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Developmental Biology

न्यूनतम इनवेसिव भ्रूण हस्तांतरण और खरगोश मॉडल में इष्टतम भ्रूण के चरण में भ्रूण काचन

Published: May 16, 2019 doi: 10.3791/58055
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

Summary

सहायक प्रजनन तकनीकों (आर्ट्स) परिणामों में सुधार और संबद्ध जोखिमों को कम करने के लिए लगातार मूल्यांकन में हैं । इस पांडुलिपि एक ंयूनतम इनवेसिव भ्रूण स्थानांतरण प्रक्रिया एक कुशल cryopreservation प्रोटोकॉल है कि मानव प्रजनन के एक आदर्श पशु मॉडल के रूप में खरगोशों के उपयोग की अनुमति देता है के साथ वर्णन करता है ।

Abstract

असिस्टेड प्रजनन तकनीक (आर्ट्स), जैसे कि इन विट्रो भ्रूण संस्कृति या भ्रूण cryopreservation, प्रसवकालीन और प्रसवोत्तर परिणामों के साथ प्राकृतिक विकास पैटर्न को प्रभावित करती है । कला अनुप्रयोगों के अहानिकर सुनिश्चित करने के लिए, पशु मॉडल में अध्ययन आवश्यक हैं । इसके अलावा, एक अंतिम कदम के रूप में, भ्रूण विकास अध्ययन उनकी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए पूर्ण अवधि के स्वस्थ वंश का विकास करने की आवश्यकता है । यहां किसी भी कला संबंधी प्रयोग को करने के लिए गर्भाशय में भ्रूण का स्थानांतरण अपरिहार्य है ।

खरगोश एक सदी से अधिक के लिए स्तनधारी प्रजनन अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है । मानव प्रजातियों और इसके छोटे आकार और कम रखरखाव लागत के लिए अपने जातिवृत् तीय निकटता के अलावा, यह प्रेरित ovulation के रूप में महत्वपूर्ण प्रजनन विशेषताओं, प्रारंभिक भ्रूण के विकास के एक कालक्रम मनुष्यों के समान है और एक छोटी गर्भावधि है कि हमें कला आवेदन के परिणामों को आसानी से अध्ययन करने की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, कला (जैसे कम शुक्राणु इंजेक्शन, भ्रूण संस्कृति, या cryopreservation) के रूप में इस प्रजाति में उपयुक्त दक्षता के साथ लागू कर रहे हैं ।

इस अनुच्छेद में प्रस्तुत लेप्रोस्कोपिक भ्रूण स्थानांतरण तकनीक और cryopreservation प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम वर्णन 1) कैसे एक आसान, ंयूनतम इनवेसिव तकनीक के माध्यम से भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए और 2) एक प्रभावी दीर्घकालिक भंडारण के लिए प्रोटोकॉल खरगोश की भ्रूण को समय लचीला साजो क्षमताओं और नमूना परिवहन करने की क्षमता प्रदान करने के लिए । विभिंन विकासात्मक चरणों में खरगोश के भ्रूण के स्थानांतरण के बाद प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि मोरूला खरगोश भ्रूण वसूली और हस्तांतरण के लिए आदर्श चरण है । इस प्रकार, एक अंडवाहिनी भ्रूण हस्तांतरण की आवश्यकता है, शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को उचित ठहराते । इसके अलावा, खरगोश morulae सफलतापूर्वक काचित और laparoscopically स्थानांतरित कर रहे हैं, वर्णित तकनीकों की प्रभावशीलता साबित ।

Introduction

मानव बांझपन को दरकिनार या उच्च आनुवंशिक मूल्य के पशुधन के प्रसार में सुधार लाने और पशु आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण के उद्देश्य के साथ, तकनीकों का एक सेट सामूहिक रूप से सहायता प्रदान की प्रजनन प्रौद्योगिकियों, जैसे superovulation, में कहा विट्रो निषेचन, भ्रूण संस्कृति, या cryopreservation,1,2विकसित किए गए । वर्तमान में, हार्मोनल उपचार अंडाशय को उत्तेजित करने के लिए दिया जाता है और कोटरीय डिम्बग्रंथि के रोम की एक बड़ी संख्या का उत्पादन1। इन रोम से एकत्र oocytes परिपक्व हो सकता है, निषेचित, और विट्रो में विकसित जब तक वे या तो cryopreserved या सरोगेट माताओं3को हस्तांतरित कर रहे हैं । हालांकि, इन उपचारों के दौरान युग्मकों और युग्मज गैर-शरीरक्रियात्मक प्रक्रियाओं की एक शृंखला के संपर्क में आ जाते हैं जिससे इन स्थितियों में जीवित रहने के लिए भ्रूण अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है4,5. इस अनुकूलन जल्दी भ्रूण plasticity है, जो जीन अभिव्यक्ति और विकासात्मक प्रोग्रामिंग6में भ्रूण परिवर्तन की अनुमति देता है के कारण संभव है । हालांकि, इन संशोधनों वयस्कता जब तक भ्रूण के विकास के बाद के चरणों को प्रभावित कर सकते हैं, और अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि तरीकों, समय, cryopreservation प्रक्रिया या संस्कृति की स्थिति भ्रूण7 भाग्य पर विभिंन परिणाम दिखाने , 8. इसलिए, कला के विशिष्ट प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, अच्छी तरह से विशेषता पशु मॉडल का उपयोग अपरिहार्य है ।

१८९०9में स्तनधारी भ्रूण के हस्तांतरण के परिणामस्वरूप पहले प्रलेखित जीवित जंम लिया । आज, एक किराए की महिला को भ्रूण हस्तांतरण (एट) के बाद भ्रूण विकास10चरणों पर preimplantation के दौरान कला प्रेरित प्रभाव का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कदम है । ET तकनीक प्रत्येक जानवर के आकार और संरचनात्मक संरचना पर निर्भर करते हैं । बड़े आकार के पशु मॉडलों के मामले में, यह ट्रांसर्विकल nonsurgical ET तकनीकों द्वारा एट प्रदर्शन करने के लिए संभव हो गया है, लेकिन छोटी-सी प्रजातियों में गर्भाशय ग्रीवा कैथेटेराइजेशन अधिक जटिल है और शल्य चिकित्सा तकनीकों अक्सर11इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, सर्जिकल एट खून बह रहा है कि प्रत्यारोपण और भ्रूण के विकास को ख़राब कर सकता है, के रूप में रक्त गर्भाशय लुमेन आक्रमण कर सकते हैं, भ्रूण मौत10के कारण कर सकते हैं । ट्रांसेविकल nonsurgical ET तकनीक अभी भी मनुष्यों में लागू कर रहे हैं, baboons, गोजातीय, सूअर और चूहों12,13,14,15,16,17, लेकिन सर्जिकल ईटीएस अभी भी बकरियों, भेड़ या अंय जानवरों के रूप में प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा रहा है जो अतिरिक्त कठिनाइयों वर्तमान जैसे खरगोश के रूप में10,18,19,20,21, (दो स्वतंत्र सेवाओं) या चूहों (छोटे आकार) । फिर भी, शल्य चिकित्सा हस्तांतरण के तरीकों को धीरे से कम आक्रामक तरीकों से प्रतिस्थापित किया गया है करते हैं । एंडोस्कोपी भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, खरगोशों में, सूअर और छोटे जुगाली करने वाले18,19,20। इन ंयूनतम इनवेसिव एंडोस्कोपी तरीकों के लिए किया जा सकता है भ्रूण स्थानांतरण के माध्यम से तुंबिका में infundibulum, जो खरगोशों में आवश्यक है और कुछ प्रजातियों में लाभप्रद प्रभाव का प्रदर्शन20। यह अंडवाहिनी में आरंभिक भ्रूण की अवस्था के दौरान भ्रूण और माता के बीच सही संवाद के महत्व पर आधारित है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, भ्रूण remodeling है कि खरगोशों में अंडवाहिनी के माध्यम से भ्रूण प्रवास के दौरान जगह लेता है22,23प्रत्यारोपण करने में सक्षम भ्रूण को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

ऐसे गोजातीय के रूप में बड़े आकार के पशु मॉडल, दिलचस्प है क्योंकि जैव रासायनिक और preimplantation सुविधाओं के मानव प्रजातियों में उन लोगों के समान है24। हालांकि, बड़े जानवर भी प्रारंभिक परीक्षणों में उपयोग करने के लिए महंगा कर रहे हैं, और कृंतकों एक आदर्श मॉडल माना जाता है (७६% मॉडल जीवों कृंतकों हैं) प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए25. फिर भी, खरगोश मॉडल प्रजनन अध्ययन में कृंतकों पर कुछ लाभ प्रदान करता है, के रूप में कुछ प्रजनन जैविक मानव द्वारा प्रदर्शित प्रक्रियाओं चूहों में उन लोगों की तुलना में खरगोश में अधिक समान हैं । मानव और खरगोश एक समान कालानुक्रमिक भ्रूणीय जीनोम सक्रियण, कंदुकन और hemochorial अपरा संरचना प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, खरगोशों का उपयोग करना यह उनके प्रेरित ovulation25के कारण निषेचन और गर्भावस्था के चरणों के सही समय पता करने के लिए संभव है । खरगोश जीवन चक्र कम कर रहे हैं, 31 दिनों में गर्भावधि को पूरा करने और के बारे में 4-5 महीने में यौवन तक पहुँचने; पशु अपने विनंर और गैर आक्रामक व्यवहार के कारण संभाल करने के लिए आसान है, और उसके रखरखाव बड़ा जानवरों की कीमत की तुलना में बहुत किफायती है । इसके अलावा, यह उल्लेख है कि खरगोशों दो स्वतंत्र cervixes11,25के साथ एक डुप्लेक्स गर्भाशय है महत्वपूर्ण है । यह एक तरजीही स्थिति में खरगोश स्थानों, विभिंन प्रयोगात्मक समूहों से भ्रूण के रूप में एक ही जानवर में स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन एक अलग गर्भाशय सींग में । यह हमें दोनों प्रयोगात्मक प्रभाव की तुलना करने की अनुमति देता है, परिणाम से मातृ कारक को कम करने.

आज, nonsurgical ET तरीकों खरगोश में उपयोग में नहीं हैं । कुछ अध्ययनों से देर से 90 के दशक में बाहर किया एक ट्रांसेवियरल की तकनीक का उपयोग कर कम प्रसव ५.५% से २०.०%11,26 बनाम 50-65% के लिए शल्य चिकित्सा पद्धतियों द्वारा की दर के परिणामस्वरूप, उन के बीच में लेप्रोस्कोपी प्रक्रिया द्वारा वर्णित Besenfelder और Brem18। खरगोशों में इन nonsurgical ET तरीकों की कम सफलता दरों अंडवाहिनी में आवश्यक भ्रूण remodeling की कमी के साथ मेल खाती है, जो ट्रांसेविएट में बचा है । यहाँ, हम एक आदर्श जीव के रूप में खरगोशों का उपयोग कर एक प्रभावी ंयूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक प्रक्रिया का वर्णन । इस तकनीक के बड़े जानवरों और मनुष्यों में आगे प्रजनन अनुसंधान के लिए एक मॉडल प्रदान करता है ।

क्योंकि खरगोश भ्रूण रोपण के लिए एक विशेष रूप से संकीर्ण समय खिड़की है, इस प्रजाति में एट एट में भ्रूण के विकास के चरण और प्राप्तकर्ता27के शारीरिक स्थिति के बीच synchrony के एक उच्च डिग्री की आवश्यकता है । कुछ मामलों में, एक प्रजनन उपचार है कि भ्रूण के विकास को धीमा कर देती है (जैसे कि विट्रो संस्कृति में ) या एंडोमेट्रियल ग्रहणशीलता (जैसे superovulation उपचार के रूप में) बदल, भ्रूण और मातृ गर्भाशय के बीच कोई synchrony है । इन स्थितियों नकारात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । इन संदर्भों में प्रतिक्रिया करने के लिए, हम एक प्रभावी खरगोश मोरेला काचन प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हमें थामने के लिए, संगठित करने और प्रयोगों को फिर से शुरू करने की अनुमति देता है । इस प्रक्रिया को प्रजनन अध्ययन के लिए logistically वांछनीय है और हमें भ्रूण के दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्षमता देता है, उनके परिवहन की अनुमति । लेप्रोस्कोपिक प्रक्रिया और cryopreservation रणनीतियों कम जानवरों के साथ अध्ययन की बेहतर योजना की अनुमति देते हैं । इस प्रकार, हमारी कार्यप्रणाली स्वास्थ्यकर और आर्थिक लाभ प्रदान करती है और प्रायोगिक पशुओं के मानव उपचार में सुधार के कथित लक्ष्य के साथ पशु अनुसंधान के 3Rs (प्रतिस्थापन, कमी और परिष्करण) की अवधारणा के अनुरूप है । इस प्रकार, इन तरीकों के साथ, खरगोश के लिए एक आदर्श मॉडल जीव का गठन vivo में प्रजनन assays हैं ।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ EEC पशु प्रयोगों के लिए और समीक्षा की और विश्वविद्यालय के जानवरों के साथ प्रयोग के लिए नैतिक समिति द्वारा मंजूरी दे दी Politècnica de València, स्पेन (रिसर्च कोड: 2015/VSC/मटर/00170) । XGD, FMJ, एमपीवीसी और JSV एक प्राधिकरण के जानवरों पर प्रयोग करने के लिए Valencian सरकारी प्रशासन द्वारा जारी प्रमाण पत्र रखती है । XGD स्वस्थानी में प्रयोग के दौरान पशुओं के कल्याण और देखभाल की निगरानी के लिए अधिकृत है ।

1. भ्रूण अंतरण

  1. प्राप्तकर्ता महिलाओं की तैयारी
    1. केवल यौन परिपक्व महिलाओं (> ४.५ महीने की उंर) का उपयोग करें ।
    2. एट से एक सप्ताह पहले, एक 16 एच प्रकाश को महिलाओं के अनुकूल/(8 एच अंधेरे शासन कूपिक विकास और बढ़ाया महिला ग्रहणशीलता शुरू करने के लिए ।
    3. का चयन करें प्राप्तकर्ता महिलाओं, योनी के रंग और turgidity देख । यदि योनी फूला हुआ और लाल है, मादा ग्रहणशील है ।
    4. शरीर के वजन की परवाह किए बिना (गोनॉडोट्रॉफिन-रिलीजिंग हार्मोन के सिंथेटिक अनुरूप) buserelin एसीटेट के 1 माइक्रोग्राम का एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा स्यूडोरेगनैन्सी (ovulation) के लिए प्रेरित ।
      नोट: आम तौर पर, ०.८ माइक्रोग्राम मध्यम आकार के खरगोश (4-5 किलो) में ovulation प्रेरण के लिए एक उपयुक्त खुराक है, इसलिए 1 माइक्रोग्राम आम तौर पर ovulation की गारंटी देता है ।
    5. Ovulation के रूप में कई दिनों के रूप में पहले से भ्रूण की आयु स्थानांतरित करने के लिए प्रेरित (उदाहरण के लिए, ताजा तूतक एट से पहले 70-72 h) ।
  2. संज्ञाहरण और पीड़ाहारी
    1. खरगोश वजन और निंनलिखित निश्चेतक और दर्दनाशक दवाओं लोड ।
      1. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में एक 30g सुई के साथ: लोड xylazine (5mg/kg) और बुप्रेनोरफिन हाइड्रोक्लोराइड (०.०३ मिलीग्राम/किग्रा) । एक और 1 मिलीलीटर सिरिंज में एक 23g परिकपाल सुई के साथ, लोड केटामाइन hydrochloride (३५ मिलीग्राम/किलो) ।
    2. खरगोश को पकड़ कर जाइलैज़िन-ब्यूप्रेनोरफिन मिश्रण को अंदर इंजेक्ट कर लें ।
    3. सीमांत कान की नस में केटामाइन के साथ pericranial सुई डालें, धीरे से सभी सिरिंज सामग्री नसों के द्वारा शुरू.
    4. सुई को ठीक करने और इसे और अधिक संज्ञाहरण यदि आवश्यक हो तो प्रशासन के लिए शेष कदम भर में डाला छोड़ दें ।
    5. पिंजरे में खरगोश (साफ और किसी भी अन्य जानवरों के बिना) एक गर्म मंच पर छोड़ दें ।
    6. एक बार बेहोश, आंख का सूखापन से बचने और नेत्रच्छद freflex की अनुपस्थिति के लिए जांच करने के लिए आंख मरहम लागू होते हैं ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए एक शल्य संज्ञाहरण विमान प्रदान करता है । एक लंबे समय की आवश्यकता है, तो 30 मिनट के बाद 1.2.1 में वर्णित केटामाइन hydrochloride की राशि का आधा के साथ अतिरिक्त dosages सुई ।
    7. पेडल पलटा और श्वास आंदोलन की जाँच करके संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी । एक अनियमित और तेज दर के लिए श्वास पैटर्न में परिवर्तन संज्ञाहरण के उचित विमान की हानि का संकेत ।
    8. श्लेष्मा झिल्ली के रंग की निगरानी (आंख, होंठ, आदि), श्वसन दर (प्रति मिनट 30-60 साँस), हृदय की दर (प्रति मिनट 120-325 धड़कता है) और मलाशय के तापमान (38-39.6 डिग्री सेल्सियस).
    9. स्थानांतरण से पहले आठ घंटे, पशुओं से भोजन रोक के लिए अधिक से अधिक आंत आकार और गतिविधि से बचने के लिए एट की प्रक्रिया समाप्त हो गया है जब तक । पानी के लिए नि: शुल्क पहुंच छोड़ दें ।
  3. भ्रूण तैयारी
    1. भ्रूण के हेरफेर मीडिया को 25 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें: आधार माध्यम (बीएम), जिसमें डुलबेस्को फॉस्फेट-बफर नमकीन (डीपीबी) शामिल है, जो बोवाइन सीरम एल्ब्युमिन के ०.२% (डब्ल्यू/वी) से पूरित है ।
    2. एक stereomसूक्ष्मदर्शी के तहत कार्य करना, कुल्ला ताजा या thawed (चरण 2) बीएम के साथ भ्रूण ।
    3. बाँझ दस्ताने का उपयोग करते हुए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक उचित विन्यस्त 17G एपीड्यूरल कैथेटर देते हैं ।
    4. Aspirate कैथेटर में बीएम के 1 सेमी, एक छोटे से हवा बुलबुला द्वारा पीछा किया ।
    5. 5-7embryos बीएम के 10 μL की मात्रा में, एक और छोटे हवा बुलबुला द्वारा पीछा किया ।
    6. बीएम के 1 सेमी aspirating द्वारा कैथेटर लोड हो रहा है खत्म ।
  4. भ्रूण अंतरण
    1. एक अपूतित वातावरण सुनिश्चित करने के लिए बाँझ दस्ताने, गाउन और मुखौटा के उपयोग पर विचार करें ।
    2. शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित, सतहों जहां सर्जरी प्रदर्शन किया जाएगा साफ है, और ७०% इथेनॉल के साथ उंहें पोंछ ।
    3. पहले से विस्तृत (कदम १.२) के रूप में संज्ञाहरण प्रदर्शन, सजगता के नुकसान के लिए जाँच.
    4. एक इलेक्ट्रिक रेज़र के साथ अधर पेट से फर दाढ़ी ।
    5. अधर उदर को अज्ञानतः तैयार कीजिए ।
      1. सर्जिकल एरिया को साफ करें और बचे हुए बालों को भी हटा दें । सर्जिकल क्षेत्र को क्लोरोहेक्शिडीन ग्लूकोनेट साबुन से धोएं । Chlorhexidine समाधान और इथेनॉल ९६ º (3 बार) के साथ क्षेत्र sanitize ।
    6. एक गर्म सर्जिकल मेज पर जानवर प्लेस, Trendelenburg की स्थिति में (४५ ° पर नीचे सिर) सुनिश्चित करने के लिए कि पेट और आंतों cranially स्थित हैं । मूत्राशय की निकासी पर विचार अगर यह turgid है । यदि इस प्रक्रिया में कोई आंत क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो पशु मर सकता है । इसलिए उंहें ठीक से स्थित करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्रा 1) ।
    7. एक बाँझ तौलिया का उपयोग कर क्षेत्र को कवर, एक छेद (fenestration) के साथ मुंडा क्षेत्र को उजागर, किसी भी संभावित दूषित क्षेत्रों से शल्य साइट को अलग करने के लिए ।
    8. एक इंडोस्कोपिक trocar 5 सेमी उदर गुहा में डालें, 2 सेमी असिरूप प्रक्रिया करने के लिए पुच्छ, और यह के माध्यम से एक दबाव को विनियमित यांत्रिक असह्य के साथ पेरिटोनियल गुहा ।
      नोट: इंट्रापेट दबाव 8-12 mmHg CO2 के साथ होना चाहिए (चित्र 1a) ।
    9. इंडोस्कोपिक ट्रोकार के माध्यम से एंडोस्कोप कैमरा डालें (चित्र 1b) ।
      नोट: प्रजनन पथ की पहचान, अगले कदम की सुविधा के लिए एट पहले कीप और तुंबिका की स्थिति और स्थिति का निर्धारण ।
    10. 17-जी एपीड्यूरल सुई को 2-3 सेंटीमीटर के बीच के वंक्षण क्षेत्र में डालें (चित्र 1बी) ।
    11. अफनडिबुलम के द्वार को पहचानें (चित्र 2a, 2b) ।
    12. लोड कैथेटर (कदम १.३) एपीड्यूरल सुई के माध्यम से पेट में डालें (चित्रा 1 सी).
    13. अंडवाहिनी का पता लगाने और तुंबिका में कीप के माध्यम से एपीड्यूरल कैथेटर के 1-2 सेमी सम्मिलित करें (चित्रा 2a-2c) । नुकसान और नकसीर को रोकने के लिए अंडवाहिनी में बहुत दूर तक प्रगति न करें ।
    14. अंडवाहिनी में भ्रूण को धीरे से कैथेटर के साथ युग्मित सिरिंज के प्लंजर को दबाकर छोड़ें (चित्र 2d-2f) । दोनों हवा बुलबुले कैथेटर से बाहर निकलना चाहिए ।
    15. भ्रूणों को छोड़े जाने के ठीक बाद कैथेटर को हटा दें ।
    16. कैथेटर कुल्ला, और भ्रूण के अभाव की जांच करने के माध्यम से छेड़खानी मध्यम जारी करने और उनके सफल हस्तांतरण की पुष्टि करें ।
    17. दोहराएं कदम 1.4.11 गर्भाशय के दूसरे पक्ष में 1.4.16, अगर वांछित ।
    18. एपीड्यूरल की सुई और एंडोस्कोप कैमरे को हटा दें ।
    19. एंडोस्कोपिक ट्रोकार के माध्यम से सीओ2 छोड़ें । अगर जानवर के पेट में अतिरिक्त गैस रहती है तो उसे दर्द और बेचैनी होगी ।
    20. एंडोस्कोपिक ट्रोकार को उदर गुहा से हटा दें । सर्जिकल तौलिया निकाल लें ।
    21. संज्ञाहरण बंद करो ।
    22. Chlorhexidine समाधान के साथ trocar द्वारा किए गए चीरा साफ । एक माइक्रो एल्यूमीनियम और एक प्लास्टिक ड्रेसिंग के साथ trocar द्वारा किए गए चीरा बंद करो ।
  5. पश्चात की देखभाल
    1. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ जानवरों का इलाज: 10 मिलीग्राम/एनरोफ्लोक्सासिन, subcuके रूप में, हर 24-एच 5 दिनों के लिए ।
    2. प्रशासन दर्दनाशक दवाओं: बुप्रेनोरफिन हाइड्रोक्लोराइड (०.०३ मिलीग्राम/किलो), इंट्रामस्क्युलर, प्रत्येक 12 घंटे के लिए 3 दिनों के लिए; Meloxicam (०.२ मिलीग्राम/किलो), subcuto, प्रत्येक 24-h 3 दिनों के लिए ।
    3. (पशु और संज्ञाहरण का इस्तेमाल की खुराक पर निर्भर करता है) सुनिश्चित करें कि वे अपनी शारीरिक स्थितियों को ठीक करने के बाद कम से कम 30 मिनट के लिए जानवरों की निगरानी ।
    4. प्राप्तकर्ता (जैसे, कान टैटू) और घर जानवरों के उपयुक्त पर्यावरण की स्थिति के साथ एक साफ पिंजरे में व्यक्तिगत रूप से पहचानें ।

Figure 1
चित्रा 1 लेप्रोस्कोपी (बाहरी दृश्य) द्वारा सहायता लेप्रोस्कोपिक भ्रूण हस्तांतरण. क) इंडोस्कोपिक ट्रोकार (एक बंदरगाह) की प्रविष्टि । B) इंडोस्कोपिक कैमरा और एपीड्यूरल सुई (काला तीर) की प्रविष्टि । C) एपिड्यूरल सुई के माध्यम से भ्रूण हस्तांतरण कैथेटर (सफेद तीर) की प्रविष्टि । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 लेप्रोस्कोपी द्वारा सहायता लेप्रोस्कोपिक भ्रूण हस्तांतरण (आंतरिक दृश्य). A: उदर क्षेत्र में एपीड्यूरल सुई के माध्यम से कैथेटर की प्रविष्टि. तारक अण् डाणु को इंगित करता है B, C, D: भ्रूणों से भरी हुई कैथेटर को अफनडिबुलम में एम्पुला क्षेत्र में डाला जाता है । E, F: भ्रूण की रिहाई, एक सूजन अंडवाहिनी के दृश्य द्वारा पुष्टि की । इस आंकड़े मार्को-Jiménez एट अल से अनुकूलित किया गया है । ३८. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

2. भ्रूण Vitrification और वार्मिंग

  1. गर्म तापमान पर काचन समाधान विषाक्तता को कम करने के लिए कमरे के तापमान (लगभग 22 डिग्री सेल्सियस) पर सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: भ्रूण इस प्रोटोकॉल में 0.1-2 μl स्वचालित पिपेट का उपयोग कर ले जाया जा सकता है, लेकिन इसी तरह के अंय उपकरणों के लिए ंयूनतम मात्रा खींचने भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
  2. एक दो कदम अतिरिक्त प्रक्रिया में भ्रूण को काटोरिफाई:
    1. भ्रूण को 10% (v/v) एथिलीन ग्लाइकॉल और 10% (v/v) डाइमेथिल सल्फॉक्साइड के बीएम में घुले हुए समलिब्रेटिंग सॉल्यूशन में 2 मिनट के लिए रखें ।
    2. भ्रूणों (चरण 2.2.1 से) 1 मिनट के लिए 20% (v/5) एथिलीन ग्लाइकोल और 20% (v/
  3. एक १२५ μL प्लास्टिक ministraw में भ्रूण लोड (जो एक कपास प्लग और एक खुले चरम के साथ एक बंद अंत होता है) । प्रक्रिया आरेख 3में योजनाबद्ध है ।
    1. जोड़ी उपयुक्त microडिस्पेंसर (उदा Captroll III®) के साथ ०.१२५ μL ministraw के बंद अंत ।
    2. 1/3 जब तक भूसे की लंबाई के, एक छोटे से हवा के बुलबुले के बाद से महाप्राण BM ।
    3. एक और छोटे हवा बुलबुला द्वारा पीछा किया, काचन समाधान के ४० μl की मात्रा में भ्रूण महाप्राण ।
    4. महाप्राण बीएम पहले तरल अंश तक (चरण 2.3.2) कपास तक पहुँचता है.
    5. एक स्ट्रॉ प्लग के साथ खुला अंत बंद करें ।
  4. चरण 2.2.2 जबकि कदम २.३ करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई अधिक से अधिक एक मिनट बीतने, जो भ्रूण के लिए विषाक्त होगा किया जा रहा है ।
  5. Vitrification प्राप्त करने के लिए सीधे ministraw तरल नाइट्रोजन में डुबकी ।
  6. वांछित समय के लिए नाइट्रोजन के लिए एक देवर में ministraw स्टोर ।
  7. भ्रूण को एक ही चरण में पिघलना ।
    1. 20-30 एस के लिए तरल नाइट्रोजन वाष्प से टहल क्षैतिज 10 सेमी रखें ।
    2. जब क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया ministraw के अंदर शुरू होता है, 25 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 एस के लिए एक पानी के स्नान में ministraw विसर्जित कर ।
    3. Ministraw प्लग निकालें और कपास प्लग में कटौती ।
    4. एक युग्मित microडिस्पेंसर के साथ, एक 5 मिनट के लिए बीएम में 25 डिग्री सेल्सियस पर ०.३३ एम सुक्रोज समाधान युक्त थाली में सभी ministraw सामग्री निष्कासित ।
      नोट: यह कदम तेजी से किया जाना चाहिए ताकि काचन समाधान के लिए भ्रूण जोखिम को कम करने के लिए ।
    5. एक और 5 मिनट के लिए बीएम समाधान युक्त एक नई थाली करने के लिए भ्रूण ले जाएँ ।
    6. केवल गैर क्षतिग्रस्त भ्रूण (बरकरार श्लेष्मरस कोट और zona pellucida के साथ) एट के साथ जारी रखने पर विचार करें ।
      नोट: खाते में ले कि thawed भ्रूण में, अतुल्यकालिक स्थानांतरण (जैसे, 60-62 एच तूतक स्थानांतरण में) भ्रूण और मातृ एंडोमैट्रियम के बीच एक पुनः तुल्यकालन की अनुमति देकर परिणाम में सुधार हो सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3: सही ढंग से भरी हुई पुआल की Schematization. क) बीएम का अर्थ है विकरण के दौरान नियोजित भ्रूण से छेड़छाड़ करने वाला मीडिया । भ्रूण को विट्रीफिकेशन सॉल्यूशन में लोड किया जाना चाहिए । ( ख) भारित स्ट्रॉ के स्थूल रूप में भ्रूण की स्थिति के विस्तृत विस्तार के साथ । यह बड़ी मात्रा में डिवाइस हमें भ्रूण की बड़ी संख्या को vitrify करने के लिए, ंयूनतम मात्रा उपकरणों के विपरीत की अनुमति देता है । इसके अलावा, इस उपकरण की हैंडलिंग ंयूनतम मात्रा उपकरणों के साथ तुलना में आसान है, जबकि परिणाम खरगोशों४१में समान हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

ताजा या विट्रिफाइड भ्रूण की ंयूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक स्थानांतरण प्रजनन अध्ययन के लिए सबसे अच्छा मॉडल जानवरों के बीच खरगोश स्थानों । सारणी 1 में विभिन्न विकासात्मक अवस्थाओं में नए एट के परिणामों को दर्शाया गया है (चित्र 4) अंतरित भ्रूणों का । जंम के समय जीवित रहने की दर (एक pup में जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण का प्रतिशत) इस अखबार में वर्णित लेप्रोस्कोपिक तकनीक की प्रभावकारिता साबित कर दिया । उच्च मूल्यों को प्राप्त किया गया जब एट तूतक चरण में भ्रूण के साथ प्रदर्शन किया गया था, या तो जल्दी या कॉंपैक्ट morulae । इन परिणामों के आधार पर, हम एक दूसरे प्रयोग करने के लिए इन भ्रूण के काचन के बाद जीवित रहने की दर का प्रदर्शन किया । इस प्रकार, तालिका 2 में हम एक ही समय में बरामद काचित खरगोश morulae स्थानांतरित करने के बाद प्राप्त परिणामों को दिखाने के लिए, उन भ्रूण है कि संहनन की एक अच्छी डिग्री या नहीं तक पहुंच गया था के बीच फर्क । जन्म के समय जीवित रहने की दर विभिन्न भ्रूण अवस्थाओं के बीच अलग थी, जो सघन मोरूआ में उच्च होती है. इसलिए, लेप्रोस्कोपिक भ्रूण हस्तांतरण खरगोशों में ताजा और विट्रिफाइड भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है

Figure 4
चित्रा 4: खरगोश भ्रूणों । क) प्राक्केंद्रक ख) आठ कोशिकाओं । ग) जल्दी मोरूला । घ) कॉंपैक्ट morula । E) ब्लासिसिस्ट । तारांकन चिह्न दो pronuclei इंगित करता है । काले तीर zona pellucida संकेत मिलता है । सफेद तीर श्लेष्मरस कोट, जो आम तौर पर भ्रूण के बीच बदलता है संकेत मिलता है । ICM: इनर सेल जन. ते: Trophectoderm । स्केल बार: ५० μm. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

विकासात्मक चरण1 भ्रूण प्राप्तकर्ताओं अंतरण स्थान गर्भावस्था दर (%) इम्प्लांटेशन दर (%) जंम के समय जीवित रहने की दर (%)2
प्राक्केंद्रक ७८ 7 Oviduct 7 (१००) ५० (६४.०)b ३४ (४३.६)b
8 कोशिकाओं ८१ 7 Oviduct 7 (१००) ६० (७४.१)b ५३ (६५.४)एक
प्रारंभिक मोरूला ८१ 7 Oviduct 7 (१००) ८० (९८.८)एक ६० (७४.१)एक
संहत मोरूला ८० 7 Oviduct 7 (१००) ८० (१००)एक ५८ (७२.५)एक
ब्लास्टोसिस्ट ८० 7 गर्भाशय 7 (१००) ७३ (९१.३)एक ३८ (४७.५)b

तालिका 1. लेप्रोस्कोपी द्वारा ताजा खरगोश भ्रूण स्थानांतरण (vivo में व्युत्पंन में ) की दक्षता । 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 कोशिकाओं), 60-62 एच (जल्दी morula), 70-72 एच (कॉंपैक्ट morula) और 80-82 एच (ब्लायोसिस्ट) में संभोग के बाद 1अलग भ्रूण बरामद किए गए । कॉंपैक्ट (> 32 कोशिकाओं) और गैर कॉंपैक्ट morulae (≈ ३२ कोशिकाओं) 70-72 एच में स्थापित किया जा सकता है, लेकिन केवल कॉंपैक्ट morulae स्थानांतरित किया गया । 2 । प्राप्तकर्ता गर्भवती से जंम के समय जीवित रहने की दर । ए, बी विभिंन सुपरस्क्रिप्ट्स के साथ मान सांख्यिकीय रूप से भिंन (P < 0.001) हैं ।

विकासात्मक अवस्था अंतरित भ्रूणों प्राप्तकर्ताओं गर्भावस्था दर (%) जंम के समय जीवित रहने की दर (%)1
असंघनित १३५ 10 9 (९०) ६२ (४५.९)b
जमा १५० 10 10 (१००.०) ९८ (६५.३)एक
कुल २८५ 20 19 (९५) १६० (५६.१)

तालिका 2 । गैर-compacted की व्यवहार्यता बनाम कॉंपैक्ट विट्रिफाइड मोरूला । a, bमान भिंन सुपरस्क्रिप्ट्स के साथ सांख्यिकीय रूप से भिंन (P < 0001) हैं । 1 । प्राप्तकर्ता गर्भवती से जंम के समय जीवित रहने की दर । भ्रूण एक ही समय (70-72 एच) में बरामद किया गया और कॉंपैक्ट (> 32 कोशिकाओं) और गैर कॉंपैक्ट morulae (≈ ३२ कोशिकाओं) में प्रतिष्ठित थे ।

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Discussion

हस्तांतरित भ्रूण9से पहले प्रलेखित जीवित जंम के मामले के बाद से, इस तकनीक और खरगोश प्रजातियों प्रजनन अध्ययन में महत्वपूर्ण बन गए हैं । इसके अलावा, हेरफेर, उत्पादन, cryopreservation, आदि शामिल भ्रूण अनुसंधान अध्ययनों के लिए एक अंतिम चरण भ्रूण क्षमता के मूल्यांकन के रूप में स्वस्थ पूर्ण अवधि के वंश पैदा करने के लिए की आवश्यकता है । इसलिए, भ्रूण हस्तांतरण तकनीक अपरिहार्य13,28है । पिछले कुछ वर्षों में, शल्य चिकित्सा तरीकों को शुरू में मातृ गर्भाशय में भ्रूण हस्तांतरण के लिए नियोजित धीरे प्रजाति के विशाल बहुमत में कम आक्रामक तरीकों द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है13,14,15, 21 , 27 , 29 , 30. हालांकि, खरगोशों में, विकास के प्रारंभिक भ्रूण चरणों में intraoviductal एट और इन विट्रो उत्पादित भ्रूण प्राकृतिक परिस्थितियों के लिए एक समान परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अपरिहार्य हो जाता है । खरगोशों में, इंट्राअंडवाहिनी म्यूसीन कोट भ्रूण प्रत्यारोपण की अनुमति देने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि यह गर्भाशय के सींग में ब्लाकसिस्ट विस्तार के दौरान भ्रूणीय कोटिंग्स के रीमॉडलिंग के बाद होती है । तथापि, ovulation के बाद 3 दिनों के लिए श्लेष्मरस कोट जमाव अंडवाहिनी तक सीमित है, और कोट सामग्री जमाव के आणविक तंत्र काफी हद तक अनजान हैं31। इन कारणों के लिए, यह ज्ञात है कि इन विट्रो मेंविकसित ब्लाकोसाइस्ट्स जीवित नहीं था जब गर्भाशय३२,३३,३४, और एक क्षतिग्रस्त श्लेष्मरस कोट के साथ भ्रूण एक कम जीवित रहने की दर है करने के लिए स्थानांतरित कर दिया ३५. इसी तरह, समूहों है कि खरगोशों में एक ट्रांसेविवल भ्रूण हस्तांतरण की रिपोर्ट बहुत कम जीवित पैदा11,26दरों में हुई । यहां, हम एक ंयूनतम इनवेसिव तकनीक, Besenfelder और Brem18से अनुकूलित वर्तमान, सफल जंम दर के साथ भ्रूण हस्तांतरण । तालिका 1में परिणाम के अनुसार, खरगोश भ्रूणों में तूतक चरण जंम के समय एक उच्च जीवित रहने की दर को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा भ्रूणीय चरण था । एक संभव विवरण प्रारंभिक चरणों में हेरफेर करने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता है । गौरतलब है कि भ्रूणीय अवस्था के बढ़ने पर सफलता की दर बढ़ जाती है, संभवतः भ्रूण के अधिक जोखिम के कारण इसकी रिकवरी से पहले अंडवाहिनी स्राव हो जाता है । लेकिन जब भ्रूण ब्लाकसिस्ट अवस्था में पहुँच जाते हैं और गर्भाशय में स्थानांतरित होने वाले स्थान होते हैं तो मानों में काफी कमी आ जाती है । क्या कहा गया है को छोड़कर नहीं, एक संभव विवरण हो सकता है कि भ्रूण अंडवाहिनी में स्थानांतरित संभावित क्षति को भ्रूण हेरफेर के दौरान श्लेष्मरस परत में उत्पन्न बहाल कर सकते हैं । इसलिए गर्भाशय में स्थानांतरित ब्लाकोसाइटिस्ट इस तंत्र से वंचित हो जाएंगे, जो उनकी रोपण क्षमता से समझौता कर सकता है ।

तकनीक एक बंदरगाह साधन (5 मिमी एंडोस्कोप trocar) का उपयोग कर किया जाता है, मामूली, संक्षिप्त हेरफेर के साथ । इसलिए, the5-mm एंडोस्कोप trocar चीरा बंद करने की आवश्यकता नहीं है । लेप्रोस्कोपिक तकनीक लाभ की कमी हुई पश्चात दर्द, सामान्य गतिविधि के लिए जल्दी वापसी, और कम पश्चात की जटिलताओं में शामिल हैं । इसके अलावा, इंडोस्कोपिक प्रक्रियाओं कम पेट आसंजन प्रेरित और खुली सर्जरी के साथ तुलना में प्राप्तकर्ता द्वारा एक बेहतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की अनुमति देते हैं21,३६,३७. हमारे प्रयोगशाला से सबूत जमा खरगोश मॉडल में इस एट प्रक्रिया की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है । इस प्रकार, पिछले पांच वर्षों में कुल ३,९०९ भ्रूण (१,३३५ ताजा और २,५७४ विट्रिफाइड भ्रूण) वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रिया के माध्यम से स्थानांतरित किया गया । इस तकनीक का एक परिणाम के रूप में, ताजा और विट्रिफाइड हस्तांतरण भ्रूण के वंश दरों ६२.९% और ४२.५%, क्रमशः३८,३९,४०,४१,४२, ४३ , ४४ , ४५ , ४६ , ४७. कई अध्ययनों से सभी इस तकनीक पर आधारित हैं: मार्को-Jiménez एट अल । ३८ , ३९ , ४० , ४१, vicente एट अल । ४२, viudes-De-कास्त्रो एट अल । ४३, saenz-De-juano एट अल । ४४ , ४५ , ४७, lavara एट अल । ४६।

इस तकनीक को ले जाने के लिए व्यावहारिक सिफारिशों के नीचे वर्णित हैं । भ्रूण संस्कृति प्रयोगों में, यह भी करने के लिए संस्कृति मीडिया और हेरफेर मीडिया के बीच भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल एक के बजाय भ्रूण हस्तांतरण के लिए एक नया कैथेटर का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है । यह खनिज तेल के हस्तांतरण से बचा जाता है और एक इष्टतम प्रवाह सुनिश्चित करता है । एट के दौरान यह महत्वपूर्ण है के लिए प्रजनन पथ के हैंडलिंग को कम करने, के रूप में अंडवाहिनी के अत्यधिक हेरफेर आसंजन में परिणाम हो सकता है । अंडवाहिनी मुड़ जाता है, तो यह सही ढंग से स्थिति की कोशिश करने के लिए एपीड्यूरल सिरिंज को रोजगार, कैथेटर नहीं, के रूप में यह भ्रूण और यांत्रिक हेरफेर उनके नुकसान का कारण बन सकता है. एक बार कैथेटर अंडवाहिनी के माध्यम से गुजरता है, यह आसानी से स्लाइड । यदि यह नहीं है, कैथेटर भटक सकता है । एक बार अंडवाहिनी के अंदर, यदि मीडिया प्रवाह नहीं है, कैथेटर थोड़ा बाहर ले जाएँ और पुन: सम्मिलित करने के लिए प्रयास करें । यह अभी भी प्रवाह नहीं करता है, तो कैथेटर भरा हुआ है । इसे अंडवाहिनी से निकालें और सामग्री को साफ माध्यम से एक डिश में छोड़ें । फिर, भ्रूण को दूसरे कैथेटर में फिर से लोड करें और उसे अंडवाहिनी में फिर से डालने का प्रयास करे । डिलिवरी आमतौर पर तूतक स्थानांतरण के बाद 28-30 दिन स्थानों लेता है ।

इसके अलावा, इस बात का संकेत सबूत है कि भ्रूण विकास चरण pseudopregnant महिलाओं में गर्भाशय के वातावरण से अधिक उंनत हो सकता है, लेकिन विपरीत नहीं है । विशेष रूप से, भ्रूण के लिए अनुकूल गर्भ वातावरण के लिए प्रतीक्षा करने की क्षमता है, लेकिन गर्भ पर्यावरण10इम्प्लांटेशन के लिए सही मंच पर भ्रूण के लिए इंतजार नहीं कर सकता । एक छोटी/लंबी अवधि के भंडारण के बाद, विट्रिफाइड भ्रूण के संबंध में इसी अनुकूल गर्भ वातावरण के साथ भ्रूण के विकास चरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए संभव है । इसके अलावा, यदि भ्रूण दाता भी भ्रूण प्राप्तकर्ता है, एंडोमैट्रियम पर superovulation के हानिकारक प्रभाव काचन तकनीक का उपयोग करके और भ्रूण एक बाद में चक्र४८में स्थानांतरित द्वारा नजरअंदाज किया जा सकता है । खरगोशों में, काचित भ्रूण को बीजाणुवाहिनी में अंतरित किया जाता है जो कि 60-62 ह पहले से (एतुल्यकालिक) एक अति कुशल तकनीक है४४,४९। इससे संबंधित, यह सुझाव दिया गया है कि 10-12 के दौरान अंडवाहिनी भ्रूण संक्रमण कोशिका शरीर विज्ञान और मृत कोशिकाओं के प्रतिस्थापन की बहाली में लाभकारी प्रभाव समझा सकता है, और शायद भ्रूण के दौरान श्लेष्मरस कोट में प्रेरित क्षति की मरंमत हेरफेर. इसके अलावा, विट्रिफाइड भ्रूण विकास में देरी पेश करते हैं, क्योंकि उन्हें स्टोरेज के दौरान मेटाबिटोकली निलंबित किया गया है । इसलिए, cryopreserved भ्रूण के अतुल्यकालिक प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरण भ्रूण अपनी चयापचय गतिविधि को फिर से सक्रिय करने के लिए और इस तरह के विकास के भ्रूण चरण गर्भ वातावरण के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाता है की अनुमति देता है । इसके बजाय, यदि cryopreserved भ्रूण एककालिक रिसेप्टर्स में स्थानांतरित कर रहे हैं, मां और भ्रूण के बीच पार बात एक सफल गर्भावस्था की शुरुआत hinders । खरगोश में, सबसे अधिक जीवित रहने की दर cryopreserved morulae४९के intraoviductal स्थानांतरण के बाद प्राप्त किया गया है । हमारे डेटा इस रिपोर्ट के साथ संगत कर रहे हैं, हालांकि तूतक चरण विभिंन उत्तरजीविता 70-72 एच (तालिका 2) पर संहनन की उनकी डिग्री के आधार पर दर को दर्शाती है । यहाँ, जमा morulae गैर-संकुचित morulae की तुलना में जन्म के समय उच्च उत्तरजीविता दर दिखाया, जो पिछले दिखा रहा है कि विकास के हर चरण cryoprotectants के पारगमन के सापेक्ष अपने स्वयं के तंत्र था के साथ सामंजस्य में था और cryopreservation समाधान५०के अलावा के दौरान निर्जलीकरण की हद तक। इन तकनीकों को रेखांकित करते हुए, हमने दर्शाया है कि काचन और अंतःअंडवाहिनी भ्रूण का एक संयोजन, द्रव नाइट्रोजन के 15 वर्षों के बाद खरगोश की आबादी को पुन: स्थापित करने की एक सफल कार्यनीति है, जो उनके बाद thaw के जीवन रक्षा और जीवित जन्म५१.

इस तकनीक को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए निंन विवरण को ध्यान में रखा जाना चाहिए । यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि लगातार माध्यमों के बढ़ते घनत्व (dpbs, साम्यन समाधान, काचन समाधान) काचन के लिए इस्तेमाल किया प्रगतिशील भ्रूण निर्जलीकरण के कारण भ्रूण संकुचन प्रेरित सकता है । तथापि, इसकी सामान्य उपस्थिति तब प्राप्त होती है जब भ्रूण को माध्यम से समकालिक किया जाता है । इसके अलावा, जब भ्रूण बढ़ती घनत्व मीडिया के बीच ले जाया जाता है, यह घनत्व आंदोलनों के कारण मीडिया की सतह पर स्थानांतरित करने के लिए जाता है । भ्रूण हानि से बचने और विट्रिफिकेशन का समय सुनिश्चित करने के लिए यह सिफारिश की जाती है कि मीडिया की छोटी-मोटी बूंदों में काट्रिफिकेशन किया जाए जिससे भ्रूण को जगह मिल सके ।

अंत में, यहां हम दोनों एक एट तकनीक और एक भ्रूण काचन विधि है कि भविष्य के अध्ययन जो एक मॉडल के रूप में खरगोशों का उपयोग की सुविधा का वर्णन । खरगोश और मनुष्यों के बीच करीब जातिवृत् तीय दूरी के आधार पर, इस मॉडल का उपयोग परिणाम आसानी से मानव नैदानिक चिकित्सा के लिए हस्तांतरणीय प्रदान कर सकता है । इसके अलावा, प्रायोगिक पशुओं के साथ मानवीय व्यवहार में सुधार लाने के लक्ष्य को बनाए रखते हुए, पशु कल्याण (प्रतिस्थापन, कमी और परिशोधन) के 3 रु की संकल्पना के अनुरूप हमारी विधि कुछ स्वास्थ्यकर और आर्थिक लाभ प्रदान करती है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अर्थव्यवस्था और स्पेन की प्रतिस्पर्धा (AGL2017-85162-C2-1-R) और Generalitat Valenciana अनुसंधान कार्यक्रम (PrometeoII 2014/036) के मंत्रालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था. अंग्रेजी पाठ N. Macowan अंग्रेजी भाषा सेवा द्वारा संशोधित संस्करण

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

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Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

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