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Developmental Biology

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

Die assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) werden kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt ein minimal-invasives Embryotransfer-Verfahren mit einem effizienten Kryokonservierungsprotokoll, das die Verwendung von Kaninchen als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung ermöglicht.

Abstract

Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs), wie in der vitro-Embryonenkultur oder Embryonen-Kryokonservierung, beeinflussen natürliche Entwicklungsmuster mit perinatalen und postnatalen Folgen. Um die Unschuld von ART-Anwendungen zu gewährleisten, sind Studien in Tiermodellen notwendig. Darüber hinaus erfordern die Studien zur Embryonenentwicklung als letzten Schritt eine Bewertung ihrer Fähigkeit, einen vollzeitlichen gesunden Nachwuchs zu entwickeln. Hier ist der Embryotransfer in die Gebärmutter unverzichtbar, um alle ARTs-bezogenen Experimente durchzuführen.

Das Kaninchen wird seit mehr als einem Jahrhundert als Modellorganismus verwendet, um die Säugetierreproduktion zu untersuchen. Neben seiner phylogenetischen Nähe zur menschlichen Spezies und ihrer geringen Größe und geringen Wartungskosten hat sie wichtige reproduktive Eigenschaften wie induzierter Eisprung, eine Chronologie der frühen embryonalen Entwicklung, die dem Menschen ähnelt, und eine kurze Schwangerschaft. Damit können wir die Folgen der ART-Anwendung leicht untersuchen. Darüber hinaus werden bei dieser Art ARTs (wie intrazytoplasmatische Spermieninjektion, Embryonenkultur oder Kryokonservierung) mit entsprechender Effizienz angewendet.

Mit Hilfe der laparoskopischen Embryotransfer-Technik und des in diesem Artikel vorgestellten Kryokonservierungsprotokolls beschreiben wir 1) wie Embryonen durch eine einfache, minimal-invasive Technik übertragen werden können und 2) ein wirksames Protokoll für die langfristige Lagerung von Kaninchen Embryonen, die zeit-flexible Logistikkapazitäten und die Transportfähigkeit der Probe bieten. Die Ergebnisse, die nach der Übertragung von Kaninchenembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien erzielt wurden, deuten darauf hin, dass Morula die ideale Stufe für die Wiederherstellung und Übertragung von Kaninchenembryonen ist. Daher ist ein oviductaler Embryotransfer erforderlich, der den chirurgischen Eingriff rechtfertigt. Darüber hinaus werden Kaninchenmorulae erfolgreich verglast und laparoskopisch übertragen, was die Wirksamkeit der beschriebenen Techniken beweist.

Introduction

Mit dem Ziel, die menschliche Unfruchtbarkeit zu umgehen oder die Verbreitung von Nutztieren mit hohem genetischen Wert zu verbessern und die genetischen Ressourcen der Tiere zu erhalten, wird eine Reihe von Techniken, die gemeinhin als assistierte Fortpflanzungstechnologien bezeichnet werden, wie zum Beispiel Superovulation, in Die vitro-Fertilisation , die Embryonenkultur oder die Kryokonservierung wurden1,2entwickelt. Derzeit werden hormonelle Behandlungen gegeben, um die Eierstöcke zu stimulieren und eine große Anzahl von antralen Eierstöcken follikeln1. Oozyten, die aus diesen Follikeln gesammelt werden, können gereift, gedüngt und in vitro entwickelt werden, bis sie entweder kryokonserviert oder an Leihmütter übertragen werden3. Während dieser Behandlungen sind Gameten und Zygoten jedoch einer Reihe nicht-physiologischer Prozesse ausgesetzt, die eine Embryonenanpassung erfordern könnten, um unter diesen Bedingungen4,5zu überleben. Diese Anpassung ist aufgrund der frühen Embryoplastizität möglich, die Embryonenveränderungen in der Genexpression und Entwicklungsprogrammierung6ermöglicht. Diese Änderungen können jedoch die nachfolgenden Stadien der Embryonenentwicklung bis ins Erwachsenenalter beeinflussen, und es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass Methoden, Timing, Kryokonservierungsverfahren oder Kulturbedingungen unterschiedliche Ergebnisse über das EmbryonenSchicksal zeigen. , 8. Um die spezifischen induzierten Wirkungen von ARTs zu erklären, ist daher der Einsatz gut charakteristischer Tiermodelle unvermeidlich.

Die erste dokumentierte Lebengeburt, die durch die Übertragung von Säugetierembryonen resultierte, fand 1890statt. Heute ist der Embryotransfer (ET) zu einem Leihmautat ein entscheidender Schritt bei der Untersuchung der ART-induzierten Effekte während der Preimenplantation auf den nachfolgenden Embryonalentwicklungsstufen 10. Die ET-Techniken hängen von der Größe und der anatomischen Struktur jedes Tieres ab. Bei großen Tiermodellen ist es möglich gewesen, ET durch transzervikale nichtchirurgische ET-Techniken durchzuführen, aber bei kleineren Arten ist Katheterisierung des Gebärmutterhalses komplexer und chirurgische Techniken werden häufig verwendet 11. Allerdings kann chirurgisches ET zu Blutungen führen, die die Implantation und die Embryonenentwicklung beeinträchtigen könnten, da Blut in das Gebärmutterlumen eindringen kann, was den Embryonentod 10 verursacht. Transcervical-nichtchirurgische ET-Techniken werden immer noch bei Menschen, Pavianen, Rindern, Schweinenund Mäuse 12, 13, 14, 15,16,17 angewendet,aberchirurgisch ETS wird immer noch in Arten wie Ziegen, Schafe oder andere Tiere, die zusätzliche Schwierigkeiten 10,18, 19, 20,21,wieKaninchen (zwei Unabhängige cervices) oder Mäuse (kleine Größe). Dennoch sind chirurgische Übertragungsmethoden in der Regel nach und nach durch weniger invasive Methoden ersetzt worden. Die Endoskopie wurde zur Übertragung von Embryonen eingesetzt, zum Beispiel bei Kaninchen, Schweinen und kleinenWiederkäuern 18,19,20. Diese minimal-invasiven Endoskopie-Methoden können verwendet werden, um Embryonen über das Infundibulum in die Ampulla zu übertragen, das bei Kaninchen unverzichtbar ist und bei einigenArten 20 positive Wirkungen gezeigt hat. Dies beruht auf der Bedeutung des richtigen Dialogs zwischen Embryo und Mutter während der frühen Embryonenphase im oviduct. Wie bereits erwähnt, ist der Embryonenumzug, der bei Kaninchen während der Embryonenwanderung durch den oviductstattfindet, unerlässlich, um Embryonen zu erreichen, die in der Lage sind, 22,23zu implantieren.

Größere Tiermodelle, wie Rinder, sind interessant, weil die Biochemie-und Präimplantationsmerkmale denen der menschlichen Spezies 24ähneln. Große Tiere sind jedoch zu teuer, um sie in Vorversuchen einzusetzen, und Nagetiere gelten als ideales Modell (76% Modellorganismen sind Nagetiere) für Laborforschung 25. Dennoch bietet das Kaninchenmodell einige Vorteile gegenüber Nagetieren in Fortpflanzungsstudien, da einige reproduktive biologische Prozesse, die von Menschen gezeigt werden, bei Kaninchen ähnlicher sind als bei Mäusen. Mensch und Kaninchen weisen eine ähnliche chronologische embryonale Genomaktivierung, Gastrulation und hemochronische Plazenta-Struktur auf. Darüber hinaus ist es möglich, mit Kaninchen den genauen Zeitpunkt der BefruchtungundSchwangerschaftsstadien aufgrund ihres induzierten Eisprungs 25 zu kennen. Kaninchenlebenszyklen sind kurz, vollenden die Schwangerschaft in 31 Tagen und erreichen die Pubertät bei etwa 4-5 Monaten; Das Tier ist aufgrund seines gefügigen und nicht aggressiven Verhaltens leicht zu handhaben, und sein Unterhalt ist im Vergleich zu den Kosten größerer Tiere sehr sparsam. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass Kaninchen eine Duplex-Gebärmutter mit zweiunabhängigenGebärmutterhalskrebs11,25haben. Dadurch wird das Kaninchen bevorzugt, da Embryonen aus den verschiedenen Versuchsgruppen in das gleiche Tier, aber in ein anderes Gebärmutterhorn übertragen werden können. So können wir beide experimentellen Effekte vergleichen und so den mütterlichen Faktor aus den Ergebnissen reduzieren.

Heute werden nicht-chirurgische ET-Methoden nicht mehr im Kaninchen eingesetzt. Einige Studien, die in den späten 90er Jahren mit einer Transcervical-ET-Technik durchgeführt wurden, führten zu niedrigenLieferraten von 5,5% bis 20,0%11,26gegenüber 50-65% durch chirurgische Methoden, darunter die Laparoskopie-Verfahren, die von beschrieben wurden. Besenfelder und Brem18. Die geringen Erfolgsraten dieser nicht-chirurgischen ET-Methoden bei Kaninchen decken sich mit dem Fehlen der notwendigen Embryonenumgestaltung im oviduct, die in transscervical ET vermieden wird. Hier beschreiben wir ein effektives minimal-invasives laparoskopisches ET-Verfahren, bei dem Kaninchen als Modellorganismus eingesetzt werden. Diese Technik ist ein Modell für die weitere Fortpflanzungsforschung bei großen Tieren und Menschen.

Da Kaninchen ein besonders schmales Zeitfenster für die Embryonenimplantation haben, erfordert ET in dieser Art ein hohes Maß an Synchronisation zwischen dem Entwicklungsstadium des Embryos bei ET und dem physiologischen Statusdes Empfängers 27. In einigen Fällen gibt es nach einer reproduktiven Behandlung, die die Embryonenentwicklung verlangsamt (wie in der In-vitro-Kultur) oder die Endometriumempfänglichkeit (wie Superovulationsbehandlungen), keine Synchronisation zwischen dem Embryo und der mütterlichen Gebärmutter. Diese Situationen können sich negativ auf das Ergebnis auswirken. Um in diesen Zusammenhängen zu reagieren, beschreiben wir ein effektives Kaninchenmorula-Vervitungsprotokoll, das es uns ermöglicht, die Experimente zu unterbrechen, zu organisieren und wieder aufzunehmen. Dieser Prozess ist logistisch wünschenswert für Fortpflanzungsstudien und gibt uns die Möglichkeit, Embryonen langfristig zu lagern, so dass sie transportiert werden können. Die laparoskopischen Verfahren und Kryokonservierungsstrategien ermöglichen eine bessere Planung von Studien mit weniger Tieren. So bietet unsere Methodik hygienische und wirtschaftliche Vorteile und entspricht dem Konzept der 3R (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) der Tierforschung mit dem erklärten Ziel, die menschliche Behandlung von Versuchstieren zu verbessern. So stellen Kaninchen mit diesen Methoden einen idealen Modellorganismus für in vivo reproduktiven Assays dar.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren, die in dieser Studie angewendet werden, wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU-EWG für Tierversuche durchgeführt und von der Ethikkommission für Experimente mit Tieren der Universität Politècnica de València überprüft und genehmigt, Spanien (Forschungscode: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC und JSV besitzen eine von der valencianischen Regierungsverwaltung ausgestellte Zulassungsbescheinigung, um an Tieren zu experimentieren. XGD ist ermächtigt, das Wohlergehen und die Pflege der Tiere während des Experiments vor Ort zu überwachen.

1. Embryotransfer

  1. Vorbereitung der Empfängerweibchen
    1. Verwenden Sie nur geschlechtsreife Weibchen (> 4,5 Monate alt).
    2. Eine Woche vor ET, passen die Weibchen an ein 16 h leichtes, 8 h dunkles Regime an, um follikuläres Wachstum und eine verbesserte weibliche Empfänglichkeit zu initiieren.
    3. Wählen Sie die Empfängerweibchen aus, wobei Sie die Trübung und Farbe der Vulva beobachten. Wenn die Vulva turgid und rötlich ist, ist das Weibchen empfänglich.
    4. Die Pseudopregnancy (Eisprung) durch eine einzige intramuskuläre Injektion von 1 μg Buserelin-Acetat (synthetische Analogie des Gonadotroin-Relenvergiftes Hormon) unabhängig vom Körpergewicht.
      Hinweis: In der Regel sind 0,8 μg eine geeignete Dosis für die Eisprunginduktion bei mittelgroßen Kaninchen (4-5 kg), so dass 1 μg in der Regel den Eisprung garantiert.
    5. Der Eisprung ist so viele Tage vorher wie das Alter der zu übertragenden Embryonen (z.B. 70-72 Stunden vor frischer Morula ET).
  2. Anästhesie und Schmerzmittel
    1. Das Kaninchen abwischen und die folgende Betäubung und Schmerzmittel laden.
      1. In einer 1 mL-Spritze mit einer 30G-Nadel: Belastung xylazine (5mg/kg) und Buprenorphine Hydrochlorid (0,03 mg/kg). In einer weiteren 1 mL-Spritze mit einer 23G pericranialen Nadel laden Ketamin Hydrochlorid (35 mg/kg).
    2. Halten Sie das Kaninchen und injizieren Sie die Xylazine-buprenorphine Mischung intramuskulär.
    3. Die Perikannadel mit Ketamin in die Randohrensader einlegen und dabei langsam alle Spritzeninhalte intravenös einführen.
    4. Die Nadel fixieren und in den verbleibenden Schritten einfügen lassen, um bei Bedarf mehr Anästhesie zu verabreichen.
    5. Lassen Sie das Kaninchen im Käfig (sauber und ohne andere Tiere) auf einer warmen Bühne.
    6. Einmal bewusstlos, Augensalbe auftragen, um Trockenheit des Auges zu vermeiden und auf das Fehlen des palpebralen Freflex zu überprüfen.
      Hinweis: Dieses Protokoll bietet eine chirurgische Anästhesie-Ebene für mindestens 30 Minuten. Wenn eine längere Zeit erforderlich ist, injizieren Sie zusätzliche Dosierungen mit der Hälfte der Menge an Ketamin-Hydrochlorid, die in 1.2.1 nach 30 Minuten beschrieben wird.
    7. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex und die Atembewegung überprüfen. Veränderungen des Atemmusters auf eine unregelmäßige und schnellere Rate deuten auf den Verlust der richtigen Anästhesieebene hin.
    8. Überwachen Sie die Farbe der Schleimhäute (Augen, Lippen, etc .), Atemfrequenz (30-60 Atemzüge pro Minute), Herzfrequenz (120-325 Schläge pro Minute) und rektale Temperatur (38-39,6 ° C).
    9. Acht Stunden vor dem Transfer, halten Lebensmittel von Tieren, um die größere Darm-Größe und Aktivität zu vermeiden, bis der ET-Prozess beendet ist. Den freien Zugang zu Wasser zu verlassen.
  3. Embryopräparation
    1. Warm das Embryonenmanipulationsmedium auf 25 ° C: Base Medium (BM), bestehend aus Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline (DPBS), ergänzt um 0,2% (w/v) von Bovine Serum Albumin.
    2. Unter einem Stereomikroskop, spülen Sie frische oder aufgetaute (Step 2) Embryonen mit BM.
    3. Mit sterilen Handschuhen einen entsprechend konfigurierten 17G-Epiduralkatheter an einer 1 ML-Spritze befestigen.
    4. 1 cm BM in den Katheter aufsaugen, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
    5. Aspirate 5-7Embryonen in einem Volumen von 10 μL von BM, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase.
    6. Beenden Sie das Beladen des Katheters, indem Sie 1 cm BM saugen.
  4. Embryotransfer
    1. Man denke an die Verwendung von sterilen Handschuhen, Kleid und Maske, um eine aseptische Umgebung zu gewährleisten.
    2. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente, reinigen Sie die Oberflächen, in denen die Operation durchgeführt wird, und wischen Sie sie mit 70% Ethanol.
    3. Führen Sie die Anästhesie wie bisher detailliert an (Schritt 1,2) durch, überprüfen Sie den Verlust von Reflexen.
    4. Das Fell aus dem ventralen Bauch mit einem elektrischen Rasiermesser rasieren.
    5. Bereiten Sie den ventralen Bauch aseptisch.
      1. Reinigen Sie den chirurgischen Bereich und entfernen Sie alle verbleibenden Haare. Den Operationsbereich mit einer Chlorhexidin Gluconat-Seife waschen. Sanitisieren Sie das Gebiet mit Chlorhexidin Lösung und Ethanol 96 º (3-mal).
    6. Legen Sie das Tier auf einen warmen OP-Tisch, in Trendelenburgs Position (Kopf nach unten bei 45 °), damit der Magen und Darm kranial aufgestellt sind. Man denke an die Evakuierung der Blase, wenn sie turgid ist. Wenn dabei eine Viscera beschädigt wird, kann das Tier sterben. Es ist daher wichtig, dass sie richtig lokalisiert sind (Abbildung 1).
    7. Bedecken Sie den Bereich mit einem sterilen Handtuch, mit einem Loch (Fackelung), das den rasierten Bereich aussetzt, um den Operationsort von möglichen Verunreinigungsbereichen zu trennen.
    8. Legen Sie einen endoskopischen Trokar 5 cm in die Bauchhöhle ein, 2 cm kaudal zum Xiphoid-Verfahren und insufflate durch ihn die Peritonealhöhle mit einem druckregulierenden mechanischen Insufflator.
      NOTE: Der inn-Bauchdruck sollte 8-12 mmHg mit CO2 (Abbildung 1A) betragen.
    9. Die Endoskop-Kamera durch das endoskopische Trocar einlegen (Abbildung 1B).
      Hinweis: Identifizieren Sie den Fortpflanzungstrakt, Bestimmung des Status und der Position des Infundibulums und Ampulla vor ET, um die nächsten Schritte zu erleichtern.
    10. Legen Sie die 17-G-Epiduralnadel zwischen 2-3 cm vom Infundibulum in den Leistenbereich ein (Abbildung 1B).
    11. Identifizieren Sie den Eingang des Infundibulums (Abbildung 2A, 2B).
    12. Den geladenen Katheter (Schritt 1.3) durch die Epiduralnadel in den Bauch einlegen (Abbildung 1C).
    13. Finden Sie den ovidukt und legen Sie 1-2 cm des Epiduralkatheters durch das Infundibulum in der Ampulla ein (Abbildung 2A-2C). Gehen Sie nicht sehr weit in den oviduct, um Schäden und Blutungen zu verhindern.
    14. Lassen Sie die Embryonen in den ovidukt, indem Sie sanft den Kolben der Spritze, die an den Katheter gekoppelt sind (Abbildung 2D-2F), drücken. Beide Luftblasen müssen den Katheter verlassen.
    15. Entfernen Sie den Katheter kurz nach dem Freisetzen der Embryonen.
    16. Spülen Sie den Katheter ab, saugen und lösen Sie das manipulierende Medium aus, um das Fehlen der Embryonen zu überprüfen und ihre erfolgreiche Übertragung zu bestätigen.
    17. Wiederholungsschritte 1.4.11, auf Wunsch in der anderen Seite der Gebärmutter zu 1.4.16.
    18. Die Epiduralnadel und die Endoskop-Kamera entfernen.
    19. Durch den endoskopischen Trocar die CO2 freigeben. Bleibt überschüssiges Gas im Bauch des Tieres, hat es Schmerzen und Beschwerden.
    20. Entfernen Sie den endoskopischen Trokar aus der Bauchhöhle. Entfernen Sie das chirurgische Handtuch.
    21. Anästhesie einstellen.
    22. Reinigen Sie den Schnitt des Trocars mit Chlorhexidin Lösung. Schließen Sie den Schnitt des Trocars mit einem mikronisierten Aluminium und einer Kunststoffverkleidung.
  5. Postoperative Betreuung
    1. Behandeln Sie die Tiere mit Antibiotika: 10 mg/kg Enrofloxacin, subkutan, alle 24-h für 5 Tage.
    2. Administer Schmerzmittel: Buprenorphine Hydrochlorid (0,03 mg/kg), intramuskulär, alle 12 Stunden für 3 Tage; Meloxicam (0,2 mg/kg), subkutan, alle 24-h für 3 Tage.
    3. Überwachen Sie die Tiere für mindestens 30 Minuten nach der Operation (abhängig vom Tier und der Dosis der Anästhesie verwendet), um sicherzustellen, dass sie ihre physiologischen Bedingungen wieder.
    4. Identifizieren Sie den Empfänger (z.B. Ohrentäbe) und Haustiere individuell in einem sauberen Käfig mit entsprechendem Umweltzustand.

Figure 1
Abbildung 1: Laparoskopischer Embryotransfer, unterstützt durch Laparoskopie (Außenansicht). A) Einleitung des endoskopischen Trocars (ein Port). B) Einleitung der endoskopischen Kamera und der Epiduralnadel (schwarzer Pfeil). C) Einleitung des Embryo-Transfer-Katheters (weißer Pfeil) durch die Epiduralnadel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Laparoskopischer Embryotransfer, unterstützt durch Laparoskopie (Innere Sicht). A: Einleitung des Katheters durch die Epiduralnadel in die Bauchzone. Sternchen zeigt das Infundibulum an. B, C, D: Der mit den Embryonen beladene Katheter wird über das Infundibulum in den Ampullabereich eingeführt. E, F: Freisetzung der Embryonen, bestätigt durch die Visualisierung eines geschwollenen oviduct. Diese Figur wurde von Marco-Jiménez et al. 38. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Embryo-Vitrifikation und Erwärmung

  1. Führen Sie alle Manipulationen bei Raumtemperatur (ca. 22 ° C) durch, um die Toxizität der Glasfaserlösung bei wärmeren Temperaturen zu reduzieren.
    Hinweis: Embryonen können in diesem Protokoll mit 0,1 -2 μL-Automatikpipette bewegt werden, aber andere ähnliche Geräte, um die Embryonen zu bewegen, die das minimale Volumen ziehen, können geeignet sein.
  2. Die Embryonen in einem zweistufigen Zusatzverfahren vitrifizieren:
    1. Legen Sie die Embryonen für 2 Minuten in eine Gleichgewichtslösung, die aus 10% (v/v) Ethylen-Glykol und 10% (v/v) Dimethylsulfoxid besteht, das in BM aufgelöst wird.
    2. Bewegen Sie die Embryonen (von Schritt 2.2.1) für eine Minute in eine Vitrifizierungslösung, die aus 20% (v/v) Ethylen-Glykol und 20% (v/v) Dimethylsulfoxid besteht, das in BM aufgelöst wird.
  3. Laden Sie die Embryonen in ein 125 μL-Kunststoff-Ministroh (das ein geschlossenes Ende mit einem Baumwollstecker und einem offenen Extrem enthält). Der Prozess ist in Abbildung3 schematisiert.
    1. Das geschlossene Ende von 0,125 μL Ministroh mit dem entsprechenden Mikrodispenser (z.B. Captroll III®) verkapeln.
    2. Aspirate BM bis zum Teil 3 der Strohlänge, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
    3. Aspirieren Sie die Embryonen in einem Volumen von 40 μL der Verglasungslösung, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase.
    4. Aspirate BM, bis der erste Flüssigkeitsfraktion (Schritt 2.3.2) die Baumwolle erreicht.
    5. Schließen Sie das offene Ende mit einem Strohplug.
  4. Führen Sie 2.2.2, während Schritt 2.3 getan wird, um sicherzustellen, dass nicht mehr als eine Minute vergehen, was für Embryonen giftig wäre.
  5. Den Ministroh direkt in flüssigen Stickstoff eintauchen, um eine Verglasung zu erreichen.
  6. Bewahren Sie das Ministroh in einem Defisch für Stickstoff für die gewünschte Zeit auf.
  7. Tauschen Sie die Embryonen in einem Schritt.
    1. Das Ministroh horizontal 10 cm aus flüssigem Stickstoffdampf für 20-30 s ablegen.
    2. Wenn der Kristallisationsprozess im Inneren des Ministrohens beginnt, tauchen Sie das Ministroh bei 25 ° C für 10-15 s in ein Wasserbad ein.
    3. Den Ministroh-Stecker entfernen und den Baumwollstecker abschneiden.
    4. Mit einem gekoppelten Mikrodispensator den gesamten Ministrohgehalt 5 Minuten lang in eine Platte mit 0,33 M Saccharrose-Lösung bei 25 ° C in BM auslagern.
      Hinweis: Dieser Schritt muss schnell getan werden, um die Embryonenexposition bei der Vitrifizierungslösung zu reduzieren.
    5. Bewegen Sie die Embryonen auf eine neue Platte, die die BM-Lösung für weitere 5 Minuten enthält.
    6. Betrachten Sie nur nicht beschädigte Embryonen (mit intaktem Schleimhautmantel und zona pellucida), um mit dem ET fortzufahren.
      Hinweis: Beachten Sie, dass bei aufgetauten Embryonen asynchrone Transfers (z.B. 60-62 h bei Morula-Transfers) die Ergebnisse verbessern können, indem eine Resynchronisierung zwischen Embryo und mütterlichem Endometrium ermöglicht wird.

Figure 3
Bild 3: Schematisierung von korrekt beladendem Stroh. A) BM bezieht sich auf die Embryo-Manipulationsmedien, die während der Verglasung eingesetzt werden. Embryonen müssen in der Vitrifizierungslösung geladen werden. B) Makroskopisches Erscheinungsbild des geladenen Strohhalms mit einem vergrößerten Detail der Embryonenposition. Dieses großvolumige Gerät ermöglicht es uns, eine große Anzahl von Embryonen zu vitrifizieren, im Gegensatz zu minimalen Volumengeräten. Darüber hinaus ist die Handhabung dieses Gerätes im Vergleich zu minimalen Volumengeräten einfacher, während die Ergebnissebei Kaninchen 41 ähnlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Representative Results

Minimal invasive laparoskopische Übertragung von frischen oder verglasten Embryonen zählt das Kaninchen zu den besten Modelltieren für Fortpflanzungsstudien. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von frischem ET in verschiedenen Entwicklungsstadien (Abbildung 4) übertragender Embryonen. Die Überlebensrate bei der Geburt (Prozentsatz der Embryonen, die zu einem Aufschlag führen) bewies die Wirksamkeit der laparoskopischen Technik, die in diesem Papier beschrieben wird. Die höheren Werte wurden erreicht, wenn das ET mit Embryonen im Morula-Stadium durchgeführt wurde, entweder frühe oder kompakte Morulae. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir ein zweites Experiment durchgeführt, um die Überlebensrate nach der Verglasung dieser Embryonen zu demonstrieren. So zeigen wir in Tabelle 2 die Ergebnisse, die nach der Übertragung von verglasten Kaninchenmorulae erzielt wurden, die zur gleichen Zeit wiedergewonnen wurden, wobei zwischen jenen Embryonen unterschieden wird, die ein gutes Maß an Verdichtung erreicht hatten oder nicht. Die Überlebensrate bei der Geburt war zwischen den verschiedenen Embryonalstadien unterschiedlich, wobei sie in verdichteten Morulae höher war. Daher ist der laparoskopische Embryotransfer eine zuverlässige Technik, um frische und verglaste Embryonen in Kaninchen zu übertragen.

Figure 4
Abbildung 4: Kaninchenembryonen. A) Pronuclear. B) Acht Zellen. C) Frühe Morula. D) Compact morula. E) Blastocyst. Asterisk zeigt die beiden Pronuklei an. Schwarze Pfeile zeigen die zona pellucida. Weiße Pfeile zeigen das Schleimhautmantel an, das normalerweise zwischen Embryonen variiert. ICM: Innere Zellmesse. TE: Trophectoderm. Skalenleiste: 50 μm.

Entwicklungsstufe1 Embryonen Empfänger Ort der Übertragung Schwangerschaftsrate (%) Implantationsrate (%) Überlebensrate bei der Geburt (%)2
Pronuklar 78 7 Oviduct 7 (100) 50 (64.0)b 34 (43,6)b
8 Zellen 81 7 Oviduct 7 (100) 60 (74.1)b 53 (65,4)a
Frühe Morula 81 7 Oviduct 7 (100) 80 (98,8)a 60 (74.1)a
Kompakte Morula 80 7 Oviduct 7 (100) 80 (100)a 58 (72,5)a
Blastozyste 80 7 gebärmutter 7 (100) 73 (91,3)a 38 (47,5)b

Tabelle 1. Effizienz des frischen Kaninchenembryonentransfers (in vivo abgeleitet) durch Laparoskopie. 1Verschiedene Embryonen wurden bei 18-20 Uhr (pronuclear), 36-38h (8 Zellen), 60-62 h (frühe Morula), 70-72 h (kompakte Morula) und 80-82 h (Blastozyste) nach der Paarung geborgen. Kompakte (& gt;32 Zellen) und nicht-kompakte Morulae ("32 Zellen") können mit 70-72 h gegründet werden, aber es wurden nur kompakte Morulae übertragen. 2 Überlebensrate bei der Geburt von der Empfängerin schwanger tut. A, b Werte mit unterschiedlichen Superskripten sind statistisch unterschiedlich (P<0.001).

Entwicklungsstufe Übertragene Embryonen Empfänger Schwangerschaftsrate (%) Überlebensrate bei der Geburt (%)1
Nicht kompakt 135 10 9 (90) 62 (45,9)b
Verdichtet 150 10 10 (100.0) 98 (65,3)a
gesamt 285 20 19 (95) 160 (56,1)

Tabelle 2. Die Tragfähigkeit von nicht verdichtelten vs. kompakten verglasten Morula. A, bWerte mit verschiedenen Superskripten sind statistisch unterschiedlich (P<0.001). 1 Überlebensrate bei der Geburt von der Empfängerin schwanger tut. Embryonen wurden gleichzeitig (70-72 h) wiedergewonnen und in kompakte (& gt;32 Zellen) und nicht-kompakten Morulae (-32 Zellen) unterschieden.

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Discussion

Seit dem ersten dokumentierten Lebendgeburtsfallausübertragenen Embryonen 9 sind diese Technik und die Kaninchenarten in Fortpflanzungsstudien entscheidend geworden. Darüber hinaus erfordern Embryonenforschungsstudien zu Manipulation, Produktion, Kryokonservierung usw . als letzten Schritt die Bewertung der Embryonenkapazität, um gesunde Vollzeitergebnisse zu erzeugen. Daher ist die Embryotransfer-Technik13,28unverzichtbar. Im Laufe der Jahre wurden die chirurgischen Methoden, die ursprünglich zur Übertragung von Embryonen in die Gebärmutter von Müttern eingesetzt wurden, in der überwiegenden Mehrheit derArten 13,14,15 nach und nach durch weniger invasive Methoden ersetzt. 21 , 27 , 29 , 30. Bei Kaninchen wird intraoviductal ET jedoch in frühen Embryostadien und in vitro produzierten Embryonen unvermeidbar, um ein ähnliches Ergebnis wie die natürlichen Bedingungen zu gewährleisten. Bei Kaninchen ist das intraoviduktale Schleimhautlack ein entscheidender Faktor für die Embryonenimplantation, da es nach der Umgestaltung der embryonalen Beschichtungen während der Blastozystenausbreitung in den Gebärmutterhörnern stattfindet. Die Ablagerung des Schleimhautfells ist jedoch nach dem Eisprung für 3 Tage auf den oviductbeschränkt, und die molekularen Mechanismen der Fellmaterialablagerung sind weitgehend unbekannt 31. Aus diesen Gründen ist bekannt, dass in vitro-entwickelten Blastozysten nicht überlebt haben, wenn sie auf die Gebärmutter32, 33,34übertragen wurden, und Embryonen mit einem beschädigten Schleimhautmantel haben eine geringere Überlebensrate 35. Ebenso führten Gruppen, die einen transzervigen Embryotransfer bei Kaninchen meldeten, zu sehr niedrigen Lebendraten11,26. Hier stellen wir eine minimal-invasive Technik vor, die von Besenfelder und Brem18angepasst wurde, um Embryonen mit erfolgreichen Geburtenraten zu übertragen. Nach den Ergebnissen in Tabelle 1 wardie Morula-Phase bei Kaninchenembryonen die beste Embryonalstufe, um eine hohe Überlebensrate bei der Geburt zu erreichen. Eine mögliche Erklärung ist die größere Sensibilität für Manipulationen der frühesten Stadien. Interessanterweise steigt die Erfolgsquote mit fortschreitendem Embryonalstadium, möglicherweise aufgrund der größeren Exposition des Embryos gegenüber oviduktalen Sekreten vor seiner Genesung. Aber wenn Embryonen das Blastozystenstadium erreichen und in die Gebärmutter versetzt werden, sinken die Werte drastisch. Ohne das Gesagte auszuschließen, könnte eine mögliche Erklärung darin bestehen, dass die in den ovidukt übertragenen Embryonen den möglichen Schaden wiederherstellen können, der während der Embryonenmanipulation in der Schleimschicht entsteht. Daher würden Blastozysten, die in die Gebärmutter übertragen werden, von diesem Mechanismus beraubt, der ihre Implantationskapazität gefährden könnte.

Die Technik wird mit einem einzigen Port-Instrument (5 mm Endoskop-Trocar) mit leichter, kurzer Manipulation durchgeführt. Daher ist der 5-mm-Endoskop-Trocar-Schnitt nicht verschluss. Zu den Vorteilen der laoraroskopischen Technik gehören verminderte postoperative Schmerzen, eine schnellere Rückkehr zur normalen Aktivität und weniger postoperative Komplikationen. Darüber hinaus führen endoskopische Eingriffe zu weniger Bauchhaftungen und ermöglichen eine bessere Immunantwort des Empfängers im Vergleich zur offenen Chirurgie 21, 36,37. Die Anhäufung von Beweisen aus unserem Labor hat die Wirksamkeit dieses ET-Verfahrens im Kaninchenmodell nachgewiesen. So wurden in den letzten fünf Jahren insgesamt 3.909 Embryonen (1.335 frische und 2.574 verglaste Embryonen) durch das im vorliegenden Manuskript beschriebene Verfahren übertragen. Als Folge dieser Technik betrug die Nachwuchsrate von frischen und verglasten Transferembryonen 62,9% bzw. 42,5%, jeweils 38,39,40 ,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. Viele Studien basieren alle auf dieser Technik: Marco-Jiménez et al. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et al. 42, Viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-Juano et al. 44 , 45 , 47, Lavara et al. 46.

Praktische Empfehlungen für die Durchführung dieser Technik werden im Folgenden beschrieben. In Experimenten der Embryonenkultur ist es auch ratsam, einen neuen Katheter für den Embryotransfer zu verwenden, anstatt den Embryonen, der verwendet wird, um die Embryonen zwischen den Kulturmedien und den Manipulationsmedien zu bewegen. Das vermeidet den Transfer von Mineralöl und sorgt für einen optimalen Fluss. Während ET ist es wichtig, den Umgang mit dem Fortpflanzungstrakt zu minimieren, da eine übermäßige Manipulation des Eividukts zu Klebstoffen führen kann. Wenn der oviduct verdreht ist, verwenden Sie die Epiduralspritze, um zu versuchen, es richtig zu positionieren, nicht den Katheter, da es die Embryonen enthält und die mechanische Manipulation könnte ihren Verlust verursachen. Wenn der Katheter durch den ovidukt geht, rutscht er leicht ab. Tut er das nicht, kann der Katheter abgewichen sein. Wenn die Medien nicht in den Eiddukt fließen, bewegen Sie den Katheter leicht heraus und versuchen Sie, ihn wieder einzufügen. Fließt es noch nicht, ist der Katheter verstopft. Entfernen Sie es aus dem oviduct und lassen Sie den Inhalt in ein Gericht mit einem sauberen Medium. Dann die Embryonen in einen anderen Katheter umladen und wieder in den oviduct einlegen. Die Lieferung erfolgt in der Regel 28-30 Tage nach Morula-Transfer.

Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass das Entwicklungsstadium des Embryos bei pseudopregningangen Frauen weiter fortgeschritten sein kann als die Gebärmutterumgebung, aber nicht umgekehrt. Konkret haben Embryonen die Fähigkeit, auf die günstige Gebärmutterumgebung zu warten, aber die Gebärmutterumgebung kann nicht auf die Embryonen warten, wenn sie die Implantation 10 in der richtigen Phasehaben. Im Hinblick auf verglaste Embryonen ist es nach einer kurzfristigen Speicherung möglich, das Entwicklungsstadium des Embryos mit der entsprechend günstigen Gebärmutterumgebung zu synchronisieren. Wenn der Embryo-Spender auch der Embryo-Empfänger ist, können die schädlichen Auswirkungen des Superovulation auf das Endometrium durch die AnwendungderVervitationstechnik und die Übertragung der Embryonen in einem nachfolgenden Zyklus 48 umgangen werden. Bei Kaninchen sind verglaste Embryonen, die in Eidevidukte von Empfängern überführt werden, die dazu gebracht wurden, 60-62 h vorher zu ovulieren (Asynchie), eine hocheffiziente Technik44,49. Im Zusammenhang damit wurde vermutet, dass der oviduktale Embryoübergang während der 10-12 h die positiven Wirkungen bei der Wiederherstellung der Zellphysiologie und dem Austausch von abgestorbenen Zellen erklären und wahrscheinlich die Schäden, die im Schleimhautmantel während des Embryos entstehen, reparieren könnte. manipulation. Außerdem weisen verglaste Embryonen eine Entwicklungsverzögerung auf, da sie während der Lagerung metabolisch ausgesetzt wurden. Daher ermöglicht die Übertragung von kryoreservierten Embryonen in asynchrone Empfänger dem Embryo, seine Stoffwechselaktivität zu reaktivieren und so wird der Embryonalstadium der Entwicklung mit der Gebärmutterumgebung synchronisiert. Wenn stattdessen kryokonservierte Embryonen in synchrone Rezeptoren übertragen werden, behindert das Kreuzgespräch zwischen Mutter und Embryo den Beginn einer erfolgreichen Schwangerschaft. Im Kaninchen wurde die höchste Überlebensrate nach intraoviduktaler Übertragung der kryoreservierten Morulae49erreicht. Unsere Daten stimmen mit diesem Bericht überein, obwohl die Morula-Bühne je nach Kryokonformitätsgrad bei 70-72 h unterschiedliche Überlebensraten nach Kryokonservierung aufweist (Tabelle 2). Hier zeigten verdichtete Morulae höhere Überlebensraten bei der Geburt im Vergleich zu nicht verdichteten Morulae, was im Einklang mit früheren Berichten stand, die zeigten, dass jede Entwicklungsstufe ihren eigenen Mechanismus im Verhältnis zur Durchdringung von Cryoprotekanten hatte und Das Ausmaß der Austrocknung beim Hinzufügen der Kryokonservierungslösung50. Hinter diesen Techniken haben wir gezeigt, dass eine Kombination aus Verglasung und intraoviduktalen Embryotransfer eine erfolgreiche Strategie ist, um Kaninchenpopulationen nach 15 Jahren Lagerung in flüssigem Stickstoff wieder herzustellen, ohne dass sich dies negativ auf ihre Das Überleben nach dem Tauwetter und die Geburt51.

Die folgenden Details sollten berücksichtigt werden, um diese Technik erfolgreich durchführen zu können. Es ist wichtig zu bedenken, dass die zunehmende Dichte der aufeinanderfolgenden Medien, die zur Verglasung verwendet werden (DPBS, Gleichgewichtslösung, Verglasungslösung), aufgrund der fortschreitenden Embryonendehydrierung zu einer Embryonenkontraktion führen könnte. Sein normales Aussehen wird jedoch wiederhergestellt, wenn der Embryo mit dem Medium ausgeglichen wird. Wenn der Embryo zudem zwischen zunehmenden Dichte-Medien bewegt wird, neigt er dazu, sich aufgrund von Dichtebewegungen auf die Oberfläche der Medien zu bewegen. Um den Verlust von Embryonen zu vermeiden und die Zeit der Verglasung zu gewährleisten, empfiehlt es sich, die Verglasung in kleinen Tropfen der Medien durchzuführen, die den Embryo an Ort und Stelle halten.

Abschließend möchte ich sagen, dass wir hier sowohl eine ET-Technik als auch eine Embryonenverglasung beschreiben, die zukünftige Studien erleichtert, die Kaninchen als Modell verwenden. Aufgrund des engen phylogenetischen Abstands zwischen Kaninchen und Menschen könnte der Einsatz dieses Modells leicht auf die klinische Humanmedizin übertragbar sein. Darüber hinaus bietet unsere Methode einige hygienische und wirtschaftliche Vorteile, die dem Konzept der 3 Rs des Tierschutzes entsprechen (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung), während das Ziel beibehalten wird, die humane Behandlung von Versuchstieren zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Mittel des spanischen Ministeriums (AGL2017-85162-C2-1-R) und Generalitat Valenciana Research Programme (PrometeoII 2014/036) unterstützt. Englische Textversion, die von N. Macowan English Language Service überarbeitet wurde

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

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Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell
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Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

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