Gotícula única Digital cadeia da polimerase para detecção abrangente e simultânea de mutações nas regiões de Hotspot

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Abstract

Reação em cadeia da polimerase digital da gota (ddPCR) é um método de reação em cadeia (PCR) polimerase quantitativos altamente sensível baseado no fracionamento de amostra em milhares de reações individuais nanométricas de água em óleo. Recentemente, ddPCR tornou-se uma das ferramentas mais precisas e sensíveis para a deteção de DNA (ctDNA) tumor de circulação. Uma das principais limitações da técnica padrão ddPCR é o número restrito de mutações que podem ser rastreados por reação, como sondas de hidrólise específica reconhecendo cada possível versão alélico são necessárias. Um método alternativo, o ddPCR de entrega, aumenta a taxa de transferência, pois requer apenas um único par de sondas para detectar e quantificar potencialmente todas as alterações genéticas na região alvo. Entrega ddPCR exibe sensibilidade comparável para ensaios de ddPCR convencional com a vantagem de detectar um maior número de mutações em uma única reação. É cost-effective, conserva o material precioso de amostra e também pode ser usado como uma ferramenta de descoberta quando mutações não são conhecidas a priori.

Introduction

Milhares de mutações somáticas relacionadas ao desenvolvimento de câncer foram relatados¹. Entre estes, alguns são marcadores preditivos da eficácia da terapia-alvo ^2,3 e genética triagem destas mutações é agora rotina clínica. Tecnologia digital de PCR (ddPCR) da gota pode ser usada para monitorar a presença ou ausência de mutações com exatidão elevada da deteção e é altamente compatível com não-invasivos biópsias líquido^4,5. No entanto, ensaios de ddPCR atual principalmente são projetados para detectar mutações conhecidas a priori. Isto limita severamente o uso de ddPCR como uma ferramenta de descoberta quando a mutação é desconhecida. Com efeito, na concepção convencional ddPCR, uma sonda de hidrólise, reconhecendo o alelo selvagem-tipo (sonda de WT) concorre com uma sonda específica, reconhecendo o alelo mutante (MUT sonda) (figura 1A). A sonda com maior afinidade se para o modelo e libera seu fluoróforo, indicando a natureza do alelo correspondente. Os dados de fluorescência obtidos para cada gota podem ser visualizados em um gráfico de dispersão representando a fluorescência emitida por sondas WT e MUT em dimensões diferentes. Uma representação esquemática de um resultado típico para um ensaio de ddPCR convencional é apresentada na figura 1A. Neste exemplo, a nuvem azul corresponde as gotículas contendo alelos WT identificados pela sonda WT, Considerando que a nuvem vermelha corresponde a gotículas no qual o alelo MUT foi amplificado e identificado pela sonda MUT. Dependendo da quantidade de DNA carregado na reação, duplas positivas gotículas contendo tanto WT e MUT amplicons podem aparecer (nuvem verde). A nuvem de cinza luz corresponde ao vazias gotículas.

Desde que a maioria das plataformas de permitir a detecção de um número limitado de fluorophores (normalmente 2, mas até 5), a taxa de transferência de ddPCR convencional é limitada. Portanto, segmentando regiões com várias mutações adjacentes requer projeto de tecnicamente desafiador multiplex ddPCR ensaios ou o uso de múltiplas reações alvejando cada mutação em paralelo. A estratégia de ddPCR de entrega, supera essa limitação como potencialmente pode detectar qualquer alteração genética dentro de uma região de destino usando um único par de sondas de hidrólise do WT. As tampas de sonda (Probe 1) primeiras que uma sequência não-variável, adjacente à região de destino e a segunda sonda (sonda 2) é complementar à sequência de WT da região de destino, onde as mutações são esperados (figura 1B). Enquanto a primeira sonda quantifica a quantidade total de moléculas ampliáveis na reação, a segunda sonda discrimina WT e MUT alelos por hibridação sub-ótimo para sequências de mutantes. Sonda 2 pode identificar vários tipos de mutações na região (substituições de nucleotídeo único ou múltiplo, exclusão, etc.) alvo⁶. Como em ddPCR convencional, a nuvem de cinza luz corresponde a gotículas não contendo nenhuma molécula de DNA. É importante recordar que, neste tipo de ensaio, separação ideal de nuvens WT e MUT é dependente da quantidade de DNA carregado na reação, desde que gotículas contendo tanto WT e MUT alelos de destino não podem ser distinguidas gotículas contendo apenas o WT formulário. Portanto, este ensaio requer que a maioria das gotículas contenham não mais de uma cópia do gene alvo.

Protocol

O protocolo aqui apresentado segue as diretrizes de ética do Institut Curie. Todas as amostras humanas foram obtidas de pacientes matriculados, após consentimento informado, em estudos aprovados pelo Conselho de revisão institucional no Institut Curie.

1. recolha, armazenamento de Plasma e extração de DNA sem célula de sangue

Nota: O DNA extraído de qualquer tipo de "tecido" pode ser usado (por exemplo, fresco ou formaldeído-fixo parafina incorporado tecidos (FFPE), células em cultura ou sangue amostras). Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a coleta de sangue, plasma isolamento e armazenamento e extração de DNA (cfDNA) sem célula.

1. Armazenamento de coleção e o plasma de sangue (Figura 2B)
   1. Colete amostras de sangue em tubos de EDTA de 7 mL. Dois tubos são recomendados para coletar cerca de 4 mL de plasma.
   2. Centrifuga os tubos por 10 min a 820 x g , dentro de 3 h da para separar os glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e plasma de sangue. O tempo entre a amostragem e a centrifugação é fundamental para obter cfDNA de alta qualidade (i.e., cfDNA não contaminado com DNA liberado de WBC).
   3. Cuidadosamente, pipetar o sobrenadante (plasma) utilizando uma pipeta de 1ml sem tocar a camada de WBC; cerca de 2 mL de plasma geralmente são recuperados por tubo EDTA.
   4. Transferir o plasma para tubos de 2 mL e centrifugar as alíquotas a 16.000 x g durante 10 minutos a 15 ° C, para remover restos de célula.
   5. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante (plasma), sem perturbar o sedimento. Distribuir o plasma em tubos criogênicos de 2ml e armazenar a-80 ° C até ser necessário.
2. cfDNA extração (Figura 2B)
   Nota: Aqui, apresentamos o procedimento usando o kit de extração manual. Uma versão automatizada, seguindo as instruções do fabricante também pode ser realizada para isolamento de cfDNA.
   1. Colocar 400 µ l de Proteinase K em um tubo de 50 mL. Adicione 4 mL de plasma (volume rotineiramente usados) e 3,2 mL de tampão de Lise ACL (contendo 1,0 µ g de RNA do portador) do kit. Fechar o tubo e misture vortexing por 30 s para obter uma solução homogénea. Incube a 60 ° C por 30 min.
   2. Adicione 7,2 mL de tampão ACB (do kit) para o lisado para otimizar a ligação dos ácidos nucleicos circulantes para a membrana de silicone e misture por num Vortex para 15 a 30 s.. Incubar o tubo por 5 min no gelo.
   3. Coloque a coluna e o extensor de 20 mL para a bomba de vácuo. Feche as posições não utilizadas para permitir a aspiração de vácuo.
   4. Com cuidado, aplique a mistura ACB lisado-tampão para o prolongamento do tubo (brevemente centrifugar o tubo para coletar o máximo de mistura ACB lisado-tampão), ligar a bomba de vácuo e permitir que o lisado a ser desenhado pelas colunas completamente. Remova e descarte o prolongamento do tubo.
   5. Aplica 600 µ l de tampão ACW1 para a coluna. Quando o buffer de ACW1 tem atraído através da coluna, adicione 750 µ l tampão ACW2 e finalmente adicionar 750 µ l de etanol (96-100%). Em seguida, coloque a coluna em um tubo de coleta de 2ml limpo e centrifugar a toda velocidade (20.000 x g) por 3 min eliminar o etanol.
   6. Coloca a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL. Abra a tampa e incubar a 56 ° C durante 10 minutos para secar a membrana.
   7. Coloque a coluna em um tubo de ligação baixa de DNA limpa 1,5 mL. Aplique cuidadosamente 36 µ l de água livre de RNase com 0,04% de azida sódica (tampão de AVE). Feche a tampa e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
   8. Centrifugar a velocidade máxima (20.000 x g) durante 1 min eluir os ácidos nucleicos e armazenar a-20 ° C até ser necessário.
3. quantificação de cfDNA
   Nota: cfDNA quantificação é realizada com um dados usando o protocolo do fabricante imediatamente após a extração ou descongelar as amostras à temperatura ambiente (RT), antes da utilização. Evite múltiplos ciclos de congelamento/descongelamento.
   1. Use o ensaio de alta sensibilidade de acordo com a quantidade de cfDNA esperado, que é geralmente inferior a 100 ng/mL plasma. cfDNA concentrações variam de 2 a 10 ng/mL para doadores saudáveis mas podem ser tão altas quanto 100 ng/mL em pacientes com doença metastática.
   2. Certifique-se de todos os reagentes estão em RT e misturam 199 µ l de tampão de diluição de dados com 1 µ l de corante (200x) por reação (N número de amostras + 2 padrões para calibrar os dados) para obter uma solução de trabalho.
   3. A solução de cfDNA cuidadosamente para garantir a homogeneidade e brevemente centrifugar para coletar conteúdo na parte inferior do tubo de vórtice.
   4. Mistura de 5 µ l de cada amostra de cfDNA com 195 µ l da solução de trabalho.
   5. Mix 10 µ l de cada norma com 190 µ l da solução de trabalho.
   6. Vórtice minuciosamente todos os tubos para 2-3 s garantir a homogeneidade e brevemente centrifugar para coletar conteúdo na parte inferior dos tubos.
   7. Incube a RT por 2 min no escuro.
   8. Leia os tubos em dados, usando o modo de saída 'ng / µ l'
   9. Calcular a concentração final em ng/mL de plasma como segue: ng / µ l x 36 (volume de eluato cfDNA) / 4 (volume de plasma extraído).

2. ddPCR sonda e Primer Design (Figura 2A)

Nota: A amplificação das moléculas alvo no ensaio de ddPCR de entrega segue princípios semelhantes de qPCR. Cada primer e sonda é projetado com o software dedicado convencional Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Projeto da primeira demão
   1. Na janela de configurações gerais, altere 'concentração de cátions divalentes' para 3,8, 'concentração de dNTPs' para 0,8 e ' mispriming/repetição biblioteca ' para o organismo correto.
   2. Na janela de configurações de avanço, altere a 'Tabela de parâmetros termodinâmicos' e a 'fórmula de concentração de sal' a Santa Lucia 1998.
   3. Escolha um T_m entre 55 e 70 ° C (com 50 mM para a concentração de sal e 300 nM para a concentração do oligonucleotide).
   4. Verifica a especificidade das primeiras demão usando ferramentas como o PrimerBlast.
   5. Evite as regiões que têm estruturas secundárias.
   6. Escolha uma sequência que tem um conteúdo GC de 50 – 60%.
   7. Evite repetições de Gs e mais de 3 bases de Cs.
   8. Escolha as primeiras demão com Gs e Cs na sua extremidade 3' quando possível.
   9. Certifique-se de que 3' extremidades de iniciadores emparelhados não têm significativa complementaridade para evitar a primeira demão-dímeros. Amplicons deve ser menor do que 150 bp para amplificar eficientemente cfDNA (quer dizer tamanho é 170 bp⁸) e DNA extraído da FFPE, que muitas vezes é fragmentado.
2. Projeto sonda
   Nota: Sondas de hidrólise são rotuladas com um repórter fluorescente na extremidade 5' e um quencher na extremidade 3'. Eles fornecem alta especificidade, alta relação sinal-ruído e permitem multiplexação se necessário. Leitores de gotículas de dois canais são compatíveis com corantes FAM e HEX ou vítima, bem como análise de FAM/HEX ou FAM/VIC acoplado sondas.
   1. Desenha a hidrólise sondas complementares à sequência de WT da região alvo e região adjacente não variável.
   2. Escolha sondas que ambos localizados dentro o amplicon definido pelo par de primer previamente concebido. Sequências da primeira demão não podem sobrepor-se com as sequências de sonda, embora eles podem sentar-se ao lado do outro.
   3. Escolha o fio que tem Cs mais do que a Gs. sondas devem ter um conteúdo GC de 30-80%.
   4. Selecione sondas que estão entre 13 e 30 nucleotídeos de comprimento. Mais sondas tendem a exibir maior fluorescência de fundo porque a distância entre o fluoróforo e o quencher afeta a têmpera do repórter fluoróforo.
   5. Selecione T_m das sondas para 3 a 10 ° c superior a T_m dos primers para assegurar a sonda hidrólise durante o recozimento da primeira demão e extensão. Potenciadores de_m T são recomendados para alcançar a necessária T_m , mantendo a sonda curta, como sondas mais curtas discriminam variantes de nucleotídeo único mais eficientemente. Sondas não devem ter um G na extremidade 5' porque isto mata o sinal de fluorescência mesmo após hidrólise.
   6. Concepção de sondas de entrega como segue: 5'-(VIC) -sequência WT complementar da região mutante-(MGB NFQ)-3' e referência sonda como: 5'-(6-FAM) -sequência complementar de uma região não-variável-(MGB NFQ)-3'. Outras combinações de repórter/quencher também são possíveis.

3. otimização da ddPCR reação (Figura 2A)

Nota: Controles de DNA de tipo selvagem e mutante utilizado nesta etapa podem ser obtido linhas celulares, amostras de tumor ou padrões de referência de DNA comercialmente disponíveis, por exemplo.

1. Realize uma PCR convencional em um termociclador usando o recurso de gradiente térmico para validar a especificidade do produto do PCR amplificado por primers desenhados.
   1. Prepare uma mistura única de reação de PCR conforme descrito abaixo no passo 4.1 (sem sondas) em um modelo de controle de DNA do selvagem-tipo para um mínimo de 8 reações para ter pelo menos uma reação para cada temperatura.
   2. Execute a amplificação usando o programa descrito no passo 4.3.2 e uma gama de temperaturas de recozimento em torno da temperatura de recozimento teórica dos primers.
   3. Carrega produtos PCR em um gel de agarose a 3% para selecionar para recozimento temperaturas fornecendo produtos específicos.
2. Realize uma série de drop-off ddPCRs usando os parâmetros descritos acima, mas desta vez incluindo ambas as sondas.
   1. Use 100% WT DNA, DNA de MUT 100% e uma mistura de WT e MUT DNA (por exemplo, 50% MUT/50% WT) para determinar as melhores condições para a separação clara de WT e MUT nuvens da gota.
   2. Escolha um intervalo de temperaturas de recozimento acima da temperatura escolhida na etapa 4.1.
   3. Selecione a temperatura do recozimento que permite detecção específica de WT ou MUT sinais quando usando 100% WT DNA ou 100% DNA MUT e melhor separação de WT e MUT nuvens da gota.
   4. Recozimento de concentrações de tempo e primer/sonda também pode ser ajustado para melhorar a separação das nuvens e diminuir o número de gotas com fluorescência intermediária (efeito de chuva).
3. Avaliar o plano de fundo ou o limite de espaço em branco (LOB) do ensaio.
   1. Realize um mínimo de 48 reações de ddPCR de entrega individuais com um controle WT DNA usando os parâmetros de recozimento e concentrações de primers/sondas escolhidas no ponto 3.2.
   2. Para cada reação, calcular a frequência do alelo mutante (MAF) da seguinte forma: (número de mutante gotículas/número de gotículas enchidos) x 100.
      Nota: O LOB é definido como a média MAF de falso-positivos e associado SD a partir do qual o intervalo de confiança de 95% (95% CI) é calculado. LOB = (média de falso-positivos MAF) + 95% CI.
4. Avalie o limite de detecção (LOD) do ensaio.
   1. Realizar reações de ddPCR de entrega utilizando diluições em série do MUT DNA no DNA da WT, com esta variando de 5% a 0,01% (≥ 8 repetições por condição). Use concentrações de parâmetros e primeiras demão/sondas recozimento escolhidas no ponto 3.2.
      Nota: O LOD é definido como os menores valores MAF para o qual replica valores médios presentes e SD acima o LOB (ver Decraene et al ⁶ para mais detalhes).

4. ddPCR protocolo (Figura 2B)

Nota: DdPCR semelhante ao convencional, o protocolo de ddPCR de entrega consiste em 4 etapas: (i) PCR mix preparação, geração (ii) da gota, amplificação por PCR (iii) e aquisição de dados (iv).

1. Preparação de mistura PCR
   1. Siga as precauções padrão, tais como luvas, usando um capuz PCR limpo, limpas pipetas e RNase, livre de DNase água destilada, para evitar contaminação.
   2. Descongelar e equilibrar os componentes de reação no RT
   3. Prepare 20 x primeiras demão/sondas mistura em água destilada, com primers em 18 µM cada e sondas em 5 µM cada.
   4. Para todas as reações de PCR individuais, prepare uma mistura de amostra, combinando 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µ l de 20 x mistura de primers/sondas e até 10 ng DNA amostra qsp 20 µ l de água destilada.
   5. Vórtice a reação misture bem para garantir a homogeneidade e brevemente centrifugar para coletar conteúdo na parte inferior do tubo antes do fornecimento. Não hesite em repetir essa etapa para cada mistura de reação antes da utilização.
2. Geração de gotículas
   1. Insira o cartucho de ddPCR no suporte e carregar 20 μL da mistura de reação contendo amostras nos poços médios do cartucho para a geração de gotículas (posições verdes na Figura 2B) utilizando uma pipeta de 8 canais.
   2. Adicione 70 μL de óleo do gerador da gota para os poços de fundo (posições amarelos).
   3. Insira o cartucho, com uma junta, no gerador da gota; as gotas serão produzidas em poços de topo do cartucho (posições azuis).
   4. Aspirar e dispensar lentamente e delicadamente (para evitar distorção) 40 μL das gotas dos cartuchos em uma placa PCR de 96 poços. Use uma pipeta multicanal para otimizar a transferência das gotas.
3. Amplificação por PCR
   1. Sele a placa final do PCR com uma folha de alumínio usando um aferidor de placa imediatamente após a transferência de gotículas para evitar a evaporação. Brevemente, centrifugar a placa para coletar conteúdo no fundo dos poços.
   2. Executar uma amplificação por PCR convencional em um termociclador usando o seguinte programa: 95 ° C 10 min, 40 ciclos de [94 ° C 30 s, validado recozimento T ° por 60 s], 98 ° C 10 min (rampa 2,5 ° C/s). Incluem controles sem entrada de DNA e o DNA de tipo selvagem (≥3 Replica) em cada execução.
   3. Quando a execução é concluída, centrifugue brevemente a placa para coletar conteúdo no fundo dos poços.
4. Aquisição de dados
   1. Após a amplificação por PCR, use o leitor de gotículas contagem de PCR positivo e negativo PCR gotículas, seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: O leitor da gota geralmente oferece um sistema de detecção óptica de duas cores compatível com fluorophores FAM, VIC ou HEX.

5. análise de dados (Figura 2 e Figura 3)

Nota: PCR positiva e PCR gotículas são contados fornecer uma quantificação absoluta do MUT e os alelos WT na região do alvo. As gotas atribuídas são usadas para calcular o MAF em cada poço. Gotícula quantificação e análise de ensaios podem ser executados usando o pacote de ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) desenvolvido pela Attali e colegas^9,10drop-off. Este pacote R classifica automaticamente as gotas como vazio, parte da "chuva" (devido a amplificação ineficiente), ou como preenchida com um sinal muito positivo (Figura 3). A seção a seguir apresenta as diferentes etapas da análise é uma breve versão da vinheta descritiva do algoritmo escrito pelos seus autores (ver algoritmo https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. RMD para mais detalhes). Dados são exportados para arquivos de valores separados por vírgula (FileName_Amplitude.csv) e carregados no pacote ddPCR para ser analisado diretamente em R ou através da interface web dedicado.

1. Ajustes de parâmetro
   Nota: Cada projeto de ensaio de queda resulta em distribuições específicas da gota final e variações na forma de nuvem, separações ou posições é de se esperar. Para garantir a eficiente análise automatizada, um conjunto de parâmetros deve ser reajustada. Se um bem tem um perfil inesperado, pode fazer a análise da placa inteira para falhar, resultando em uma mensagem de erro. A problemática bem terá que ser identificado e removido a análise automatizada.
   1. Identifica a falhados poços usando (REMOVE_FAILURES). Use o TOTAL_DROPS_T (o valor padrão é 5.000) para ajustar o número mínimo de gotas em cada poço. Use o EMPTY_LAMBDA_LOW_T (o valor padrão é 0.3) e EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (o valor padrão é 0,99) para ajustar as métricas que avaliem as nuvens de gotículas esperada (vazio, MUT, WT) e sua qualidade.
      Nota: Ter muitas gotículas vazias é um sinal de que não havia suficiente ampliáveis modelo na reação.
   2. Identifica as gotas outlier usando (REMOVE_OUTLIERS). Use TOP_PERCENT (padrão é p = 1%) para ajustar os % p de gotículas, tendo o valor mais alto de sinal em cada dimensão de sinal (FAM, VIC/HEX) fora de gotículas no prato inteiro. Use o CUTOFF_IQR (o padrão é 5) para ajustar o limite de outlier dos top % p de sinal mais alto.
   3. Identifica as gotas vazias usando (REMOVE_EMPTY). Use o CUTOFF_SD (o padrão é 7) para ajustar o desvio padrão da distribuição gaussiana (gotículas vazio) inferior dos valores de sonda 1.
   4. Gotículas de portão usando (classificar). Use o CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (o padrão é 3) para ajustar o desvio padrão da distribuição gaussiana (enchido gotículas) maior dos valores 1 sonda. Use o ADJUST_BW_MIN (o padrão é 4) e ADJUST_BW_MAX (o padrão é 20) para ajustar os parâmetros k_min e k_max para estimar a densidade do kernel da sonda 2 valores e discriminar o MUT e a nuvem WT de gotículas.
      1. Use SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (padrão é p = 1%) e SIGNIFICANT_P_VALUE (o padrão é o nível de significância s=0.01%) para classificar os poços como mutante ou sua.
         Nota: Este algoritmo, um mutante bem é definido como tendo um MAF estatisticamente significativamente maior do que p %.
2. Análise automatizada
   Nota: Para cada parâmetro apresentado nesta seção, os autores do pacote ddPCR R têm valores padrão proposto com base em seus conhecimentos e seus dados. No entanto, todos os parâmetros podem ser modificados para aumentar a qualidade da análise (Figura 3).
   1. Identifica a falha de poços.
      1. Use quatro métricas de controle de qualidade (configurações: REMOVE_FAILURES) para identificar a falha de poços; o primeiro é o número mínimo de gotículas que deve conter um poço. Os outros três centrar-se na identificação de populações de candidato válido para vazio, possivelmente FAM + e HEX + / VIC + gotículas. Remova os poços que não cumprem esses critérios de análise a jusante.
   2. Identifica as gotas de outlier.
      1. Para evitar a inclinação para retenção de gotículas, remover valores atípicos (i.e., as gotas com um valor HEX/VIC ou FAM anormalmente elevada) de posterior análise definindo um limite de limite superior (configurações: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identifica as gotas vazias.
      1. Identificar as gotas vazias para reduzir a dimensão dos dados (em um poço típico, eles serão responsáveis pela maior parte as gotas) e eliminar o viés estatístico, devido à presença de uma grande parcela de informações inúteis como gotículas contendo apenas modelo permanecem ( configurações: REMOVE_EMPTY).
   4. Realize a retenção de gotículas.
      1. Classificar as gotas restantes como mutante, sua ou chuva (configurações: classificar).
   5. Identifica as gotas de chuva.
      1. Como as gotas de chuva resultam de amplificação ineficiente, excluir do FAM + ou HEX + / VIC + nuvens. Determinar as fronteiras de seus clusters usando seus valores de sonda 1 (definição: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identifica mutante contra gotículas de tipo selvagem.
      1. Como o destaque da análise é a discriminação entre modelos mutante e sua, identifica todas as gotas restantes nesta fase como um ou o outro. Desde que têm valores semelhantes de sonda 1, usar sonda 2 valores para melhor prever sua respectiva natureza (configurações: ADJUST_BW_MIN e ADJUST_BW_MAX).
   7. Classifica poços como mutante versus o tipo selvagem.
      1. Depois de determinar quais as gotas são MUT e WT, calcule a MAF. Usando a frequência de mutação e o p-valor associado de cada poço, é possível classificá-las (configurações: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) como WT (contendo principalmente as gotas WT) ou poços MUT (contendo um número estatisticamente significativo de MUT gotas).
3. Explorar e exportar os dados
   1. Explorar e exportar os dados como número de gotículas, outliers, gotículas vazias, concentrações ou gráficos que podem ser ainda mais personalizados para representação ideal.

Representative Results

Em um estudo de prova de conceito, KRAS exon 2 mutações (códons 12 e 13) e EGFR exon 19 exclusões foram investigadas em FFPE tecidos e amostras de plasma de pacientes com câncer usando o declive ddPCR estratégia⁶.

A sonda de entrega KRAS interrogado uma região bp 16, englobando várias mutações no exon 2 do gene KRAS , que abrigam mais de 95% das mutações conhecidas KRAS em cânceres humanos¹¹. A sonda de referência foi de 20 bp em comprimento e localizado 3 bp a jusante. Para otimizar o nosso ensaio, usamos DNA extraído de linhas de células contendo 2 dos aminoácidos mais frequentemente mutados KRAS : G12V (c.35GT, SW480) e G13D (c.38GA, HCT 116).

O ensaio de queda do EGFR foi projetado para procurar todas as exclusões activação do EGFR exon 19. O ensaio usado uma sonda 25 bp-long drop-off, colocada sobre a região recorrente excluída juntamente com uma sonda de referência de 21 bp, localizado 31 bp a jusante no amplicon mesmo. Para otimizar o nosso ensaio, usamos um conjunto padrão de cfDNA referência incluindo o EGFR exon 19 exclusão c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Sensibilidade, especificidade e localização de nuvens de gotículas foram definidos com amostras de controlo de MUT e WT PBMC DNA genômico como mostrado na Figura 4A para KRAS. Temos ainda mais demonstrado que este tipo de ensaio funciona em vários tipos de alterações genéticas, tais como a substituição simples, múltiplas substituições ou exclusões (Figura 4B), bem como em vários tipos de amostra⁶.

Figura 1: A ddPCR entrega requer um único par de hidrólise oligo-sondas para digitalizar todas as mutações de um hotspot região. Projetos de ensaios com um resultado esquemático exibido como dispersão bidimensional plota apresentando intensidade de fluorescência da gota. (A) ddPCR convencional com mutante (sonda MUT) e sondas do tipo selvagem (sonda WT) visando a exata mesma região. (B) a entrega ddPCR contém um teste de referência (sonda 1) que anneals a uma região não-variável e uma sonda de drop-off (sonda 2) visando a região mutante mas complementares à sequência de WT, dentro o amplicon mesmo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fluxo de trabalho ddPCR de entrega para o perfilamento de mutação do DNA de plasma. O fluxo de trabalho completo é composto de 5 etapas principais: (A) (1) projeto de cartilhas e sondas, (2) otimização do ensaio, extração de isolamento e cfDNA de plasma (3) (B), (4) ddPCR executar e análise de dados (5) (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: análise de entrega ddPCR. Entrega ddPCR análise fluxo de trabalho destacando parâmetros importantes que precisa de ser afinado. Isso garante eficiente identificação automatizada de outliers, vazios, chuva ou gotículas positivas; atribuição de gotículas MUT ou WT e computação o MAF para cada poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos - KRAS e EGFR entrega ddPCR ensaios. (A) exemplo de resultados obtidos durante as etapas de otimização do ensaio ddPCR drop-off. Deteção de mutante e/ou DNA do selvagem-tipo em uma reação contendo 100% MUT DNA, DNA de MUT 5% e 100% WT DNA. (B) exemplos de plasma amostras analisadas com o KRAS e o EGFR entrega ddPCR ensaios mostrando a detecção de nucleotídeo único e várias substituições no exon 2 do KRAS e uma exclusão no EGFR exon 19. Esta figura foi adaptada da Decraene et al ⁶. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Para projetar um ensaio de ddPCR de entrega eficiente, otimização é crucial, e o protocolo deve ser seguido cuidadosamente. Cada combinação de primers e sondas tem uma eficiência de reação de PCR exclusiva. Assim, um ensaio individual tem de ser cuidadosamente validado em amostras de controle antes de serem utilizados em amostras de teste valioso. Otimização e validação são importantes para a detecção do sinal de pico de certificar e avaliar a sensibilidade e especificidade. Conforme descrito no protocolo, todas as mutações, localizadas em uma região de destino abrangida pela 2 "sonda" potencialmente podem ser interrogadas. Não obstante, validação é recomendada para mutações localizadas em 5' ou 3' extremidades do "sonda 2", uma vez que estas podem afetar a eficiência do ensaio do drop-off.

O método apresentado aqui pode ser executado com DNA extraído de qualquer tipo de "tecido", incluindo os tecidos FFPE, células em cultura ou sangue de amostras. No entanto, a qualidade da extração do ácido nucleico dramaticamente pode afetar resultados ddPCR. Inibidores do PCR como heparina, proteínas, hemo, fenol, proteases, colágeno, melanina, detergentes ou sais têm de ser eliminados, tanto quanto possível durante a amostragem e as etapas de purificação. Embora as amostras de DNA podem ser diluídas para reduzir o impacto de inibidores da PCR no ddPCR, diluição diminui sensibilidade porque menos cópias do alvo serão testadas por reação. Isto deve ser tida em conta quando um certo nível de sensibilidade está a ser alcançado, como um mínimo de cópias deve ser testado.

DdPCR drop-off pode ser aplicado a vários tipos de alterações moleculares (substituições de nucleotídeo único e múltiplo, exclusões, etc.). Além de utilizar apenas duas sondas para detectar todas as alterações (aumentando assim praticidade e custo-efetividade do ensaio), ddPCR de entrega gera menos ruído de fundo⁶ e mostra sensibilidade aumentada em comparação com ensaios multiplex. Além disso, uma vez que é realizada em uma única reação, quantidades mínimas de amostras de doentes são consumidas. Este ensaio é particularmente atraente no contexto da biópsia líquida porque a quantidade de ctDNA é muitas vezes baixa nestas amostras.

Com efeito, o método apresentado aqui é aplicável para o rastreio de mutação no material líquido-biópsia e já provou a sua utilidade para a prática clínica (screening de mutaçãoESR1 no julgamento clínico de PADA-1 - NCT03079011). No entanto, é fundamental usar amplicons tão curtos quanto possível neste cenário por causa a fragmentação do cfDNA⁸.

Caracterização a jusante ainda precisa ser realizada separadamente para identificar a mutação exata transportada por alelos mutantes. No entanto, porque as decisões terapêuticas baseiam-se principalmente no estado mutacional das regiões de ponto de acesso dos oncogenes targetable (mutante de vs WT), a capacidade de entrega ddPCR de identificar imediatamente as mutações torna uma poderosa ferramenta de diagnóstico. Além disso, a mutação exata não precisa ser conhecido um priori para projetar um ensaio em contraposição ao atuais soluções comerciais. Além disso, ddPCRs de entrega podem ser combinados com ensaios específicos ddPCR convencionais para aumentar ainda mais o número de mutações selecionados para (dados não mostrados). Finalmente, ddPCR de entrega pode ser aplicado a outros campos de pesquisa. Em particular, ele pode vir a ser uma ferramenta útil para a seleção positivas colônias em experimentos de edição do genoma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer