Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Summary

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Abstract

Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) örnek ayırma yağı su bireysel tepkiler nano ölçekli binlerce içine temel bir son derece hassas nicel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemidir. Son zamanlarda, ddPCR tümör DNA (ctDNA) algılama dolaşan için en doğru ve hassas araçlarından biri haline gelmiştir. Her olası allelic sürüm tanıma belirli hidroliz probları gerektiğinden bir standart ddPCR tekniği önemli sınırlamaları tepki ekranlı mutasyonlar kısıtlı sayısıdır. Probları algılamak ve potansiyel olarak tüm genetik değişiklikler hedeflenen bölgede ölçmek için yalnızca tek bir çift gerektirdiğinden alternatif bir metodoloji, teslim ddPCR, üretilen iş, artırır. Teslimat ddPCR geleneksel ddPCR deneyleri mutasyonlar daha fazla sayıda tek bir reaksiyonu tespit avantajı ile karşılaştırılabilir duyarlılık görüntüler. Düşük maliyetli, değerli örnek malzeme tasarrufu ve mutasyonlar bir prioribilinen değil aynı zamanda bir keşif aracı olarak kullanılabilir.

Introduction

Somatik mutasyon kanser geliştirilmesi için ilgili binlerce bildirilen¹olmuştur. Bunlar arasında birkaç akıllı işaretleri etkinliğinin hedefe yönelik tedavi ^2,3 ve şimdi rutin klinik pratikte bu mutasyonlar eleme genetik. Damlacık dijital PCR (ddPCR) teknoloji olup mutasyonların yüksek algılama hassasiyeti ile izlemek için kullanılan ve non-invaziv sıvı biyopsi^4,5ile son derece uyumludur. Ancak, geçerli ddPCR deneyleri öncelikle bir prioribilinen mutasyonlar algılamak için tasarlanmıştır. Mutasyon bilinmeyen olduğunda bu ciddi bir şekilde ddPCR bir keşif aracı olarak kısıtlar. Nitekim, geleneksel ddPCR tasarımında, vahşi tipi gen (WT sonda) tanıma bir hidroliz sonda mutant gen (MUT sonda) (Şekil 1A) tanıma belirli bir sonda ile buz dansında yarışmaktadır. Sonda daha yüksek benzeşimli şablona hybridizes ve karşılık gelen alleli niteliği gösteren onun fluorophore serbest bırakır. Her damla için elde edilen floresan veriler farklı boyutta WT ve MUT probları tarafından yayılan floresans temsil eden bir dağılım çizim olarak görüntülenmeyecektir. Geleneksel ddPCR tahlil için tipik bir sonuç şematik gösterimi Şekil 1Aile sunulur. Örneğin, mavi bulut ise kırmızı bulut içinde MUT alleli edilmiş amplifikatör ve MUT sondası tarafından tanımlanan damlacıkları karşılık gelen WT sondası tarafından tanımlanan WT gen içeren damlacıklar karşılık gelir. Tepki olarak yüklenen DNA miktarı bağlı olarak, Çift Kişilik olumlu damlacıkları WT ve MUT amplicons içeren (yeşil bulut) görünebilir. Işık gri bulut için boş damlacıkları karşılık gelir.

Fluorophores (genellikle 2, 5'e kadar ama) sınırlı sayıda tespiti için en platformlar izin beri geleneksel ddPCR-den geçerek sınırlıdır. Bu nedenle, birden çok bitişik mutasyonlar bölgeleriyle hedefleme Teknik olarak çok katmanlı ddPCR deneyleri veya birden çok tepkiler her mutasyon paralel hedefleme kullanımı zor tasarım gerektirir. Teslimat ddPCR strateji gibi potansiyel olarak WT hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak bir hedef bölge içinde herhangi bir genetik değişiklik tespit edebilen bu sınırlamanın üstesinden gelir. Hedef bölge ve ikinci sonda (sonda 2) bitişik olmayan değişken sıra mutasyonlar nerede hedef bölge WT dizisi tamamlayıcı ilk sonda (sonda 1) kapsar (Şekil 1B) bekleniyor. İlk sonda tepki amplifiable molekülleri toplam miktarı quantifies iken, ikinci sonda WT ve MUT allelleri mutant sıralarını alt-optimal hibridizasyon tarafından ayrımcılık. Sonda 2 hedef bölge (tek veya birden fazla nükleotit oyuncu değişikliği, silme vb.)⁶' mutasyonların birden çok türü tanımlayabilirsiniz. Geleneksel ddPCR olduğu gibi hafif gri bulut yok DNA molekülleri içeren damlacıklar karşılık gelir. Bu tür tahlil, en uygun WT ve MUT bulutlar ayrılması WT ve MUT hedef gen içeren damlacıklar sadece WT içeren damlacıklar ayırt edemez beri tepki olarak yüklenen DNA miktarına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir formu. Bu nedenle, bu tahlil çoğu damlacıkları hedeflenen gen birden fazla kopyasını içermesini gerektirir.

Protocol

Burada sunulan Protokolü Institut Curie etik kuralları izler. Tüm insan örnekleri kaydoldu Institut Curie, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış çalışmalarda aydınlatılmış onam sonra hastalardan elde edilmiştir.

1. kan toplama, plazma depolama ve boş hücre DNA ekstraksiyon

Not: herhangi bir "doku" türünden çıkarılan DNA kullanılabilir (Örneğin, taze veya formaldehit sabit parafin (FFPE) doku, hücre kültürü veya kan örneklerinde gömülü). Burada, biz kan toplama, plazma yalıtım ve depolama ve boş hücre DNA (cfDNA) çıkarma için ayrıntılı yönergeler sağlar.

1. Kan toplama ve plazma Muhafazası (Şekil 2B)
   1. 7 mL EDTA tüpler kan örnekleri toplamak. İki tüp yaklaşık 4 mL plazma toplamak için tavsiye edilir.
   2. Tüpler için kırmızı kan hücreleri (RBC), beyaz kan hücreleri (WBC) ve plazma ayırmak için kan alımı, 820 x g 3 saat içinde 10 dk santrifüj kapasitesi. Örnekleme ve Santrifüjü arasındaki süre yüksek kalitede cfDNA (Yani, WBC yayımlanan DNA ile kontamine değil cfDNA) elde etmek için önemlidir.
   3. Dikkatle damlalıklı WBC katman dokunmadan 1 mL damlalıklı kullanarak süpernatant (plazma); yaklaşık 2 mL plazma genellikle EDTA Tüp kurtarıldı.
   4. Plazma 2 mL tüpler için aktarmak ve 16.000 x g 10 dk 15 ° C'de hücre artıkları kaldırmak için de aliquots santrifüj kapasitesi.
   5. Dikkatle damlalıklı Pelet bozmadan süpernatant (plazma). 2 mL kriyojenik tüpler plazmada dağıtmak ve-80 ° gerekinceye kadar C'de depolayın.
2. cfDNA ayıklama (Şekil 2B)
   Not: Burada, yordamı kullanarak el ile ekstraksiyon kiti mevcut. Üreticinin yönergelerini izleyerek otomatik bir sürüm da cfDNA yalıtım için gerçekleştirilebilir.
   1. 400 µL İndinavir k 50 mL tüp içine koymak. 4 mL plazma (rutin olarak kullanılan cilt) ve lizis arabellek (1.0 µg taşıyıcı RNA içeren) ACL 3.2 mL Seti'nden ekleyin. Tüp kapatın ve 30 vortexing tarafından mix s homojen bir çözüm elde etmek için. 30 dk 60 ° C'de kuluçkaya.
   2. Arabellek ACB 7.2 mL (Seti'nden) lysate silika membran için dolaşımdaki nükleik asitleri bağlama optimize etmek ve vortexing için 15-30 s. Incubate buz üzerinde 5 min için tüp tarafından karışımı ekleyin.
   3. Sütun ve 20 mL extender vakum pompası yerleştirin. Vakum aspirasyon izin vermek için kullanılmayan pozisyonları kapatmak.
   4. Dikkatle tüp extender (kısaca santrifüj tüpü en fazla arabellek lysate ACB karışımı toplamak), lysate arabellek ACB karışımı uygulamak vakum pompası üzerinde geçiş ve lysate sütunlar boyunca tamamen çekilecek izin. Kaldırmak ve tüp extender atın.
   5. 600 µL arabelleği ACW1 sütun için geçerlidir. Arabellek ACW1 sütunu boyunca çizildiğinde 750 µL eklemek arabellek ACW2 ve son olarak 750 µL etanol (96-%100) ekleyin. O zaman, temiz 2 mL toplama tüp ve santrifüj etanol ortadan kaldırmak için 3 dakika için tam hızda (20.000 x g) sütun yeri.
   6. Sütun yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin. Kapağı açın ve membran tamamen kurumasını 10 dk 56 ° C'de kuluçkaya.
   7. Sütun bir temiz 1.5 mL DNA düşük bağlama tüp içine yerleştirin. Dikkatli bir şekilde 36 µL RNase free su %0,04 sodyum azid (arabellek AVE) ile uygulanır. Kapağı kapatın ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
   8. Nükleik asitler elute ve -20 ° C de ihtiyaç kadar saklamak 1 dk için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kapasitesi.
3. cfDNA miktar
   Not: cfDNA miktar kullanmadan önce hemen çekme ya da örnekleri, oda sıcaklığında (RT), çözdürme sonra üreticinin iletişim kuralını kullanan bir yer ile gerçekleştirilir. Birden çok donma/çözülme döngüsü kaçının.
   1. Yüksek-duyarlı tahlil genellikle 100 ng/mL plazma olan beklenen cfDNA miktarını göre kullanın. cfDNA konsantrasyonları ama 2 – 10 ng/mL sağlıklı bağış için menzil metastatik hastalığı bulunan olgularda 100 ng/mL olarak yüksek olabilir.
   2. Tüm reaktifler RT ve yer seyreltme arabelleği 199 µL boya (200 x) 1 µL ile reaksiyon (N örnekleri + yer ayarlamak için 2 standartları sayısı) karışımı sağlamak çalışan bir çözüm elde etmek için.
   3. Girdap cfDNA çözüm iyice homojenliği sağlamak ve kısaca içeriği tüp alt toplamak için santrifüj kapasitesi.
   4. Mix 5 µL 195 µL çalışma çözüm ile her cfDNA örneği.
   5. 190 µL çalışma çözüm ile Mix 10 µL her standart.
   6. 2-3 s kısaca içeriği tüpler alt toplamak için santrifüj kapasitesi ve homojenliği emin olmak için girdap iyice tüm tüpleri.
   7. RT karanlıkta 2 min için kuluçkaya.
   8. ' Ng/µL' çıkış modu kullanarak yer, tüplerde okuyun
   9. Plazma ng/ml son konsantrasyonu aşağıdaki gibi hesaplar: ng/µL x 36 (cfDNA eluate hacmi) / 4 (çıkarılan plazma hacmi).

2. ddPCR sonda ve astar tasarım (Şekil 2A)

Not: Amplifikasyon teslimat ddPCR tahlil hedeflenen moleküllerin qPCR benzer ilkeleri takip eder. Her astar ve yoklama geleneksel adanmış yazılım Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/) ile tasarlanmıştır.

1. Astar tasarım
   1. Genel ayarlar penceresinde 0.8 ve ' mispriming/Kütüphane tekrarlama ' doğru organizmaya 'divalent katyonlar konsantrasyon' 3,8, 'dNTPs konsantrasyon' için değiştirin.
   2. Önceden ayarları penceresinde 'Termodinamik parametreler tablo' ve 'tuz konsantrasyonu formülü' Santa Lucia 1998'e değiştirin.
   3. 55 ve 70 ° C arasında T_m seçin (50 mm için tuz konsantrasyonu ve 300 nM oligonükleotid yoğunlaşması).
   4. PrimerBlast gibi araçlarla astar özgüllük denetleyin.
   5. İkincil yapılar var bölgeler kaçının.
   6. 50-%60 bir GC içeriğe sahiptir bir sıra seçin.
   7. Gs ve 3 üsleri artık Cs tekrarlar kaçının.
   8. Sonunda onların 3' mümkün olduğunda Gs ve Cs ile astar seçin.
   9. 3' ucunda eşleştirilmiş astar astar-dimer önlemek için önemli tamamlayıcılık var mı emin olun. Amplicons 150 daha küçük olmalıdır verimli bir şekilde cfDNA yükseltmek için bp (170 bp⁸boyutudur demek) ve sık sık parçalanmış FFPE çıkarılan DNA.
2. Sonda tasarım
   Not: Hidroliz probları 5' uç bir floresan muhabir ve 3' ucunda bir içki ile etiketlenir. Yüksek özgüllük, sağladıkları yüksek sinyal gürültü oranı ve çoğullama gerektiğinde izin verir. İki kanallı damlacık okuyucular FAM/HEX analizini yanı sıra FAM ve HEX veya VIC boyalar ile uyumlu veya FAM/VIC probları birleştiğinde.
   1. Hidroliz probları hedef bölge ve bitişik olmayan değişken bölge WT dizisi için tamamlayıcı tasarlayın.
   2. Her ikisi de daha önce tasarlanmış astar çifti tarafından tanımlanan amplicon içinde yer alan probları seçin. Her ne kadar yan yana oturup olabilir astar dizileri sonda sıralarıyla üstüne gelemez.
   3. Gs. probları bir GC içerik % 30-80 olması gerekir daha daha fazla Cs vardır strand seçin.
   4. 13 ve 30 nükleotid uzunluğunda arasında probları seçin. Daha uzun probları eğilimi yüksek arka plan floresans görüntülemek için fluorophore ve içki arasındaki mesafe fluorophore muhabir Şoklama etkilediği için.
   5. T_m 3-10 ° C astar astar tavlama ve uzantısı sırasında sonda hidroliz emin olmak için T_m daha yüksek olmak probları seçin. T_m arttırıcılar gerekli T_m kısa probları tek nükleotid türevleri daha verimli bir şekilde ayrımcılık gibi kısa, sonda tutarken ulaşmak için tavsiye edilir. Çünkü bu bile hidroliz sonra floresans sinyal quenches probları 5' sonunda bir G olmamalıdır.
   6. Teslimat probları aşağıdaki gibi tasarım: 5'-(VIC) -Tamamlayıcı WT dizisi mutasyona uğramış bölge-(MGB NFQ)-3' ve referans olarak yoklama: 5'-(6-FAM) -Tamamlayıcı sıralı olmayan değişken bölge-(MGB NFQ)-3'. Gazeteci/içki diğer kombinasyonları da mümkündür.

3. ddPCR reaksiyon (Şekil 2A) getirilmesi

Not: Bu adımda kullanılan yaban tipi ve mutant DNA denetimleri hücre hatları, tümör örnekleri veya piyasada bulunan DNA kullanılan standartlar, örneğin elde edilebilir.

1. Örfî bir PCR tasarlanmış astar tarafından güçlendirilmiş PCR ürünü özgüllük doğrulamak için termal degrade özelliğini kullanarak bir termal cycler gerçekleştirin.
   1. Bir PCR reaksiyon karışımı vahşi tipi DNA denetim şablonu en az sıcaklık en az bir reaksiyon için 8 Tepkiler basamakta 4.1 (olmadan probları) aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
   2. Adım 4.3.2 ve tavlama sıcaklıkları astar teorik tavlama sıcaklığını çevresinde bir dizi açıklanan program kullanarak amplifikasyon çalıştırın.
   3. PCR ürünleri belirli ürünler sunmak sıcaklıklar tavlama için seçmek için %3 özel jel üzerinde yük.
2. Yukarıda açıklanan parametreleri kullanarak teslim ddPCRs ama her iki prob dahil olmak üzere bu sefer bir dizi yapmak.
   1. Kullanımı % 100 WT DNA, % 100 MUT DNA ve WT ve MUT DNA karışımı (Örneğin, % 50 MUT/50% WT) WT ve MUT damlacık bulutlar clear ayrılması için en iyi koşulları belirlemek için.
   2. Tavlama sıcaklığı yukarıda adım 4.1'de seçilen sıcaklık aralığı seçin.
   3. % 100 WT DNA veya %100 MUT DNA ve en iyi WT ve MUT damlacık bulutlar ayrılması kullanırken sinyalleri WT veya MUT belirli algılanmasını sağlayan tavlama sıcaklığı seçin.
   4. Zaman ve astar/sonda konsantrasyonları tavlama da bulutlar ayrılması geliştirmek ve orta Floresan (yağmur efekti) ile damlacıkları sayısını azaltmak için ayarlanabilir.
3. Arka plan veya boş (LOB) sınırı değerlendirmek testin.
   1. En az 48 bireysel teslimat ddPCR reaksiyonlar WT denetim tavlama parametreleri ve 3.2 seçilen astar/probları konsantrasyonları kullanma DNA ile gerçekleştirin.
   2. Her reaksiyon için mutant Gen frekansı (MAF) aşağıdaki gibi hesaplar: (mutant damlacıkları/sayısı dolu damlacıkları sayısı) x 100.
      Not: LOB yanlış MAF ortalama tanımlanan ve ilişkili SD % 95 güven aralığı (% 95 GA) hesaplanır. LOB (yanlış MAF ortalaması) = + % 95 CI.
4. Algılama (LOD olarak) testin sınırı değerlendirin.
   1. Teslimat ddPCR reaksiyonlar WT DNA, %0.01 %5 değişen MAFs ile seri dilutions MUT DNA kullanarak gerçekleştirmek (≥ 8 çoğaltır koşul). 3.2 seçilen tavlama parametreleri ve astar/sondalar konsantrasyonları kullanın.
      Not: En küçük MAF değerleri kendisi için mevcut ortalama değerleri ve SD LOB yukarıda çoğaltır LOD tanımlanır (bkz: Decraene vd. ⁶ daha fazla ayrıntı için).

4. ddPCR Protokolü (Şekil 2B)

Not: Benzer geleneksel ddPCR, teslimat ddPCR Protokolü 4 adımdan oluşur: (i) PCR karışımı hazırlanması, (ii) damlacık üretimi, (iii) PCR güçlendirme ve (iv) veri toplama.

1. PCR karışımı hazırlık
   1. Standart önlemler takip et, temiz bir PCR başlık, temiz Pipetler ve RNase, kullanarak, eldivenler gibi DNaz ücretsiz distile su kirlenmesini önlemek için.
   2. Çözülme ve reaksiyon bileşenler RT. equilibrate
   3. 20 x 18 µM, astar ve sondalar, 5 mikron ile distile su karışımında astar/sonda hazırlayın.
   4. Tüm bireysel PCR reaksiyonları için 2 x ddPCR supermix (10 μL), 20 x astar/probları mix ve en fazla 10 ng DNA örneği qsp 20 µL distile su 1 µL birleştirerek bir örnek karışım hazırlayın.
   5. Reaksiyon homojenliği sağlamak için iyice karıştırın ve kısa bir süre önce dağıtım içeriği tüp alt toplamak için santrifüj kapasitesi. Her reaksiyon karışımı kullanmadan önce için bu adımı yineleyin için tereddüt etmeyin.
2. Damlacık üretimi
   1. DdPCR kartuş tutucusuna takın ve reaksiyon Mix damlacık üretimi (yeşil pozisyonlarda Şekil 2B) için kartuşu orta kuyu örnekleri içeren 20 μL yük bir 8 kanallı pipet kullanarak.
   2. Damlacık jeneratör petrol 70 μL alt wells (sarı pozisyonlar) ekleyin.
   3. Bir conta ile kartuşu damlacık jeneratör takın; damlacıkları kartuş (mavi pozisyonlar) üst wells üretilecektir.
   4. Aspire edin ve yavaş yavaş ve nazikçe dağıtmak (kesme) önlemek için kartuşları bir 96-şey PCR tabak içine üzerinden damlacıkları 40 μL. Damlacıkları devrinin en iyi duruma getirmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
3. PCR güçlendirme
   1. Son PCR tabak bir tabak mühürleyen hemen damlacıklar aktardıktan sonra buharlaşma önlemek için kullanarak bir alüminyum folyo ile kapatın. Kısaca içeriği kuyu dibinde toplamak için plaka santrifüj kapasitesi.
   2. Örfî bir PCR güçlendirme aşağıdaki programı kullanarak bir termal cycler üzerinde çalıştırın: 95 ° C 10 min, 40 döngüleri [94 ° C 30 s, doğrulanmış tavlama T ° 60 s], 98 ° C 10 dk (rampa 2,5 ° C/s). Denetimler hiçbir giriş DNA ile vahşi türü (≥3 çoğaltır) ile her vadede içerir.
   3. Çalıştır tamamlandığında, kısaca içeriği kuyu dibinde toplamak için plaka santrifüj kapasitesi.
4. Veri toplama
   1. PCR güçlendirme sonra üreticinin yönergelerini izleyerek damlacık okuyucu sayısı PCR-pozitif ve PCR negatif damlacıkları, kullanın.
      Not: Damlacık okuyucu genellikle FAM, VIC veya HEX fluorophores ile uyumlu bir adet iki renkli Optik algılama sistemi sunar.

5. veri analizi (Şekil 2C ve Şekil 3)

Not: PCR-pozitif ve PCR negatif damlacıkları MUT ve WT allelleri hedeflenen bölge, mutlak bir miktar sağlamak için dikkate alınır. Atanan damlacıkları MAF her iyi hesaplamak için kullanılır. Damlacık miktar ve Analizi teslimat deneyleri Attali ve meslektaşları^9,10tarafından geliştirilen ddPCR R paket (https://github.com/daattali/ddpcr) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu R paket otomatik olarak boş, "yağmur" (nedeniyle verimsiz amplifikasyon) parçası olarak veya gerçek olumlu sinyal (Şekil 3) ile dolu olarak damlacıkları sınıflandırır. Analizi farklı adımları sunan aşağıdaki bölümde (bkz: https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ algoritması. olan yazarlar tarafından yazılmış algoritması açıklayıcı skeç, kısa bir sürümüdür Daha fazla ayrıntı için RMD). Verileri virgülle ayrılmış değerler dosyası (FileName_Amplitude.csv) verilen ve doğrudan R veya adanmış web arabirimi yoluyla çözümlenmesi için ddPCR paketindeki yükledi.

1. Parametre ayarlamaları
   Not: Her teslimat tahlil tasarım belirli son damlacık dağılımları ve varyasyonları bulut form, renk ayrımlarını veya pozisyonlar olan beklenebilir. Verimli otomatik analizi sağlamak için bir parametre kümesi ayarlanması gerekir. Bir de beklenmedik bir profil varsa, başarısız kılmak için bütün tabağı analizini kaynaklanan bir hata iletisine neden olabilir. Sorunlu de tespit ve otomatik analizinden kaldırılması gerekir.
   1. Başarısız wells (REMOVE_FAILURES) kullanarak tanımlayın. Kullanma TOTAL_DROPS_T (varsayılan değerdir 5.000) damlacıkları her iyi en az sayısını ayarlamak için. Kullanma EMPTY_LAMBDA_LOW_T (varsayılan değer olduğu 0.3) ve EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (varsayılan değerdir 0.99) beklenen damlacık bulutlar (boş, MUT, WT) değerlendirmek ölçümleri ayarlamak için ve kendi kalite.
      Not: çok fazla boş damlacıkları sahip olduğunu değil yeterince amplifiable şablon tepki bir ibret vardır.
   2. Aykırı damlacıkları (REMOVE_OUTLIERS) kullanarak tanımlayın. Kullanma TOP_PERCENT (varsayılandır p = %1) damlacıkları tüm plaka dışında en yüksek sinyal değeri her sinyal boyut (FAM, VIC/HEX) sahip damlacıkları üst p yüzde ayarlamak için. Kullanma CUTOFF_IQR (varsayılan olarak 5) en yüksek sinyal üst p yüzde aykırı eşik ayarlamak için.
   3. Boş damlacıkları (REMOVE_EMPTY) kullanarak tanımlayın. Kullanma CUTOFF_SD (varsayılan değer 7) daha düşük (boş damlacıkları) Gauss dağılımı Probe 1 değerleri standart sapması ayarlamak için.
   4. Kapı damlacıkları (sınıflandırma) kullanarak. Kullanma CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (varsayılan olarak 3) daha yüksek (dolgulu damlacıkları) Gauss dağılımı Probe 1 değerleri standart sapması ayarlamak için. Kullanma ADJUST_BW_MIN (varsayılan, 4) ve ADJUST_BW_MAX (varsayılan olarak 20) sonda 2 değerlerini Çekirdek yoğunluğu tahmin ve MUT ve WT bulut damlacıkları ayırımcılık için k_min ve k_max parametreleri ayarlamak için.
      1. Kullanmak SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (varsayılandır p = %1) ve SIGNIFICANT_P_VALUE (varsayılan olarak anlam düzeyinde s=0.01%) kuyu mutant veya wildtype olarak sınıflandırmak için.
         Not: Bu algoritma, bir mutant de istatistiksel olarak önemli ölçüde p daha yüksek bir MAF sahip olarak tanımlanır.
2. Otomatik Analizi
   Not: Bu bölümde sunulan her parametre için önerilen varsayılan değerleri kendi uzmanlık ve verilerine göre ddPCR R paket yazarlar var. Ancak, tüm parametreler Analizi (Şekil 3) kalitesini artırmak için değiştirilebilir.
   1. Başarısız olan kuyu tanımlayın.
      1. Dört kalite kontrol ölçümleri kullanın (ayarları: REMOVE_FAILURES) başarısız wells; tanımlamak için İlki bir de içermelidir damlacıkları az sayısıdır. Diğer üç odak geçerli aday nüfus boş, muhtemelen FAM + ve HEX için tanımlama +/ VIC + damlacıkları. Aşağı akım analizi bu kriterleri karşılamak için başarısız wells kaldırın.
   2. Aykırı damlacıkları tanımlayın.
      1. Damlacık çoğunluğuna baskının eğri önlemek amacıyla, aykırı (Yani, damlacıkları anormal derecede yüksek HEX/VIC veya FAM değeri olan) daha fazla analiz bir üst sınır eşik ayarlayarak kaldırmak (ayarları: REMOVE_OUTLIERS).
   3. Boş damlacıkları tanımlayın.
      1. Veri boyutunu azaltmak için boş damlacıkları tanımlamak (tipik bir kuyuda onlar damlacıkları çoğu için hesap olacaktır) ve sadece şablonu içeren damlacıklar kalması gibi (yararsız bilgi büyük bir bölümünü varlığı nedeniyle istatistiksel önyargı ortadan kaldırmak ayarları: REMOVE_EMPTY).
   4. Damlacık geçişi gerçekleştirin.
      1. Kalan damlacıkları mutant, wildtype ya da yağmur olarak sınıflandırmak (ayarları: SINIFLANDIRMAK).
   5. Yağmur damlacıkları tanımlayın.
      1. FAM + veya HEX gelen yağmur damlacıkları verimsiz amplifikasyon neden olarak hariç tutmak +/ VIC + bulutlar. Onların sonda 1 değerleri kullanarak kendi kümeleri sınırları belirlemek (ayarı: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
   6. Mutant vahşi tipi damlacıkları karşı tanımlayın.
      1. Analiz vurgulamak ayrımcılık mutant ve wildtype şablonlar arasında olduğu için bir veya diğer olarak bu aşamada tüm kalan damlacıkları tanımlayın. Benzer Probe 1 değerlerine sahip olmalıdır beri en iyi onların anılan sıraya göre doğa tahmin etmek sonda 2 değerleri kullanın (ayarları: ADJUST_BW_MIN ve ADJUST_BW_MAX).
   7. Kuyu mutant karşı vahşi-türü olarak sınıflandırmak.
      1. MUT ve WT hangi damlacıkları olduğunu belirledikten sonra MAF hesaplayın. Mutant frekans ve ilişkili p-değeri her iyi kullanarak, bu onları sınıflandırmak mümkündür (ayarları: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) olarak (çoğunlukla WT damlacıkları içeren) WT veya MUT wells (MUT istatistiksel olarak anlamlı bir sayı içeren damlacıkları).
3. Keşfetmek ve verileri verme
   1. Keşfetmek ve verileri damlacıkları, aykırı, boş damlacıkları, konsantrasyonları veya daha fazla en iyi temsil için özelleştirilebilir grafikler sayısı olarak dışa aktarın.

Representative Results

Bir kanıtı-of-concept çalışmada, KRAS exon 2 mutasyonlar (kodon 12 ve 13) ve EGFR exon 19 silme FFPE doku ve teslimat ddPCR strateji⁶kullanarak kanserli hastalarda plazma örnekleri incelenmiş.

KRAS teslimat sonda hangi insan kanser¹¹bilinen KRAS mutasyonların % 95'den fazla liman birden çok mutasyonların exon 2 KRAS gen kapsayan 16 bir bp bölge sorgulaması. 20 referans yoklamaydı uzunluğu ve bulunduğu 3 kan basıncı kan basıncı aşağı. 2 en sık mutasyona uğramış KRAS amino asit içeren hücre satırlarından çıkarılan DNA kullandığımız bizim tahlil optimize etmek için: G12V (c.35GT, SW480) ve G13D (c.38GA, HCT 116).

EGFR teslimat tahlil EGFR exon 19 tüm aktive silme için taramak için tasarlanmıştır. Tahlil tekrarlayan silinen bölge ile birlikte bir başvuru sonda 21 üzerinde yerleştirilen bir 25 bp-uzun teslimat sonda kullanılan bp, yer alan 31 kan basıncı aşağı aynı amplicon. EGFR dahil cfDNA referans standart kümesi kullandığımız bizim tahlil en iyi duruma getirmek için exon 19 silme c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del.

Duyarlılık, özgüllük ve damlacık bulutlar konumunu kontrol MUT örnekleri ve Şekil 4A gösterildiği gibi WT PBMC genomik DNA ile KRAS için tanımlandı. Biz daha fazla bu tür bir tahlil genetik değişiklikler tek alternatifi, birden fazla oyuncu değişikliği veya silme (4B rakam) gibi birden çok türde yanı sıra çeşitli örnek türleri⁶çalışıyor gösterdi.

Şekil 1: iade ddPCR hidroliz oligo-sonda bir hotspot bölgesinin tüm mutasyonlar taramak için benzersiz bir çift gerektirir. Tasarımları ile bir şematik sonuç iki boyutlu dağılım gösteren damlacık floresan yoğunluğu çizer olarak gösterilen tahlil. (A)mutant (MUT sonda) ve tam olarak aynı bölge hedefleme vahşi-tipi (WT sonda) probları ile konvansiyonel ddPCR. (B) teslimat ddPCR olmayan değişken bölge anneals bir başvuru sonda (sonda 1) ve tamamlayıcı aynı amplicon içinde WT diziye ama mutasyona uğramış bölge hedefleme bir teslimat sonda (sonda 2) içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: teslimat ddPCR iş akışı için plazma mutasyon DNA profilleme yöntemi. Tam iş akışı 5 önemli adımlardan oluşur: (A) (1) tasarım astar ve sondalar, tahlil, (B) (3) plazma yalıtım ve cfDNA çıkarma, (4) ddPCR çalıştırmak ve (C) (5) veri analiz optimizasyonu (2). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: teslimat ddPCR analiz. Teslimat ddPCR analiz iş akışı önemli parametreler vurgulayarak bu ince ayar gerekir. Bu outliers, boş verimli otomatik tanımlaması, yağmur veya pozitif damlacıkları sağlar; MUT veya WT damlacıkları gibi ve her şey için MAF bilgi işlem. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Temsilcisi sonuçları - KRAS ve EGFR teslimat ddPCR deneyleri. (A)örnek sonuçları elde edilen teslimat ddPCR tahlil optimizasyonu adımları uyguladığınızda. Mutant ve/veya vahşi tipi DNA % 100 MUT DNA, %5 MUT DNA ile % 100 WT içeren bir tepki olarak algılanması. Plazma numuneleri KRAS ve EGFR ile analiz örnekleri (B) teslimat ddPCR deneyleri exon 2 KRAS ve silme EGFR exon 19 içinde algılanması tek nükleotid ve birden çok oyuncu değişikliği gösteren. Bu rakam Decraene ve ark. adapte edilmiş ⁶. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bir verimli teslimat ddPCR tahlil tasarlamak için optimizasyon çok önemli ve protokol dikkatle izlenmesi gerekir. Astar ve sondalar her birleşimi bir benzersiz PCR reaksiyon verimlilik vardır. Böylece, bir tek tek tahlil dikkatli bir şekilde kontrol örnekleri üzerinde değerli test örnekleri üzerinde kullanılmadan önce doğrulanması gerekiyor. En iyi duruma getirme ve doğrulama en yüksek sinyal algılama tasdik ve özgüllük ve duyarlılık değerlendirmek önemlidir. İletişim kuralında açıklandığı gibi "yoklama 2" ile kaplı bir hedef bölge içinde yer alan tüm mutasyonlar potansiyel olarak sorguya. Yine de, doğrulama "sonda 2", 5' ya da 3' ucunda bulunan mutasyonlar için tavsiye edilir bunlar teslimat tahlil verimliliğini etkileyebilir beri.

Burada sunulan Yöntem "doku" FFPE dokular, kültür ya da kan örnekleri hücreleri de dahil olmak üzere, her türlü çıkarılan DNA ile yapılabilir. Ancak, nükleik asit ayıklama kalitesini önemli ölçüde ddPCR sonuçları etkileyebilir. PCR inhibitörleri heparin, proteinler, heme, fenol, proteaz, kollajen, melanin, deterjanlar veya tuzları gibi örnekleme ve arıtma adımları sırasında mümkün olduğunca ortadan gerek. DNA örnekleri PCR inhibitörleri ddPCR üzerinde etkisini azaltmak için seyreltilmiş rağmen daha az hedef kopyalarını tepki test çünkü seyreltme hassasiyeti azaltır. Olarak en az kopya test gerekir ulaşmak için duyarlılık belirli bir düzeyde olduğunda bu dikkate alınması gereken.

Teslimat ddPCR moleküler değişiklikler (tekli ve çoklu nükleotit oyuncu değişikliği, silme vb.)birçok türü için uygulanabilir. Tüm değişiklikler (böylece pratiklik ve maliyet-etkililik testin artan) algılamak için sadece iki problar kullanarak, yanı sıra teslimat ddPCR daha az arka plan gürültü⁶ oluşturur ve artan duyarlılık multiplex deneyleri için karşılaştırıldığında gösterir. Ayrıca, bu yana tek bir reaksiyon gerçekleştirilir, hasta örnekleri çok az miktarda tüketilir. CtDNA miktarı genellikle bu örnekleri düşük olduğundan bu tahlil sıvı biyopsi bağlamında özellikle itiraz ediyor.

Gerçekten de, burada sunulan yöntem sıvı-biyopsi malzeme mutasyon tarama için geçerlidir ve yararını klinik pratikte (Reset-1 klinik deneme - NCT03079011ESR1 mutasyonu tarama) için zaten kanıtlamıştır. Ancak, bu ortamda mümkün olduğunca kısa amplicons cfDNA⁸parçalanma nedeniyle kullanmak çok önemlidir.

Aşağı akım karakterizasyonu yine mutant Gen tarafından taşınan tam mutasyonu tanımlamak için ayrı ayrı yapılması gerekir. Çünkü tedavi kararları öncelikle targetable oncogenes (WT vs mutant) bölgelerinde etkin nokta mutational durumuna göre ancak, teslimat ddPCR hemen mutasyonlar tanımlama yeteneği güçlü bir tanı aracı kolaylaştırır. Ayrıca, tam mutasyon bir tahlil ikimizde için geçerli ticari çözümler tasarlamak için bir priori bilinen gerekmez. Buna ek olarak, teslimat ddPCRs belirli geleneksel ddPCR deneyleri için fazla artış ile (veri için gösterilmez) ekranlı mutasyonlar sayısı birleştirilebilir. Son olarak, teslimat ddPCR diğer araştırma alanlarına uygulanır. Özellikle, genom düzenleme deneyler olumlu kolonilerde süzmek için yararlı bir araç olarak kanıtlamak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer