA⁸.

Stroomafwaarts karakterisering moet nog apart ter identificatie van de exacte mutaties gedragen door mutant allelen worden uitgevoerd. Omdat therapeutische besluiten zijn voornamelijk gebaseerd op de vogelgriepvirus status van hotspot regio's van targetable oncogenen (WT vs mutant), maakt het vermogen van drop-off ddPCR om onmiddellijk het identificeren van mutaties het echter een krachtig diagnostisch hulpprogramma. De exacte mutatie hoeft bovendien niet te worden a priori voor het ontwerpen van een bepaling in tegenstelling tot huidige commerciële oplossingen bekend. Daarnaast kan drop-off ddPCRs worden gecombineerd met specifieke conventionele ddPCR testen tot verdere verhoging van het aantal mutaties gescreend voor (gegevens niet worden weergegeven). Ten slotte kan drop-off ddPCR worden toegepast op andere gebieden van onderzoek. In het bijzonder, kan blijken een nuttig instrument voor het screenen van positieve kolonies in genoom bewerken experimenten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer