Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/58055
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

Summary

Assisted reproductieve technieken (ARTs) worden voortdurend geëvalueerd om de resultaten te verbeteren en de daaraan verbonden Risico's te verminderen. Dit manuscript beschrijft een minimaal invasieve embryotransfer procedure met een efficiënt cryopreservatie protocol dat het gebruik van konijnen als een ideaal dierlijk model van menselijke voortplanting toelaat.

Abstract

Geassisteerde reproductieve technieken (kunst), zoals in vitro embryocultuur of embryo cryopreservatie, beïnvloeden natuurlijke ontwikkelingspatronen met perinatale en postnatale gevolgen. Om de onschadelijkheid van kunst toepassingen te waarborgen, zijn studies in dierlijke modellen noodzakelijk. Bovendien, als een laatste stap, embryo ontwikkeling studies vereisen evaluatie van hun vermogen om op volledige termijn gezonde nakomelingen te ontwikkelen. Hier, embryotransfer naar de baarmoeder is onmisbaar voor het uitvoeren van een ARTs-gerelateerde experiment.

Het konijn is gebruikt als een modelorganisme om de voortplanting van zoogdieren te bestuderen voor meer dan een eeuw. In aanvulling op haar verwantschap nabijheid van de menselijke soort en de geringe omvang en lage onderhoudskosten, het heeft belangrijke reproductieve kenmerken zoals geïnduceerde ovulatie, een chronologie van de vroege embryonale ontwikkeling vergelijkbaar met de mens en een korte dracht die ons toelaten om de gevolgen van de kunst toepassing gemakkelijk te bestuderen. Bovendien worden kunst (zoals intracytoplasmatische spermainjectie, embryocultuur, of cryopreservatie) toegepast met geschikte efficiency in deze soort.

Met behulp van de laparoscopische embryotransfer techniek en de cryopreservatie protocol gepresenteerd in dit artikel, beschrijven we 1) hoe embryo's overdracht door middel van een eenvoudige, minimaal invasieve techniek en 2) een effectief protocol voor de lange termijn opslag van konijn embryo's om tijd-flexibele logistieke capaciteiten te bieden en de mogelijkheid om het monster te vervoeren. De resultaten verkregen na de overdracht van konijn embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia geven aan dat morula is de ideale fase voor konijn embryo herstel en overdracht. Zo is een oviductal embryotransfer vereist, rechtvaardigen de chirurgische procedure. Bovendien, konijn morulae zijn met succes verglaasd en Laparoscopisch overgedragen, waaruit de effectiviteit van de beschreven technieken.

Introduction

Met de doelstellingen van het omzeilen van menselijke onvruchtbaarheid of de verbetering van de verspreiding van vee van hoge genetische waarde en het behoud van dierlijke genetische hulpbronnen, een reeks technieken gezamenlijk genoemd ondersteunde reproductie technologieën, zoals superovulatie, in vitro fertilisatie, embryocultuur, of cryopreservatie, werden ontwikkeld1,2. Momenteel worden hormonale behandelingen gegeven aan de eierstokken te stimuleren en produceren een groot aantal antral ovariële follikels1. Oöcyten verzameld uit deze follikels kunnen worden gerijpt, bevrucht, en ontwikkeld in vitro totdat ze ofwel gecryopreserveerde of overgedragen aan surrogaat moeders3. Echter, tijdens deze behandelingen, gameten en zygoten worden blootgesteld aan een reeks van niet-fysiologische processen die kunnen vereisen embryo aanpassing om te overleven in deze omstandigheden4,5. Deze aanpassing is mogelijk door de vroege embryo-plasticiteit, waardoor embryo veranderingen in genexpressie en ontwikkelings programmering6. Echter, deze wijzigingen kunnen invloed hebben op de daaropvolgende stadia van de ontwikkeling van embryo's tot volwassenheid, en het is nu algemeen aanvaard dat methoden, timing, cryopreservatie procedure of cultuur voorwaarden tonen verschillende resultaten op embryo Fate7 , 8. Daarom is het gebruik van goed gekenmerkte diermodellen onvermijdelijk om de specifieke geïnduceerde effecten van kunst te verhelderen.

De eerste gedocumenteerde levende geboorte als gevolg van de overdracht van zoogdier embryo's vond plaats in 18909. Vandaag, embryotransfer (ET) naar een surrogaat vrouwtje is een cruciale stap in het bestuderen van de kunst-geïnduceerde effecten tijdens de pre-implantatie op de daaropvolgende embryo ontwikkeling stadia10. ET de technieken hangen van de grootte en de anatomische structuur van elk dier af. In het geval van grote dierlijke modellen, is het mogelijk geweest om ET door transcervicale niet-chirurgische ET technieken uit te voeren, maar in kleiner-grootte soorten katheterisatie van de cervix is complexer en de chirurgische technieken worden vaak gebruikt11. Echter, chirurgische ET kan leiden tot bloedingen die implantatie en embryo ontwikkeling kunnen schaden, als het bloed kan binnenvallen de baarmoeder lumen, waardoor embryo Death10. Transcervicale niet-chirurgische et technieken worden nog steeds toegepast bij mensen, bavianen, runderen, varkens en muizen12,13,14,15,16,17, maar chirurgische ETS worden nog steeds gebruikt in soorten zoals geiten, schapen of andere dieren die extra moeilijkheden veroorzaken10,18,19,20,21, zoals konijnen (twee onafhankelijke cervices) of muizen (kleine grootte). Niettemin, chirurgische overdracht methoden hebben de neiging geleidelijk te zijn vervangen door minder invasieve methoden. Endoscopie werd gebruikt voor de overdracht van embryo's, bijvoorbeeld bij konijnen, varkens en kleine herkauwers18,19,20. Deze minimaal invasieve endoscopie methoden kunnen worden gebruikt voor de overdracht van embryo's in de ampulla via de infundibulum, die essentieel is bij konijnen en heeft aangetoond gunstige effecten in sommige soorten20. Dit is gebaseerd op het belang van de juiste dialoog tussen embryo en moeder tijdens vroege embryonale stadia in de eileider. Zoals hierboven vermeld, het embryo remodeling dat plaatsvindt in konijnen tijdens de embryo migratie door de eileider is van essentieel belang voor het bereiken van embryo's kunnen inplanteren22,23.

Grotere dierlijke modellen, zoals runderen, zijn interessant, omdat de biochemische en pre-implantatie functies zijn vergelijkbaar met die in de menselijke soort24. Nochtans, zijn de grote dieren te duur om in inleidende proeven te gebruiken, en de knaagdieren worden beschouwd als een ideaal model (76% modelorganismen zijn knaagdieren) voor laboratoriumonderzoek25. Niettemin, het konijn model biedt een aantal voordelen ten opzichte van knaagdieren in reproductieve studies, zoals sommige reproductieve biologische processen tentoongesteld door de mens zijn meer vergelijkbaar in konijnen dan die in muizen. De mens en de konijnen presenteren een gelijkaardige chronologische embryonale genoom activering, gastrulation en hemochorial placenta structuur. Bovendien is het gebruiken van konijnen het mogelijk om de nauwkeurige timing van bemesting en zwangerschapsstadia te kennen toe te schrijven aan hun veroorzaakte ovulatie25. Konijn levenscycli zijn kort, de voltooiing van de zwangerschap in 31 dagen en het bereiken van de puberteit op ongeveer 4-5 maanden; het dier is gemakkelijk te hanteren vanwege zijn volgzaam en niet-agressief gedrag, en het onderhoud is zeer zuinig in vergelijking met de kosten van grotere dieren. Bovendien is het van cruciaal belang te vermelden dat konijnen hebben een duplex baarmoeder met twee onafhankelijke baarmoederhals11,25. Dit plaatst het konijn in een preferentiële positie, aangezien de embryo's van de verschillende experimentele groepen in het zelfde dier, maar in een verschillende baarmoeder hoorn kunnen worden overgebracht. Dit stelt ons in staat om zowel experimentele effecten te vergelijken, het verminderen van de moeder factor van de resultaten.

Vandaag, niet-chirurgische ET methoden zijn niet in gebruik in konijn. Sommige studies uitgevoerd in de late jaren ' 90 met behulp van een transcervicale et techniek resulteerde in lage leverings percentages variërend van 5,5% tot 20,0%11,26 versus 50-65% door chirurgische methoden, waaronder de laparoscopie procedure beschreven door Besenfelder en brem18. De lage slaagpercentages van deze niet-chirurgische ET methoden in konijnen samenvallen met het ontbreken van de noodzakelijke embryo remodeling in de eileider, die wordt vermeden in transcervicale ET. Hier beschrijven we een effectieve minimaal invasieve laparoscopische ET procedure met behulp van konijnen als een modelorganisme. Deze techniek biedt een model voor verder voortplantings onderzoek bij grote dieren en mensen.

Omdat de konijnen een bijzonder smal tijdvenster voor embryo implantatie hebben, vereist ET in deze soort een hoge graad van synchronie tussen de ontwikkelingsfase van het embryo in ET en de fysiologische status van de ontvanger27. In sommige gevallen, na een reproductieve behandeling die embryo ontwikkeling (zoals in vitro cultuur) vertraagt of het endometrium ontvankelijkheid (zoals superovulatie behandelingen) verandert, is er geen synchronie tussen het embryo en de moeder baarmoeder. Deze situaties kunnen een negatieve invloed hebben op het resultaat. Om te reageren in deze context, beschrijven we een effectief konijn morula verglazing protocol dat ons in staat stelt te pauzeren, organiseren en hervatten van de experimenten. Dit proces is logistiek wenselijk voor reproductieve studies en geeft ons de capaciteit voor lange termijn opslag van embryo's, waardoor hun vervoer. De laparoscopische procedure en cryopreservatie strategieën zorgen voor een betere planning van studies met minder dieren. Onze methodologie biedt dus hygiënische en economische voordelen en voldoet aan het concept van de 3V (vervanging, reductie en verfijning) van dier onderzoek met als doel de menselijke behandeling van proefdieren te verbeteren. Aldus, met deze methodes, vormen de konijnen een ideaal modelorganisme voor in vivo reproductieve analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in deze studie gebruikte experimentele procedures werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EU-EEG voor dierproeven en werden door het ethische Comité voor experimenten met dieren van de Universitat Politècnica de València beoordeeld en goedgekeurd. Spanje (onderzoek code: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC en JSV heeft een autorisatie certificaat afgegeven door de regering van Valencia om te experimenteren op dieren. XGD is gemachtigd om in situ toezicht te houden op het welzijn en de verzorging van de dieren tijdens het experiment.

1. embryo transfer

  1. Bereiding van vrouwelijke ontvangers
    1. Gebruik alleen seksueel rijpe vrouwen (> 4,5 maanden oud).
    2. Een week voor ET, passen vrouwtjes aan een 16 h licht/8 h donker regime te initiëren folliculaire groei en verbeterde vrouwelijke ontvankelijkheid.
    3. Selecteer de ontvanger vrouwtjes, het observeren van de turgescentie en de kleur van de vulva. Als de vulva is turgescent en roodachtig, het vrouwtje is ontvankelijk.
    4. Induceren pseudopregnancy (ovulatie) door een enkele intramusculaire injectie van 1 µ g van busereline acetaat (synthetisch analoog van gonadotrofine-releasing hormoon), ongeacht het lichaamsgewicht.
      Nota: normaal, 0,8 µ g is een geschikte dosis voor ovulatie inductie in middelgrote konijnen (4-5 kg), zodat 1 µ g over het algemeen de ovulatie waarborgt.
    5. De ovulatie zo veel dagen vooraf te induceren als de leeftijd van de embryo's worden overgedragen (bijvoorbeeld 70-72 h voor verse morula ET).
  2. Anesthesie en analgesie
    1. Weeg het konijn en laad de volgende verdovingsmiddelen en pijnstillers.
      1. In een spuit van 1 mL met een 30G naald: belasting xylazine (5mg/kg) en buprenorfine hydrochloride (0,03 mg/kg). In een andere 1 mL spuit met een 23G pericranial naald, belasting ketamine hydrochloride (35 mg/kg).
    2. Houd het konijn en injecteren van de xylazine-buprenorfine mengsel intramusculair.
    3. Steek de pericranial naald met ketamine in de marginale oor ader, langzaam de invoering van alle injectiespuit inhoud intraveneus.
    4. Bevestig de naald en laat het geplaatst in de resterende stappen om meer anesthesie te beheren indien nodig.
    5. Laat het konijn in de kooi (schoon en zonder andere dieren) op een warme podium.
    6. Eenmaal bewusteloos, van toepassing Eye zalf om droogte van het oog te voorkomen en te controleren op de afwezigheid van de palpebrale freflex.
      Opmerking: dit protocol biedt een chirurgische anesthesie vliegtuig voor een minimum van 30 minuten. Als een langere tijd nodig is, injecteren extra doseringen met de helft van het bedrag van ketamine hydrochloride beschreven in 1.2.1 na 30 min.
    7. Controleer de diepte van de anesthesie door het controleren van de pedaal reflex en ademhaling beweging. De veranderingen in het ademhalingspatroon aan een onregelmatig en sneller tarief wijzen op verlies van het juiste vlak van anesthesie.
    8. Controleer de kleur van de slijmvliezen (ogen, lippen, enz.), ademhalingstarief (30-60 ademhalingen per minuut), harttarief (120-325 slagen per minuut) en rectale temperatuur (38-39.6 °c).
    9. Acht uur voor de overdracht, weigeren voedsel van dieren om de grotere darm grootte en de activiteit te voorkomen totdat het ET proces is voltooid. Laat vrije toegang tot water.
  3. Embryo-voorbereiding
    1. Verwarm de media van de embryo manipulatie aan 25 °C: basis middel (BM), bestaand uit Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) aangevuld met 0,2% (w/v) van het serum albumine van het rund.
    2. Werken onder een stereomicroscoop, spoel verse of ontdooide (stap 2) embryo's met BM.
    3. Bevestig met steriele handschoenen een op de juiste wijze geconfigureerde 17G epidurale katheter met een 1 mL spuit.
    4. Aspireren 1 cm van BM in de katheter, gevolgd door een kleine lucht zeepbel.
    5. Aspireren 5-7embryos in een volume van 10 µ L van BM, gevolgd door een andere kleine lucht zeepbel.
    6. Finish het laden van de katheter door opzuigen 1 cm van BM.
  4. Embryo transfer
    1. Overweeg het gebruik van steriele handschoenen, toga en masker om een aseptische omgeving te garanderen.
    2. Steriliseren chirurgische instrumenten, het reinigen van de oppervlakken waar een operatie zal worden uitgevoerd, en veeg ze met 70% ethanol.
    3. Voer anesthesie als eerder gedetailleerde (stap 1,2), controle op het verlies van reflexen.
    4. Scheer de vacht van de buik met een elektrisch scheermes.
    5. Bereid de buik aseptisch.
      1. Reinig de chirurgische ruimte en verwijder eventuele resterende haar. Was het chirurgische gebied met een chloorhexidinegluconaat zeep. Sanitize het gebied met chloorhexidine oplossing en ethanol 96 º (3 keer).
    6. Plaats het dier op een warme chirurgische tafel, in de positie van Trendelenburg (hoofd naar beneden om 45 °) om ervoor te zorgen dat de maag en darmen zijn craniale gelegen. Overweeg de evacuatie van de blaas als het turgescent is. Als een ingewanden beschadigd zijn in het proces, kan het dier sterven. Het is daarom belangrijk dat ze goed zijn gelegen (Figuur 1).
    7. Bedek het gebied met behulp van een steriele handdoek, met een gat (fenestratie) bloot het geschoren gebied, om de chirurgische site te scheiden van alle mogelijke vervuilende gebieden.
    8. Plaats een Endoscopische trocar 5 cm in de buikholte, 2 cm caudale aan de xiphoid proces, en insufflate door het de buikholte met een druk-regulerende mechanische insufflator.
      Opmerking: de intra-abdominale druk moet 8-12 mmHg met CO2 (Figuur 1a).
    9. Plaats de endoscoop camera via de Endoscopische trocar (Figuur 1b).
      Opmerking: Identificeer het voortplantingskanaal, het bepalen van de status en de positie van de infundibulum en ampulla vóór ET om de volgende stappen te vergemakkelijken.
    10. Plaats de 17-G epidurale naald in de liesstreek tussen 2-3 cm van de infundibulum (Figuur 1b).
    11. Identificeer de ingang van de infundibulum (Figuur 2a, 2b).
    12. Plaats de geladen katheter (stap 1,3) door de epidurale naald in de buik (figuur 1c).
    13. Zoek de eileider en steek 1-2 cm van de epidurale katheter door de infundibulum in de ampulla (Figuur 2a-2c). Niet ver vooruit in de eileider om schade en bloeding te voorkomen.
    14. Laat de embryo's in de eileider door voorzichtig te drukken op de zuiger van de spuit gekoppeld aan de katheter (figuur 2D-2F). Beide luchtbellen moeten de katheter verlaten.
    15. Verwijder de katheter net nadat de embryo's zijn vrijgegeven.
    16. Spoel de katheter, opzuigen en loslaten van het manipuleren van het medium om de afwezigheid van de embryo's te controleren en hun succesvolle overdracht te bevestigen.
    17. Herhaal de stappen 1.4.11 naar 1.4.16 in de andere kant van de baarmoeder, indien gewenst.
    18. Verwijder de epidurale naald en endoscoop camera.
    19. Release CO2 via de Endoscopische trocar. Als overtollig gas blijft in de buik van het dier, zal het pijn en ongemak.
    20. Verwijder de Endoscopische trocar uit de buikholte. Verwijder de chirurgische handdoek.
    21. Stop de anesthesie.
    22. Reinig de incisie gemaakt door de trocar met chloorhexidine oplossing. Sluit de incisie gemaakt door de trocar met een micron aluminium en een plastic dressing.
  5. Postoperatieve zorg
    1. Behandel de dieren met antibiotica: 10 mg/kg enrofloxacin, onderhuids, elke 24-h voor 5 dagen.
    2. Toediening van pijnstillers: buprenorfine hydrochloride (0,03 mg/kg), intramusculair, elk 12 uur voor 3 dagen; Meloxicam (0,2 mg/kg), onderhuids, elke 24-h voor 3 dagen.
    3. Monitor de dieren gedurende ten minste 30 min na de operatie (afhankelijk van het dier en de dosis van de anesthesie gebruikt) ervoor te zorgen dat ze terug te vorderen van hun fysiologische omstandigheden.
    4. Identificeer de ontvanger (bijv., oor tatoeage) en huisdieren individueel in een schone kooi met de juiste omgevingsconditie.

Figure 1
Figuur 1: laparoscopische embryotransfer bijgestaan door laparoscopie (External view). A) inbrengen van de Endoscopische trocar (één poort). B) inbrengen van de Endoscopische camera en de epidurale naald (zwarte pijl). C) het inbrengen van de embryo-overbrengings katheter (witte pijl) door de epidurale naald. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: laparoscopische embryotransfer bijgestaan door laparoscopie (Internal View). A: Inbrengen van de katheter door de epidurale naald in de buik zone. Asterisk geeft de infundibulum. B, C, D: De katheter geladen met de embryo's wordt ingevoegd in ampulla gebied over de infundibulum. E, F: Release van de embryo's, bevestigd door de visualisatie van een gezwollen eileider. Dit cijfer is aangepast van Marco-Jiménez et al. 38. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. embryo-verglazing en-opwarming

  1. Voer alle manipulaties bij kamertemperatuur (rond 22 °C) uit om de toxiciteit van de verglazing-oplossing bij warmere temperaturen te verminderen.
    Opmerking: embryo's kunnen worden verplaatst met behulp van 0.1-2 µ L automatische pipet in dit protocol, maar ook andere soortgelijke apparaten te verplaatsen van de embryo's slepen het minimum volume kan geschikt zijn.
  2. Vitrify de embryo's in een procedure in twee stappen aanvullen:
    1. Plaats de embryo's gedurende 2 minuten in equilibrating oplossing bestaande uit 10% (v/v) ethyleenglycol en 10% (v/v) dimethyl sulfoxide opgelost in BM.
    2. Verplaats de embryo's (vanaf stap 2.2.1) gedurende 1 minuut in verglazing oplossing bestaande uit 20% (v/v) ethyleenglycol en 20% (v/v) dimethyl sulfoxide opgelost in BM.
  3. Laad de embryo's in een 125 µ L plastic ministraw (die een gesloten uiteinde met een katoenen stekker en een open Extreme bevat). Het proces is schematized in Figuur 3.
    1. Koppel het gesloten uiteinde van 0,125 l ministraw met de juiste microdispenser (bijv. Captroll III®).
    2. Aspireren BM tot 1/3 van het stro lengte, na door een kleine lucht zeepbel.
    3. Aspireren de embryo's in een volume van 40 µ L van verglazing oplossing, gevolgd door een andere kleine lucht zeepbel.
    4. Aspireren BM tot de eerste vloeibare fractie (stap 2.3.2) bereikt het katoen.
    5. Sluit het open uiteinde met een stro stekker.
  4. Voer stap 2.2.2, terwijl stap 2,3 wordt gedaan om ervoor te zorgen dat niet meer dan een minuut verstrijkt, die giftig zou zijn voor embryo's.
  5. Dompel de ministraw direct in vloeibare stikstof om verglazing te bereiken.
  6. Bewaar de ministraw in een dewar's voor stikstof voor de gewenste tijd.
  7. De embryo's in één stap ontdooien.
    1. Plaats de ministraw horizontaal 10 cm van vloeibare stikstof damp voor 20-30 s.
    2. Wanneer de kristallisatie proces begint in de ministraw, dompel de ministraw in een waterbad bij 25 ° c voor 10-15 s.
    3. Verwijder de ministraw stekker en snijd de katoenen stekker.
    4. Met een gekoppelde microdispenser, verdrijven alle ministraw inhoud in een plaat met 0,33 M sacharoseoplossing bij 25 ° c in BM gedurende 5 minuten.
      Opmerking: deze stap moet snel gedaan worden om de embryo-blootstelling aan de verglazing oplossing te verminderen.
    5. Verplaats de embryo's naar een nieuwe plaat met BM-oplossing voor nog eens 5 minuten.
    6. Overweeg alleen niet-beschadigde embryo's (met intacte mucine jas en zona pellucida) om verder te gaan met de ET.
      Opmerking: Houd er rekening mee dat in ontdooide embryo's, asynchrone overdrachten (bijv. 60-62 h in morula overdrachten) de resultaten kunnen verbeteren door een hersynchronisatie tussen het embryo en het moeder endometrium mogelijk te maken.

Figure 3
Figuur 3: Schematization van correct geladen stro. A) BM verwijst naar de embryo-manipulatie media in dienst tijdens verglazing. Embryo's moeten in verglazing oplossing worden geladen. B) macroscopische verschijning van het geladen stro met een vergrote detail van de embryo positie. Deze grote-volume-apparaat stelt ons in staat om vitrify groot aantal embryo's, in tegenstelling tot minimale volume-apparaten. Voorts is de behandeling van dit apparaat gemakkelijker vergeleken met minimum volume apparaten, terwijl de resultaten in konijnen41gelijkaardig zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Minimaal invasieve laparoscopische overdracht van verse of verglaasd embryo's plaatst het konijn onder de beste modeldieren voor reproductieve studies. Tabel 1 toont de resultaten van Fresh et in verschillende ontwikkelingsstadia (Figuur 4) van overgebrachte embryo's. De overlevingskans bij de geboorte (percentage van de embryo's die resulteren in een pup) bleek de werkzaamheid van de laparoscopische techniek beschreven in dit document. De hogere waarden werden bereikt toen de ET werd uitgevoerd met embryo's in de morula fase, hetzij vroege of compacte morulae. Op basis van deze resultaten hebben we een tweede experiment uitgevoerd om het overlevingspercentage na verglazing van deze embryo's te demonstreren. Zo, in tabel 2 tonen we de resultaten verkregen na de overdracht van verglaasd konijn morulae hersteld op hetzelfde moment, differentiëren tussen die embryo's die had bereikt een goede mate van verdichting of niet. Het overlevingspercentage bij de geboorte was verschillend tussen de verschillende embryo stadia, die hoger waren in verdichte morulae. Daarom is laparoscopische embryotransfer een betrouwbare techniek om verse en verglaasd embryo's bij konijnen over te brengen

Figure 4
Figuur 4: konijnen embryo's. A) prokern. B) acht cellen. C) vroege morula. D) compacte morula. E) blastocyst. Asterisk geeft de twee prokernen. Zwarte pijlen geven de zona pellucida. De witte pijlen wijzen op de mucine laag, die normaal tussen embryo's varieert. ICM: Inner Cell Mass. TE: Trophectoderm. Schaal Bar: 50 µm. Please Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Ontwikkelingsfase1 Embryo 's Geadresseerden Plaats van overdracht Zwangerschapspercentage (%) Implantatie rate (%) Overlevingskans bij de geboorte (%)2
Pronucleaire 78 7 Oviduct 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
8 cellen 81 7 Oviduct 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)een
Vroege morula 81 7 Oviduct 7 (100) 80 (98,8)een 60 (74,1)een
Compacte morula 80 7 Oviduct 7 (100) 80 (100)een 58 (72,5)een
Blastocyst 80 7 Baarmoeder 7 (100) 73 (91,3)een 38 (47,5)b

Tabel 1. Efficiëntie van verse konijn embryotransfer (in vivo afgeleid) door laparoscopie. 1verschillende embryo's werden teruggewonnen 18-20u (prokern), 36-38H (8 cellen), 60-62 h (vroege morula), 70-72 h (compacte morula) en 80-82 h (blastocyst) na het koppelen. Compact (> 32 cellen) en niet-compacte morulae (≈ 32 cellen) kan worden gesticht op 70-72 h, maar alleen compacte morulae werden overgedragen. 2 Overlevingskans bij de geboorte van de ontvanger zwanger is. a, b De waarden met verschillende Super scripts zijn statistisch verschillend (P < 0.001).

Ontwikkelingsfase Overgedragen embryo's Geadresseerden Zwangerschapspercentage (%) Overlevingspercentage bij de geboorte (%)1
Niet-verdichte 135 10 9 (90) 62 (45,9)b
Gecomprimeerde 150 10 10 (100,0) 98 (65,3)een
Totale 285 20 19 (95) 160 (56,1)

Tabel 2. Levensvatbaarheid van niet-verdichte VS compact verglaasd morula. a, bwaarden met verschillende Super scripts zijn statistisch verschillend (P < 0.001). 1 Overlevingskans bij de geboorte van de ontvanger zwanger is. De embryo's werden teruggewonnen tezelfdertijd (70-72 h) en werden onderscheiden in compacte (> 32 cellen) en niet-compacte morulae (≈ 32 cellen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sinds het eerste gedocumenteerde levende geboorte geval van overgebrachte embryo's9, zijn deze techniek en de konijn soorten essentieel in reproductieve studies geworden. Daarnaast vereisen embryo-onderzoek met manipulatie, productie, cryopreservatie, enz. , als laatste stap de evaluatie van de embryo capaciteit voor het opwekken van gezonde nakomelingen op volle termijn. Daarom is embryotransfer techniek onmisbaar13,28. In de loop der jaren zijn de chirurgische methoden die aanvankelijk werden gebruikt om embryo's in de moeder baarmoeder over te brengen, geleidelijk vervangen door minder invasieve methoden in de overgrote meerderheid van de soorten13,14,15, 21 , 27 , 29 , 30. echter, bij konijnen, intraoviductal et in de vroege embryo stadia van ontwikkeling en in vitro geproduceerde embryo's onvermijdelijk is om een soortgelijk resultaat te garanderen aan de natuurlijke omstandigheden. Bij konijnen, intraoviductal mucine jas is een cruciale factor waardoor embryo implantatie, zoals het plaatsvindt na de verbouwing van de embryonale coatings tijdens blastocyst expansie in de baarmoeder hoorns. Nochtans, is de depositie van de laag mucine beperkt tot eileider 3 dagen na ovulatie, en de moleculaire mechanismen van de depositie van het laag materiaal zijn grotendeels onbekend31. Om deze redenen is bekend dat in vitro-ontwikkelde blastocysten niet overleefden toen overgebracht naar de baarmoeder32,33,34, en embryo's met een beschadigde mucine vacht hebben een lagere overlevingskans 35. Evenzo, groepen die een transcervicale embryotransfer gemeld bij konijnen resulteerde in een zeer lage Live-geboren tarieven11,26. Hier presenteren we een minimaal invasieve techniek, aangepast van Besenfelder en brem18, voor de overdracht van embryo's met een succesvolle geboortecijfers. Volgens de resultaten in tabel 1was de morula fase in konijnen embryo's de beste embryonale fase om bij de geboorte een hoog overlevingspercentage te bereiken. Een mogelijke verklaring is de grotere gevoeligheid voor manipulatie van de vroegste stadia. Interessant is dat het succespercentage stijgt naarmate de embryonale fase vordert, mogelijk als gevolg van de grotere blootstelling van het embryo om afscheidingen oviductal voorafgaand aan het herstel. Maar wanneer de embryo's het blastocyst stadium bereiken en zijn plaats-concordantie overgebracht naar de baarmoeder, dalen de waarden drastisch. Afgezien van wat er is gezegd, kan een mogelijke verklaring zijn dat de embryo's die in de eileider worden overgebracht, de mogelijke schade die tijdens de embryo manipulatie in de mucine laag is ontstaan, kunnen herstellen. Daarom, blastocysten overgebracht in de baarmoeder zou worden beroofd van dit mechanisme, dat zou kunnen compromitteren hun implantatie capaciteit.

De techniek wordt uitgevoerd met behulp van een enkele poort instrument (5 mm endoscoop trocar), met lichte, korte manipulatie. Daarom, the5-mm endoscoop trocar incisie vereist geen sluiting. Laparoscopische techniek voordelen zijn verminderde postoperatieve pijn, sneller terug te keren naar de normale activiteit, en minder postoperatieve complicaties. Bovendien, Endoscopische procedures induceren minder abdominale adhesie en laat een betere immuunrespons door de ontvanger in vergelijking met open chirurgie21,36,37. Het accumuleren van bewijsmateriaal van ons laboratorium heeft de doeltreffendheid van deze ET procedure in het konijn model aangetoond. Zo werden in de laatste vijf jaar een totaal van 3.909 embryo's (1.335 verse en 2.574 verglaasd embryo's) overgedragen via de procedure beschreven in het huidige manuscript. Als gevolg van deze techniek, de nakomelingen van verse en verglaasd Transfer embryo's waren 62,9% en 42,5%, respectievelijk38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. veel studies zijn allemaal gebaseerd op deze techniek: Marco-Jiménez et al. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et al. 42, Viudes-de-Castro et al. 43, Sikkens-de-JUANO et al. 44 , 45 , 47, Lavara et al. 46.

Praktische aanbevelingen voor de uitvoering van deze techniek worden hieronder beschreven. In embryo-cultuur experimenten is het ook raadzaam om een nieuwe katheter te gebruiken voor embryotransfer in plaats van de embryo's die gebruikt worden om de embryos tussen de cultuurmedia en manipulatie media te verplaatsen. Dit voorkomt de overdracht van minerale olie en zorgt voor een optimale stroom. Tijdens ET is het belangrijk om behandeling van het voortplantingskanaal te minimaliseren, aangezien de bovenmatige manipulatie van eileider in adhesies kon resulteren. Als de eileider is gedraaid, in dienst van de epidurale spuit om te proberen om het goed te positioneren, niet de katheter, want het bevat de embryo's en de mechanische manipulatie kan hun verlies veroorzaken. Zodra de katheter loopt door de eileider, het glijdt gemakkelijk. Als dit niet het geval is, kan de katheter zijn afgeweken. Eenmaal in de eileider, als de media niet stromen, beweeg de katheter iets uit en probeer het opnieuw in te voegen. Als het nog steeds niet stroomt, de katheter is verstopt. Verwijder het uit de eileider en laat de inhoud in een schotel met een schoon medium. Dan, herlaad de embryo's in een andere katheter en probeer opnieuw in te voegen in de eileider. Levering duurt meestal plaatsen 28-30 dagen na morula Transfer.

Daarnaast is er bewijs waaruit blijkt dat het embryo ontwikkelingsfase kan worden geavanceerder dan de baarmoeder milieu in pseudopregnant vrouwtjes, maar niet het tegenovergestelde. Specifiek, embryo's hebben de mogelijkheid om te wachten op de gunstige baarmoeder omgeving, maar de baarmoeder omgeving kan niet wachten op de embryo's op het juiste podium voor de inplanting10. Met betrekking tot verglaasd embryo's, na een korte/lange termijn opslag is het mogelijk om de ontwikkelingsfase van het embryo te synchroniseren met de overeenkomstige gunstige baarmoeder omgeving. Als de embryo-donor ook de embryo-ontvanger is, kunnen de schadelijke effecten van de superovulatie op het endometrium worden omzeild met behulp van de verglazing techniek en de overdracht van de embryo's in een daaropvolgende cyclus48. In konijnen, verglaasd embryo's overgedragen in eileiders van ontvangers geïnduceerde tot ovuleren 60-62 h vooraf (asynchronie) is een zeer efficiënte techniek44,49. In verband met deze, is gesuggereerd dat de oviductal embryo overgang tijdens 10-12 h kan de gunstige effecten in het herstel van de cel fysiologie en vervanging van dode cellen te verklaren, en waarschijnlijk reparatie van de schade geïnduceerde in mucine jas tijdens het embryo Manipulatie. Bovendien, verglaasd de embryo's een vertraging in ontwikkeling, aangezien zij metabolisch tijdens de opslag zijn opgeschort. Daarom, de overdracht van gecryopreserveerde embryo's in asynchrone ontvangers kan het embryo zijn metabole activiteit opnieuw te activeren en dus de embryo fase van de ontwikkeling is gesynchroniseerd met de baarmoeder omgeving. In plaats daarvan, als gecryopreserveerde embryo's worden overgedragen in synchrone receptoren, de cross-talk tussen de moeder en het embryo belemmert het ontstaan van een succesvolle zwangerschap. In konijn, de hoogste overlevingskans is verkregen na intraoviductal overdracht van gecryopreserveerde morulae49. Onze gegevens zijn in overeenstemming met dit rapport, hoewel het morula stadium verschillende overlevingspercentages na cryopreservatie vertoont, afhankelijk van de mate van verdichting op 70-72 h (tabel 2). Hier, verdichte morulae bleek hogere overlevingskansen bij de geboorte in vergelijking met niet-verdichte morulae, die in overeenstemming was met eerdere rapporten waaruit blijkt dat elk stadium van de ontwikkeling had zijn eigen mechanisme ten opzichte van de doordringen van cryoprotectants en de mate van uitdroging tijdens de toevoeging van de cryopreservatie oplossing50. Ten grondslag liggen aan deze technieken, hebben we aangetoond dat een combinatie van verglazing en intraoviductal embryotransfer een succesvolle strategie is om de konijn populaties na 15 jaar opslag in vloeibare stikstof terug te brengen, zonder nadelige gevolgen voor hun na de dooi overleving en levende geboorte51.

De volgende gegevens moeten in aanmerking worden genomen om deze techniek succesvol uit te voeren. Het is belangrijk in gedachten te houden dat de toenemende dichtheid van de opeenvolgende mediums gebruikt voor verglazing (DPBS, evenwicht oplossing, verglazing oplossing) kan leiden tot embryo contractie als gevolg van progressieve embryo uitdroging. Nochtans, wordt zijn normale verschijning teruggekregen wanneer het embryo met het middel wordt geëquilibreerd. Bovendien, wanneer het embryo wordt verplaatst tussen de toenemende dichtheid media, heeft het de neiging om te verhuizen naar het oppervlak van de media als gevolg van dichtheid bewegingen. Om embryo verlies te vermijden en de tijd van verglazing te verzekeren, is het aan te bevelen om de verglazing in kleine dalingen van de media uit te voeren die het embryo op zijn plaats zullen houden.

Samenvattend, hier beschrijven we zowel een ET techniek en een embryo verglazing methode die toekomstige studies die konijnen gebruiken als model te vergemakkelijken. Op basis van de nauwe verwantschaps afstand tussen konijnen en mensen kan het gebruik van dit model de resultaten gemakkelijk overdraagbaar maken aan de menselijke klinische geneeskunde. Bovendien, onze methode biedt een aantal hygiënische en economische voordelen, in overeenstemming met het concept van de 3 RS van het welzijn van dieren (vervanging, vermindering en verfijning), met behoud van het doel van de verbetering van de menselijke behandeling van proefdieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door fondsen van het ministerie van economie en concurrentievermogen van Spanje (AGL2017-85162-c2-1-R) en Generalitat Valencia Research Programme (PrometeoII 2014/036). Engelse tekstversie herzien door N. Macowan English language service

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).

Tags

Ontwikkelingsbiologie uitgifte 147 embryo embryotransfer laparoscopie verglazing cryopreservatie Rabbit
Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, … More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter