Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier avec précision les multiples altérations génétiques d’une région cible en une seule réaction à l’aide de Drop-off ddPCR et une paire de sondes d’hydrolyse.

Abstract

Gouttelette numérique polymérisation en chaîne (ddPCR) est une méthode de réaction en chaîne (PCR) ultrasensible polymérase quantitative basée sur le fractionnement des échantillons dans des milliers de taille nanométrique de réactions individuelles eau-dans-huile. Récemment, ddPCR est devenu un des outils plus précis et plus sensibles pour la détection de l’ADN (ADNct) tumeur en circulation. Une des principales limites de la technique standard ddPCR est le nombre limité de mutations qui peut être projeté par réaction, comme les sondes d’hydrolyse spécifiques reconnaissant chaque version allélique possible sont nécessaires. Une autre méthode, le drop-off ddPCR, augmente le débit, car il ne nécessite qu’une seule paire de sondes pour détecter et quantifier potentiellement toutes les altérations génétiques dans la région ciblée. Drop-off ddPCR affiche une sensibilité comparable aux déterminations ddPCR classiques avec l’avantage de détecter un plus grand nombre de mutations dans une seule réaction. Il est rentable, conserve de précieux échantillons et peut aussi servir comme un outil de découverte lorsque les mutations ne sont pas connues a priori.

Introduction

Des milliers de mutations somatiques liées au développement du cancer ont été signalés¹. Parmi ceux-ci, quelques-uns sont des marqueurs prédictifs de l’efficacité de la thérapie ciblée ^2,3 et dépistage de ces mutations génétique est pratique clinique de routine maintenant. Gouttelette numérique technologie PCR (ddPCR) peut être utilisée pour surveiller la présence ou l’absence de mutations avec une précision de détection élevé et est hautement compatible avec biopsies liquide non invasif^4,5. Cependant, les tests de ddPCR actuellement sont principalement conçus pour détecter les mutations connues a priori. Ceci limite fortement l’utilisation de ddPCR comme un outil de découverte lorsque la mutation est inconnue. En effet, lors de la conception conventionnelle de ddPCR, une sonde d’hydrolyse reconnaissant l’allèle sauvage (WT sonde) est en concurrence avec une sonde spécifique reconnaissant l’allèle mutant (MUT sonde) (Figure 1 a). La sonde avec une affinité plus élevée s’hybride au modèle et libère ses fluorophore, indiquant la nature de l’allèle correspondant. Les données de fluorescence obtenues pour chaque gouttelette peuvent être visualisées dans un nuage de points représentant la fluorescence émise par les sondes em et MUT de différentes dimensions. Une représentation schématique d’un résultat typique pour un dosage ddPCR conventionnelle est présentée dans la Figure 1 a. Dans cet exemple, la nuée bleue correspond à des gouttelettes contenant des allèles WT identifiées par la sonde WT, alors que le nuage rouge correspond à gouttelettes où l’allèle MUT a été amplifié et identifiée par la sonde MUT. Selon la quantité d’ADN chargé dans la réaction, des gouttelettes positives doubles contenant des amplicons fois WT et MUT peuvent apparaître (Nuage vert). Le nuage gris clair correspond à gouttelettes vides.

Étant donné que la plupart des plates-formes permettant la détection d’un nombre limité de fluorophores (généralement 2, mais jusqu'à 5), un débit de ddPCR conventionnelle est limité. Cibler des régions présentant des mutations adjacentes multiples exige donc, design de techniquement difficiles ddPCR multiplex essais ou l’utilisation de multiples réactions ciblant chaque mutation en parallèle. La stratégie de ddPCR Drop-off, permet de surmonter cette limitation car il peut éventuellement détecter toute modification génétique dans une région cible à l’aide d’une paire de sondes d’hydrolyse WT. Le premier sonde (Probe 1) couvrant qu'une séquence non variable, adjacente à la région cible et la deuxième sonde (sonde 2) est complémentaire de la séquence WT de la région cible où les mutations sont attendus (Figure 1 b). Alors que la première sonde quantifie le montant total des molécules amplifiables dans la réaction, la deuxième sonde discriminatoire WT et MUT allèles par hybridation sous-optimal de séquences de mutants. Sonde 2 peut identifier plusieurs types de mutations dans la région (substitutions nucléotidiques simples ou multiples, suppression, etc.) la cible⁶. Comme dans les ddPCR classique, le nuage gris clair correspond à gouttelettes ne contenant aucune des molécules d’ADN. Il est important de rappeler que dans ce type de test, une séparation optimale des nuages WT et MUT est tributaire de la quantité d’ADN chargé dans la réaction, puisque les gouttelettes contenant les WT et MUT allèles cible ne peut pas être distinguées de gouttelettes contenant uniquement le WT formulaire. Par conséquent, ce test nécessite que la plupart des gouttelettes contiennent pas plus d’une copie du gène ciblé.

Protocol

Le protocole présenté ici suit les directives d’éthique de l’Institut Curie. Tous les échantillons humains provenaient de patients inscrits, après consentement éclairé, dans études approuvées par le Conseil d’examen institutionnel à l’Institut Curie.

1. collecte, stockage de Plasma et l’Extraction d’ADN acellulaire de sang

NOTE : ADN extrait de n’importe quel type de « tissu » peut être utilisé (p. ex., frais ou formaldéhyde-correction paraffine embarqué des tissus (FFIP), les cellules dans les échantillons de culture ou de sang). Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour la collecte de sang, plasma localisation et stockage et acellulaire l’extraction d’ADN (cfDNA).

1. Stockage de collection et le plasma du sang (Figure 2 b)
   1. Recueillir des échantillons de sang dans les tubes EDTA 7 mL. Deux tubes sont recommandés à recueillir environ 4 mL de plasma.
   2. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 820 x g moins de 3 h du tirage pour séparer les globules rouges (RBC), de globules blancs (WBC) et de plasma sanguin. Le délai entre le prélèvement et la centrifugation est essentiels pour obtenir des cfDNA de haute qualité (c.-à-d., cfDNA ne pas contaminée avec de l’ADN, libéré de la WBC).
   3. Soigneusement la pipette le surnageant (plasma) à l’aide d’une pipette 1 mL sans toucher la couche WBC ; environ 2 mL de plasma sont généralement récupérées par tube EDTA.
   4. Transférer le plasma à tubes de 2 mL et centrifuger les aliquotes à 16 000 x g pendant 10 min à 15 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
   5. Soigneusement la pipette le surnageant (plasma) sans déranger le culot. Distribuer le plasma en tubes cryogéniques de 2 mL et stocker à-80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
2. cfDNA Extraction (Figure 2 b)
   Remarque : Nous présentons ici la procédure à l’aide du kit d’extraction manuelle. Une version automatisée en suivant les instructions du fabricant peut également être exécutée pour cfDNA isolement.
   1. Mettre 400 µL de protéinase K dans un tube de 50 mL. Ajouter 4 mL de plasma (volume couramment utilisé) et 3,2 mL de tampon de lyse ACL (contenant 1,0 µg transporteur RNA) du kit. Fermer le tube et mélanger au Vortex pendant 30 s pour obtenir une solution homogène. Incuber à 60 ° C pendant 30 min.
   2. Ajouter 7,2 mL de tampon ACB (à partir de la trousse) pour le lysat d’optimiser la liaison des acides nucléiques circulants à la membrane de la silice et mélanger au vortex pour 15 à 30 s. Incuber le tube pendant 5 minutes sur la glace.
   3. Placer la colonne et l’extendeur de 20 mL dans la pompe à vide. Fermez les positions non utilisées afin de permettre l’aspiration intra-utérine.
   4. Appliquer soigneusement le mélange de PBR de lysat-tampon dans le prolongateur de tube (centrifuger brièvement le tube afin de collecter le maximum de mélange de PBR de lysat-tampon), mettre en marche la pompe à vide et permettre le lysat aspiration à travers les colonnes complètement. Retirer et jeter le prolongateur de tube.
   5. Appliquer 600 µL de tampon ACW1 à la colonne. Lorsque le tampon ACW1 a dessiné par le biais de la colonne, ajouter 750 µL tampon ACW2 et enfin ajoutez 750 µL d’éthanol (96-100 %). Ensuite, placez la colonne dans un tube de prélèvement propre 2 mL et centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 3 min éliminer l’éthanol.
   6. Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Ouvrez le couvercle et laisser incuber à 56 ° C pendant 10 min pour sécher la membrane.
   7. Placer la colonne dans un tube à faible liaison ADN propre de 1,5 mL. Appliquer soigneusement 36 µL d’eau exempte de RNase avec 0,04 % d’azide de Sodium (tampon AVE). Fermer le couvercle et laisser incuber à température ambiante pendant 3 min.
   8. Centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 1 min à éluer les acides nucléiques et conserver à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. quantification de le cfDNA
   Remarque : cfDNA quantification est effectuée avec un fluorimètre utilisant le protocole du fabricant immédiatement après extraction ou décongeler les échantillons à la température ambiante (RT), avant de l’utiliser. Éviter de multiples cycles de gel/dégel.
   1. Utilisez le test de sensibilité élevée selon la quantité attendue de cfDNA, qui est généralement inférieure à 100 ng/mL de plasma. cfDNA concentrations vont de 2 à 10 ng/mL pour les donneurs sains, mais peuvent être aussi hautes que 100 ng/mL chez les patients avec une maladie métastatique.
   2. Assurez-vous que tous les réactifs sont à ta et 199 µL de tampon de dilution fluorimètre mêlent 1 µL de colorant (200 x) par réaction (nombre N d’échantillons + 2 normes pour calibrer le fluorimètre) pour obtenir une solution de travail.
   3. Vortex la solution cfDNA soigneusement pour garantir l’homogénéité et centrifuger brièvement pour collecter le contenu au fond du tube.
   4. Mix 5 µL de chaque échantillon cfDNA 195 µl de la solution de travail.
   5. Mix 10 µL de chaque étalon avec 190 µL de la solution de travail.
   6. Vortex soigneusement tous les tubes pour 2 – 3 s pour garantir l’homogénéité et centrifuger brièvement pour collecter le contenu au fond des tubes.
   7. Incuber à RT pendant 2 min dans l’obscurité.
   8. Lire les tubes dans le fluorimètre, en utilisant le mode de sortie « ng/µL »
   9. Calculer la concentration finale en ng/mL de plasma comme suit : ng/µL x 36 (volume de l’éluat cfDNA) / 4 (volume de plasma extraite).

2. ddPCR sonde et amorces (Figure 2 a)

Remarque : L’amplification des molécules ciblées dans le dosage de ddPCR déclin suit des principes similaires de qPCR. Chaque amorce et la sonde est conçu avec le logiciel dédié classique Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Conception d’amorce
   1. Dans la fenêtre Paramètres généraux, remplacez « concentration des cations divalents » à 3,8, «concentration des dNTPs» 0,8 et « mispriming/répétition Library » à l’organisme approprié.
   2. Dans la fenêtre de réglages d’avance, changer la « Table des paramètres thermodynamiques » et la « formule de la concentration en sel » à Santa Lucia 1998.
   3. Choisissez un T_m entre 55 et 70 ° C (avec 50 mM pour la concentration en sel et 300 nM pour la concentration de l’oligonucléotide).
   4. Vérifier la spécificité des amorces à l’aide d’outils tels que PrimerBlast.
   5. Éviter les régions disposant de structures secondaires.
   6. Choisir une séquence qui a un contenu en GC de 50 à 60 %.
   7. Éviter les répétitions de Gs et Cs plus de 3 bases.
   8. Le choix des amorces avec Gs et Cs à leur extrémité 3' lorsque cela est possible.
   9. Veiller à ce que les extrémités 3' des amorces appariés n’ont pas complémentarité importante afin d’éviter l’amorce-dimères. Amplicons devrait être inférieure à 150 bp pour amplifier efficacement cfDNA (moyen taille 170 bp⁸) et l’ADN extrait de FFIP, qui est souvent fragmenté.
2. Conception de la sonde
   NOTE : Sondes d’hydrolyse sont étiquetés avec un journaliste fluorescent à l’extrémité 5' et un piège à l’extrémité 3'. Ils fournissent la grande spécificité, rapport signal sur bruit élevé et permet, multiplexage si nécessaire. Deux canaux gouttelette lecteurs sont compatibles avec les colorants FAM et HEX ou VIC ainsi qu’une analyse de FAM/HEX ou FAM/VIC couplée des sondes.
   1. Conception de sondes d’hydrolyse complémentaire de la séquence WT de la région de la cible et la région adjacente de non variable.
   2. Choisir les sondes, que toutes deux situées au sein de l’amplicon définie par la paire d’amorces déjà conçue. Séquences d’amorces ne peut pas superposer avec les séquences de la sonde, bien qu’ils peuvent s’asseoir à côté de l’autre.
   3. Choisissez le brin qui a plus de Cs que Gs. sondes doivent avoir un contenu en GC de 30 à 80 %.
   4. Sélectionnez les sondes qui se situent entre 13 et 30 nucléotides de long. Sondes longues ont tendance à afficher la fluorescence de fond plus élevé parce que la distance entre le fluorophore et l’extincteur affecte la trempe du fluorophore reporter.
   5. Sélectionnez T_m des sondes de 3 à 10 ° c plus élevée que la T_m des amorces pour sonde hydrolyse lors des amorces recuit et extension. Exhausteurs de_m T sont recommandées pour atteindre les requis de T_m tout en gardant la sonde courte, comme les sondes plus courtes variantes de nucléotide de discrimination plus efficacement. Sondes ne devraient pas avoir un G à l’extrémité 5' car cela apaise le signal de fluorescence même après hydrolyse.
   6. Sondes de déclin de conception comme suit : 5'-(VIC) -séquence WT complémentaire de la région mutée-(MGB NFQ)-3' et référence sonde comme : 5'-(6-FAM) -séquence complémentaire d’une région non variable-(MGB NFQ)-3'. Autres combinaisons de journaliste/extincteur sont également possibles.

3. optimisation de la ddPCR réaction (Figure 2 a)

Remarque : Les contrôles ADN sauvage et mutantes utilisées dans cette étape peuvent être obtenues des lignées cellulaires, des échantillons de tumeur ou étalons de référence ADN disponibles dans le commerce, par exemple.

1. Effectuer une PCR classique sur un thermocycleur utilisant la fonction gradient thermique pour valider la spécificité du produit PCR amplifié par les amorces.
   1. Préparer un mélange unique de réaction PCR comme indiqué ci-dessous au point 4.1 (sans sondes) sur un modèle de contrôle de l’ADN sauvage pendant au moins 8 réactions d’avoir au moins une réaction par la température.
   2. Exécutez l’amplification en utilisant le programme décrit à l’étape 4.3.2 et une plage de températures de recuit autour de la température de recuit théorique des amorces.
   3. Charger des produits PCR sur un gel d’agarose à 3 % à choisir pour le recuit des températures fournissant des produits spécifiques.
2. Exécuter une série de ddPCRs de dépôt en utilisant les paramètres décrits ci-dessus, mais cette fois, y compris les deux sondes.
   1. Utilisez 100 % WT ADN, ADN MUT 100 % et un mélange de WT et MUT ADN (par exemple, 50 % MUT/50% WT) afin de déterminer les meilleures conditions pour une séparation nette entre les nuages de gouttelettes WT et MUT.
   2. Choisissez une gamme de recuit des températures supérieures à la température choisie à l’étape 4.1.
   3. Sélectionnez la température de recuit qui permet une détection spécifique de WT ou MUT signaux lors de l’utilisation de l’ADN WT 100 % ou 100 % MUT ADN et meilleure séparation des nuages de gouttelettes WT et MUT.
   4. Recuit de concentrations de temps et apprêt/sonde peut également être ajusté afin d’améliorer la séparation des nuages et de diminuer le nombre de gouttelettes avec fluorescence intermédiaire (effet de pluie).
3. Évaluer l’arrière-plan ou la limite du blanc (LOB) du dosage.
   1. Effectuer un minimum de 48 réactions de ddPCR de dépôt individuel avec un contrôle WT ADN en utilisant les paramètres recuits et amorces/sondes concentrations choisies au point 3.2.
   2. Pour chaque réaction, calculer la fréquence de l’allèle mutant (CRG) comme suit : (nombre de mutant gouttelettes/nombre de gouttelettes remplies) x 100.
      NOTE : Le LOB est défini comme la moyenne MAF de faux-positifs et associé SD dont l’intervalle de confiance 95 % (IC à 95 %) est calculé. LOB = (moyenne de faux positifs du CRG) + IC à 95 %.
4. Évaluer la limite de détection (LOD) du test.
   1. Effectuer des réactions de ddPCR de dépôt à l’aide de dilutions successives du MUT ADN dans l’ADN de WT, avec MAFs variant entre 5 % et 0,01 % (≥ 8 répétitions par État). Utiliser des concentrations de paramètres et amorces/sondes recuites choisies au point 3.2.
      Remarque : La limite de détection est défini comme les plus petit CRG valeurs pour lequel réplique les valeurs moyennes présentes et SD ci-dessus le LOB (voir Decraene et al. ⁶ pour plus de détails).

4. ddPCR protocole (Figure 2 b)

Remarque : DdPCR similaire aux classiques, le protocole de ddPCR Drop-off se compose de 4 étapes : (i) PCR mélanger la préparation, génération de gouttelettes (ii), l’amplification par PCR (iii) et d’acquisition de données (iv).

1. Préparation de mélange PCR
   1. Des précautions standard, telles que le port de gants, à l’aide d’une hotte PCR clean propres pipettes et RNase, DNase-libre de l’eau distillée pour éviter toute contamination.
   2. Décongeler et équilibrer les éléments de réaction à température ambiante.
   3. Préparer 20 x mélange amorces/sondes dans l’eau distillée, avec les amorces à 18 µM de chaque et sondes à 5 µM de chaque.
   4. Pour toutes les réactions de PCR individuelles, préparer un mélange de l’échantillon en combinant 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µL de 20 x mélange amorces/sondes et jusqu'à 10 ng ADN échantillon qsp 20 µL d’eau distillée.
   5. Vortex la réaction bien mélanger afin de garantir l’homogénéité et centrifuger brièvement pour collecter les contenus dans le bas du tube avant la distribution. N’hésitez pas à répéter cette étape pour chaque mélange de réaction avant utilisation.
2. Génération de gouttelettes
   1. Insérez la cartouche de ddPCR dans le support et charger 20 μL de mélange réactionnel contenant des échantillons dans les puits moyens de la cartouche pour la production de gouttelettes (postes verts dans la Figure 2 b) à l’aide d’une pipette à 8 canaux.
   2. Ajouter 70 μL d’huile de générateur de gouttelettes dans les puits à fond (jaunes postes).
   3. Insérez la cartouche, avec un joint d’étanchéité, dans le générateur de gouttelettes ; gouttelettes se produiront dans les puits supérieurs de la cartouche (postes bleus).
   4. Aspirer et distribuer lentement et doucement (pour éviter le cisaillement) 40 μL des gouttelettes contenue dans les cartouches dans une assiette PCR 96 puits. Utiliser une pipette multicanaux pour optimiser le transfert des gouttelettes.
3. Amplification par PCR
   1. Sceller la plaque PCR finale avec une feuille d’aluminium à l’aide d’un film adhésif immédiatement après le transfert de gouttelettes pour éviter l’évaporation. Brièvement, centrifuger la plaque pour collecter le contenu au fond des puits.
   2. Exécuter une amplification PCR conventionnelle sur un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 95 ° C 10 min, 40 cycles de [94 ° C 30 s, validée par recuit T ° pendant 60 s], 98 ° C 10 min (rampe 2,5 ° C/s). Inclure les contrôles pas d’entrée de l’ADN et l’ADN de type sauvage (≥3 réplique) pour chaque série.
   3. Lorsque la course est terminée, centrifuger brièvement la plaque pour collecter le contenu au fond des puits.
4. Acquisition de données
   1. Après amplification par PCR, utiliser le lecteur de la gouttelette au comte PCR positif et des gouttelettes de PCR négatif, suivant les instructions du fabricant.
      Remarque : Le lecteur de gouttelettes propose généralement un système de détection optique bicolore compatible avec des fluorophores FAM, VIC ou HEX.

5. analyse (Figure 2 et Figure 3)

NOTE : Gouttelettes PCR-positifs et négatifs PCR sont comptés pour fournir une quantification absolue de la MUT et les allèles WT à la région ciblée. Les gouttelettes attribuées sont utilisés pour calculer le CRG dans chaque puits. Gouttelette quantification et analyse des déclins analyses peuvent être effectuées en utilisant le paquet de ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) développé par Attali et ses collègues^9,10. Ce progiciel R classe automatiquement les gouttelettes dans le vide, cadre de la « pluie » (en raison de l’amplification inefficace), ou comme rempli d’un signal réel positif (Figure 3). La section suivante présente les différentes étapes de l’analyse est une version courte de la vignette descriptive de l’algorithme rédigé par ses auteurs (Voir l’algorithme de https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. MDM pour plus de détails). Les données sont exportées vers des fichiers de valeurs séparées par des virgules (FileName_Amplitude.csv) et téléchargées dans le package ddPCR pour être analysées directement sur R ou via l’interface web dédiée.

1. Réglages de paramètre
   NOTE : Chaque modèle de dosage de déclin entraîne des distributions spécifiques gouttelette final et variations dans la forme des nuages, des séparations ou des postes doit être prévu. Afin d’assurer une analyse automatisée efficace, un ensemble de paramètres doit être ajustée. Si un bien a un profil inattendu, cela pourrait causer à l’analyse de la plaque entière à l’échec, ce qui entraîne un message d’erreur. La problématique bien devra être identifié et supprimé de l’analyse automatique.
   1. Identifier des puits ayant échouées à l’aide de (REMOVE_FAILURES). Utilisez TOTAL_DROPS_T (valeur par défaut est 5 000) pour ajuster le nombre minimal de gouttelettes en suspension dans chaque puits. Utilisez EMPTY_LAMBDA_LOW_T (valeur par défaut est 0. 3) et EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (valeur par défaut est de 0,99) pour ajuster les paramètres qui évaluent les nuages de gouttelettes attendus (vide, Mout, WT) et leur qualité.
      Remarque : Ayant trop de gouttelettes vides est un signe qu’il n’a pas suffisamment amplifiable modèle dans la réaction.
   2. Identifier les gouttelettes aberrantes en utilisant (REMOVE_OUTLIERS). Utilisez TOP_PERCENT (valeur par défaut est p = 1 %) pour ajuster le pourcentage de p haut de gouttelettes ayant la valeur la plus élevée de signal dans chaque dimension de signal (FAM, VIC/HEX) hors de gouttelettes dans la plaque entière. Utilisez CUTOFF_IQR (valeur par défaut est 5) pour régler le seuil de valeur aberrante de la tranche de % p de signal plus élevé.
   3. Identifier les gouttelettes vides à l’aide de (REMOVE_EMPTY). Utilisez CUTOFF_SD (valeur par défaut est 7) pour ajuster l’écart type de la distribution de Gauss (gouttelettes vide) inférieure des valeurs sonde 1.
   4. Gouttelettes de porte à l’aide de (classer). Utilisez CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (valeur par défaut est 3) pour ajuster l’écart type de la distribution de Gauss (gouttelettes remplies) supérieure des valeurs sonde 1. Utilisez ADJUST_BW_MIN (valeur par défaut est 4) et ADJUST_BW_MAX (valeur par défaut est 20) pour ajuster les paramètres k_min et k_max pour estimer la densité du noyau des sonde 2 valeurs et discriminer la MUT et le nuage WT de gouttelettes.
      1. Utilisez SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (valeur par défaut est p = 1 %) et SIGNIFICANT_P_VALUE (valeur par défaut est s=0.01% niveau de signification) pour classer les puits comme mutant ou type sauvage.
         Remarque : Dans cet algorithme, un mutant bien est défini comme ayant un CRG statistiquement significativement plus élevée que p %.
2. Analyse automatisée
   Remarque : Pour chaque paramètre présentée dans cette section, les auteurs du package ddPCR R ont des valeurs proposées par défaut basées sur leur expertise et leurs données. Cependant, tous les paramètres peuvent être modifiés pour améliorer la qualité de l’analyse (Figure 3).
   1. Identifier les puits ayant échouées.
      1. Utilisez les quatre paramètres de contrôle de la qualité (paramètres : REMOVE_FAILURES) pour identifier des puits défectueux ; le premier est le nombre minimal de gouttelettes qui doit contenir un puits. Les trois autres se concentrent sur l’identification des populations de candidat valable pour vide, éventuellement FAM + et HEX + / VIC + gouttelettes. Retirez le puits qui ne respectent pas ces critères d’analyse en aval.
   2. Identifier les gouttelettes aberrantes.
      1. Afin d’éviter la gouttelette de blocage de l’inclinaison, supprimer les valeurs aberrantes (c.-à-d., les gouttelettes d’une valeur anormalement élevée de HEX/VIC ou FAM) de l’analyse en définissant un seuil limite supérieure (paramètres : REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identifier les gouttelettes vides.
      1. Identifier les gouttelettes vides afin de réduire la dimension des données (dans un puits typique, ils représenteront pour la plupart des gouttelettes) et d’éliminer les biais statistique en raison de la présence d’une grande partie des informations inutiles que les gouttelettes contenant seulement du modèle restent () paramètres : REMOVE_EMPTY).
   4. Effectuer des gouttelettes Gate.
      1. Classer les gouttes restantes en mutant, type sauvage ou pluie (paramètres : classer).
   5. Identifier les gouttelettes de pluie.
      1. Comme des gouttelettes de pluie résultent d’amplification inefficace, exclure du FAM + ou HEX + / VIC + nuages. Déterminer les frontières de leurs groupes à l’aide de leurs valeurs de sonde 1 (réglage : CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identifier le mutant par rapport aux gouttelettes de type sauvage.
      1. Comme le point culminant de l’analyse est la discrimination entre les modèles de mutant et de type sauvage, identifier toutes les gouttelettes restants à ce stade que l’un ou l’autre. Car ils devraient avoir des valeurs similaires de sonde 1, utilisez Probe 2 valeurs pour mieux prédire leur nature respective (paramètres : ADJUST_BW_MIN et ADJUST_BW_MAX).
   7. Classer les puits comme mutant contre sauvage.
      1. Après avoir déterminé quelles gouttelettes sont Mout et WT, calculer le CRG. L’utilisation de la fréquence des mutants et la p-valeur associée de chaque puits, il est possible de les classer (paramètres : SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) comme WT (contenant principalement des gouttelettes de WT) ou puits MUT (contenant un nombre statistiquement significatif de MUT gouttelettes).
3. Explorer et exporter les données
   1. Explorez et exportez les données comme le nombre de gouttelettes, valeurs aberrantes, gouttelettes vides, concentrations ou graphiques que vous peuvent personnaliser davantage pour représentation optimale.

Representative Results

Dans une étude de validation, des mutations exon 2 KRAS (codons 12 et 13) et EGFR exon 19 suppressions ont été étudiées en tissus FFPE et échantillons plasmatiques provenant de patients atteints de cancer en utilisant le dépôt ddPCR stratégie⁶.

La sonde de déclin KRAS interrogé une région bp 16 englobant plusieurs mutations dans l’exon 2 du gène KRAS , qui abritent plus de 95 % des mutations connues dans les cancers humains¹¹ KRAS . La sonde de référence était de 20 bp en longueur et 3 situé bp en aval. Afin d’optimiser notre essai, nous avons utilisé des ADN extrait de lignées de cellules contenant 2 des acides aminés plus fréquemment mutées KRAS : G12V (c.35GT, SW480) et G13D (c.38GA, 116 HCT).

Le dosage de déclin EGFR a été conçu pour rechercher toutes les destructions activation de l’EGFR exon 19. Le test utilisé une sonde de 25 bp-long déclin placée au-dessus de la région supprimée récurrente avec une sonde de référence de 21 bp, situé 31 bp en aval dans l’amplicon même. Afin d’optimiser notre essai, nous avons utilisé un ensemble standard de référence de cfDNA y compris l' EGFR exon 19 suppression c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Sensibilité, spécificité et l’emplacement des nuages de gouttelettes ont été définis avec les échantillons de contrôle MUT et l’ADN génomique de PBMC WT tel qu’illustré à la Figure 4 a pour KRAS. De plus, nous avons démontré que ce type de test fonctionne sur de multiples types d’altérations génétiques telles que la substitution simple, plusieurs substitutions ou destructions (Figure 4 b), ainsi que sur divers échantillons types⁶.

Figure 1 : le déclin ddPCR nécessite une paire unique d’hydrolyse oligo-sondes pour balayer toutes les mutations d’une région hotspot. Dessins de dosage avec un résultat schématique affiché comme l’intensité de fluorescence des gouttelettes montrant des intrigues à deux dimensions. (A) ddPCR classiques avec mutant (sonde MUT) et sauvage (sonde WT) sondes ciblant la région même exacte. DdPCR (B) le dépôt contient une sonde de référence (sonde 1) qui recuits à une région non variable et une sonde de déclin (sonde 2) visant la région mutée mais complémentaire de la séquence WT, au sein de l’amplicon même. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : "workflow" ddPCR Drop-off pour plasma ADN mutation profilage. Le workflow complet se compose de 5 étapes principales : (A) (1) conception des amorces et des sondes, (2) optimisation du dosage, extraction d’isolement et cfDNA du plasma (3) (B), (4) ddPCR exécuter et analyse de données (5) (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : analyse de déclin ddPCR. Workflow Drop-off ddPCR analyse mettant en évidence les paramètres importants qui doivent être affinées. Cela garantit efficace identification automatisée des valeurs aberrantes, vides, de pluie ou de gouttelettes positives ; attribution des gouttelettes MUT ou WT et calcul le CRG pour chaque puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats représentatifs - KRAS et EGFR Drop-off ddPCR tests. (A) exemple de résultats obtenus lors des étapes d’optimisation du dosage ddPCR Drop-off. Détection de mutant et/ou d’ADN de type sauvage dans une réaction contenant 100 % MUT ADN, ADN de MUT de 5 % et 100 % WT ADN. (B) exemples d’échantillons plasmatiques analysées avec le KRAS et l' EGFR ddPCR déclin des analyses montrant la détection des nucléotides et des substitutions multiples dans l’exon 2 du KRAS et une délétion dans l’EGFR exon 19. Ce chiffre a été adapté de Decraene et al. ⁶. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Pour concevoir un test de ddPCR déclin efficace, l’optimisation est cruciale, et le protocole doit être suivi attentivement. Chaque combinaison des amorces et des sondes a une efficacité de réaction PCR unique. Ainsi, une analyse individuelle doit être soigneusement validés sur des échantillons de contrôle avant d’être utilisé sur des échantillons d’essai précieux. Optimisation et validation sont importantes pour certifier la détection de signal de crête et évaluer la spécificité et la sensibilité. Comme décrit dans le protocole, toutes les mutations situées dans une région cible couverte par la « sonde 2 » peuvent potentiellement être interrogées. Néanmoins, la validation est recommandée pour les mutations localisées aux extrémités 5' ou 3' de « sonde 2 », puisque ceux-ci peuvent affecter l’efficacité de l’essai de débarquement.

La méthode présentée ici peut être effectuée avec l’ADN extrait de n’importe quel type de « tissu », y compris les tissus FFIP, cellules dans des échantillons de sang ou de la culture. Cependant, la qualité de l’extraction des acides nucléiques peut influer considérablement sur ddPCR résultats. Inhibiteurs de PCR comme l’héparine, protéines, hème, phénol, protéases, collagène, mélanine, détergents ou sels doivent être éliminées autant que possible au cours de l’échantillonnage et les étapes de purification. Bien que des échantillons d’ADN peuvent être dilués pour réduire l’impact des inhibiteurs de PCR sur le ddPCR, dilution diminue la sensibilité car moins de copies de la cible seront testés par réaction. Cela devrait prendre en considération lorsqu’un certain niveau de sensibilité doit être atteint, car un minimum de copies doit être testé.

DdPCR Drop-off peut être appliquée à de nombreux types d’altérations moléculaires (substitutions nucléotidiques simples ou multiples, suppressions, etc.). Outre l’utilisation de seulement deux sondes pour détecter tous les changements (ce qui augmente la praticité et la rentabilité du test), Drop-off ddPCR génère moins de bruit de fond⁶ et montre une sensibilité accrue par rapport aux dosages multiplex. En outre, puisqu’il est effectué en une seule réaction, des quantités minimes d’échantillons de patients sont consommées. Ce dosage est particulièrement attrayant dans le cadre de la biopsie liquide parce que la quantité d’ADNct est souvent faible dans ces échantillons.

En effet, la méthode présentée ici s’applique pour le dépistage de la mutation en matériau liquide-biopsie et a déjà prouvé son utilité pour la pratique clinique (dépistage de mutation deESR1 dans l’essai clinique de PADA-1 - NCT03079011). Toutefois, il est essentiel d’utiliser des amplicons aussi court que possible dans ce cadre en raison de la fragmentation de cfDNA⁸.

Caractérisation en aval doit toujours être effectuée séparément afin d’identifier la mutation exacte par allèles mutants. Cependant, parce que les décisions thérapeutiques reposent principalement sur le statut mutationnel des régions hotspot des oncogènes targetable (mutant de vs WT), la capacité du déclin ddPCR de détecter immédiatement les mutations rend un puissant outil de diagnostic. Par ailleurs, la mutation exacte n’a pas besoin de s’appeler priori concevoir un dosage par opposition aux solutions commerciales actuelles. En outre, Drop-off ddPCRs combinable avec des épreuves de ddPCR conventionnelle spécifique pour augmenter le nombre de mutations dépistage (données non présentées). Enfin, ddPCR Drop-off peut être appliqué à d’autres domaines de la recherche. En particulier, il peut s’avérer un outil utile pour le dépistage des colonies positives dans les expériences de modification du génome.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer