Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Abstract

Reacción en cadena de polimerasa digital gota (ddPCR) es un método de reacción en cadena (PCR) alta sensibilidad cuantitativa de polimerasa basado en fraccionamiento de la muestra en miles de reacciones individuales de agua en aceite tamaño nanométrico. Recientemente, ddPCR ha convertido en uno de los instrumentos más precisos y sensibles para la detección de ADN (ctDNA) de tumor de circulación. Una de las principales limitaciones de la técnica de ddPCR estándar es el número limitado de mutaciones que pueden ser defendidos por reacción, como sondas de hidrólisis específica reconociendo cada versión alélica posible son necesarias. Una metodología alternativa, el ddPCR de entrega, aumenta el rendimiento, ya que requiere solamente un solo par de sondas para detectar y cuantificar potencialmente todas las alteraciones genéticas en la región específica. Entrega ddPCR muestra sensibilidad comparable a ensayos ddPCR convencional con la ventaja de detectar un mayor número de mutaciones en una sola reacción. Es rentable, conserva muestras preciosas y puede usarse como una herramienta de descubrimiento cuando las mutaciones se desconocen a priori.

Introduction

Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados¹. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida ^2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos^4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados principalmente para detectar las mutaciones conocidas a priori. Esto limita severamente el uso de ddPCR como una herramienta de descubrimiento cuando la mutación es desconocida. De hecho, en el diseño convencional de ddPCR, una sonda de hidrólisis reconociendo el alelo de tipo salvaje (WT sonda) compite con una sonda específica reconociendo el alelo mutante (MUT Probe) (figura 1A). La sonda con mayor afinidad cruza por hibridación a la plantilla y libera su fluoróforo, indicando la naturaleza del alelo correspondiente. Los datos de fluorescencia obtenidos para cada gotita se pueden visualizar en un diagrama de dispersión que representa la fluorescencia emitida por las sondas WT y MUT en diferentes dimensiones. Una representación esquemática de un resultado típico de un ensayo de ddPCR convencional se presenta en la figura 1A. En este ejemplo, la nube azul corresponde a las gotitas que contienen alelos WT identificados por la punta de prueba de peso, mientras que la nube roja corresponde a gotitas en el que el alelo MUT ha sido amplificado e identificado por la sonda MUT. Dependiendo de la cantidad de DNA en la reacción, doble positivo gotitas que contienen peso y MUT amplicones pueden aparecer (nube verde). La nube gris clara corresponde a gotas de vacías.

Puesto que la mayoría de las plataformas permite la detección de un número limitado de fluoróforos (generalmente 2, pero hasta 5), rendimiento de ddPCR convencional es limitado. Por lo tanto, dirigida a las regiones con múltiples mutaciones adyacentes requiere diseño de técnicamente difícil ensayos multiplex ddPCR o el uso de múltiples reacciones dirigidas a cada mutación en paralelo. La estrategia de ddPCR de entrega, supera esta limitación como es potencialmente capaz de detectar cualquier alteración genética dentro de una región de destino utilizando un único par de sondas de hidrólisis WT. La primera cubre sonda (sonda 1) es complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino donde las mutaciones son una secuencia no variable, adyacente a la región de destino y la segunda sonda (sonda 2) espera (figura 1B). Mientras que la primera punta de prueba cuantifica la cantidad total de amplificable moléculas en la reacción, la segunda sonda discrimina alelos WT y MUT óptimo hibridación a las secuencias mutantes. Punta de prueba 2 puede identificar varios tipos de mutaciones en la región (substituciones del nucleótido único o múltiples, eliminación, etc.) de destino⁶. Como en ddPCR convencional, la nube gris clara corresponde a las gotas que contienen no las moléculas de ADN. Es importante recordar que en este tipo de análisis, separación óptima de WT y MUT nubes depende de la cantidad de ADN cargado en la reacción, ya que no se pueden distinguir las gotitas que contienen alelos objetivo WT y MUT de gotitas que contienen sólo el peso forma. Por lo tanto, este análisis requiere que la mayoría de las gotas contienen no más de una copia del gen objetivo.

Protocol

El protocolo que presentamos sigue las pautas de ética del Instituto Curie. Todas las muestras humanas fueron obtenidas de pacientes inscritos, tras consentimiento informado, en estudios aprobado por la Junta de revisión institucional en el Instituto Curie.

1. recolección, almacenamiento de Plasma y extracción de ADN libre de células de la sangre

Nota: Se puede utilizar la DNA extraída de cualquier tipo de "tejido" (por ejemplo, parafina fresca o formaldehído-fija integrado tejidos (FFPE), las células en las muestras de cultura o de la sangre). Aquí proporcionamos instrucciones detalladas para recolección de sangre, plasma aislamiento y almacenamiento y extracción de ADN (cfDNA) sin células.

1. Almacenamiento de la colección y el plasma de la sangre (figura 2B)
   1. Obtener muestras de sangre en tubos con EDTA de 7 mL. Dos tubos se recomiendan recoger aproximadamente 4 mL de plasma.
   2. Centrifugar los tubos durante 10 min a 820 x g dentro de 3 h de la atracción de la sangre para separar los glóbulos rojos (RBC), leucocitos (WBC) y plasma. El tiempo entre el muestreo y la centrifugación es crítico para obtener alta calidad cfDNA (es decir, cfDNA no contaminado con ADN de WBC).
   3. Pipetee cuidadosamente el sobrenadante (plasma) utilizando una pipeta de 1 mL sin tocar la capa de WBC; generalmente se recuperan alrededor de 2 mL de plasma por tubo de EDTA.
   4. Transferir el plasma a tubos de 2 mL y centrifugar las alícuotas a 16.000 x g por 10 min a 15 ° C para eliminar restos celulares.
   5. Pipetee cuidadosamente el sobrenadante (plasma) sin perturbar el pellet. Distribuir el plasma en tubos criogénicos de 2 mL y guardar a-80 ° C hasta que se necesite.
2. cfDNA extracción (Figura 2B)
   Nota: Aquí, presentamos el procedimiento utilizando el kit de extracción manual. Una versión automatizada siguiendo las instrucciones del fabricante puede realizarse también para el aislamiento de cfDNA.
   1. Poner 400 μL de proteinasa K en un tubo de 50 mL. Agregar 4 mL de plasma (volumen utilizada de manera rutinaria) y 3,2 mL de tampón de lisis ACL (contiene 1,0 μg portador RNA) desde el kit. Cierre el tubo y mezclar con un vórtex durante 30 s para obtener una solución homogénea. Incubar a 60 ° C durante 30 minutos.
   2. Añadir 7,2 mL de buffer ACB (del kit) para el lisado para optimizar la Unión de las circulación los ácidos nucleicos a la membrana de silicona y mezclar con un vórtex para 15 – 30 s. Incubar el tubo durante 5 minutos en hielo.
   3. Coloque la columna y el diluyente de 20 mL en la bomba de vacío. Cerca de las posiciones no utilizadas para permitir la extracción con bomba aspirativa.
   4. Aplique cuidadosamente la mezcla de lisado-buffer ACB en el extensor de tubo (brevemente centrifugar el tubo para recoger el máximo de mezcla de lisado-buffer ACB), encender la bomba de vacío y permitir que el lisado ser dibujado a través de las columnas completamente. Retire y deseche el extensor de tubo.
   5. Aplique 600 μl de buffer ACW1 a la columna. Cuando buffer ACW1 ha dibujado a través de la columna, agregar 750 μl tampón ACW2 y finalmente agregar 750 μl de etanol (96-100%). Luego, coloque la columna en un tubo limpio de 2 mL y centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 3 minutos eliminar el etanol.
   6. Coloque la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL. Abra la tapa e incubar a 56 ° C durante 10 min secar completamente la membrana.
   7. Coloque la columna en un tubo de unión baja de ADN limpio de 1,5 mL. Aplique cuidadosamente 36 μl de agua libre de ARNasa con 0,04% de azida sódica (tampón de AVE). Cierre la tapa e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
   8. Centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 1 min eluir los ácidos nucleicos y almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.
3. cuantificación de cfDNA
   Nota: cfDNA la cuantificación se realiza con un fluorómetro usando protocolo del fabricante inmediatamente después de la extracción o la descongelación de las muestras a temperatura ambiente (RT), antes de su uso. Evitar congelaciones y descongelaciones múltiples.
   1. Utilizar el análisis de alta sensibilidad según la cantidad de cfDNA esperado, que es generalmente menos de 100 ng/mL plasma. cfDNA las concentraciones van desde 2 a 10 ng/mL para donantes sanos pero pueden ser tan altas como 100 ng/mL en pacientes con enfermedad metastásica.
   2. Asegurar todos los reactivos a temperatura ambiente y mezclan 199 μl de tampón de dilución de Fluorímetro con 1 μl de colorante (200 x) por la reacción (número N de muestras + 2 normas para calibrar el fluorómetro) para obtener una solución de trabajo.
   3. La solución de cfDNA para asegurar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior del tubo de vórtice.
   4. Mezcla 5 μl de cada muestra de cfDNA con 195 μl de la solución de trabajo.
   5. Mezclar 10 μl de cada norma con 190 μl de la solución de trabajo.
   6. Tubos de vórtice completamente todas para que 2-3 s garantizar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior de los tubos.
   7. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min en la oscuridad.
   8. Leer los tubos en el fluorómetro, usando el modo de salida de ' ng/μl'
   9. Calcule la concentración final en ng/mL de plasma de la siguiente manera: ng/μl x 36 (volumen de eluido cfDNA) / 4 (volumen de plasma extraído).

2. ddPCR sonda y Primer diseño (figura 2A)

Nota: La amplificación de las moléculas específicas en el análisis de ddPCR de entrega sigue principios similares de qPCR. Cada cartilla y punta de prueba está diseñado con el software dedicado convencional Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/).

1. Primer diseño
   1. En la ventana de configuración general, cambiar 'concentración de cationes divalentes' a 3.8, 'concentración de dNTPs' a 0.8 y ' mispriming/repetición biblioteca ' para el organismo correcto.
   2. En la ventana de configuración avanzada, cambiar la 'Tabla de parámetros termodinámicos' y la 'fórmula de la concentración de sal' a Santa Lucia 1998.
   3. Elegir un T_m entre 55 y 70 ° C (de 50 mM para la concentración de sal y 300 nM para la concentración del oligonucleótido).
   4. Comprobar la especificidad de los primers mediante herramientas como PrimerBlast.
   5. Evitar las regiones que tienen estructuras secundarias.
   6. Elegir una secuencia que tiene un contenido GC del 50 – 60%.
   7. Evitar repeticiones de Gs y Cs más de 3 bases.
   8. Elegir cebadores con Gs y Cs en su extremo 3' siempre que sea posible.
   9. Aseguran 3' extremos de cebadores apareados no complementariedad significativa para evitar dímeros de primer. Amplicones deben ser menor que 150 bp eficientemente ampliar cfDNA (sea tamaño 170 bp⁸) y la DNA extraída de FFPE, que es a menudo fragmentado.
2. Diseño de la sonda
   Nota: Las sondas de hidrólisis se etiquetan con un reportero fluorescente en el extremo 5' y un extintor en el extremo 3'. Proporcionan alta especificidad, alta relación de señal a ruido y permite multiplexación si es necesario. Dos canales gotita lectores son compatibles con tintes FAM y HEX o VIC, así como análisis de FAM/HEX o FAM/VIC junto las puntas de prueba.
   1. Diseño de sondas de hidrólisis complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino y la región adyacente de la variable no.
   2. Seleccione sondeos ubicados dentro de los amplicones definidos por el par de la cartilla diseñado previamente. Secuencias de la cartilla no pueden solaparse con las secuencias de sondeo, aunque puede sentarse uno junto al otro.
   3. Elegir la cadena que tiene más Cs de Gs. puntas de prueba deben tener un contenido de GC de 30-80%.
   4. Seleccione sondeos que están entre los 13 y 30 nucleótidos de longitud. Las sondas más largas tienden a mostrar mayor fluorescencia de fondo porque la distancia entre el fluoróforo y el quencher afecta el amortiguamiento de la reportera del fluoróforo.
   5. Seleccione T_m de las sondas de 3 a 10 ° c superior a T_m de los iniciadores para sonda de hidrólisis durante el recocido de la cartilla y extensión. Potenciadores de_m T se recomiendan para alcanzar el necesario T_m manteniendo la sonda corta, como las puntas de prueba más cortos discriminan variantes de un solo nucleótido más eficientemente. Las sondas no deben tener un G en el extremo 5' porque esto apaga la señal de fluorescencia incluso después de la hidrólisis.
   6. Diseño entrega las puntas de prueba como sigue: 5'-(VIC) -secuencia complementaria del peso de la región mutada-(MGB NFQ)-3' y como la punta de prueba de referencia: 5'-(6-FAM) -secuencia complementaria de una región variable no-(MGB NFQ)-3'. También son posibles otras combinaciones de reportero/extintor.

3. optimización de la ddPCR reacción (figura 2A)

Nota: Controles de DNA de tipo salvaje y mutantes utilizados en esta etapa pueden obtenerse de líneas celulares, muestras tumorales o estándares de referencia de ADN disponibles comercialmente, por ejemplo.

1. Realizar una PCR convencional en un termociclador mediante la función gradiente térmica para validar la especificidad del producto PCR amplificado por los primers diseñados.
   1. Preparar una mezcla única de la reacción de PCR como se describe a continuación en el paso 4.1 (sin sondas) en una plantilla de control de DNA de tipo salvaje para un mínimo de 8 reacciones que tenga al menos una reacción por temperatura.
   2. Ejecute la amplificación usando el programa descrito en paso 4.3.2 y un rango de temperaturas de recocido alrededor de la temperatura de recocido teórica de los iniciadores.
   3. Carga de productos de la PCR en un gel de agarosa al 3% para seleccionar para recocido temperatura proveyendo productos específicos.
2. Realizar una serie de ddPCRs de entrega usando los parámetros descritos anteriormente, pero esta vez incluyendo ambas puntas de prueba.
   1. Uso 100% WT ADN, ADN de MUT 100% y una mezcla de WT y MUT ADN (por ejemplo, 50% MUT/50% WT) para determinar las mejores condiciones para la separación clara de las nubes de gotas WT y MUT.
   2. Elegir una gama de temperaturas de recocido por encima de la temperatura elegida en el paso 4.1.
   3. Seleccione la temperatura de recocido que permite la detección específica de peso o MUT señales cuando se utiliza ADN de peso 100% o 100% ADN de MUT y mejor separación de las nubes de gotas WT y MUT.
   4. Recocido de concentraciones tiempo y primer punta de prueba también se puede ajustar para mejorar la separación de las nubes y para disminuir el número de gotas con fluorescencia intermedia (efecto lluvia).
3. Evaluar el límite de espacio en blanco (LOB) o fondo del ensayo.
   1. Realizar un mínimo de 48 reacciones de ddPCR de entrega individuales con un control de peso ADN utilizando los parámetros de recocido y las concentraciones de primers/sondas en 3.2.
   2. Para cada reacción, calcular la frecuencia del alelo mutante (MAF) como sigue: (número de mutante gotitas o número de gotas llenas) x 100.
      Nota: La unidad de negocio es definido como la media MAF de falsos positivos y asociado SD desde la que se calcula el intervalo de confianza de 95% (IC 95%). LPP = (media de falsos positivos MAF) + IC del 95%.
4. Evaluar el límite de detección (LOD) del ensayo.
   1. Realizar reacciones de ddPCR de entrega utilizando diluciones seriadas de ADN de MUT en el ADN de la WT, con MAFs desde 5% hasta el 0,01% (≥ 8 repeticiones por condición). Utilizar concentraciones de parámetros y cartillas/sondas recocidas en 3.2.
      Nota: El LOD se define como los valores más pequeños del MAF que replica los valores medios presentes y SD por encima de la línea de negocio (véase Decraene et al. ⁶ para más detalles).

4. ddPCR protocolo (figura 2B)

Nota: DdPCR Similar al convencional, el protocolo de ddPCR de entrega consiste en 4 pasos: (i) PCR mezclar preparación, generación de la gotita (ii), amplificación por PCR (iii) y adquisición de datos (iv).

1. Preparación de la mezcla de PCR
   1. Seguir las precauciones estándar, tales como guantes, utilizando una Limpie la campana de PCR, pipetas limpias y Rnasa, DNasa libre agua destilada para evitar la contaminación.
   2. Descongelar y equilibrar los componentes de la reacción a TA.
   3. Preparar 20 x mezcla de cebadores/puntas de prueba en agua destilada, con cartillas a 18 μm y sondas de 5 μm.
   4. Para todas las reacciones individuales de PCR, preparar una mezcla de la muestra mediante la combinación de 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 μl de 20 x mezcla de sondas de cartillas y hasta 10 ng ADN muestra qsp 20 μl de agua destilada.
   5. Mezclar la reacción mezclar cuidadosamente para asegurar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior del tubo antes de dispensar. No dude en repetir este paso para cada mezcla de reacción antes de su uso.
2. Generación de la gota
   1. Inserte el cartucho de ddPCR en el soporte y cargar 20 μL de mezcla de reacción que contienen las muestras en los pocillos mediados del cartucho para la generación de gotas (posiciones de verdes en la figura 2B) con una pipeta de 8 canales.
   2. Añadir 70 μL de aceite generador de gotas en los pocillos de fondo (amarillo posiciones).
   3. Inserte el cartucho, con una junta, en el generador de gotas; las gotitas se producirán en los pozos superior del cartucho (posiciones azul).
   4. Aspirar y dispensar lentamente y suavemente (para evitar cizallamiento) 40 μL de las gotitas de los cartuchos en una placa PCR de 96 pocillos. Utilice una pipeta multicanal para optimizar a la transferencia de las gotas.
3. Amplificación por PCR
   1. Selle la placa final de la PCR con una lámina de aluminio utilizando un sellador de placas inmediatamente después de la transferencia de las gotas para evitar la evaporación. Centrifugar brevemente la placa para recoger contenidos en la parte inferior de los pozos.
   2. Ejecutar una amplificación de PCR convencional en un termociclador con el siguiente programa: 95 ° C 10 min, 40 ciclos de [94 ° C 30 s, validado recocido T ° por 60 s], 98 ° C 10 min (rampa 2,5 C ° / s). Incluyen controles sin entrada DNA y DNA de tipo salvaje (≥ 3 repeticiones) en cada serie.
   3. Una vez terminada la carrera, centrifugar brevemente la placa para recoger contenidos en la parte inferior de los pozos.
4. Adquisición de datos
   1. Después de la amplificación por PCR, utilizar el lector de gotita a cuenta positiva de PCR y PCR-negativa gotas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: El lector de gota generalmente ofrece un sistema de detección óptica de dos colores compatible con fluoróforos FAM, VIC o hexagonal.

5. Análisis (figura 2 y figura 3)

Nota: Gotitas positivo PCR y PCR-negativos se cuentan proporcionar una cuantificación absoluta de la MUT y los alelos WT en la región específica. Las gotitas asignadas se utilizan para calcular el MAF en cada pozo. Cuantificación de la gotita y análisis de entrega ensayos se pueden realizar utilizando el paquete de ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) desarrollado por Attali y colegas^9,10. Este paquete de R clasifica automáticamente las gotas como vacía, parte de la "lluvia" (debido a la amplificación ineficiente) o con una señal real positiva (figura 3). La siguiente sección presenta las distintas etapas del análisis es una versión breve de la viñeta descriptiva del algoritmo escrito por sus autores (véase algoritmo de https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. RMD para más detalles). Datos son exportados a archivos de valores separados por comas (FileName_Amplitude.csv) y subidos en el paquete de ddPCR para ser analizados directamente en R o a través de la interfaz web dedicada.

1. Ajustes de parámetro
   Nota: Cada diseño de ensayo entrega resultados en distribuciones específicas gotita final y variaciones en la forma de nube, separaciones o posiciones es de esperarse. Para garantizar la eficiente Análisis automatizado, un conjunto de parámetros necesita ser ajustado. Si bien tiene un perfil de inesperada, puede causar el análisis de la placa entera no, resultando en un mensaje de error. La problemática también tendrá que ser identificado y extraído el análisis automatizado.
   1. Identificar pozos fallidos usando (REMOVE_FAILURES). Uso de TOTAL_DROPS_T (valor por defecto es 5.000) para ajustar el número mínimo de gotas en cada pozo. Uso de EMPTY_LAMBDA_LOW_T (valor por defecto es 0.3) y EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (valor por defecto es 0.99) para ajustar las métricas que evalúen las nubes gota esperado (vacío, MUT, WT) y su calidad.
      Nota: Tener demasiadas gotas de vacías es un signo que no había plantilla suficiente amplificable en la reacción.
   2. Identificar gotas aislados usando (REMOVE_OUTLIERS). Uso de TOP_PERCENT (valor predeterminado es p = 1%) para ajustar el porcentaje de p superior de gotitas con el valor más alto de la señal en cada dimensión de la señal (FAM, VIC/HEX) de gotitas en toda la placa. Uso de CUTOFF_IQR (por defecto es 5) para ajustar el umbral de valores atípicos del porcentaje de p superior de señal más alto.
   3. Identificar vacías gotas usando (REMOVE_EMPTY). Usar CUTOFF_SD (el valor predeterminado es 7) para ajustar la desviación de estándar de la distribución de Gauss (vacío gotitas) baja de los valores de la sonda 1.
   4. Gotitas de puerta usando (clasificar). Usar CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (el valor predeterminado es 3) para ajustar la desviación estándar de la distribución de Gauss (lleno de gotitas) mayor de los valores de la sonda 1. Usar ADJUST_BW_MIN (por defecto es 4) y ADJUST_BW_MAX (el valor predeterminado es 20) para ajustar los parámetros k_min y k_max para estimar la densidad del núcleo de los valores de la sonda 2 y discriminar la MUT y la nube de la WT de gotitas.
      1. Usar SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (valor predeterminado es p = 1%) y SIGNIFICANT_P_VALUE (por defecto es s=0.01% nivel de significancia) para clasificar los pozos como mutante o wildtype.
         Nota: En este algoritmo, un mutante bien se define como teniendo un MAF que es significativamente más alto que p %.
2. Análisis automatizado de
   Nota: Para cada parámetro se presentan en esta sección, los autores del paquete de ddPCR R tienen valores propuesto basados en su experiencia y sus datos. Sin embargo, todos los parámetros pueden modificarse para aumentar la calidad del análisis (figura 3).
   1. Identificar pozos fallidos.
      1. Utiliza cuatro indicadores de control de calidad (ajustes: REMOVE_FAILURES) para identificar pozos fallidos; el primero es el número mínimo de gotas que debe contener un pozo. Los otros tres se centran en la identificación de las poblaciones de candidato válido para vacío, posiblemente FAM + y HEX + VIC + gotas. Eliminar pozos que no cumplan con estos criterios de análisis de aguas abajo.
   2. Identificar las gotitas aislados.
      1. Para evitar sesgar la gotita que bloquean, quitar outliers (es decir, las gotas con un anormalmente alto valor HEX/VIC o FAM) de análisis estableciendo un umbral de límite superior (configuración: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Identificar gotitas de vacías.
      1. Identificar vacías gotas para reducir la dimensión de los datos (en un pozo típico, representan para la mayoría de las gotas) y eliminar el sesgo estadístico debido a la presencia de una gran parte de información inútil siendo sólo que contiene la plantilla de gotas () configuración: REMOVE_EMPTY).
   4. Realizar gota gating.
      1. Clasificar las gotas restantes como mutante, wildtype o lluvia (ajustes: clasificar).
   5. Identificar las gotas de lluvia.
      1. Como gotas de lluvia resultan de amplificación ineficiente, excluir de la FAM + o HEX + VIC + nubes. Determinar las fronteras de sus racimos con sus valores de sonda 1 (ajuste: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Identificar a mutantes frente a gotas de tipo salvaje.
      1. Como el punto culminante del análisis de la discriminación entre plantillas de mutante y de tipo salvaje, identificar todas las gotas restantes en esta etapa uno o el otro. Puesto que deben tener valores similares de sonda 1, utilizar sonda 2 valores mejor predecir su naturaleza respectiva (configuración: ADJUST_BW_MIN y ADJUST_BW_MAX).
   7. Clasificar pozos como mutante versus tipo salvaje.
      1. Después de determinar que las gotas son MUT y peso, calcular el MAF. Utilizando la frecuencia de mutantes y un valor de p asociado de cada pozo, es posible clasificarlos (configuración: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) como peso (contiene sobre todo gotas de WT) o pozos MUT (contiene un número estadísticamente significativo de MUT gotitas).
3. Explorar y exportar los datos
   1. Explorar y exportar los datos como número de gotitas, afloramientos, gotitas de vacías, las concentraciones o gráficos que pueden personalizarse aún más para la representación óptima.

Representative Results

En un estudio de prueba de concepto, mutaciones del exón 2 de KRAS (codones 12 y 13) y EGFR exón 19 eliminaciones fueron investigados en los tejidos FFPE y las muestras de plasma de pacientes con cáncer mediante la entrega ddPCR estrategia⁶.

La punta de prueba KRAS entrega interrogó a una región de bp 16 que abarca múltiples mutaciones en el exón 2 del gen KRAS , que albergan más del 95% de las mutaciones de KRAS conocidas en cánceres humanos¹¹. La sonda de referencia fue 20 bp de longitud y situado 3 bp río abajo. Para optimizar nuestro análisis, se utilizó ADN extraído de las líneas celulares que contiene 2 de los aminoácidos más frecuentemente mutados de KRAS : G12V (c.35GT, SW480) y G13D (c.38GA, HCT 116).

El ensayo de entrega EGFR fue diseñado para escanear todas eliminaciones activación del EGFR exón 19. El ensayo utiliza una sonda de 25 entrega de bp de largo colocada sobre la región suprimida recurrente junto con una sonda de referencia de 21 bp, situado 31 bp río abajo en el mismo amplicon. Para optimizar nuestro análisis, hemos utilizado un conjunto de estándar de referencia de cfDNA incluyendo el EGFR c.2235_2249del de deleción del exón 19, p.Glu746_Ala750del.

Sensibilidad, especificidad y localización de las nubes de gotas se han definido con muestras de control de MUT y el ADN genómico PBMC de peso como se muestra en la Figura 4A para KRAS. Hemos demostrado además que este tipo de análisis funciona en múltiples tipos de alteraciones genéticas como sustitución simple, múltiples sustituciones o eliminaciones (Figura 4B), así como en diversos tipos de muestra⁶.

Figura 1: el ddPCR de entrega requiere un único par de oligo-sondas de hidrólisis para escanear todas las mutaciones de una región de hotspot. Análisis de diseños con un resultado esquemático muestra como parcelas de dispersión bidimensional que muestra intensidad de fluorescencia de la gotita. (A) ddPCR convencional con mutante (sonda MUT) y sondas de tipo salvaje (sensor de peso) a la misma región exacta. DdPCR (B) la entrega contiene una sonda de referencia (sonda 1) que recuece a una región no variables y una sonda de bajada (sonda 2) dirigida a la región mutada pero complementarios a la secuencia de la WT, dentro de los mismos productos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: flujo de trabajo ddPCR de entrega para el perfilado de mutación de ADN de plasma. El flujo de trabajo completo se compone de 5 pasos principales: (A) (1) diseño de primers y sondas, (2) optimización del análisis, extracción de aislamiento y cfDNA de plasma (3) (B), (4) ddPCR ejecutar y (C) (5) análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de bajada ddPCR. Entrega ddPCR análisis flujo de trabajo destacando los parámetros importantes que necesitan ser ajustados. Esto asegura la eficiente identificación automatizada de afloramientos, vacíos, la lluvia o gotas positivas; asignación de gotitas MUT o WT y computación el MAF para cada pozo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados representativos - análisis de ddPCR de entrega EGFR y KRAS . (A) ejemplo de los resultados obtenidos durante los pasos de optimización de la prueba de ddPCR de entrega. Detección de mutantes o DNA de tipo salvaje en una reacción que contiene 100% MUT ADN, ADN de MUT 5% y 100% WT ADN. (B) ejemplos de plasma muestras analizadas con el KRAS y EGFR entrega ddPCR ensayos que muestran la detección de un solo nucleótido y sustituciones múltiples en el exón 2 de KRAS y una deleción en el exón 19 de EGFR . Esta figura ha sido adaptada de Decraene et al. ⁶. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Para diseñar un ensayo de ddPCR de entrega eficiente, la optimización es crucial, y el protocolo debe seguirse cuidadosamente. Cada combinación de cebadores y sondas tiene un única eficiencia de reacción de PCR. Así, un ensayo individual tiene que ser cuidadosamente validado en muestras de control antes de ser utilizado en muestras de prueba valiosos. Optimización y validación son importantes para la detección de la señal de pico de certificar y evaluar sensibilidad y especificidad. Como se describe en el protocolo, todas las mutaciones que se encuentra en una región de destino de la "sonda 2" potencialmente pueden ser interrogadas. Sin embargo, validación se recomienda para las mutaciones situadas en los extremos 5' o 3' de "sonda 2", ya que estos pueden afectar la eficacia de la prueba de entrega.

El método presentado aquí se puede realizar con la DNA extraída de cualquier tipo de "tejido", incluyendo los tejidos FFPE, células en muestras de sangre o la cultura. Sin embargo, la calidad de la extracción de ácidos nucleicos puede impactar dramáticamente resultados ddPCR. Inhibidores de la PCR como heparina, proteínas, heme, fenol, proteasas, colágeno, melanina, detergentes o sales deben eliminarse tanto como sea posible durante la toma de muestras y los pasos de purificación. Aunque las muestras de ADN pueden ser diluidas para reducir el impacto de los inhibidores de la polimerización en cadena en el ddPCR, dilución disminuye la sensibilidad porque menos copias del destino pondrá a prueba por reacción. Esto debe tomarse en consideración cuando un cierto nivel de sensibilidad debe ser alcanzado, como se ensayarán un mínimo de copias.

Entrega ddPCR puede aplicarse a muchos tipos de alteraciones moleculares (substituciones del nucleótido simple y múltiple, eliminaciones, etc.). Además de utilizar sólo dos sondas para detectar todas las alteraciones (aumentando practicidad y rentabilidad del ensayo), ddPCR de entrega genera menos ruido de fondo⁶ y muestra mayor sensibilidad en comparación con ensayos multiplexores. Además, ya que se realiza en una sola reacción, se consumen cantidades mínimas de muestras de pacientes. Este análisis es particularmente atractivo en el contexto de la biopsia líquida porque la cantidad de ctDNA es a menudo baja en estas muestras.

De hecho, el método presentado aquí es aplicable para la investigación de la mutación en el material de biopsia de líquido y ya ha demostrado su utilidad para la práctica clínica (ESR1 investigación de la mutación en el ensayo clínico PADA-1 - NCT03079011). Sin embargo, es crucial utilizar amplicones tan corto como sea posible en este entorno debido a la fragmentación de cfDNA⁸.

Caracterización aguas abajo todavía debe realizarse por separado para identificar la mutación exacta por alelos del mutante. Sin embargo, debido a decisiones terapéuticas se basan principalmente en el estado mutacional de regiones de hotspot de oncogenes targetable (mutante de vs WT), la capacidad de bajada ddPCR inmediatamente identificar mutaciones es una poderosa herramienta de diagnóstico. Por otra parte, la mutación exacta no necesita ser conocida a priori para el diseño de un ensayo en contraposición a las soluciones comerciales actuales. Además, entrega ddPCRs puede combinarse con análisis específicos ddPCR convencional para aumentar aún más el número de mutaciones para (datos no mostrados). Por último, dejar ddPCR puede aplicarse a otros campos de investigación. En particular, puede resultar ser una herramienta útil para la detección de colonias positivas en experimentos edición del genoma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer