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Developmental Biology

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

Les techniques de procréation assistée (ARTs) sont en évaluation continue pour améliorer les résultats et réduire les risques associés. Ce manuscrit décrit une procédure de transfert d’embryons mini-invasive avec un protocole de cryoconservation efficace qui permet l’utilisation de lapins comme modèle animal idéal de reproduction humaine.

Abstract

Les techniques de reproduction assistée (art), telles que la culture d’embryons in vitro ou la cryopréservation des embryons, affectent les schémas de développement naturel avec des conséquences périnatales et postnatales. Pour garantir l’innocuité des applications ART, des études sur des modèles animaux sont nécessaires. En outre, dans un dernier temps, les études sur le développement embryonnaire exigent une évaluation de leur capacité à développer des descendants sains à terme. Ici, le transfert d’embryon vers l’utérus est indispensable pour réaliser toute expérience liée aux ARTs.

Le lapin a été utilisé comme organisme modèle pour étudier la reproduction des mammifères depuis plus d’un siècle. En plus de sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et sa petite taille et son faible coût d’entretien, il a des caractéristiques de reproduction importantes telles que l’ovulation induite, une chronologie du développement embryonnaire précoce semblable à l’homme et une courte gestation qui nous permettent d’étudier facilement les conséquences de l’application ART. De plus, les ARTs (comme l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, la culture d’embryons ou la cryopréservation) sont appliqués avec une efficacité appropriée chez cette espèce.

En utilisant la technique de transfert d’embryon laparoscopique et le protocole de cryoconservation présenté dans cet article, nous décrivons 1) Comment transférer des embryons par une technique facile, minimalement invasive et 2) un protocole efficace pour le stockage à long terme du lapin d’embryons pour fournir des capacités logistiques flexibles et la capacité de transporter l’échantillon. Les résultats obtenus après le transfert d’embryons de lapins à différents stades de développement indiquent que la morula est le stade idéal pour la récupération et le transfert d’embryons de lapins. Ainsi, un transfert d’embryon oviducte est exigé, justifiant la procédure chirurgicale. En outre, les morulas de lapin sont vitrifiés avec succès et transférés par voie laparoscopique, prouvant l’efficacité des techniques décrites.

Introduction

Dans le but de contourner l’infertilité humaine ou d’améliorer la diffusion du bétail de haute valeur génétique et de préserver les ressources génétiques animales, un ensemble de techniques appelées collectivement les technologies de reproduction assistée, telles que la superovulation, dans la fécondation vitro, la culture embryonnaire ou la cryoconservation ont été développées1,2. Actuellement, des traitements hormonaux sont donnés pour stimuler les ovaires et produire un grand nombre de follicules ovariens antraux1. Les ovocytes recueillis à partir de ces follicules peuvent être mûris, fécondés et développés in vitro jusqu’à ce qu’ils soient cryopréservés ou transférés aux mères porteuses3. Cependant, pendant ces traitements, les gamètes et les zygotes sont exposés à une série de processus non physiologiques qui pourraient nécessiter une adaptation embryonnaire pour survivre dans ces conditions4,5. Cette adaptation est possible en raison de la plasticité embryonnaire précoce, qui permet des changements d’embryon dans l’expression génique et la programmation du développement6. Cependant, ces modifications peuvent influencer les stades ultérieurs du développement embryonnaire jusqu’à l’âge adulte, et il est maintenant largement admis que les méthodes, le timing, la procédure de cryoconservation ou les conditions de culture montrent des résultats différents sur le destin embryonnaire7 , 8. par conséquent, pour élucider les effets induits spécifiques des ARTs, l’utilisation de modèles animaux bien caractérisés est inévitable.

La première naissance vivante documentée résultant du transfert d’embryons de mammifères a eu lieu en 18909. Aujourd’hui, le transfert d’embryons (ET) à une femelle porteuse est une étape cruciale dans l’étude des effets induits par l’ART pendant la préimplantation sur les stades ultérieurs de développement de l’embryon10. Les techniques de l’ET dépendent de la taille et de la structure anatomique de chaque animal. Dans le cas des modèles animaux de grande taille, il a été possible d’effectuer des ET par des techniques de l’ET non chirurgicales transcervicales, mais dans les espèces de plus petite taille, le cathétérisme du col de l’utérus est plus complexe et les techniques chirurgicales sont fréquemment utilisées11. Cependant, l’ET chirurgicale peut provoquer une hémorragie qui pourrait nuire au développement de l’implantation et de l’embryon, car le sang peut envahir la lumière utérine, causant la mort de l’embryon10. Les techniques transcervicales et non chirurgicales sont toujours appliquées chez les humains, les babouins, les bovins, les porcs et les souris12,13,14,15,16,17, mais chirurgicaux Les Ets sont toujours utilisés dans des espèces comme les chèvres, les moutons ou d’autres animaux qui présentent des difficultés supplémentaires10,18,19,20,21, comme les lapins (deux des cervices indépendants) ou des souris (de petite taille). Néanmoins, les méthodes de transfert chirurgical tendent à être graduellement remplacées par des méthodes moins invasives. L’endoscopie a été utilisée pour transférer des embryons, par exemple, chez les lapins, les porcs et les petits ruminants18,19,20. Ces méthodes d’endoscopie minimalement invasives peuvent être utilisées pour transférer des embryons dans l’ampoule par l’intermédiaire de l’infundibulum, qui est essentiel chez les lapins et a démontré des effets bénéfiques chez certaines espèces20. Ceci est basé sur l’importance du dialogue correct entre l’embryon et la mère pendant les stades précoces de l’embryon dans l’oviducte. Comme mentionné ci-dessus, le remodelage de l’embryon qui a lieu chez les lapins pendant la migration de l’embryon à travers l’oviducte est essentiel pour obtenir des embryons capables d’implanter22,23.

Les modèles animaux de grande taille, comme les bovins, sont intéressants parce que les caractéristiques biochimiques et préimplantatoires sont similaires à celles de l’espèce humaine24. Cependant, les grands animaux sont trop coûteux à utiliser dans les essais préliminaires, et les rongeurs sont considérés comme un modèle idéal (76% des organismes modèles sont des rongeurs) pour la recherche en laboratoire25. Néanmoins, le modèle de lapin offre quelques avantages par rapport aux rongeurs dans les études de reproduction, car certains processus biologiques de reproduction exposés par les humains sont plus semblables chez les lapins que chez les souris. Les humains et les lapins présentent une activation du génome embryonnaire similaire, la gastrulation et la structure du placenta hémochorial. En outre, l’utilisation de lapins, il est possible de connaître le moment exact de la fécondation et les stades de la grossesse en raison de leur ovulation induite25. Les cycles de vie de lapin sont courts, achevant la gestation en 31 jours et atteignant la puberté à environ 4-5 mois; l’animal est facile à manipuler en raison de son comportement docile et non-agressif, et son entretien est très économique par rapport aux frais des animaux plus grands. En outre, il est crucial de mentionner que les lapins ont un utérus duplex avec deux Cervixes indépendants11,25. Cela place le lapin dans une position préférentielle, car les embryons des différents groupes expérimentaux peuvent être transférés dans le même animal, mais dans une corne utérine différente. Cela nous permet de comparer les deux effets expérimentaux, réduisant ainsi le facteur maternel des résultats.

Aujourd’hui, les méthodes ET non chirurgicales ne sont pas utilisées chez le lapin. Certaines études réalisées à la fin des années 90 à l’aide d’une technique transcervicale et ont entraîné des taux de livraison faibles variant de 5,5% à 20,0%11,26 versus 50-65% par des méthodes chirurgicales, dont la procédure de laparoscopie décrite par Besenfelder et Brem18. Les faibles taux de réussite de ces méthodes non chirurgicales chez les lapins coïncident avec l’absence de remodelage embryonnaire nécessaire dans l’oviducte, ce qui est évité dans l’HE transcervicale. Ici, nous décrivons une procédure de l’HE laparoscopique efficace ET peu invasive utilisant des lapins comme organisme modèle. Cette technique fournit un modèle pour de nouvelles recherches sur la reproduction chez les grands animaux et les humains.

Étant donné que les lapins ont un créneau horaire particulièrement étroit pour l’implantation d’embryons, l’ET chez cette espèce exige un degré élevé de synchronie entre le stade de développement de l’embryon à et et l’état physiologique du receveur27. Dans certains cas, après un traitement reproductif qui ralentit le développement de l’embryon (comme la culture in vitro ) ou modifie la réceptivité de l’endomètre (comme les traitements de la superovulation), il n’y a pas de synchronie entre l’embryon et l’utérus maternel. Ces situations peuvent affecter négativement les résultats. Pour répondre dans ces contextes, nous décrivons un protocole efficace de vitrification de la morula de lapin qui nous permet de suspendre, d’organiser et de reprendre les expériences. Ce processus est logistiquement souhaitable pour les études de reproduction et nous donne la capacité de stockage à long terme des embryons, permettant leur transport. La procédure laparoscopique et les stratégies de cryoconservation permettent une meilleure planification des études avec moins d’animaux. Ainsi, notre méthodologie offre des avantages hygiéniques et économiques et est conforme au concept de 3Rs (remplacement, réduction et raffinement) de la recherche animale avec l’objectif déclaré d’améliorer le traitement humain des animaux expérimentaux. Ainsi, avec ces méthodes, les lapins constituent un organisme modèle idéal pour les essais de reproduction in vivo .

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales utilisées dans cette étude ont été effectuées conformément à la directive 2010/63/UE CEE pour les expérimentations animales et examinées et approuvées par le Comité d’éthique pour l’expérimentation des animaux de l’Universitat Politècnica de València, Espagne (code de recherche: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC et JSV détiennent un certificat d’autorisation délivré par l’administration gouvernementale valencienne pour expérimenter sur les animaux. XGD est autorisé à superviser in situ le bien-être et le soin des animaux pendant l’expérimentation.

1. transfert d’embryons

  1. Préparation des femelles bénéficiaires
    1. N’utiliser que des femelles sexuellement matures (> 4,5 mois).
    2. Une semaine avant ET, adaptez les femelles à un régime de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pour initier la croissance folliculaire et améliorer la réceptivité féminine.
    3. Sélectionnez les femelles bénéficiaires, en observant la turgidité et la couleur de la vulve. Si la vulve est turgide et rougeâtre, la femelle est réceptive.
    4. Induire Pseudo (ovulation) par une seule injection intramusculaire de 1 μg d’acétate de buserelin (analogue synthétique de l’hormone libérant la gonadotrophine), quel que soit le poids corporel.
      NOTE: normalement, 0,8 μg est une dose appropriée pour l’induction de l’ovulation chez les lapins de taille moyenne (4-5 kg), donc 1 μg garantit généralement l’ovulation.
    5. Induire l’ovulation autant de jours à l’avance que l’âge des embryons à transférer (par exemple, 70-72 h avant la morula fraîche ET).
  2. Anesthésie et analgésie
    1. Peser le lapin et charger les anesthésiques et les analgésiques suivants.
      1. Dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30G: charger la xylazine (5mg/kg) et le chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg). Dans une autre seringue de 1 mL avec une aiguille périraniale de 23G, charger le chlorhydrate de kétamine (35 mg/kg).
    2. Tenez le lapin et injectez le mélange de xylazine-buprénorphine par voie intramusculaire.
    3. Insérez l’aiguille périrânienne avec de la kétamine dans la veine auriculaire marginale, en introduisant lentement tout le contenu de la seringue par voie intraveineuse.
    4. Fixez l’aiguille et laissez-la insérée tout au long des étapes restantes pour administrer plus d’anesthésie si nécessaire.
    5. Laisser le lapin dans la cage (propre et sans autres animaux) sur une scène chaude.
    6. Une fois inconscient, appliquez la pommade oculaire pour éviter la sécheresse de l’œil et vérifier l’absence du palpébral Freflex.
      NOTE: ce protocole fournit un plan d’anesthésie chirurgicale pour un minimum de 30 min. Si un temps plus long est nécessaire, injecter des doses supplémentaires avec la moitié de la quantité de chlorhydrate de kétamine décrite dans 1.2.1 après 30 min.
    7. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de pédale et le mouvement respiratoire. Les changements dans le modèle respiratoire à un taux irrégulier et plus rapide indiquent la perte du plan approprié de l’anesthésie.
    8. Surveillez la couleur des muqueuses (yeux, lèvres, etc.), la fréquence respiratoire (30-60 respirations par minute), la fréquence cardiaque (120-325 battements par minute) et la température rectale (38-39,6 ° c).
    9. Huit heures avant le transfert, retenir la nourriture des animaux pour éviter la plus grande taille et l’activité de l’intestin jusqu’à ce que le processus ET est terminé. Laissez libre accès à l’eau.
  3. Préparation d’embryons
    1. Réchauffer le support de manipulation d’embryons à 25 ° c: milieu de base (BM), composé de la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) complétée par 0,2% (p/v) d’albumine sérique bovine.
    2. Travailler sous un stéréomicroscope, rincer les embryons frais ou décongelés (étape 2) avec BM.
    3. En utilisant des gants stériles, fixez un cathéter épidural 17G correctement configuré à une seringue de 1 mL.
    4. Aspirer 1 cm de BM dans le cathéter, suivi d’une petite bulle d’air.
    5. Aspirer 5-7embryons dans un volume de 10 μL de BM, suivi d’une autre petite bulle d’air.
    6. Terminer le chargement du cathéter en aspirant 1 cm de BM.
  4. Transfert d’embryons
    1. Considérez l’utilisation de gants, de robe et de masque stériles pour assurer un environnement aseptique.
    2. Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée, et essuyez-les avec 70% d’éthanol.
    3. Effectuer l’anesthésie comme indiqué précédemment (étape 1,2), la vérification de la perte de réflexes.
    4. Rasez la fourrure de l’abdomen ventrale avec un rasoir électrique.
    5. Préparez l’abdomen ventrale de façon aseptique.
      1. Nettoyez la zone chirurgicale et enlevez les poils restants. Laver la zone chirurgicale avec un savon au gluconate de chlorhexidine. Désinfecter la zone avec la solution de chlorhexidine et l’éthanol 96 º (3 fois).
    6. Placez l’animal sur une table chirurgicale chaude, dans la position de Trendelenburg (la tête vers le bas à 45 °) pour s’assurer que l’estomac et les intestins sont situés crânien. Considérez l’évacuation de la vessie si elle est turgide. Si des viscères sont endommagés dans le processus, l’animal peut mourir. Il est donc important de les faire correctement localisés (figure 1).
    7. Couvrez la zone à l’aide d’une serviette stérile, avec un trou (fenestration) exposant la zone rasée, pour séparer le site chirurgical de toute zone contaminante potentielle.
    8. Insérer un trocart endoscopique de 5 cm dans la cavité abdominale, 2 cm caudale au processus xiphoïde, et insuffler à travers lui la cavité péritonéale avec un insufflateur mécanique régulant la pression.
      NOTE: la pression intra-abdominale doit être de 8-12 mmHg avec CO2 (figure 1a).
    9. Insérez la caméra endoscope à travers le trocart endoscopique (figure 1b).
      Note: Identifiez le tractus reproducteur, en déterminant l’État et la position de l’infundibulum et de l’ampoule avant et pour faciliter les prochaines étapes.
    10. Insérer l’aiguille épidurale de 17 G dans la région inguinale entre 2-3 cm de l’intérieur (figure 1b).
    11. Identifiez l’entrée de l’infundibulum (figure 2a, 2b).
    12. Insérez le cathéter chargé (étape 1,3) à travers l’aiguille épidurale dans l’abdomen (figure 1c).
    13. Localiser l’oviducte et insérer 1-2 cm du cathéter épidural à travers l’infundibulum de l’ampoule (figure 2a-2C). Ne pas progresser très loin dans l’oviducte pour éviter les dommages et les hémorragies.
    14. Relâcher les embryons dans l’oviducte en appuyant doucement sur le piston de la seringue couplé au cathéter (figure 2D-2F). Les deux bulles d’air doivent sortir du cathéter.
    15. Retirer le cathéter juste après la libération des embryons.
    16. Rincer le cathéter, aspirer et relâcher le fluide manipulateur pour vérifier l’absence des embryons et confirmer leur transfert réussi.
    17. Répétez les étapes 1.4.11 à 1.4.16 de l’autre côté de l’utérus, si désiré.
    18. Retirez l’aiguille épidurale et l’appareil photo endoscope.
    19. Relâchez CO2 à travers le trocar endoscopique. Si l’excès de gaz reste dans l’abdomen de l’animal, il aura de la douleur et de l’inconfort.
    20. Retirer le trotre endoscopique de la cavité abdominale. Enlevez la serviette chirurgicale.
    21. Arrêtez l’anesthésie.
    22. Nettoyez l’incision faite par le trocart avec une solution de chlorhexidine. Fermez l’incision faite par le trocart avec un aluminium micronisé et un pansement en plastique.
  5. Soins postopératoires
    1. Traiter les animaux avec des antibiotiques: 10 mg/kg d’enrofloxacine, sous-cutanée, tous les 24-h pendant 5 jours.
    2. Administrer des analgésiques: chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg), par voie intramusculaire, chaque 12 heures pendant 3 jours; Méloxicam (0,2 mg/kg), par voie sous-cutanée, tous les 24-h pendant 3 jours.
    3. Surveillez les animaux pendant au moins 30 min après la chirurgie (selon l’animal et la dose d’anesthésie utilisée) en veillant à ce qu’ils récupèrent leurs conditions physiologiques.
    4. Identifiez le receveur (p. ex., tatouage d’oreille) et les animaux domestiques individuellement dans une cage propre avec l’état environnemental approprié.

Figure 1
Figure 1: transfert d’embryon laparoscopique assisté par laparoscopie (vue externe). A) insertion du trocart endoscopique (un port). B) insertion de la caméra endoscopique et de l’aiguille épidurale (flèche noire). C) insertion du cathéter de transfert d’embryon (flèche blanche) à travers l’aiguille épidurale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: transfert d’embryon laparoscopique assisté par laparoscopie (vue interne). A: Insertion du cathéter à travers l’aiguille épidurale dans la zone abdominale. L’astérisque indique l’infundibulum. B, C, D: Le cathéter chargé avec les embryons est inséré dans la région d’ampoule à travers l’infundibulum. E, F: Libération des embryons, confirmée par la visualisation d’un oviduct gonflé. Ce chiffre a été adapté de Marco-Jiménez et coll. 38 veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. vitrification et réchauffement embryonnaires

  1. Effectuer toutes les manipulations à température ambiante (environ 22 ° c) pour réduire la toxicité de la solution de vitrification à des températures plus chaudes.
    Remarque: les embryons peuvent être déplacés à l’aide de la pipette automatique 0,1-2 μL dans ce protocole, mais d’autres dispositifs similaires pour déplacer les embryons faisant glisser le volume minimum peuvent convenir.
  2. Vitrifiez les embryons dans une procédure d’addition en deux étapes:
    1. Placer les embryons pendant 2 minutes dans une solution équilibrante composée de 10% (v/v) d’éthylène glycol et de 10% (v/v) de diméthyl sulfoxyde dissous dans BM.
    2. Déplacer les embryons (à partir de l’étape 2.2.1) pendant 1 minute dans une solution de vitrification consistant en 20% (v/v) d’éthylène glycol et 20% (v/v) de diméthyl sulfoxyde dissous dans BM.
  3. Chargez les embryons dans un 125 μL de plastique (qui contient une extrémité fermée avec un bouchon de coton et un extrême ouvert). Le processus est schématisé dans la figure 3.
    1. Coupler l’extrémité fermée de 0,125 μL ministraw avec le microdistributeur approprié (p. ex. Captroll III®).
    2. Aspirate BM jusqu’à 1/3 de la longueur de la paille, suite à une petite bulle d’air.
    3. Aspirer les embryons dans un volume de 40 μL de solution de vitrification, suivi d’une autre petite bulle d’air.
    4. Aspirate BM jusqu’à ce que la première fraction liquide (étape 2.3.2) atteigne le coton.
    5. Fermez l’extrémité ouverte avec une prise de paille.
  4. Effectuer l’étape 2.2.2 alors que l’étape 2,3 est en cours pour s’assurer qu’il ne s’écoule pas plus d’une minute, ce qui serait toxique pour les embryons.
  5. Plonger le ministraw directement dans l’azote liquide pour obtenir la vitrification.
  6. Stockez le ministraw dans un Dewar pour l’azote pour le temps désiré.
  7. Décongeler les embryons en une seule étape.
    1. Placer le ministraw horizontalement à 10 cm de la vapeur d’azote liquide pour 20-30 s.
    2. Lorsque le processus de cristallisation commence à l’intérieur du ministraw, immerger le ministraw dans un bain d’eau à 25 ° c pour 10-15 s.
    3. Retirez le bouchon ministraw et coupez le bouchon en coton.
    4. Avec un microdistributeur couplé, expulser tout le contenu du ministraw dans une assiette contenant 0,33 M de saccharose à 25 ° c en BM pendant 5 minutes.
      Remarque: cette étape doit être effectuée rapidement afin de réduire l’exposition de l’embryon à la solution de vitrification.
    5. Déplacez les embryons vers une nouvelle plaque contenant une solution BM pendant 5 min.
    6. Ne considérez que les embryons non endommagés (avec le manteau de mucine intact et la zona pellucida) pour continuer avec l’ET.
      NOTE: tenir compte du fait que, dans les embryons décongelés, les transferts asynchrones (p. ex., 60-62 h dans les transferts de morula) peuvent améliorer les résultats en permettant une resynchronisation entre l’embryon et l’endomètre maternel.

Figure 3
Figure 3: schématisation de la paille correctement chargée. A) BM fait référence à l’embryon manipulant les milieux utilisés pendant la vitrification. Les embryons doivent être chargés dans une solution de vitrification. B) aspect macroscopique de la paille chargée avec un détail magnifié de la position de l’embryon. Ce dispositif de grand volume nous permet de vitrifier un grand nombre d’embryons, contrairement aux appareils de volume minimum. En outre, la manipulation de cet appareil est plus facile par rapport aux dispositifs de volume minimum, tandis que les résultats sont similaires chez les lapins41. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Representative Results

Le transfert laparoscopique mini-invasif d’embryons frais ou vitrifiés place le lapin parmi les meilleurs animaux modèles pour les études de reproduction. Le tableau 1 présente les résultats de l’HE fraîche à différents stades de développement (figure 4) des embryons transférés. Le taux de survie à la naissance (pourcentage d’embryons ayant entraîné un chiot) a prouvé l’efficacité de la technique laparoscopique décrite dans cet article. Les valeurs plus élevées ont été obtenues lorsque l’ET a été réalisée avec des embryons dans la phase morula, soit des morulae précoces ou compactes. Sur la base de ces résultats, nous avons effectué une deuxième expérience pour démontrer le taux de survie après vitrification de ces embryons. Ainsi, dans le tableau 2 nous montrons les résultats obtenus après le transfert des morulas de lapin vitrifiés récupérés en même temps, différant entre les embryons qui avaient atteint un bon degré de compactage ou non. Le taux de survie à la naissance était différent entre les différentes étapes de l’embryon, étant plus élevé dans les morulae compactés. Par conséquent, le transfert d’embryon laparoscopique est une technique fiable pour transférer des embryons frais et vitrifiés chez les lapins

Figure 4
Figure 4: embryons de lapins. A) pronuclear. B) huit cellules. C) morula précoce. D) morula compacte. E) blastocyste. Astérisque indique les deux pronuclei. Les flèches noires indiquent la zone pellucida. Les flèches blanches indiquent le pelage de la mucine, qui varie normalement entre les embryons. Missile aux performances améliorées: masse cellulaire interne. TE: trophectoderme. Barre d’échelle: 50 μM. veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Stade de développement1 Embryons Destinataires Lieu de transfert Taux de grossesse (%) Taux d’implantation (%) Taux de survie à la naissance (%)2
Pronucléaire 78 7 Oviduct 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
8 cellules 81 7 Oviduct 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)a
Morula précoce 81 7 Oviduct 7 (100) 80 (98,8)a 60 (74,1)a
Morula compacte 80 7 Oviduct 7 (100) 80 (100)a 58 (72,5)a
Blastocyste 80 7 utérus 7 (100) 73 (91,3)a 38 (47,5)b

Tableau 1. Efficacité du transfert d’embryon de lapin frais (dérivéin vivo ) par laparoscopie. 1embryons différents ont été récupérés à 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 cellules), 60-62 h (morula précoce), 70-72 h (morula compacte) et 80-82 h (blastocyste) après l’accouplement. Des morulas compactes (> 32 cellules) et non compactes (≈ 32 cellules) peuvent être fondées à 70-72 h, mais seules des morulas compactes ont été transférées. 2 les deux Taux de survie à la naissance du receveur enceinte fait. a, b Les valeurs avec différents exposants sont statistiquement différentes (P < 0,001).

Stade de développement Embryons transférés Destinataires Taux de grossesse (%) Taux de survie à la naissance (%)1
Non compacté 135 10 9 (90) 62 (45,9)b
compacté 150 10 10 (100,0) 98 (65,3)a
total 285 20 19 (95) 160 (56,1)

Tableau 2. Viabilité de la morula vitrifiée non compactée et compacte. les valeurs a, bavec différents exposants sont statistiquement différentes (P < 0,001). le premier Taux de survie à la naissance du receveur enceinte fait. Les embryons ont été récupérés en même temps (70-72 h) et ont été distingués en morulas compacts (> 32 cellules) et non compacts (≈ 32 cellules).

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Discussion

Depuis le premier cas de naissance en direct documenté d’embryons transférés9, cette technique et l’espèce de lapin sont devenues cruciales dans les études de reproduction. En outre, les études de recherche sur les embryons impliquant la manipulation, la production, la cryopréservation, etc. exigent comme dernière étape l’évaluation de la capacité embryonnaire pour générer une progéniture saine à long terme. Par conséquent, la technique de transfert d’embryon est indispensable13,28. Au fil des ans, les méthodes chirurgicales employées initialement pour transférer des embryons dans l’utérus maternel ont été graduellement remplacées par des méthodes moins invasives dans la grande majorité des espèces13,14,15, le 21 , 27 la plupart des , le 29 , 30. Cependant, chez les lapins, l’HE intraoviductale dans les stades précoces de développement et les embryons produits in vitro devient inévitable pour assurer un résultat similaire aux conditions naturelles. Chez les lapins, le manteau de mucine intraoviductale est un facteur crucial permettant l’implantation d’embryons, car il se déroule après le remodelage des revêtements embryonnaires pendant l’expansion du blastocyste dans les cornes utérines. Cependant, le dépôt de la mucine est limité à l’oviducte pendant 3 jours après l’ovulation, et les mécanismes moléculaires du dépôt de matériau de la couche sont largement inconnus31. Pour ces raisons, on sait que les blastocystes développés in vitron’ont pas survécu lorsqu’ils sont transférés dans l’utérus32,33,34, et les embryons avec un manteau de mucine endommagé ont un taux de survie plus faible 35. de même, les groupes qui ont rapporté un transfert d’embryon transcervicale chez le lapin ont entraîné des taux de naissance très faibles de11,26. Ici, nous présentons une technique minimalement invasive, adaptée de Besenfelder et Brem18, pour transférer des embryons avec des taux de natalité réussis. Selon les résultats du tableau 1, le stade morula des embryons de lapins était le meilleur stade embryonnaire pour atteindre un taux de survie élevé à la naissance. Une explication possible est la plus grande sensibilité à la manipulation des premières étapes. Fait intéressant, le taux de réussite augmente à mesure que l’étape embryonnaire progresse, peut-être en raison de la plus grande exposition de l’embryon aux sécrétions oviductales avant sa récupération. Mais lorsque les embryons atteignent le stade du blastocyste et sont transférés dans l’utérus, les valeurs diminuent radicalement. Sans exclure ce qui a été dit, une explication possible pourrait être que les embryons transférés dans l’oviducte peuvent rétablir les dommages possibles générés dans la couche de mucine pendant la manipulation d’embryons. Par conséquent, les blastocystes transférés dans l’utérus seraient privés de ce mécanisme, ce qui pourrait compromettre leur capacité d’implantation.

La technique est réalisée à l’aide d’un instrument à port unique (5 mm endoscope trocar), avec une manipulation légère et brève. Par conséquent, l’incision du trocart endoscope de the5 mm ne nécessite pas de fermeture. Les avantages de la technique laparoscopique comprennent une diminution de la douleur postopératoire, un retour plus rapide à l’activité normale et moins de complications postopératoires. En outre, les procédures endoscopiques induisent moins d’adhérences abdominales et permettent une meilleure réponse immunitaire par le receveur par rapport à la chirurgie ouverte21,36,37. Accumulation de preuves de notre laboratoire a démontré l’efficacité de cette procédure ET dans le modèle de lapin. Ainsi, au cours des cinq dernières années, un total de 3 909 embryons (1 335 frais et 2 574 d’embryons vitrifiés) ont été transférés dans le cadre de la procédure décrite dans le présent manuscrit. À la suite de cette technique, les taux de progéniture des embryons de transfert frais et vitrifiés étaient de 62,9% et42,5%, respectivement38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. de nombreuses études reposent sur cette technique: Marco-Jiménez et coll. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et coll. 42, Viudes-de-Castro et coll. 43, Saenz-de-Juano et coll. 44 , 45 , 47, lavara et coll. 46.

Des recommandations pratiques pour la réalisation de cette technique sont décrites ci-dessous. Dans les expériences de culture embryonnaire, il est également conseillé d’utiliser un nouveau cathéter pour le transfert d’embryons au lieu de celui utilisé pour déplacer les embryons entre les milieux de culture et les milieux de manipulation. Cela évite le transfert d’huile minérale et assure un écoulement optimal. Pendant l’ET il est important de minimiser la manipulation du tractus reproductif, car une manipulation excessive de l’oviducte pourrait entraîner des adhérences. Si l’oviducte est tordu, employez la seringue épidurale pour essayer de la positionner correctement, pas le cathéter, car il contient les embryons et la manipulation mécanique pourrait causer leur perte. Une fois que le cathéter traverse l’oviduct, il glisse facilement. Si ce n’est pas le cas, le cathéter peut s’être dévié. Une fois à l’intérieur de l’oviduct, si le support ne coule pas, déplacez le cathéter légèrement et essayez de le réinsérer à nouveau. Si elle ne coule toujours pas, le cathéter est obstrué. Retirez-le de l’oviducte et relâchez le contenu dans un plat avec un milieu propre. Ensuite, rechargez les embryons dans un autre cathéter et essayez de le réinsérer dans l’oviducte. La livraison prend habituellement des places 28-30 jours après le transfert de morula.

En outre, il existe des preuves indiquant que le stade de développement de l’embryon peut être plus avancé que l’environnement utérin chez les femelles pseudopregnant, mais pas le contraire. Plus précisément, les embryons ont la capacité d’attendre l’environnement de l’utérus favorable, mais l’environnement de l’utérus ne peut pas attendre les embryons à la bonne étape pour l’implantation10. En ce qui concerne les embryons vitrifiés, après un stockage à court/long terme, il est possible de synchroniser le stade de développement de l’embryon avec l’environnement de l’utérus favorable correspondant. En outre, si le donneur d’embryon est également le receveur de l’embryon, les effets néfastes de la superovulation sur l’endomètre peuvent être contournés en utilisant la technique de vitrification et en transférant les embryons dans un cycle ultérieur48. Chez les lapins, les embryons vitrifiés transférés dans les oviductes des receveurs induits à l’ovuler 60-62 h au préalable (asynchronie) est une technique très efficace44,49. En relation avec cela, il a été suggéré que la transition de l’embryon oviducte pendant 10-12 h pourrait expliquer les effets bénéfiques dans la restauration de la physiologie cellulaire et le remplacement des cellules mortes, et probablement réparer les dommages induits dans le manteau de mucine pendant l’embryon manipulation. En outre, les embryons vitrifiés présentent un retard dans le développement, car ils ont été métabolisés en suspension pendant le stockage. Par conséquent, le transfert d’embryons cryoconservés dans des receveurs asynchrones permet à l’embryon de réactiver son activité métabolique et, par conséquent, le stade embryonnaire de développement est synchronisé avec l’environnement de l’utérus. Au lieu de cela, si les embryons cryopréservés sont transférés dans des récepteurs synchroniques, le Cross-Talk entre la mère et l’embryon entrave l’apparition d’une grossesse réussie. Chez le lapin, le taux de survie le plus élevé a été obtenu après le transfert intraoviductal des morulas49cryopréservés. Nos données sont conformes à ce rapport, bien que le stade morula présente des taux de survie différents suivant la cryoconservation en fonction de leur degré de compactage à 70-72 h (tableau 2). Ici, les morulas compactées présentaient des taux de survie plus élevés à la naissance comparativement aux morulas non compactés, ce qui était en concordance avec les rapports précédents montrant que chaque stade de développement avait son propre mécanisme par rapport à la perméation des cryoprotecteurs et l’étendue de la déshydratation lors de l’addition de la solution de cryopréservation50. Sous-jacente à ces techniques, nous avons démontré qu’une combinaison de vitrification et de transfert d’embryons intraoviductal est une stratégie réussie pour rétablir les populations de lapins après 15 ans de stockage dans l’azote liquide, sans effet néfaste sur leur la survie après dégel et la naissance vivante51.

Les détails suivants doivent être pris en compte pour exécuter cette technique avec succès. Il est important de garder à l’esprit que la densité croissante des médiums consécutifs utilisés pour la vitrification (DPBS, solution d’équilibration, solution de vitrification) pourrait induire une contraction embryonnaire due à une déshydratation progressive de l’embryon. Cependant, son aspect normal est récupéré lorsque l’embryon est équilibré avec le milieu. En outre, lorsque l’embryon est déplacé entre les milieux de densité croissante, il tend à se déplacer à la surface des médias en raison de mouvements de densité. Pour éviter la perte d’embryons et assurer le temps de vitrification, il est recommandable d’effectuer la vitrification dans de petites gouttes de la presse qui gardera l’embryon en place.

En conclusion, nous décrivons ici une technique et une méthode de vitrification embryonnaire qui facilitent les études futures qui utilisent les lapins comme modèle. Sur la base de la distance phylogénétique étroite entre les lapins et les humains, l’utilisation de ce modèle pourrait fournir des résultats facilement transférables à la médecine clinique humaine. En outre, notre méthode offre des avantages hygiéniques et économiques, conformes au concept des 3 r du bien-être animal (remplacement, réduction et raffinement), tout en conservant l’objectif d’améliorer le traitement humain des animaux expérimentaux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été appuyé par des fonds du ministère de l’Economie et de la compétitivité de l’Espagne (AGL2017-85162-C2-1-R) et du programme de recherche Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Version texte anglaise révisée par N. MacOwan English Language Service

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

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Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit
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Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

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