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Genetics

हॉटस्पॉट क्षेत्रों में उत्परिवर्तनों का व्यापक और एक साथ पता लगाने के लिए एकल छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

doi: 10.3791/58051 Published: September 25, 2018

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक ही प्रतिक्रिया में एक लक्ष्य क्षेत्र के कई आनुवंशिक परिवर्तन ddPCR और hydrolysis जांच का एक अनूठा जोड़ी का उपयोग कर मात्रा को बढ़ाता है ।

Abstract

छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (ddPCR) नैनो आकार के पानी में तेल व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं के हजारों में नमूना अंश पर आधारित एक अति संवेदनशील मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) विधि है । हाल ही में, ddPCR ट्यूमर डीएनए (ctDNA) का पता लगाने के लिए परिसंचारी के लिए सबसे सटीक और संवेदनशील उपकरणों में से एक बन गया है । मानक ddPCR तकनीक की प्रमुख सीमाओं में से एक उत्परिवर्तनों की सीमित संख्या है कि प्रतिक्रिया प्रति दिखलाई जा सकता है, के रूप में विशिष्ट hydrolysis प्रत्येक संभव allelic संस्करण को पहचानने की जांच की आवश्यकता है । एक वैकल्पिक पद्धति, ड्रॉप बंद ddPCR, प्रवाह बढ़ जाती है, क्योंकि यह जांच की केवल एक जोड़ी की आवश्यकता का पता लगाने और लक्षित क्षेत्र में संभावित सभी आनुवंशिक परिवर्तन यों तो । ड्रॉप बंद ddPCR एक ही प्रतिक्रिया में उत्परिवर्तनों की एक बड़ी संख्या का पता लगाने के लाभ के साथ पारंपरिक ddPCR परख के लिए तुलनीय संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है । यह लागत प्रभावी है, कीमती नमूना सामग्री को संरक्षित करता है, और यह भी एक खोज उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब उत्परिवर्तनों एक प्राथमिकताओंज्ञात नहीं हैं ।

Introduction

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शारीरिक कैंसर के विकास से संबंधित उत्परिवर्तनों के हजारों1बताया गया है । इन के अलावा, कुछ लक्षित चिकित्सा 2,3 और इन उत्परिवर्तनों के आनुवंशिक स्क्रीनिंग की प्रभावकारिता के पूर्वानुमान मार्करों है अब नियमित नैदानिक अभ्यास है । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) प्रौद्योगिकी उपस्थिति या उच्च का पता लगाने सटीकता के साथ उत्परिवर्तनों के अभाव के लिए निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और गैर इनवेसिव तरल बायोप्सी4,5के साथ अत्यधिक संगत है । हालांकि, वर्तमान ddPCR परख मुख्य रूप से एक प्राथमिकताओंज्ञात उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । यह गंभीर रूप से एक खोज उपकरण के रूप में ddPCR का उपयोग सीमा जब उत्परिवर्तन अज्ञात है । दरअसल, पारंपरिक ddPCR डिजाइन में, एक hydrolysis जंगली प्रकार एलील (WT जांच) को पहचानने जांच उत्परिवर्ती एलील (MUT जांच) (आंकड़ा 1a) पहचानने एक विशिष्ट जांच के साथ प्रतिस्पर्धा है । उच्च संबध के साथ जांच टेंपलेट के लिए hybridizes और उसके fluorophore विज्ञप्ति, इसी एलील की प्रकृति का संकेत है । प्रत्येक छोटी बूंद के लिए प्राप्त प्रतिदीप्ति डेटा एक तितर बितर साजिश में visualized किया जा सकता है WT और MUT जांच विभिंन आयामों में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व । एक पारंपरिक ddPCR परख के लिए एक ठेठ परिणाम के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1aमें प्रस्तुत किया है । इस उदाहरण में, नीले बादल WT जांच द्वारा पहचाने गए WT alleles युक्त बूंदों से मेल खाती है, जबकि लाल बादल उन बूंदों से मेल खाती है जिनमें MUT एलील को MUT जांच द्वारा प्रवर्धित और पहचाना गया है । प्रतिक्रिया में लोड डीएनए की मात्रा के आधार पर, WT और MUT दोनों amplicons युक्त दोहरी सकारात्मक बूंदों (हरे बादल) प्रकट कर सकते हैं । हल्की धूसर बादल खाली बूंदों से मेल खाती है ।

के बाद से सबसे प्लेटफार्मों fluorophores की एक सीमित संख्या का पता लगाने के लिए अनुमति (आमतौर पर 2, लेकिन अप करने के लिए 5), पारंपरिक ddPCR का प्रवाह सीमित है । इसलिए, कई आसंन उत्परिवर्तनों के साथ क्षेत्रों लक्ष्यीकरण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मल्टीप्लेक्स ddPCR परख या एकाधिक समानांतर में प्रत्येक उत्परिवर्तन लक्ष्यीकरण प्रतिक्रियाओं के उपयोग के डिजाइन की आवश्यकता है । ड्रॉप बंद ddPCR रणनीति, इस सीमा पर काबू के रूप में यह संभवतः एक लक्षित क्षेत्र के भीतर किसी भी आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के WT hydrolysis जांच की एक अनूठी जोड़ी का उपयोग कर सकते हैं । पहली जांच (जांच 1) एक गैर चर अनुक्रम, लक्ष्य क्षेत्र और दूसरी जांच (जांच 2) को कवर लक्ष्य क्षेत्र के WT अनुक्रम जहां उत्परिवर्तनों (आंकड़ा 1b) की उंमीद कर रहे है के पूरक है । जबकि पहली जांच प्रतिक्रिया में प्रवर्धित अणुओं की कुल राशि quantifies, दूसरी जांच भेदभाव WT और MUT alleles उप द्वारा इष्टतम संकरण के उत्परिवर्ती दृश्यों के लिए । जांच 2 लक्ष्य क्षेत्र में उत्परिवर्तनों के कई प्रकार की पहचान कर सकते है (एक या एकाधिक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन, विलोपन, आदि)6। पारंपरिक ddPCR में के रूप में, प्रकाश ग्रे बादल कोई डीएनए अणुओं युक्त बूंदों से मेल खाती है । यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि परख के इस प्रकार, WT और MUT बादलों की इष्टतम जुदाई में प्रतिक्रिया में भरी हुई डीएनए की मात्रा पर निर्भर है, के बाद से दोनों WT और MUT लक्ष्य alleles युक्त बूंदों केवल WT युक्त बूंदों से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है प्रपत्र. इसलिए, इस परख की आवश्यकता है कि अधिकांश बूंदों को लक्षित जीन की एक से अधिक प्रति नहीं होते हैं ।

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Protocol

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यहां प्रस्तुत प्रोटोकाल में Institut क्यूरी के आचार दिशानिर्देश का पालन होता है । सभी मानव नमूनों को नामांकित रोगियों से प्राप्त किया गया था, सूचित सहमति के बाद, अध्ययन में Institut क्यूरी पर संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित ।

1. रक्त संग्रह, प्लाज्मा भंडारण और सेल मुक्त डीएनए निष्कर्षण

नोट: डीएनए "ऊतक" के किसी भी प्रकार से निकाले इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, ताजा या formaldehyde-फिक्स्ड आयल एंबेडेड (FFPE) ऊतकों, संस्कृति या रक्त के नमूनों में कोशिकाओं) । यहां, हम रक्त संग्रह, प्लाज्मा अलगाव और भंडारण, और सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) निष्कर्षण के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं ।

  1. रक्त संग्रह और प्लाज्मा संग्रहण (चित्रा बी)
    1. 7 मिलीलीटर EDTA ट्यूबों में रक्त के नमूने ले लीजिए । दो ट्यूबों प्लाज्मा के आसपास 4 मिलीलीटर इकट्ठा करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।
    2. ८२० पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों के लिए ट्यूब केंद्रापसारक रक्त ड्रा के 3 ज के भीतर लाल रक्त कोशिकाओं को अलग (आरबीसी), सफेद रक्त कोशिकाओं (WBC) और प्लाज्मा । नमूना और केंद्रापसारक के बीच का समय उच्च गुणवत्ता cfDNA प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, WBC से जारी डीएनए के साथ दूषित नहीं cfDNA) ।
    3. WBC परत को छूने के बिना 1 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग करके supernatant (प्लाज्मा) को सावधानीपूर्वक प्लास्टिक; प्लाज्मा के आसपास 2 मिलीलीटर आमतौर पर EDTA ट्यूब प्रति बरामद कर रहे हैं ।
    4. 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए प्लाज्मा स्थानांतरण और 15 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १६,००० x g पर aliquots केंद्रापसारक सेल मलबे को दूर करने के लिए ।
    5. सावधानी से गोली परेशान बिना supernatant (प्लाज्मा) प्लास्टिक । 2 मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूबों में प्लाज्मा वितरित और जरूरत है जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  2. cfDNA निष्कर्षण (चित्र b)
    नोट: यहां, हम मैनुअल निष्कर्षण किट का उपयोग कर प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । एक स्वचालित संस्करण निर्माता के निर्देशों का पालन भी cfDNA अलगाव के लिए किया जा सकता है ।
    1. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में Proteinase कश्मीर के ४०० µ एल रखो । प्लाज्मा के 4 मिलीलीटर जोड़ें (मात्रा नियमित रूप से इस्तेमाल किया) और lysis बफर ACL की ३.२ मिलीलीटर (१.० µ g वाहक आरएनए युक्त) किट से । एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए 30 एस के लिए भंवर द्वारा ट्यूब और मिश्रण बंद करो । 30 मिनट के लिए ६० ° c पर मशीन ।
    2. (किट से) बफर एसीबी के ७.२ मिलीलीटर जोड़ें सिलिका झिल्ली और मिश्रण करने के लिए परिसंचारी न्यूक्लिक एसिड की बाइंडिंग का अनुकूलन करने के लिए lysate के लिए भंवर द्वारा 15-30 एस मशीन बर्फ पर 5 मिनट के लिए ट्यूब ।
    3. कॉलम और वैक्यूम पंप में 20 मिलीलीटर भरनेवाला प्लेस । अप्रयुक्त पदों को बंद करने के लिए वैक्यूम आकांक्षा की अनुमति ।
    4. ध्यान से ट्यूब भरनेवाला में lysate बफर एसीबी मिश्रण लागू करें (संक्षेप में ट्यूब lysate-बफर एसीबी मिश्रण की अधिकतम इकट्ठा करने के लिए), निर्वात पंप पर स्विच और lysate पूरी तरह से कॉलम के माध्यम से तैयार किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं । निकालें और ट्यूब भरनेवाला त्यागें ।
    5. स्तंभ के लिए बफ़र ACW1 के ६०० µ l लागू करें । जब बफर ACW1 स्तंभ के माध्यम से तैयार की है, जोड़ें ७५० µ एल बफर ACW2 और अंत में इथेनॉल के ७५० µ एल जोड़ने (96-100%) । फिर, एक साफ 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में कॉलम प्लेस और पूरी गति से केंद्रापसारक (२०,००० एक्स जी) 3 मिनट के लिए इथेनॉल को खत्म करने के लिए ।
    6. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में कॉलम प्लेस । ढक्कन खोलें और 10 मिनट के लिए ५६ ° c पर गर्मी झिल्ली पूरी तरह से सूखी ।
    7. कॉलम को साफ १.५ मिलीलीटर डीएनए कम बाइंडिंग ट्यूब में रखें । ध्यान से ०.०४% सोडियम azide (बफर AVE) के साथ RNase मुक्त पानी की ३६ µ एल लागू होते हैं । ढक्कन बंद करो और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    8. पूरी गति से केंद्रापसारक (२०,००० x g) 1 मिनट के लिए elute न्यूक्लिक एसिड और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत है ।
  3. cfDNA ठहराव
    नोट: cfDNA ठहराव एक fluorometer के साथ किया जाता है तुरंत निष्कर्षण या सड़ के बाद कमरे के तापमान (RT), उपयोग करने से पहले के नमूने पर निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर । कई फ्रीज/गल चक्र से बचें ।
    1. उच्च संवेदनशीलता का प्रयोग करें cfDNA मात्रा की उंमीद के अनुसार परख, जो आमतौर पर कम है १०० एनजी/ cfDNA सांद्रता से लेकर 2-10 स्वस्थ दाताओं के लिए एनजी/एमएल मेटास्टेटिक रोग के साथ रोगियों में १०० एनजी/एमएल के रूप में उच्च के रूप में हो सकता है ।
    2. सुनिश्चित करें कि सभी रिएजेंट RT पर हैं और १९९ µ एल डाई (200x) प्रति प्रतिक्रिया (N संख्या के नमूने + 2 मानकों की fluorometer जांच करने के लिए) एक काम समाधान प्राप्त करने के लिए 1 µ l के साथ fluorometer कमजोर पड़ने बफर के मिश्रण.
    3. भंवर cfDNA अच्छी तरह से एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए और संक्षेप में ट्यूब के नीचे सामग्री एकत्र करने के लिए केंद्रापसारक समाधान ।
    4. १९५ µ l के साथ प्रत्येक cfDNA नमूना के 5 µ l को मिलाकर कार्य समाधान करे ।
    5. मिश्रण काम समाधान के १९० µ एल के साथ प्रत्येक मानक के 10 µ एल ।
    6. भंवर अच्छी तरह से 2 के लिए सभी ट्यूबों-3 के लिए एकरूपता सुनिश्चित करने और संक्षेप में ट्यूबों के तल पर सामग्री एकत्र करने के लिए केंद्रापसारक ।
    7. अंधेरे में 2 मिनट के लिए आर टी पर मशीन ।
    8. fluorometer में ट्यूबों पढ़ें, का उपयोग कर ' एनजी/µ एल ' आउटपुट मोड
    9. प्लाज्मा के एनजी/एमएल में अंतिम एकाग्रता निंनानुसार गणना: एनजी/µ एल एक्स ३६ (cfDNA eluate की मात्रा)/4 (निकाली प्लाज्मा की मात्रा) ।

2. ddPCR जांच और प्राइमर डिजाइन (चित्रा 2a)

नोट: ड्रॉप में लक्षित अणुओं के प्रवर्धन-बंद ddPCR परख qPCR के समान सिद्धांतों के बाद । प्रत्येक प्राइमर और जांच पारंपरिक समर्पित सॉफ्टवेयर Primer37 (http://primer3.ut.ee/) के साथ बनाया गया है ।

  1. प्राइमरी डिजाइन
    1. सामान्य सेटिंग्स विंडो में, परिवर्तन ' एकाग्रता की divalent cations ' करने के लिए ३.८, 'dNTPs की एकाग्रता' ०.८ करने के लिए, और ' भड़काने/दोहराने पुस्तकालय ' सही जीव के लिए.
    2. अग्रिम सेटिंग्स विंडो में, सांता लूसिया १९९८ करने के लिए दोनों ' ऊष्मा मापदंडों की तालिका ' और ' नमक एकाग्रता फार्मूला ' बदल जाते हैं ।
    3. ५५ और ७० ° c (oligonucleotide एकाग्रता के लिए नमक एकाग्रता और ३०० एनएम के लिए ५० मिमी के साथ) के बीच एक टीएम चुनें ।
    4. ऐसे PrimerBlast के रूप में उपकरणों का उपयोग कर प्राइमरों की विशिष्टता की जांच करें ।
    5. द्वितीयक संरचना वाले क्षेत्रों से बचें ।
    6. 50 – 60% की GC सामग्री है एक अनुक्रम चुनें ।
    7. 3 ठिकानों से अधिक समय जीएस और सीएस की दोहराने से बचें ।
    8. अपने 3 ' अंत में जी एस और सीएस के साथ प्राइमर चुनें जब संभव हो ।
    9. सुनिश्चित करें कि युग्मित प्राइमरों के 3 सिरों को प्राइमरी-dimers से बचने के लिए महत्वपूर्ण complementarity नहीं है । Amplicons से छोटा होना चाहिए १५० बीपी कुशलता से बढ़ाना cfDNA (माध्य आकार है १७० bp8) और FFPE से निकाले डीएनए, जो अक्सर खंडित है ।
  2. जांच डिजाइन
    नोट: Hydrolysis जांच 5 ' अंत में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ लेबल और 3 ' अंत में एक शमन कर रहे हैं । वे उच्च विशिष्टता, उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करते हैं और यदि जरूरत हो तो मल्टीप्लेक्स की अनुमति दें । दो चैनल छोटी बूंद पाठकों FAM और हेक्स या विक रंजक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से FAM/हेक्स या FAM/विक युग्मित जांच के विश्लेषण के साथ संगत कर रहे हैं ।
    1. डिजाइन hydrolysis जांच लक्ष्य क्षेत्र और आसंन गैर चर क्षेत्र के WT अनुक्रम के पूरक ।
    2. जांच चुनें दोनों पहले से डिजाइन प्राइमर जोड़ी द्वारा परिभाषित amplicon के भीतर स्थित है । प्राइमर दृश्यों जांच दृश्यों के साथ ओवरलैप नहीं कर सकते, हालांकि वे एक दूसरे के बगल में बैठ सकते हैं ।
    3. किनारा है कि जी एस से अधिक सीएस चुनें । जांच में 30-80% की GC सामग्री होनी चाहिए ।
    4. जांच का चयन करें जो लंबाई में 13 से 30 न्यूक्लियोटाइड के बीच हो । अब जांच के लिए उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदर्शन करते है क्योंकि fluorophore और शमन के बीच की दूरी fluorophore रिपोर्टर के शमन प्रभावित करता है ।
    5. प्राइमरी एनीलिंग और एक्सटेंशन के दौरान जांच hydrolysis सुनिश्चित करने के लिए प्राइमरों के टीएम की तुलना में 3 से 10 डिग्री सेल्सियस अधिक होने के लिए जांच के टीएम का चयन करें । टीएम बढ़ाने के लिए आवश्यक टीएम तक पहुंचने जबकि जांच कम रखने की सिफारिश कर रहे हैं, के रूप में कम जांच भेदभाव एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट और अधिक कुशलता से । जांच 5 ' अंत में एक जी नहीं है क्योंकि यह hydrolysis के बाद भी प्रतिदीप्ति संकेत शमन करना चाहिए ।
    6. डिज़ाइन ड्रॉप-ऑफ़ जांच निंनानुसार है: 5 '-(विक)-रूपांतरित क्षेत्र के पूरक WT अनुक्रम-(एमजीबी NFQ)-3 ' और संदर्भ जांच के रूप में: 5 '-(6-FAM)-एक गैर चर क्षेत्र के पूरक अनुक्रम-(एमजीबी NFQ)-3 ' । रिपोर्टर/शमनकर्ता के अंय संयोजन भी संभव है ।

3. ddPCR प्रतिक्रिया का अनुकूलन (चित्रा 2a)

नोट: जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती डीएनए इस कदम में इस्तेमाल नियंत्रण सेल लाइनों, ट्यूमर के नमूनों या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए संदर्भ मानकों से प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए ।

  1. थर्मल ढाल सुविधा का उपयोग करने के लिए डिजाइन प्राइमरों द्वारा परिवर्धित पीसीआर उत्पाद की विशिष्टता को मान्य करने के लिए एक थर्मल साइकिल चालक पर एक पारंपरिक पीसीआर प्रदर्शन ।
    1. एक अद्वितीय पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार के रूप में कदम ४.१ में नीचे वर्णित के रूप में (जांच के बिना) एक जंगली प्रकार के डीएनए नियंत्रण के लिए एक ंयूनतम 8 प्रतिक्रियाओं के लिए टेंपलेट पर तापमान के अनुसार कम से एक प्रतिक्रिया है ।
    2. कदम 4.3.2 पर वर्णित कार्यक्रम का उपयोग प्रवर्धन चलाने और प्राइमरों के सैद्धांतिक एनीलिंग तापमान के आसपास एनीलिंग तापमान की एक सीमा ।
    3. एनीलिंग तापमान विशिष्ट उत्पादों को उपलब्ध कराने के लिए चयन करने के लिए एक 3% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों लोड ।
  2. ऊपर वर्णित पैरामीटर्स का उपयोग करके ड्रॉप-ऑफ़ ddPCRs की श्रृंखला निष्पादित करें लेकिन इस समय दोनों जांचें शामिल हैं ।
    1. उपयोग १००% WT डीएनए, १००% MUT डीएनए और WT और MUT डीएनए का एक मिश्रण (जैसे, ५०% MUT/WT और WT छोटी बूंद बादलों की स्पष्ट जुदाई के लिए सबसे अच्छी स्थिति का निर्धारण करने के लिए ।
    2. चरण ४.१ में चुने गए तापमान के ऊपर एनीलिंग तापमान की एक श्रेणी चुनें ।
    3. एनीलिंग तापमान जो WT या MUT संकेतों का विशिष्ट पता लगाने के लिए अनुमति देता है का चयन करें जब १००% WT डीएनए या १००% MUT डीएनए और WT और MUT छोटी बूंद बादल का सबसे अच्छा जुदाई का उपयोग कर ।
    4. एनीलिंग समय और प्राइमर/जांच सांद्रता भी बादलों की जुदाई में सुधार करने के लिए और मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति (वर्षा प्रभाव) के साथ बूंदों की संख्या में कमी करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
  3. पृष्ठभूमि या खाली की सीमा का मूल्यांकन करें (LOB) परख की ।
    1. ३.२ में चुना एनीलिंग मापदंडों और प्राइमरों/जांच सांद्रता का उपयोग कर एक WT नियंत्रण डीएनए के साथ ४८ व्यक्तिगत ड्रॉप-ऑफ ddPCR प्रतिक्रियाओं की एक ंयूनतम प्रदर्शन ।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, के रूप में उत्परिवर्ती एलील आवृत्ति (MAF) की गणना इस प्रकार है: (उत्परिवर्ती बूंदों की संख्या/
      नोट: LOB false-धनात्मक MAF माध्य और संबद्ध SD जिसमें से ९५% विश्वास अंतराल (९५% CI) परिकलित है के रूप में परिभाषित किया गया है । LOB = (false-धनात्मक MAF का अर्थ) + ९५% CI ।
  4. परख का पता लगाने की सीमा (लोद) का मूल्यांकन करें ।
    1. प्रदर्शन ड्रॉप बंद ddPCR WT डीएनए में MUT डीएनए के धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग प्रतिक्रियाओं, 5% से ०.०१% से लेकर MAFs के साथ (≥ 8 शर्त प्रति दोहराने) । ३.२ में चुना एनीलिंग मानकों और प्राइमरों/जांच का उपयोग करें ।
      नोट: लोद के लिए सबसे छोटा MAF मान के रूप में परिभाषित किया गया है जो वर्तमान औसत मानों और SD LOB के ऊपर प्रतिकृति करता है (देखें Decraene एट अल । 6 अधिक जानकारी के लिए) ।

4. ddPCR प्रोटोकॉल (चित्रा 2 बी)

नोट: पारंपरिक ddPCR के समान, ड्रॉप-ऑफ़ ddPCR प्रोटोकॉल में 4 चरण होते हैं: (i) पीसीआर मिक्स तैयारी, (ii) छोटी बूंद पीढ़ी, (iii) पीसीआर प्रवर्धन और (iv) डेटा अर्जन ।

  1. पीसीआर मिक्स वडा
    1. मानक सावधानियों, जैसे दस्ताने पहने, एक स्वच्छ पीसीआर हुड, स्वच्छ पिपेट, और RNase, DNase से मुक्त आसुत जल का उपयोग कर संक्रमण से बचने के लिए का पालन करें ।
    2. गल और आरटी पर प्रतिक्रिया घटकों equilibrate ।
    3. आसुत जल में 20x प्राइमरों/जांच मिश्रण तैयार, प्राइमरों के साथ 18 µ मीटर प्रत्येक पर और जांच 5 µ मीटर प्रत्येक पर ।
    4. सभी व्यक्तिगत पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए, 2x ddPCR supermix के संयोजन के द्वारा एक नमूना मिश्रण तैयार करें (10 μL), 20x प्राइमरों की 1 µ एल/जांच मिश्रण और आसुत जल के 10 एनजी डीएनए नमूना qsp 20 µ l तक ।
    5. भंवर रिएक्शन अच्छी तरह से एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण और संक्षेप में वितरण से पहले ट्यूब के तल पर सामग्री एकत्र करने के लिए केंद्रापसारक । उपयोग करने से पहले प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए इस कदम को दोहराने में संकोच न करें ।
  2. छोटी बूंद पीढ़ी
    1. धारक में ddPCR कारतूस डालें और प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μL लोड छोटी बूंद पीढ़ी के लिए कारतूस के मध्य कुओं में नमूने से युक्त ( चित्रा 2 बीमें हरे रंग की स्थिति) एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग कर ।
    2. नीचे कुओं (पीले पदों) में छोटी बूंद जनरेटर तेल की ७० μL जोड़ें ।
    3. कारतूस डालें, एक गैसकेट के साथ, छोटी बूंद जनरेटर में; बूंदों कारतूस (नीले पदों) के शीर्ष कुओं में उत्पादन किया जाएगा ।
    4. महाप्राण और धीरे से तिरस्कृत करना (बाल काटना से बचने के लिए) ४० कारतूस से एक ९६-खैर पीसीआर प्लेट में बूंदों की μL । एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए बूंदों के हस्तांतरण का अनुकूलन ।
  3. पीसीआर प्रवर्धन
    1. एक एल्यूमीनियम पंनी के साथ अंतिम पीसीआर प्लेट सील तुरंत वाष्पीकरण से बचने के लिए बूंदों को स्थानांतरित करने के बाद एक थाली मुहर का उपयोग । संक्षेप में प्लेट को कुओं के तल पर सामग्री इकट्ठा करने के लिए ।
    2. एक थर्मल साइकिल चालक पर एक पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन भागो निंनलिखित प्रोग्राम का उपयोग: ९५ ° c 10 मिनट, [९४ ° c 30 एस के ४० चक्र, ६० एस के लिए मांय एनीलिंग टी °], ९८ ° c 10 मिनट (रैंप 2.5 ° c/ कोई इनपुट डीएनए और जंगली प्रकार के डीएनए के साथ नियंत्रण शामिल करें (≥ 3 प्रतिकृति) प्रत्येक चलाने में ।
    3. जब रन पूरा हो गया है, संक्षेप में थाली केंद्रापसारक को कुओं के नीचे सामग्री इकट्ठा ।
  4. डेटा प्राप्ति
    1. पीसीआर प्रवर्धन के बाद, निर्माता के निर्देशों का पालन, पीसीआर पॉजिटिव और पीसीआर नकारात्मक बूंदों गिनती करने के लिए छोटी बूंद पाठक का उपयोग करें ।
      नोट: छोटी बूंद पाठक आमतौर पर एक दो रंग ऑप्टिकल जांच प्रणाली FAM, विक या हेक्स fluorophores के साथ संगत प्रदान करता है ।

5. डाटा एनालिसिस (फिगर 2c और चित्रा 3)

नोट: पीसीआर-पॉजीटिव और पीसीआर-नेगेटिव बूंदों को लक्षित क्षेत्र में MUT और WT alleles का एक निरपेक्ष ठहराव प्रदान करने के लिए गिना जाता है । असाइन की गई बूंदों का उपयोग प्रत्येक कुआं में MAF की गणना करने के लिए किया जाता है । छोटी बूंद ठहराव और ड्रॉप के विश्लेषण की परख ddPCR आर पैकेज (https://github.com/daattali/ddpcr) Attali और9,10सहयोगियों द्वारा विकसित का उपयोग किया जा सकता है । इस R पैकेज स्वचालित रूप से खाली, "वर्षा" के भाग के रूप में वर्गीकरण बूंदों (अकुशल प्रवर्धन के कारण), या के रूप में एक वास्तविक सकारात्मक संकेत (चित्रा 3) के साथ भरा । निंनलिखित अनुभाग के विश्लेषण के विभिंन कदम प्रस्तुत करने के अपने लेखकों द्वारा लिखित एल्गोरिथ्म के वर्णनात्मक शब्दचित्र का एक संक्षिप्त संस्करण है (https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/एल्गोरिथ्म देखें । अधिक जानकारी के लिए Rmd) । डेटा को अल्पविराम से अलग मूल्यों फ़ाइलों को निर्यात कर रहे है (FileName_Amplitude. csv) और ddPCR पैकेज में अपलोड करने के लिए सीधे आर में या समर्पित वेब अंतरफलक के माध्यम से विश्लेषण किया जाएगा ।

  1. पैरामीटर समायोजन
    नोट: प्रत्येक ड्रॉप ऑफ परख विशिष्ट अंतिम छोटी बूंद वितरण और बादल फार्म, जुदाई या पदों में बदलाव में डिजाइन परिणाम की उंमीद की जा रही है । कुशल स्वचालित विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए, पैरामीटर्स का एक सेट समायोजित करने की आवश्यकता है । एक अच्छी तरह से एक अप्रत्याशित प्रोफ़ाइल है, तो यह एक त्रुटि संदेश में जिसके परिणामस्वरूप, विफल करने के लिए पूरी थाली के विश्लेषण के कारण हो सकता है । समस्याग्रस्त अच्छी तरह से पहचान की है और स्वचालित विश्लेषण से हटा दिया जाएगा ।
    1. पहचान असफल कुओं का उपयोग (REMOVE_FAILURES) । TOTAL_DROPS_T का प्रयोग करें (डिफ़ॉल्ट मान ५,००० है) प्रत्येक कुआं में बूंदों की ंयूनतम संख्या को समायोजित करने के लिए । का प्रयोग करें EMPTY_LAMBDA_LOW_T (डिफ़ॉल्ट मान ०.३ है) और EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (डिफ़ॉल्ट मान ०.९९ है) की उंमीद छोटी बूंद बादल (खाली, MUT, WT) और उनकी गुणवत्ता का मूल्यांकन मैट्रिक्स को समायोजित करने के लिए ।
      नोट: बहुत अधिक खाली बूंदें होने एक संकेत है कि प्रतिक्रिया में पर्याप्त प्रवर्धित टेंपलेट नहीं था ।
    2. (REMOVE_OUTLIERS) का उपयोग कर ग़ैर बूंदों की पहचान । का प्रयोग करें TOP_PERCENT (डिफ़ॉल्ट p = 1%) प्रत्येक संकेत आयाम में उच्चतम संकेत मूल्य (FAM, विक/हेक्स) पूरी थाली में बूंदों से बाहर होने की बूंदों के शीर्ष पी प्रतिशत समायोजित करने के लिए । उपयोग CUTOFF_IQR (डिफ़ॉल्ट है 5) उच्चतम संकेत के शीर्ष p प्रतिशत की ग़ैर थ्रेशोल्ड समायोजित करने के लिए ।
    3. (REMOVE_EMPTY) का उपयोग कर खाली बूंदों की पहचान । का प्रयोग करें CUTOFF_SD (डिफ़ॉल्ट 7 है) के मानक विचलन को समायोजित करने के लिए निचली (खाली बूंदें) जांच के गाऊसी वितरण 1 मान ।
    4. गेट बूंदों का उपयोग (वर्गीकृत) । CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD का उपयोग करें (डिफ़ॉल्ट है 3) उच्च (भरी हुई बूंदों) के मानक विचलन को समायोजित करने के लिए जांच 1 मान के गाऊसी वितरण । का प्रयोग करें ADJUST_BW_MIN (डिफ़ॉल्ट 4 है) और ADJUST_BW_MAX (डिफ़ॉल्ट 20 है) को समायोजित करने के लिए k_min और k_max पैरामीटर जांच के कर्नेल घनत्व का अनुमान लगाने के लिए 2 मूल्यों और भेदभाव MUT और बूंदों के WT बादल ।
      1. का प्रयोग करें SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (डिफ़ॉल्ट p = 1%) और SIGNIFICANT_P_VALUE (डिफ़ॉल्ट है महत्व स्तर एस = 0.01%) या तो उत्परिवर्ती या wildtype के रूप में वर्गीकृत कुओं ।
        नोट: इस एल्गोरिथ्म में, एक उत्परिवर्ती अच्छी तरह से p% से सांख्यिकीय काफी अधिक है कि एक MAF होने के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  2. स्वचालित विश्लेषण
    नोट: इस खंड में प्रस्तुत प्रत्येक पैरामीटर के लिए, लेखकों ddPCR R पैकेज की उनकी विशेषज्ञता और उनके डेटा के आधार पर डिफ़ॉल्ट मान प्रस्तावित है । हालांकि, सभी पैरामीटर्स को विश्लेषण (चित्र 3) की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है ।
    1. विफल कुओं की पहचान ।
      1. विफल कुओं की पहचान करने के लिए चार गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक (सेटिंग्स: REMOVE_FAILURES) का उपयोग करें; पहले एक अच्छी तरह से शामिल होना चाहिए कि बूंदों की न्यूनतम संख्या है । खाली, संभवतः FAM + और हेक्स +/VIC + बूंदों के लिए वैध उंमीदवार आबादी की पहचान पर अंय तीन ध्यान केंद्रित । कुओं कि बहाव विश्लेषण से इन मानदंडों को पूरा करने में विफल निकालें ।
    2. ग़ैर बूंदों को पहचानें ।
      1. आदेश में छोटी बूंद गेटिंग से बचने के लिए, outliers (यानी, एक असामान्य रूप से उच्च हेक्स/विक या FAM मूल्य के साथ बूंदों) को एक ऊपरी सीमा दहलीज (सेटिंग्स: REMOVE_OUTLIERS) सेट करके आगे विश्लेषण से हटा दें ।
    3. खाली बूंदों को पहचानें ।
      1. डेटा के आयाम को कम करने के लिए खाली बूंदों की पहचान करें (विशिष्ट रूप से, वे अधिकांश बूंदों के लिए खाते होंगे) और केवल टेंपलेट युक्त बूंदों के रूप में बेकार जानकारी के एक बड़े हिस्से की उपस्थिति के कारण सांख्यिकीय पूर्वाग्रह को खत्म ( सेटिंग्स: REMOVE_EMPTY) ।
    4. छोटी बूंद गेटिंग प्रदर्शन ।
      1. या तो उत्परिवर्ती, wildtype या बारिश (सेटिंग्स: वर्गीकृत) के रूप में शेष बूंदों वर्गीकृत ।
    5. बारिश की बूंदों की पहचान ।
      1. के रूप में बारिश की बूंदों अकुशल प्रवर्धन से परिणाम, FAM + या हेक्स +/VIC + बादलों से बाहर । उनकी जांच 1 मूल्यों (सेटिंग: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD) का उपयोग कर अपने समूहों की सीमाओं का निर्धारण ।
    6. की पहचान उत्परिवर्ती बनाम जंगली प्रकार की बूंदों ।
      1. विश्लेषण के प्रकाश के रूप में उत्परिवर्ती और wildtype के बीच भेदभाव है टेंपलेट्स, या तो एक या दूसरे के रूप में इस स्तर पर सभी शेष बूंदों की पहचान । के बाद से वे इसी तरह की जांच करना चाहिए 1 मूल्यों, जांच 2 मूल्यों का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा उनके संबंधित प्रकृति (सेटिंग्स: ADJUST_BW_MIN और ADJUST_BW_MAX) की भविष्यवाणी ।
    7. जंगली प्रकार के उत्परिवर्ती बनाम कुओं के रूप में वर्गीकृत ।
      1. निर्धारित करने के बाद जो बूंदें MUT और WT हैं, MAF की गणना करें । एक अच्छी तरह के उत्परिवर्ती आवृत्ति और संबंधित पी-मूल्य का उपयोग करना, यह उन्हें वर्गीकृत करने के लिए संभव है (सेटिंग्स: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) WT के रूप में (ज्यादातर WT बूंदों से युक्त) या MUT वेल्स (MUT की एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संख्या से युक्त बूंदें) ।
  3. डेटा का अंवेषण और निर्यात करें
    1. अन्वेषण और बूंदों की संख्या के रूप में डेटा निर्यात, outliers, खाली बूंदें, सांद्रता या रेखांकन है कि आगे इष्टतम प्रतिनिधित्व के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Representative Results

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एक सबूत के अवधारणा अध्ययन में, KRAS एक्सॉन 2 उत्परिवर्तनों (codons 12 और 13) और EGFR एक्सॉन 19 विलोपन FFPE ऊतकों और कैंसर के रोगियों से प्लाज्मा के नमूनों में ड्रॉप-ऑफ ddPCR6रणनीति का उपयोग कर जांच की गई ।

KRAS ड्रॉप जांच से एक 16 बीपी क्षेत्र KRAS जीन है, जो मानव कैंसर11में जाना जाता KRAS उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक बंदरगाह के 2 एक्सॉन में कई उत्परिवर्तनों को शामिल पूछताछ की । संदर्भ जांच में 20 बीपी लंबाई में और 3 बीपी बहाव स्थित था । हमारे परख का अनुकूलन, हम सेल सबसे अक्सर रूपांतरित KRAS अमीनो एसिड के 2 युक्त लाइनों से निकाले डीएनए का इस्तेमाल किया: G12V (सी. 35GT, SW480) और G13D (सी. 38GA, HCT ११६) ।

EGFR ड्रॉप-ऑफ परख EGFR एक्सॉन 19 के सभी हटाने को सक्रिय करने के लिए स्कैन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । परख 21 बीपी की एक संदर्भ जांच के साथ एक साथ आवर्तक नष्ट क्षेत्र पर रखा एक 25 बीपी लंबी बूंद की जांच का इस्तेमाल किया, एक ही amplicon में 31 बीपी बहाव स्थित है । हमारे परख अनुकूलित करने के लिए, हम EGFR एक्सॉन 19 विलोपन सी 2235_2249del, पी Glu746_Ala750del सहित एक cfDNA संदर्भ मानक सेट का इस्तेमाल किया ।

संवेदनशीलता, विशिष्टता और छोटी बूंद बादल के स्थान नियंत्रण MUT नमूनों और WT PBMC जीनोमिक डीएनए के रूप में KRAS के लिए चित्र 4a में दिखाए गए के साथ परिभाषित किया गया है । हम आगे का प्रदर्शन किया है कि परख के इस प्रकार के एकल प्रतिस्थापन के रूप में आनुवंशिक परिवर्तन के कई प्रकार पर काम करता है, एकाधिक प्रतिस्थापन या विलोपन (चित्रा 4B) के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिंन नमूना प्रकार6पर ।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रॉप-ऑफ ddPCR hydrolysis oligo की एक अनूठी जोड़ी की आवश्यकता है-जांच करने के लिए एक hotspot क्षेत्र के सभी उत्परिवर्तनों स्कैन । एक योजनाबद्ध परिणाम के साथ परख डिजाइन दो आयामी तितर बितर छोटी बूंद प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखा भूखंडों के रूप में प्रदर्शित । (एक) उत्परिवर्ती (MUT जांच) और वंय-प्रकार (WT जांच) के साथ पारंपरिक ddPCR सटीक एक ही क्षेत्र को लक्षित जांच । (B) ड्रॉप-ऑफ़ ddPCR में एक संदर्भ जांच (जांच 1) होती है जो एक गैर-परिवर्तनीय क्षेत्र को anneals है और एक ड्रॉप-ऑफ़ जांच (जांच 2) रूपांतरित क्षेत्र को लक्षित करता है लेकिन WT अनुक्रम के पूरक है, उसी amplicon के भीतर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: प्लाज्मा डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए ड्रॉप-ऑफ ddPCR कार्यप्रवाह । पूर्ण कार्यप्रवाह 5 प्रमुख चरणों से बना है: (A) (1) प्राइमरों और जांच के डिजाइन, (2) परख के अनुकूलन, () (3) प्लाज्मा अलगाव और cfDNA निष्कर्षण, (4) ddPCR भागो और () (5) डेटा विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ड्रॉप-ऑफ ddPCR विश्लेषण । ड्रॉप-ऑफ़ ddPCR विश्लेषण वर्कफ़्लो उन महत्वपूर्ण पैरामीटर्स को हाइलाइट करता है जिंहें ठीक-ट्यून करने की आवश्यकता होती है । यह outliers, खाली, बारिश या सकारात्मक बूंदों के कुशल स्वचालित पहचान सुनिश्चित करता है; MUT या WT बूंदें निर्दिष्ट और एक अच्छी तरह के लिए MAF कंप्यूटिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम- KRAS और EGFR ड्रॉप बंद ddPCR परख । (A) ड्रॉप-ऑफ ddPCR परख के अनुकूलन चरणों के दौरान प्राप्त परिणामों का उदाहरण । १००% MUT डीएनए, 5% MUT डीएनए और १००% WT डीएनए युक्त प्रतिक्रिया में उत्परिवर्ती और/या जंगली प्रकार के डीएनए का पता लगाना । () प्लाज्मा नमूनों के उदाहरण KRAS और EGFR ड्रॉप बंद ddPCR परख के साथ विश्लेषण एक न्यूक्लियोटाइड और एक्सॉन के KRAS 2 में एकाधिक प्रतिस्थापन और EGFR एक्सॉन 19 में एक विलोपन का पता लगाने दिखा । यह आंकड़ा Decraene एट अल से अनुकूलित किया गया है । 6. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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एक कुशल ड्रॉप बंद ddPCR परख डिजाइन, अनुकूलन महत्वपूर्ण है, और प्रोटोकॉल ध्यान से पालन किया जाना चाहिए । प्राइमरों और जांच के प्रत्येक संयोजन एक अद्वितीय पीसीआर प्रतिक्रिया दक्षता है । इस प्रकार, एक व्यक्ति परख है ध्यान से नियंत्रण के नमूनों पर मांय से पहले मूल्यवान परीक्षण के नमूनों पर इस्तेमाल किया जा रहा है । अनुकूलन और सत्यापन पीक संकेत पता लगाने और विशिष्टता और संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, एक लक्ष्य "जांच 2" द्वारा कवर क्षेत्र में स्थित सभी उत्परिवर्तनों संभावित पूछताछ की जा सकती है । बहरहाल, सत्यापन या तो 5 ' या 3 ' की "जांच 2" समाप्त होता है पर स्थित उत्परिवर्तनों के लिए सिफारिश की है, के बाद से इन ड्रॉप की क्षमता को प्रभावित कर सकते है परख बंद ।

यहां प्रस्तुत विधि "ऊतक" के किसी भी प्रकार से निकाले गए डीएनए के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, FFPE ऊतकों सहित, संस्कृति या रक्त के नमूनों में कोशिकाओं. हालांकि, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की गुणवत्ता में नाटकीय रूप से ddPCR परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । पीसीआर अवरोधकों जैसे हेपरिन, प्रोटीन, षयवस्तु, phenol, टीज़, कोलेजन, मेलेनिन, डिटर्जेंट या लवण की सैंपलिंग और शुद्धि के कदम के दौरान जितना संभव हो सके खत्म किया जाना चाहिए । हालांकि डीएनए नमूनों ddPCR पर पीसीआर अवरोधकों के प्रभाव को कम करने के लिए पतला किया जा सकता है, कमजोर पड़ने संवेदनशीलता कम हो जाती है क्योंकि लक्ष्य की कम प्रतियां प्रति प्रतिक्रिया का परीक्षण किया जाएगा । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब संवेदनशीलता का एक निश्चित स्तर तक पहुंच सकता है, के रूप में एक ंयूनतम प्रतियां परीक्षण किया जाना चाहिए ।

ड्रॉप-ऑफ ddPCR आणविक परिवर्तन (एकल और एकाधिक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन, विलोपन, आदि) के कई प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । केवल दो जांच का उपयोग करने के अलावा सभी परिवर्तन का पता लगाने (जिससे व्यावहारिकता और लागत परख के प्रभाव में वृद्धि), ड्रॉप बंद ddPCR कम पृष्ठभूमि शोर6 उत्पंन करता है और मल्टीप्लेक्स परख की तुलना में वृद्धि की संवेदनशीलता से पता चलता है । इसके अतिरिक्त, एक ही प्रतिक्रिया में किया जाता है के बाद से, रोगी के नमूनों की न्यूनतम मात्रा खपत होती है । इस परख तरल बायोप्सी के संदर्भ में विशेष रूप से अपील है क्योंकि ctDNA की मात्रा अक्सर इन नमूनों में कम है ।

दरअसल, यहां प्रस्तुत विधि तरल बायोप्सी सामग्री में उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग के लिए लागू है और पहले से ही नैदानिक अभ्यास के लिए अपनी उपयोगिता साबित (ESR1 उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग में विराजित-1 नैदानिक परीक्षण-NCT03079011) । हालांकि, यह amplicons8cfDNA के विखंडन के कारण इस सेटिंग में संभव के रूप में कम के रूप में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

बहाव लक्षण वर्णन अभी भी अलग से प्रदर्शन करने के लिए सटीक उत्परिवर्ती alleles द्वारा किए गए उत्परिवर्तन की पहचान की जरूरत है । हालांकि, चिकित्सकीय निर्णय मुख्य रूप से लक्षित oncogenes (WT बनाम उत्परिवर्ती) के हॉटस्पॉट क्षेत्रों के उत्परिवर्तन की स्थिति पर आधारित हैं, क्योंकि तुरंत उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए ड्रॉप ऑफ ddPCR की क्षमता यह एक शक्तिशाली नैदानिक उपकरण बनाता है । इसके अलावा, सटीक उत्परिवर्तन के लिए एक प्राथमिकताओं को सम्पूर्णतया में वर्तमान वाणिज्यिक समाधान के लिए एक परख डिजाइन ज्ञात होने की जरूरत नहीं है । इसके अलावा, ड्रॉप बंद ddPCRs विशिष्ट पारंपरिक ddPCR परख के साथ संयुक्त किया जा सकता है और (डेटा नहीं दिखाया गया है) के लिए स्क्रीन उत्परिवर्तनों की संख्या में वृद्धि । अंत में, ड्रॉप-ऑफ ddPCR अनुसंधान के अंय क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, यह जीनोम संपादन प्रयोगों में सकारात्मक कालोनियों स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हो सकता है ।

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Disclosures

कई लेखकों दो पेटेंट अनुप्रयोगों के अंवेषकों नामित कर रहे है (ep 17305920.5, ep 18305277.8) ctDNA का पता लगाने से संबंधित ।

Acknowledgments

इस कार्य में Institut क्यूरी सिर्क (ग्रांट इंका-DGOS-४६५४) का सहयोग लिया गया । लेखक भी चाहते है कि वीडियो के लिए उसके योगदान के लिए कैरोलीन Hego धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2EDTA tube (color code : lavender) BD 367863 EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) Qiagen 55114 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) Qiagen 937556 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system Qiagen 9001297 fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus Qiagen 19413 For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226 The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader Bio-Rad 186-3003 or186-4003, respectively The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator Bio-Rad 186-3002 or 186-4002, respectively Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851196 Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer Bio-Rad 181-4000 PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder Bio-Rad 186-3051 Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets Bio-Rad 186-4007 Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix Bio-Rad 186-3010 ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates Eppendorf 951020362 96-well semi-skirted plates
Foil seal Bio-Rad 181-4040 Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL Eppendorf 0030 108.051 Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set HORIZON HD780 The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 Life Technologies Q32854 The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer

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References

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हॉटस्पॉट क्षेत्रों में उत्परिवर्तनों का व्यापक और एक साथ पता लगाने के लिए एकल छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
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Decraene, C., Bortolini Silveira, A., Michel, M., Bidard, F. C., Pierga, J. Y., Stern, M. H., Proudhon, C. Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions. J. Vis. Exp. (139), e58051, doi:10.3791/58051 (2018).More

Decraene, C., Bortolini Silveira, A., Michel, M., Bidard, F. C., Pierga, J. Y., Stern, M. H., Proudhon, C. Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions. J. Vis. Exp. (139), e58051, doi:10.3791/58051 (2018).

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