Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58054
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine, Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University

Summary

זה נשאר אתגר גדול לפתח מותנה נוקאאוט גנטי או יעיל ג'ין-נוקאאוט באיברים דג זברה למבוגרים. כאן אנחנו מדווחים על פרוטוקול עבור ביצוע siRNA בתיווך nanoparticle ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים, ובכך מספק שיטה אובדן-של-פונקציה חדשה ללמוד. האיברים הבוגרים דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.

Abstract

יונקים יש קיבולת מוגבלת מאוד לחדש את הלב לאחר אוטם שריר הלב. מצד שני, דג זברה בוגרת מחדש את הלב שלה לאחר כריתה איפקס או cryoinjury, שהופך אותו אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר רגנרציה של הלב. עם זאת, העדר שיטות אובדן-של-תפקוד האיברים הבוגרים הגביל תובנות לגבי המנגנונים הלב התחדשות. התערבות ב RNA באמצעות מערכות אספקה שונים הוא כלי רב עוצמה עבור להשתיק גנים בתרבית של תאים ואורגניזמים מודל. אנחנו דיווחו בעבר כי חלקיקים אנקפסולציה siRNA בהצלחה הזן תאים וגוררים נוקאאוט גנטי ספציפי יוצאת דופן בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול פשוט, מהיר ויעיל עבור משלוח siRNA בתיווך דנדרימר ו ג'ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות. שיטה זו מספקת גישה חלופית לקביעת ג'ין פונקציות באיברים למבוגרים בדג זברה, ניתן להרחיב אורגניזמים מודל אחרים גם כן.

Introduction

אוטם שריר הלב, הפכה איום בריאותי גדול, שמוביל נטל כלכלי עצום ברחבי העולם1. הלב יונקים בוגרים נכשלת לחדש, לחדש את cardiomyocytes לאיבוד בקנה מידה מאקרוסקופית אחרי הפציעה, שמוביל היווצרות של רקמות צלקת ואי ספיקת לב עוקבות. בניגוד יונקים, דג זברה הוא מסוגל הלב התחדשות, בעיקר באמצעות התפשטות שריר הלב חזקים לאחר סוגים שונים של פגיעה בלב, שהופך אותו אורגניזם מודל אידיאלי בשביל לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות לב 2,3,4,5,6,7,8. התחדשות הבסיסית של הלב דג זברה בפענוח מנגנוני אנדוגני הוא אזור מרגש של מחקר בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות לשפר את לב האדם התחדשות9.

מניפולציה גנטית שיטות זמינות דג זברה. אלה מורכב morpholinos (מו) אשר נמצאים בשימוש נרחב גם צפרדעים, צ'יק, יונקים חוץ דג זברה10,11,12,13. מו יש נוקאאוט יעיל היעד גנים סנפיר דג זברה למבוגרים, המוח ולאחר רשתית14,15,16,17,18,19. נעול-nucleic חומצה (מגבר קדם) היא עוד oligonucleotide מלאכותי המשמש כדי להפיל את ביטוי גנים אנדוגני לא רק בדג זברה עוברי, אלא גם למבוגרים אברי חית20,21,22, 23 , 24. אולם חוסר של שיטות יעילות אובדן-של-פונקציה עבור לבבות המבוגרים נותרה מכשול בפני הלומדים את המנגנונים המולקולריים של התחדשות איברים. מעכבי הנוכחי, מולקולה קטנה או ביטוי הטרנסגניים של מוטציות דומיננטה-שלילי משמשים בעיקר כדי לחסום את הפונקציה של גנים מסוימים או מסלול ללמוד את תפקידה דג זברה בוגרת הלב התחדשות25,26 ,27. עם זאת, לא כל הגנים או איתות המסלולים הינם ישימים עבור שיטות אלה.

RNAs הפרעה קטנה (siRNAs) נמצאים בשימוש נרחב עבור ניתוח אובדן-של-פונקציה בתרבית של תאים, העוברים של מודל אורגניזמים, כמו גם איברים למבוגרים עבור מחקרים פרה חיה מודלים28,29,30 , 31 , 32. siRNAs שימשו באופן יעיל להשתקת גנים גידולים33,34,35 , cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 באמצעות מערכות אספקה שונים. לאחרונה פיתחנו nanoparticle אנקפסולציה siRNA יעיל ג'ין-להחרשת בלב למבוגרים ההתחדשות באמצעות מספר חלקיקים שונים41,42,43, מתן כלי הרומן מחקרים פונקציונלי של גנים באיברים דג זברה למבוגרים. על סמך שלנו הקודם מחקרים41,42,43, כאן אנו מציגים עבור siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת ההתחדשות f-PAMAM-פג-R9 משתמש פרוטוקול פשוטה, פרקטית, עדיין חזק dendrimers. Aldh1a2 (אלדהיד דהידרוגנאז 1, בן משפחה A2) ג'ין היה upregulated לאחר כריתה איפקס דג זברה, אבלציה של Aldh1a2 חסם את התחדשות לב44. פה אנחנו לוקחים את aldh1a2 ג'ין לדוגמה כדי לבדוק את יעילות תמונות ציפורים גנים מתווכת על-ידי הזרקת אנקפסולציה nanoparticle siRNA. פרוטוקול זה מכיל הליך כריתה הלב דג זברה, סינתזה של חלקיקים של שיטת משלוח על חלקיקים אנקפסולציה siRNA ללב דג זברה למבוגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בשימוש פרוטוקול דג זברה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה באוניברסיטת פקינג, אשר הוא מוכר באופן מלא על ידי האגודה הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה.

1. הכנת פתרון Tricaine

  1. כדי להכין פתרון מניות tricaine, להוסיף 400 מ"ג אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate אבקת mL 97.9 מזוקקים למים, ולאחר מכן להוסיף מ ל 2.1 של טריס מ' 1 (pH 9.5) כדי להתאים את ה-pH ל ~ 7. חנות הפתרון מניות ב 4 º C.
  2. כדי להכין הפתרון עובד tricaine, להוסיף 4.2 mL tricaine מניות פתרון 100 מ ל אקווריום מערכת המים.

2. בוגרים דג זברה כריתה חדרית

  1. להכין כלים וחומרים לניתוח הכוללים חתיכת ספוג, צלחת פטרי מלא tricaine עובד פתרון, פיפטה פלסטיק, stereomicroscope, שני מלקחיים חדה, iridectomy מספריים, ואת המרפק פינצטה (איור 1).
  2. להכין את חריץ קטן בגודל של 4 ס מ x 0.5 ס מ ו- 0.5 ס מ עומק על ספוג כדי להחזיק את דג זברה במהלך הניתוח כריתה חדרית.
  3. מילוי טנק דג זברה 3 L עם חצי מיכל של דג זברה מערכת המים נעשית באמצעות 60 mg/L ים ומלחים dH2O עבור ההתאוששות של הדג פצועים.
  4. עזים ומתנגד הדגים על 10 ס מ צלחת פטרי עם פתרון tricaine עד התנועות גיל ירידה אחת לשניה, לשמור את הדגים במשך לפחות 30 s כדי להבטיח כי זה הוא מורדם לחלוטין.
  5. העבר את הדג anesthetized הפינצטה המרפק אל החריץ צדדי הגחון ספוג לח למעלה. חזותית לאתר את השוליים של הלב הפועם ולאחר מכן אתר את הלב תחת stereomicroscope.
  6. השתמש את המספריים iridectomy לעשות חתך קטן של 1 מ"מ החודר העור והשרירים, בזהירות לקרוע את שכבת האפיתל כסוף של שק הלב עם קצות המלקחיים לגשת הלב. אין להכניס המלקחיים עמוק מדי לתוך חלל כדי למנוע את הפגיעה הלב.
    הערה: בשלב זה, עליך לזכור כדי להימנע לדימום. אל תכלול את הדגים הניסוי אם לדימום מתרחשת, מאז דימום יתר נגרמת בעיקר על ידי הפגיעה בשוגג הלב, אז תגרום מטעה תוצאות.
  7. חושפים את הנוזלים בעדינות מחזיק קדקדה עם מלקחיים חדה בעזרת היד האחרת או על ידי הפעלת לחץ עדין בבטן. לאחר מכן, עם היד השנייה, הסר ~ 20% הנוזלים-השיא בעזרת המספריים iridectomy.
    הערה: אין דימום נרחב צריך להתרחש בשלב זה.
  8. השתמש מפית רטובה כדי לכסות את החתך, כמו הגלישה פצעים בשפע עבור 15-45 s לפני קרישה, ולאחר מכן להחזיר את הדגים לתוך המיכל עם מערכת מים.
    הערה: אין צורך לתפור את החתך.
  9. ודא כי הדג חוזר גיל תנועות 1 דקות, ואז קורות חיים שחייה. אם הדג אינו מציג תנועות גיל לאחר 50 s במים, ולהגן על ידי מתיז מים לתוך הגג באמצעות פיפטה פלסטיק עד הדג קורות חיים פעיל אוורור.
  10. לשמור על הדגים למערכת המיחזור לאחר ההסרה חדרית.
    הערה: אין לו מיוחד יש צורך בהשוואה עם הדג רגיל. שיעור התמותה של כריתה חדרית דג זברה למבוגרים הוא כ- 5-10%. כמעט כל מוות קורה בתוך 24 שעות לאחר הניתוח.

3. הכנת אנקפסולציה siRNA חלקיקים

  1. לסנתז את פאם f4-פג-R9 דנדרימר.
    הערה: הסינתזה של f-פאם4-פג-R9 דנדרימר חומרים בוצע כפי שתואר לעיל37 עם מספר שינויים. האורך של α, ω-dipyridyl disulfido פוליאתילן גליקול (PEG-Py-Py) הצטמצם ל משקל מולקולרי של 1,000 כדי למקסם את ומגעים siRNAs (איור 2B).
  2. יבש 10 מ ג של הגרעין cystamine של G4.0 polyamidoamine (כינה PAMAM) באמצעות מייבש ואקום ב 45 ° C 1 h ולמוסס את PAMAM ב- saline פוספט באגירה של 2 מ ל Dulbecco (DPBS, פתרון מלח מאוזנת המשמש עבור מגוון של יישומים התרבות התא).
  3. להמיס 1.7 מ"ג tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) ב 1 מ"ל DPBS, לערבב עם הפתרון PAMAM המבושלות 3.2 ולהשאיר בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין במשך 8 שעות.
    הערה: TCEP הוא ten-fold עודף על הקשרים דיסולפידי של PAMAM טוחנת יחס.
  4. להסיר TCEP מוגזמת על ידי אולטראפילטרציה. הוסף DPBS לתערובת PAMAM-TCEP לעיל כדי להגיע את עוצמת הקול של 10 מ"ל, הפתרון מועבר לתוך צינור אולטראפילטרציה 3 kDa (משקל מולקולרי לחתוך) MWCO. לאחר צנטריפוגה ב 3000 g למשך 15 דקות, לבטל את הפתרון בצינור אוסף. מסתכמים DPBS על המכשיר מסנן mL 10 ובעדינות פיפטה הדגימה מספר פעמים, צנטריפוגה שוב. חזור על שלב זה עבור 4 פעמים. לאחר שעבר סינון, וארוקן את הדגימה מהמכשיר מסנן.
    הערה: המוצר של שלב זה מצטמצם PAMAM (הנקרא f-PAM4).
  5. להמיס 14 מ ג Py-פג-Py ב 1 מ"ל DPBS, לערבב עם הפתרון f-PAM4 ולהשאיר את זה עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות. ואז להסיר את יתר Py-פג-Py על ידי השלב אולטראפילטרציה כמתואר ב- 3.4. לאחר שעבר סינון, וארוקן את הדגימה מהמכשיר מסנן.
    הערה: המוצר נקרא בשם f-PAM4-פג-Py. כמות Py-פג-Py היא 10-fold יחס טוחנת קבוצות תיול ב- f-PAM4.
  6. התמוססות 6.4 מ ג של ציסטאין הסתיימה R9 פפטיד (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) 1 מ"ל DPBS, לערבב עם f-PAM4-פג-Py ומערבבים בעדינות במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר. לטהר המוצר הסופי, בשם f-PAM4-פג-R9, על ידי השלב אולטראפילטרציה כמתואר ב- 3.4 חוץ מזה DPBS משתנה מים יונים. Lyophilize את המוצר באמצעות ואקום ההקפאה מייבש.
    הערה: המוצרים 3.5, 3.6 לפני lyophilization מאוחסנים ב-20 ℃ במשך חודש לפחות. לאחר lyophilization של f-PAM4-פג-R9, מאוחסנות הדגימות ב-20 ℃ לפחות 2 חודשים.
  7. כדי לקבוע את מידת השינוי פג ופפטיד, להמיס 5 מ"ג f-PAM4-פג-Py D2O (דאוטריום אוקסיד) והעבר אותו לאמבטיה מדגם NMR (תהודה מגנטית גרעינית). ביצוע ניתוח ספקטרלי 1H-NMR-400 מגה-הרץ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ניתוח נתונים NMR37.
    הערה: באופן ספציפי, הנציג PAMAM פסגות (- NCH2CH2CO-) פג פסגות (- OCH2CH2-), ארגינין בפסגות שאריות (- HCCH2CH2CH2NH-) פפטידים צפויים להיות טווחים 2.4-2.6, 3.7 – 3.8 ו 1.6-1.8 ppm, בהתאמה. לקבוע את מידת השינוי של פג, R9 יחסית PAMAM על-ידי חישוב אינטגרלים את הפסגות פג ו- R9 ועד לפסגות PAMAM. מידת השינוי פג הוא 100% והוא השינוי R9 לפחות 50%. 1H-NMR ספקטרלי הבדיקות מבוצעות במתקן הליבה של המוסד.
  8. להמיס את פאם f4-פג-R9 דנדרימר לפדר ב- PBS כדי 4 מ"ג/מ"ל ולהפוך aliquots של הפתרון עבור שימוש חד פעמי.
    הערה: הפתרון דנדרימר ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות, בלי לחזור על הקפאה והפשרה.
  9. להמיס את siRNAs התווית על-ידי צבעי cyanine (הנקרא Cy5-siRNA), Aldh1a2 siRNA או מקושקשות בקרה שלילית siRNA במים מזוקקים 10 מיקרומטר.
    הערה: השתמש siRNAs התווית על-ידי צבעי את cyanine כדי להעריך אם siRNA nanoparticle אנקפסולציה באפשרותך להזין בלב דגים (איור 2א-ב). פרוטוקול זה לוקח aldh1a2 כמו ג'ין דוגמה כדי לקבוע את היעילות של משלוח של f-PAM4-פג-R9 אנקפסולציה דנדרימר siRNA. מסדרות siRNAs הם: Cy5-siRNA antisense סטרנד: יונקות-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′, siAldh1a2 סטרנד antisense: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' ו בקרה שלילית מקושקשות siRNA antisense סטרנד: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'.
  10. כדי להכין את הפתרון אנקפסולציה siRNA ננו-חלקיק, מערבבים siRNA עם אמצעי אחסון שווה של פתרון דנדרימר דגירה המדגם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות להכין טרי הפתרון siRNA-nanoparticle לפני השימוש.
    הערה: הנפח של פתרון nanoparticle אנקפסולציה siRNA תלוי מספר הדגים הולך להיות מוזרק. לדוגמה, להתכונן פתרון דנדרימר µL לפחות 120 (לערבב 60 µL siRNA פתרון והפתרון דנדרימר 60 של µL) ההזרקה של 10 דגים (~ 10 µL לכל דג), סופר לאובדן של פתרון.

4. הזרקה של חלקיקים אנקפסולציה siRNA ללב דג זברה למבוגרים

  1. כמתואר לעיל, להתכונן חתיכת ספוג עם חריץ, צלחת פטרי 10 ס מ מלא עם פתרון tricaine, פיפטה פלסטיק, stereomicroscope, פינצטה המרפק של מזרק אינסולין (איור 1), כמו גם דגי זהב עם מערכת מים דיור דגים לאחר ההזרקה.
  2. לאפשר את דג זברה פצוע שהוכנו בשלבים 2.1 – 2.10 להתאושש במשך יום אחד לאחר כריתה חדרית ולאחר מכן עזים ומתנגד הדג (ימים שלאחר קטיעה) dpa 1 בתמיסה tricaine כמתואר ב- 2.4.
  3. העברת הדגים anesthetized, הצד הבטני, אל החריץ סמרטוט לח באמצעות את הפינצטה המרפק. אתר הלב הפועם תחת stereomicroscope.
  4. לטעון µL 10 של הפתרון nanoparticle אנקפסולציה siRNA לתוך המזרק אינסולין. להימנע כמה שיותר בועות.
  5. לשתק את הדג באמצעות בעדינות את הפינצטה המרפק כדי להחזיק את אזור בית החזה עם היד האחרת. לא תהדק את הדג חזק מדי.
    הערה: זכור כי אין דימום נרחב צריך להתרחש במהלך ההזרקה.
  6. להחזיק את המזרק מלא אינסולין על ~ 30° ולהזריק ~ 10 µL של פתרון לתוך חלל בית החזה בעזרת היד השנייה (משלימה איור 1).
    הערה: לפעמים הפתרון זורם החוצה במהלך ההזרקה, אך זה אינו משפיע על האפקט siRNA. הפתרון siRNA-ננו-חלקיק יכול להיות מוזרק פעם ביום במשך מספר ימים עד חודש, בהתאם תוכנית ניסויית ספציפיים. להזריק דג עם סוג אחד של siRNA בכל פעם. אם יותר משני סוגי siRNA צריך להיות מוזרק דג אחד, להזריק סוג אחד של siRNA בכל פעם, ולאחר מכן הוסף סוג נוסף של siRNA 1 h מאוחר יותר. ב פרוטוקול זה, הוזרק רק סוג אחד של siRNA לכל דג.
  7. העברת הדגים למיכל עם מערכת המים.
    הערה: הדג צפויים מחדש איוורור בתוך 1 דקות ולאחר מכן לחדש שחייה. ההזרקה של חלקיקים אנקפסולציה siRNA או siRNA בדרך כלל אינו גורם המוות בדג זברה למבוגרים.

5. לב אוסף, קיבוע, והערכת יעילות siRNA משלוח

  1. להכין 1 מ"ל של 4% פתרון paraformaldehyde בשפופרת microcentrifuge עבור כל קבוצה.
  2. עזים ומתנגד הדג בפתרון tricaine-הימים שנבחרו לאחר זריקות. מקם את הדגים supinely לתוך החריץ ספוג לח. עושים חתך גדול באזור בית החזה ופתח נרחב עם הפינצטה. לאחוז את מערכת יצוא, להוציא את הלב כל בזהירות עם הפינצטה.
  3. לשטוף את הלב עם PBS ולהסיר במהירות נוזל נוסף עם מפית. לשים עד 10 לבבות לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 1 מ ל paraformaldehyde. בעדינות היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים, להשאיר למשך הלילה ב 4 º C.
  4. למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לבבות Cy5-siRNAs-מוזרק באמצעות ה- ויוו הדמיה מערכת (משלימה איור 2). השתמש לבבות דג זברה 3-4 עבור כל קבוצה במחקר זה.
  5. הר הלבבות קבוע עם פרפין או OCT מורכבים (הטבעה בינוני עבור קפוא דגימות רקמה להבטיח טמפרטורה אופטימלית חיתוך).

6. הערכה של ג'ין להחרשת siRNA בתיווך ננו-חלקיק

  1. להכין מכולה מבודדת עם פינצטה ארוכה. יוצקים בחנקן נוזלי בשליש הכרך של הגורם המכיל.
  2. עזים ומתנגד הדג בפתרון tricaine-2 dpa. לנתח את הלבבות, כמתואר ב- 5.2 ולאחר מכן הסר את יצוא בדרכי ואטריום.
    הערה: הדג יכול לשחזר הניתוח ביום אחד, לאחר מכן מוזרק-dpa 1 עם או מקושקשות אנקפסולציה siRNA חלקיקים (siNC) כמו שליליות שליטה או aldh1a2 אנקפסולציה siRNA חלקיקים (siAldh1a2).
  3. להעביר את החדרים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL באמצעות את הפינצטה, לכסות את מכסה הצינורית ולאחר מיד למקם את הצינור לתוך המיכל מבודד עם חנקן נוזלי. תן את הבמה צינורות על-החנקן הנוזלי עבור כמה הגבלת שימוש הפינצטה זמן להסיר את צינורות המכולה.
  4. חזור על שלבים 6.2, 6.3 עד כל החדרים נאספים. השתמש לבבות 6-10 עבור כל קבוצה.
  5. לחלץ את הרנ א הכולל לבבות עם ריאגנט בידוד ה-RNA. להעריך את רמות הביטוי של הגנים המתאימים על ידי RT-PCR כמותי באמצעות תחל Gapdh f: GATACACGGAGCACCAGGTT; Gapdh r: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 f: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 r: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע את היעילות של המשלוח siRNA בתיווך דנדרימר, אנחנו resected השיא של הנוזלים של הלב דג זברה, ואז מזריקים µL כ- 10 של דנדרימר בלבד (קבוצה מדומה), Cy5-siRNA בלבד (קבוצה עירום) או f-PAMAM-פג-R9 אנקפסולציה דנדרימר Intrapleurally Cy5-siRNA (קבוצת Cy5-siRNA), בהתאמה (איור 2א-ב). האות פלורסצנטיות היה לזיהוי בליבם הזריק אנקפסולציה דנדרימר Cy5-siRNA ב 3, 24 ו 48 מדד מחירי הבתים של (הזרקת שלאחר שעות), בזמן זה היה בקושי לזיהוי בלבבות מקבוצות מעושה ועירום -מדד מחירי הבתים של 48 (איור 2C-D), רומז דנדרימר f-PAMAM-פג-R9 ביעילות מקלה על מסירת siRNAs אל לב דג זברה למבוגרים, יציב במשך לפחות יומיים.

כדי לחקור את ההשפעה של siRNA אנקפסולציה דנדרימר על ג'ין להחרשת, בחרנו aldh1a2 (אנזים לסנתז חומצה retinoic) כמו גן המטרה, אשר דווחה יהיה צורך הלב חידוש לאחר כריתה חדרית44 . כפי שמוצג באיור 3א, הדגים היו מותרים להתאושש במשך יום אחד לאחר כריתה חדרית, ואז microinjected עם אנקפסולציה דנדרימר siRNA. . מצאנו רמת הביטוי של mRNA aldh1a2 ירד בליבם שטופלו siAldh1a2 אנקפסולציה דנדרימר f-PAMAM-פג-R9 בהשוואה לזה של אנקפסולציה דנדרימר מקושקשות siRNA (siNC) ב 2 dpa (איור 3ב'), הוכחת כי f-PAMAM-פג-R9 בתיווך דנדרימר siRNAs להשיג גנים ספציפיים להשתיק בלב דג זברה למבוגרים.

Figure 1
איור 1 : ניתוח לב וכלי נגינה הזרקת בית החזה. צילום של כלי הנגינה המשמשים כריתה חדרית בלב דג זברה למבוגרים: ספוג עם חריץ, פינצטה המרפק, מלקחיים חדה, iridectomy מספריים, פינצטה ארוכה את המזרק אינסולין משמש למשלוח אנקפסולציה דנדרימר siRNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : יעיל f-PAMAM-פג-R9 בסיוע דנדרימר משלוח של siRNA אל לב פצוע דג זברה בוגרת. ערכת (A) עבור חוקרים את יעילות ספיגת ננו-חלקיק-כמוס Cy5-siRNA בלב דג זברה בוגרת לאחר כריתה חדרית (dpa: בימים שלאחר קטיעה; מדד מחירי הבתים של: הזרקת שלאחר שעות). (B) סינתזה של f-PAMAM-פג-R9 דנדרימר והכנת אנקפסולציה דנדרימר Cy5-siRNA. (ג) Cy5 הדמיה זריחה של לבבות הזריק dendrimers בלבד (מעושה), Cy5-siRNA רק בלי דנדרימר כימוס (עירום), קרינה פלואורסצנטית אנקפסולציה דנדרימר הנקרא Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) זוהה על ידי ההדמיה vivo ב מערכת, מראה כי קרינה פלואורסצנטית אותות היו כמעט בלתי מורגשת בקבוצות מעושה ועירום -מדד מחירי הבתים של 48, בעוד אותות חזקים נשמרים באנקפסולציה דנדרימר Cy5-siRNA הקבוצות מ 3 ל מדד מחירי הבתים של 48. קנה מידה שרירותית של קרינה פלואורסצנטית אותות מציג חלש (כחול) כדי חזק (אדום). (ד) כימות של זריחה Cy5-siRNA אותות בלבבות מוערך על ידי ה- ויוו מערכת כמו לוח C הדמיה (* P < 0.05, * * * P < 0.001; הנתונים אינם s.e.m. זאת אומרת ±; חד-כיווני השונות ואחריו Bonferroni של השוואה מרובים בדיקות; n = 3-4 לבבות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : SiRNA יעיל להחרשת aldh1a2 בלב דג זברה בוגרת פצוע. ערכת (A) עבור חוקרים את השפעת ג'ין להחרשת aldh1a2 siRNA. QPCR (B) חושף את aldh1a2 mRNA ירד בליבם siAldh1a2 אנקפסולציה ננו-חלקיק בהשוואה אנקפסולציה nanoparticle siRNA מקושקשות לבבות (siNC). רמת הביטוי של mRNA aldh1a2 היה מנורמל מאת GAPDH (* * * P < 0.001; נתונים אתה מתכוון ± s.e.m. עם לזווג מבחן t של סטודנט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 1
משלים איור 1: תמונות של חלל בית החזה הזרקת. (א) בחלל בית-החזה בדגים הבוגרים-יום 1 post קטיעה. (B) הזרקה של siRNA אנקפסולציה nanoparticle לתוך חלל בית החזה. גודל ברים: 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 2
משלים איור 2: יעילות ספיגת ננו-חלקיק-כמוס Cy5-siRNA בלב שציווית דג זברה בוגרת. (א) Cy5 הדמיה זריחה של לבבות הזריק dendrimers בלבד (מעושה), Cy5-siRNA עירום בלי דנדרימר כימוס (עירום), עוברת אנקפסולציה דנדרימר Cy5-siRNA תחת ה- ויוו מערכת הדמיה. קנה מידה שרירותית של קרינה פלואורסצנטית אותות היא חלשה (כחול) חזקה (אדום). (B) כימות של זריחה Cy5-siRNA אותות בלבבות נמדד באמצעות ה ויוו מערכת כמו פאנל A הדמיה (NC: משמעותיים שונה; הנתונים זאת אומרת ± s.e.m.; חד-כיווני השונות ואחריו את Bonferroni של מספר מבחן השוואה; n = 3-4 לבבות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דג זברה הוא לגמרי מסוגל של רגנרציה מגוון איברים כולל את הלב למבוגרים5. בעוד שיטות מהונדס גנטית הם מפותח ללמוד פונקציות גנים העוברים של דג זברה, החוקרים עדיין עומדות בפנינו משימה מרתיעה של יצירת אללים mutant מותנה בדג זברה45,46. לפיכך, מוטציות דומיננטה-שלילי הטרנסגניים או מעכבי מולקולה קטנה משמשים לעתים קרובות לפונקציות ג'ין כתובת דג זברה בוגרת איברים25,27,42. במהלך מספר שנים, פיתחנו שיטה חלופית לניתוח אובדן-של-פונקציה של גנים בלב דג זברה למבוגרים באמצעות משלוח siRNA בתיווך nanoparticle וג'ין להשתיק41,42, 43. כאן, מוצג עבור שיטה זו באמצעות siRNA בתיווך דנדרימר ג'ין להחרשת בלבבות דג זברה בפרט ואולי גם באיברים דג זברה אחרים, באופן כללי, פרוטוקול מפורט.

מולקולת siRNA לא יכול להיכנס לתוך התאים על ידי עצמו. בגלל שלה מטען שלילי, להיות מושפל בקלות על ידי נוקלאז. עם מונו-לפזר מולקולות, מבנים tunable ומאפיינים, dendrimers היה נחשב siRNA מבטיח גם נשאים 47. Dendrimers PAMAM יש מהפרברים cationic עשיר, אמינים חציצה בתוך אשר יכול לתווך siRNA כימוס בתנאים פיזיולוגיים, זירוז אפקט "פרוטון ספוג" לשחרר siRNA מ endosomes בציטופלסמה בהתאמה48 , 49 , 50. במאמר זה, PAMAM שונתה כדי לשפר את יציבות ויעילות משלוח. מערכת f-PAMAM-פג-R9 מספקת ראש דנדרימר PAMAM המיספרי עם המטען החיובי לצורך כימוס siRNA למנוע ההשפלה על ידי נוקלאז. הזרוע פג ופפטיד transmembrane את R9 שימש כדי לשפר את hydrophilicity של חלקיקים לייצוב ולקדם את ספיגת על ידי תאים בהתאמה.

האיכות ואת סוג של חלקיקים הם קריטיים עבור משלוח siRNA יעיל ו ג'ין להחרשת בלב דג זברה. חקרנו בהצלחה שלושה חלקיקים מגוונת מבחינה מבנית למטרה זו: פג-PLA, חלקיקים f-PAMAM-פג-R9, פיי-HYD-RGD41,42,43. למרות שהם לא מסחרית מיוצרים, מעבדת כימיה אורגנית רגיל יכול בקלות לסנתז, לטהר חלקיקים כפי שתואר לעיל35,37,43. כאן, אנו בחרנו את דנדרימר f-PAMAM-פג-R9 כדוגמה כדי להציג את משלוח siRNA פשוט, יעיל, בתיווך דנדרימר ואת ג'ין להחרשת בלב דג זברה בוגרת לאחר כריתה חדרית, כי זה יחסית קל להכין שנטענו siRNA דנדרימר-מתחמי, כגון על ידי המקננת התערובת בטמפרטורת החדר למשך ~ 20 דקות. מצד שני, ה-pH יש יותאם עבור טעינה siRNA nanocomplexes אם פיי-HYD-RGD הוא בשימוש43. באופן דומה, emulsifying ושגרות טיהור חיוניים להשגת פתרון אחיד siRNA אנקפסולציה nanoparticle אם פג-PLA חלקיקים נמצאים בשימוש35,41.

עוד צעד קריטי היא למזער או אין דימום במהלך ההזרקה של siRNA אנקפסולציה דנדרימר כמתואר ב- 4.5 מאז לדימום פסיקות התחדשות לב ומערכות ביולוגיות אחרות. לפיכך, אנו ממליצים לא כולל דגים מקבוצות הניסוי אם הדימום מתרחש במהלך ההזרקה. באופן כללי, הליך פשוט הזרקת בקלות mastered לאחר מספר נסיונות.

המגבלות הגדולות של שיטה זו הם הטכנולוגיה siRNA עצמו, כגון אפקטים חופש-יעד פוטנציאליים ומחיקה לא שלם של הגנים של עניין. אחרת, היה מאוד לשחזור השכפול הביולוגית של ג'ין להחרשת של מספר גנים הפגינו העבודה שלנו ושל אחרים41. חשוב, פרוטוקול זה הוא מהיר, פשוט ויעיל, הטיפול הזרקה הוא נסבל היטב על ידי דג זברה למבוגרים. ניתוח ניסיוני של יעילות ג'ין להחרשת siRNA עשויה לכלול את ההערכה של mRNA רמות הביטוי על-ידי הכלאה באתרו בתוך או RT-PCR כמותי, או של רמות ביטוי חלבון באמצעות שהכלים המערבי, immunohistochemical מכתים, או ניתוחים פונקציונליים אחרים. יחד, אנו תומכים באופן מלא siRNA הקלו nanoparticle משלוח ככלי חלופי ללימודי אובדן-של-פונקציה בלב דג זברה בוגרת בפרט, גישה זו יורחב גם לאיברים אחרים דג זברה למבוגרים, אורגניזמים אחרים מודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה ד ר ברוס IC תגובות ביקורתיות, לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 ו 31521062), חברת AstraZeneca אסיה, ולא מתעוררים תרופה חדשנית שוק התפתחות מוקדמת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tricaine Sigma E10521 Store at 4 °C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
  2. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
  3. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
  4. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
  5. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  6. Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
  7. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
  8. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
  10. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
  11. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  12. Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
  13. London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
  14. Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
  15. Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
  16. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
  17. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  18. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
  19. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
  20. Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
  21. Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
  22. Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
  23. Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
  24. Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
  25. Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
  26. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  27. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  28. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
  29. de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
  30. Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
  31. McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
  32. Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
  33. Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
  34. Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
  35. Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
  36. Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
  37. Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
  38. Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
  39. Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
  40. Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
  41. Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
  42. Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
  43. Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
  44. Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
  45. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  46. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  47. Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
  48. Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
  49. Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
  50. Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 137 דג זברה התחדשות לב למבוגרים חלקיקים siRNA ג'ין שתיקה התפתחותית ביולוגיה גנטיקה
בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu,… More

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. W. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter