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Developmental Biology

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

보조 생식 기술 (ARTs)은 결과를 개선 하 고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가를 하 고 있습니다. 이 원고는 인간 재생의 이상적인 동물 모델로 서 토끼의 사용을 허용 하는 효율적인 냉동 보존 프로토콜을 가진 최소 침 습 배아 전달 절차를 설명 합니다.

Abstract

시험관 내 배아 배양 또는 배아 동결 보존과 같은 보조 생식 기술 (ARTs)은 출산 및 출생 후의 결과와 함께 자연 개발 패턴에 영향을 미칩니다. 예술 응용 프로그램의 무해 함을 보장 하기 위해 동물 모델에 대 한 연구가 필요 합니다. 또한, 마지막 단계로, 태아 발달 연구는 완전 한 건강 한 자손을 개발 하는 그들의 능력의 평가를 요구 합니다. 여기에서 자 궁으로의 배아 전달은 예술 관련 실험을 수행 하는 데 필수적입니다.

토끼는 한 세기 이상 동안 포유류 재생을 연구 하는 모델 유기 체로 사용 되었습니다. 인간 종과 그것의 작은 크기 및 낮은 유지 관리 비용에 대 한 계통 적 근접성 외에도 유도 배 란, 인간과 유사한 초기 배아 개발의 연대기 및 짧은 임신과 같은 중요 한 생식 특성을가지고 있습니다. 그것은 우리가 쉽게 예술 응용 프로그램의 결과를 연구 할 수 있도록. 더욱이, 예술 (예를 들어, 내과 세포 정자 주사, 배아 배양 또는 동결 보존)은이 종에서 적절 한 효율로 적용 된다.

본 기사에 제시 된 복 강경 배아 전달 기술 및 동결 보존 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 1) 쉽게, 최소 침 습 적 기술 및 2) 토끼의 장기 저장을 위한 효과적인 프로토콜을 통해 배아를 전달 하는 방법을 설명 배아는 시간-유연한 물류 용량 및 샘플을 수송 할 수 있는 능력을 제공 한다. 다른 발달 단계에서 토끼 배아를 양도 한 후 얻어진 결과는 모 룰라가 토끼 배아 회복 및 전달에 이상적인 단계 임을 나타냅니다. 따라서, 외 과적 배아 전달은 수술 절차를 정당화 해야 합니다. 또한, 토끼 모 루 애는 성공적으로 유리 화 되 고 복 강경 전이 되어 기술 된 기술의 효과를 입증 합니다.

Introduction

인간 불모를 우회 하거나 높은 유전 가치를 가진 가축의 보급을 개량 하 고 동물성 유전 자원을 보전 하는의 목표를 가진, 일련의 기술의 세트는, 초 배 란과 같은 원조 재생산 기술 이라고 불렀습니다 시험관 내 시비, 배아 배양 또는 냉동 보존은1,2로 개발 되었다. 현재, 호르몬 치료는 난소를 자극 하 고 다 수의 배 승 난소 모 낭을 생성 하기 위하여 주어 집니다1. 이들 여 포 로부터 채취 된 난 모 세포는 냉동 보존 되거나 대리 모 (3)로 이송 될 때까지 시험관 내에서 성숙, 수정 및 개발 될 수 있다. 그러나, 이러한 치료법 중에,가 및 zygotes는 이러한 조건4,5에서 생존 하기 위해 배아 적응이 필요할 수 있는 일련의 비 생리 적 과정에 노출 된다. 이 적응은 유전자 발현 및 발달 프로그래밍6에서 배아 변화를 허용 하는 초기 배아가 소성으로 인해 가능 합니다. 그러나, 이러한 수정은 성인이 될 때까지 배아 발달의 후속 단계에 영향을 미칠 수 있고, 지금 널리 방법, 타이밍, 냉동 보존 절차 또는 배양 조건이 배아 운명에 다른 결과를 보여줍니다7 , 8. 따라서 예술의 특정 한 유도 효과를 밝히기 위해 잘 특성화 된 동물 모델을 사용 하는 것은 불가피 합니다.

포유동물 배아의 전사 로부터 발생 되는 최초 기록 된 살아있는 출생은 18909에서 일어났다. 오늘날, 대리 여성에 대 한 배아 이식 (ET)은 후속 배아 개발 단계10에 이식 하는 동안 당해 유발 효과를 연구 하는 중요 한 단계 이다. ET 기술은 각 동물의 크기 및 해부학 적 구조에 따라 달라 집니다. 대형 동물 모델의 경우, transcervical 비 수술 ET 기술에 의해 ET을 수행 할 수 있었지만, 자 궁 경부의 작은 크기의 카 테 터는 더 복잡 하 고 외과 기술이 자주 사용 됩니다11. 그러나 외과 ET는 혈액이 자 궁 루멘을 침범 하 여 태아 죽음10을 일으키는 원인이 되기 때문에 이식 및 배아 발달을 손상 시킬 수 있는 출혈 발생할 수 있습니다. Transcervical 비 수술 적 ET 기술은 인간, 개 코 원숭이, 소, 돼지 및 생쥐12,13,14,15,17에 여전히 적용 되지만 외과 ETs는 여전히 염소, 양 또는 기타 동물 들과 같은 종에서 사용 되 고 있으며이는 추가로 어려움을 겪고 있다10,18,19,20토끼와 같은 (2 독립 cervices) 또는 마우스 (작은 크기). 그럼에도 불구 하 고, 외과 적 전달 방법은 점차적으로 덜 침 습 적 방법으로 대체 되는 경향이 있습니다. 내 시경은 토끼, 돼지 및 작은 반추 위 제18,19,20등에서 배아를 전달 하는데 사용 되었다. 이러한 최소 침 습 내 시경 검사 법은 토끼에 필수적 이며 일부 종20에서 유익한 효과를 입증 한 infundibulum을 통해 암 울 라로 배아를 전달 하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 oviduct에 있는 초기 배아 단계 도중 태아와 어머니 사이 정확한 대화의 중요성에 근거를 두고 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 배아를 통해 이식 하는 동안 토끼에서 일어나는 배아 리 모델링은 이식22,23을 할 수 있는 배아를 달성 하는 것이 필수적 이다.

소 등의 대형 동물 모델은 생화학 적 및 이식 기능이 인간 종24와 유사 하기 때문에 흥미롭습니다. 그러나, 큰 동물은 예비 실험에서 사용 하기에는 너무 비싸지 고, 설치류는 실험실 연구25에 대 한 이상적인 모델로 간주 됩니다 (76% 모델 생물은 설치류). 그럼에도 불구 하 고, 토끼 모델은 생식 연구에서 설치류에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다, 인간에 의해 전시 된 일부 생식 생물학 과정은 쥐 보다 토끼에서 더 유사 하다. 인간과 토끼는 유사한 연대순으로 배아 게놈 활성화, gastrulation 및 혈우병 태 반 구조를 제시 한다. 또한, 토끼를 사용 하는 것은 그들의 배 란 (25)의 유도로 인 한 풍부 하 게 함 및 임신 단계의 정확한 타이밍을 알 수 있다. 토끼 라이프 사이클은 짧고, 31 일에 임신을 완료 하 고 약 4-5 개월에 사춘기에 도달; 동물의 유 순 및 비 공격적인 행동으로 인해 취급이 용이 하 고, 그 유지는 큰 동물의 비용에 비해 매우 경제적 이다. 더욱이, 토끼는 두 개의 독립적인 서 비 세스11,25를 가진 이중 자 궁을가지고 있다는 것을 언급 하는 것이 중요 합니다. 이것은 다른 실험 군의 배아가 동일한 동물로, 그러나 다른 자 궁 경적으로 전달 될 수 있기 때문에, 특혜 위치에 토끼를 배치 합니다. 이것은 우리가 결과에서 모성 요인을 감소, 두 실험 효과를 비교할 수 있습니다.

오늘, 비 외과 ET 방법은 토끼에 사용 되지 않습니다. Transcervical ET 기술을 사용 하 여 90 년대 후반에 수행 된 일부 연구는 외과 적 방법으로 5.5% ~ 20.0%,26 ~ 50-65%에 이르는 낮은 납품 율을 초래 했으며, 그 중에서 복 강경 수술 절차 베 센 펠 더와 브 렘18. 토끼에서 이러한 비 수술 ET 방법의 낮은 성공률은 transcervical ET에서 피할 수 있는 oviduct에 필요한 배아 리 모델링의 부족과 일치 합니다. 여기서, 우리는 모델 유기 체로 서 토끼를 사용 하는 효과적인 최소 침 습 복 강경 ET 절차를 설명 한다. 이 기술은 큰 동물 및 인간에서 추가 생식 연구를 위한 모델을 제공 합니다.

토끼는 특히 배아 이식에 대 한 좁은 시간 윈도우를가지고 있기 때문에,이 종에서는 ET에서 배아의 발달 단계와 수용자 (27)의 생리 적 상태 사이에 높은 수준의 동기화가 필요 하다. 어떤 경우에는 배아 개발을 느리게 하는 생식 치료 (예: 시험관 내 문화) 또는 자궁내 막 감수 (예: 배 란 치료)를 변경 하는 경우 배아와 모계 자 궁 사이에는 동기화가 없습니다. 이러한 상황은 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 맥락에서 응답 하기 위해, 우리는 실험을 일시 중지, 구성 및 재개 할 수 있는 효과적인 토끼 모 룰라 유리 화 프로토콜을 설명 합니다. 이 과정은 재생산 연구를 위해로 서 바람직 하 고 우리에 게 그들의 수송을 허용 하는 배아의 장기 저장을 위한 능력을 줍니다. 복 강경 절차 및 냉동 보존 전략은 적은 동물 연구의 더 나은 계획을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법론은 위생 적이 고 경제적 인 이점을 제공 하 고 실험 동물의 인간 치료를 개선 한다는 명시 된 목표로 동물 연구의 3Rs (교체, 감소 및 정제)의 개념을 준수 합니다. 따라서, 이러한 방법으로, 토끼는 생체 내 생식 분석을 위한 이상적인 모델 유기 체를 구성 한다.

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Protocol

이 연구에서 사용 된 모든 실험 절차는 동물 실험을 위한 지침 2010/63/EU EEC에 따라 수행 되었으며, 시고요 Politècnica 드 València의 동물 들과 실험을 위한 윤리적 위원회에 의해 검토 및 승인 되었습니다. 스페인 (연구 코드: 2015/VSC/완두콩/00170) XGD, FMJ, MPVC 및 JSV는 동물 실험을 위해 발렌시아 정부 행정부가 발급 한 인증 인증서를 보유 하 고 있습니다. XGD는 실험 중에 동물의 복지와 보살 핌을 현장에서 감독 하도록 승인 된다.

1. 배아 이식

  1. 수용자 여성 준비
    1. 성적으로 성숙한 여성만 사용 (> 4.5 개월).
    2. 1 주일 전, 여 포 성장 및 향상 된 여성 감수 성을 시작 하는 16 시간 빛/8 h 어둠 정권에 여성을 적응.
    3. 여성을 선택 하 고 외 음부의 색을 관찰 합니다. 외 음부는 turgid와 붉은 경우, 여성은 수용.
    4. 의 단일 근육 주사에 의해 의사 임신을 유도 (배 란) 1 µ g의 buserelin 아세테이트 (생식 샘 자극 호르몬의 합성 아날로그) 체중에 관계 없이.
      참고: 일반적으로 0.8 µ g는 중간 크기의 토끼 (4-5 kg)에서 배 란 유도에 적합 한 용량 이므로 1 µ g는 일반적으로 배 란을 보장 합니다.
    5. 배아의 나이가 전이 될 때까지 며칠 전에 미리 배 란을 유도 한다 (예를 들어, 70-72 h는 신선한 모 룰라 ET).
  2. 마 취 및 진통
    1. 토끼를 무게와 다음 마 취 제 및 진통제를 로드 합니다.
      1. 30Ml/kg의 바늘을 넣은 1 mL 주사기와 부 프레 노르 틴 염 산 (0.03 mg/kg)을 사용 하십시오. 다른 1Ml의 주사기에 23G의 pericranial 바늘, 하 중 케 타 민 히드로 클로 라 이드 (35 mg/kg).
    2. 토끼를 잡고 xylazine-부 프레 노르 핀 혼합물을 피하에 주입 하십시오.
    3. Pericranial 바늘을 한계 귀 정 맥에 케 타 민 삽입 하 고, 모든 주사기 내용물을 정 맥 내에 서서히 도입 합니다.
    4. 바늘을 고정 하 고 필요한 경우 더 마 취를 관리 할 수 있는 나머지 단계를 통해 삽입 남겨.
    5. 따뜻한 무대에서 (깨끗 하 고 다른 동물 없이) 케이지에 토끼를 남겨 주세요.
    6. 일단 무 의식, 눈의 건조를 방지 하 고 palpebral freflex의 부재를 확인 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다.
      참고:이 프로토콜은 최소 30 분 동안 수술 마 취 평면을 제공 합니다. 더 긴 시간이 필요한 경우, 1.2.1에 설명 된 케 타 민 히드로 클로 라 이드의 양의 절반으로 추가 용량을 주입 30 분 후.
    7. 페달 반사와 호흡 운동을 확인 하 여 마 취의 깊이를 모니터링 합니다. 불규칙 하 고 빠른 속도로 호흡 패턴의 변화는 마 취의 적절 한 평면의 손실을 나타냅니다.
    8. 점 막 (눈, 입술 등)의 색을 모니터 하 고 호흡 률 (120-325 분당 30-60 호흡)과 직장 온도 (38-39.6 ° c)를 모니터링 합니다.
    9. 전송 8 시간 전에, ET 과정이 끝날 때까지 큰 창 자 크기와 활동을 피하기 위해 동물에서 음식을 보류. 물에 대 한 무료 액세스를 남겨 주세요.
  3. 배아 준비
    1. 배아 조작 매체를 25°c로 따뜻하게 하 여 소 혈 청 알 부 민의 0.2% (w/v)로 보충 되는 Dulbecco의 인산 완충 식 염 수 (DPBS)로 구성 된 베이스 배지 (BM).
    2. 실체 현미경으로 작업 하는 경우에는 BM을 사용 하 여 신선 또는 동결 해제 (2 단계) 배아를 씻어 냅니다.
    3. 멸 균 장갑을 사용 하 여 1 mL 주사기에 적절 하 게 구성 된 17G 경 막 외 카 테 터를 부착 하십시오.
    4. 작은 기포 다음에 카 테 터에 BM의 1 센티미터를 흡입.
    5. BM의 10 µ L의 부피에서 5-7 배아를 흡 인 하 고 또 다른 작은 기포를 따른다.
    6. BM의 1cm를 흡입 하 여 카 테 터 로드를 마칩니다.
  4. 배아 이식
    1. 멸 균 장갑, 가운 및 마스크를 사용 하 여 무 균 환경을 보장 하십시오.
    2. 수술 도구를 소독 하 고 수술이 수행 될 표면을 청소 하 고 70% 에탄올로 닦아 냅니다.
    3. 이전에 상세한 대로 마 취를 수행 (단계 1.2), 반사의 손실에 대 한 검사.
    4. 배 복 부에서 털을 전기 면도기로 면도 합니다.
    5. 복 부를 무 균 적으로 준비 합니다.
      1. 수술 부위를 청소 하 고 남은 모발을 제거 합니다. 수술 부위를 클 로르 헥 딘 글 루 콘 글 루 콘 비누로 씻으십시오. 클 로르 헥 세 딘 용액과 에탄올 96 º (3 회)으로 부위를 소독 하십시오.
    6. 트 렌 버그의 위치 (45 ° 아래로 머리)에 있는 따뜻한 수술 용 탁자 위에 동물을 놓고 위장과 내장이 위치 하 고 있는지 확인 하십시오. 방광의 대피를 고려 하십시오. 이 과정에서 내장이 손상 되 면 동물이 죽을 수 있습니다. 따라서 적절 하 게 배치 하는 것이 중요 합니다 (그림 1).
    7. 어떤 잠재적인 오염 지역에서 수술 부위를 분리, 면도 영역을 노출 구멍 (fenestration)와 함께 멸 균 타월을 사용 하 여 영역을 커버.
    8. 내 시경 트로 카 1 개를 복 강에 5cm 삽입 하 고 장티푸스 공정에 2cm 꼬리을 주입 하 고 압력 조절 기계식 취 입 기를 사용 하 여 복 막 캐비티를 통과 시킵니다.
      참고: 복 부 내부 압력은 CO2와 8-12 mmHg 이어야 합니다 .
    9. 내 시경 트로 카를 통해 내 시경 카메라를 삽입 합니다 (그림 1b).
      참고: 생식 기관을 확인 하 고, 다음 단계를 용이 하 게 하기 위해 ET 이전의 상태와 중 위 수의 위치를 결정 합니다.
    10. 17 G 경 막 외 바늘을 사 타 구니 부 위에 2-3 cm 사이에 삽입 하십시오 (그림 1b).
    11. 의 입구를 확인 합니다 (그림 2a, 2b).
    12. 로드 된 카 테 터 (단계 1.3)를 경 막 외 바늘을 통해 복 부에 삽입 합니다 (그림 1c).
    13. 암 울 라 (그림 2a-2c)의 안 위를 통해에 피 덕트를 찾아 경 막 외 카 테 터의 1-2 cm를 삽입 합니다. 손상 및 출혈을 방지 하기 위해 아주 멀리 난관로 진행 하지 마십시오.
    14. 배아를 카 테 터에 결합 된 주사기의 플런저를 가볍게 눌러 난관로 방출 한다 (2d-2f). 두 기포가 카 테 터를 종료 해야 합니다.
    15. 배아가 방출 된 직후 카 테 터를 제거 하십시오.
    16. 카 테 터를 헹 구 고 조절 배지를 풀어 배아가 없는지 확인 하 고 성공적인 전달을 확인 하십시오.
    17. 원하는 경우 자 궁의 다른 쪽에서 1.4.16 1.4.11 단계를 반복 합니다.
    18. 경 막 외 바늘 및 내 시경 카메라를 제거 합니다.
    19. 내 시경 트로 카를 통해 co2를 방출 합니다. 과잉 가스가 동물의 복 부에 남아 있으면 통증과 불편 함이 있을 것입니다.
    20. 복 강에서 내 시경 트로 카를 제거 합니다. 수술 용 타월을 제거 하십시오.
    21. 마 취를 중단 하십시오.
    22. 트로 카가 만든 절 개를 클 로르 헥 딘 용액으로 청소 하십시오. 트로 카가 만든 절 개를 미 분화 알루미늄과 플라스틱 드레싱으로 닫습니다.
  5. 수술 후 관리
    1. 항생제로 동물을 치료: 엔로 플 록 사신 10 밀리 그램/kg, 피하, 5 일 동안 매 24 시간.
    2. 진통제 관리: 부 프레 노르 틴 염 산 (0.03 mg/kg), 피하, 각 12 시간 3 일 동안; 멜 록 시 캄 (0.2 밀리 그램/kg), 피하, 3 일 동안 매 24 시간.
    3. 수술 후 적어도 30 분 동안 동물을 모니터링 하십시오 (동물 및 마 취의 복용량에 따라 다름) 그들의 생리 적 상태를 회복 시킵니다.
    4. 적절 한 환경 조건으로 깨끗 한 케이지에 있는 받는 사람 (예: 귀 타 투) 및 집 동물을 개별적으로 식별 합니다.

Figure 1
그림 1: 복 강경 검사 (외부 보기)에 의해 보조 된 복 강경 배아 전달. A) 내 시경 트로 카 삽입 (1 포트) B) 내 시경 카메라와 경 막 외 바늘 (검정색 화살표)의 삽입. C) 경 막 외 바늘을 통과 하는 배아 이식 카 테 터 (백색 화살표)의 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 복 강경 검사 (내부 보기)에 의해 지원 복 강경 배아 전송. A: 복 부 구역에 경 막 외 바늘을 통해 카 테 터 삽입. 별표는 인 푼 디 bulum을 나타냅니다. B, C, D: 배아와 함께 적재 된 카 테 터는 전체에 걸쳐 ampulla 지역에 삽입 됩니다. E, F: 배아의 방출은, 팽 윤 된 oviduct의 가시화에 의해 확인 되었다. 이 그림은 마르코-지 메 네즈 외에서 조정 되었습니다 . 38. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 태아의 비 삼중 화와 온난화

  1. 상 온 (22 ° c 전후)에서 모든 조작을 수행 하 여 따뜻한 온도에서 유리 화 용액 독성을 감소 시킵니다.
    참고: 배아는이 프로토콜에서 0.1-2 µ L 자동 피 펫을 사용 하 여 움직일 수 있지만, 다른 유사 장치는 배아를 이동 시켜 최소 부피를 드래그 하는 것이 적합할 수 있다.
  2. 2 단계 추가 절차에서 배아를 vitrify:
    1. Equilibrating에 10%의 에틸렌 글리콜과 10% (v/v) 디 메 틸 설 폭 사이드로 이루어진 용액에 2 분간 배아를 넣고 BM에 용 해 시켰다.
    2. 단계 2.2.1에서 배아를 1 분간 20%의 에틸렌 글리콜과 20% (v/v) 디 메 틸 설 폭 사이드로 구성 된 유리 화 용액으로 이동 시켜 BM에 용 해 시켰다.
  3. 125 µ L 플라스틱 미니 밀 (면 마 개 플러그와 한 개의 열린 극단으로 한 개의 닫힌 끝이 포함 되어 있습니다)에 배아를 로드 합니다. 이 과정은 그림 3에서 스키마 화할 것입니다.
    1. 0.125 μ l 미니 스트로의 닫힌 말단을 적절 한 마이크로 디스펜서 (예: Captroll III®)와 함께 사용 하십시오.
    2. 작은 기포에 의해 다음 빨 대 길이의 1/3까지 BM을 흡 기.
    3. 40 µ L의 부피로 배아를 흡 인 하 고, 또 다른 작은 기포를가 하였다.
    4. 첫 번째 액체 분 획까지 BM을 흡입 합니다 (단계 2.3.2)가 면에 도달 합니다.
    5. 빨 대 플러그가 있는 오픈 엔드를 닫습니다.
  4. 2.3 단계를 수행 하는 동안 2.2.2 단계에서 1 분 이상 경과 하지 않으면 배아에 독성이 있을 수 있습니다.
  5. 미니 스트로를 액체 질소에 직접 플런지 하 여 유리 화를 얻습니다.
  6. 원하는 시간 동안 질소에 대 한 dewar에 미니 밀을 저장 합니다.
  7. 배아를 단일 단계로 해 동 한다.
    1. 20-30 s에 대 한 액체 질소 증기에서 수평으로 10cm의 미니 밀을 배치 합니다.
    2. 결정 화 과정이 미니 스트로 내부에서 시작 될 때, 10-15의 경우 25 ° c의 수조에 미니 스트로를 담가 보십시오.
    3. 미니 스트로 플러그를 분리 하 고 코 튼 플러그를 자릅니다.
    4. 결합 된 마이크로 디스펜서를 사용 하 여 모든 미니 밀의 내용물을 BM의 25 ° c에서 0.33 M 자당 용액을 포함 하는 플레이트에 5 분간 배출 합니다.
      참고:이 단계는 유리 화 솔루션에 대 한 배아 노출을 줄이기 위해 신속 하 게 수행 해야 합니다.
    5. 다른 5 분 동안 BM 용액을 포함 하는 새로운 플레이트에 배아를 이동.
    6. ET를 계속 하려면 손상 되지 않은 배아만 고려 하십시오 (온전한 뮤 신 코트와 조 나 펠 루시와 함께).
      참고: 해 동 배아에서 비동기 전송 (: 모 룰라 전송에서 60-62 h)은 배아와 모계 endometrium 간의 재 동기화를 허용 하 여 결과를 향상 시킬 수 있음을 고려 하십시오.

Figure 3
그림 3: 올바르게 로드 된 빨 대의 식 각. A) BM은 비 삼중 화 중에 사용 되는 배아 조작 매체를 지칭 한다. 배아는 유리 화 용액으로 로딩 되어야 한다. B) 배아 위치에 대 한 확대 된 디테일과 함께 로드 된 짚의 거시적 모습. 이 대용량 장치를 사용 하면 최소 볼륨 장치와 달리 많은 수의 배아를 vitrify 할 수 있습니다. 또한,이 장치의 처리는 최소 부피 장치에 비해 용이 하며, 결과는 토끼41에서 유사 하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Representative Results

최소 침 습 복 강경은 생식 연구를 위한 가장 좋은 모델 동물 중 토끼를 배치 하는 신선 또는 유리 화 된 배아의 전송. 표 1 은 전이 된 배아의 상이한 발달 단계 (도 4)에서의 신선한 ET의 결과를 보여준다. 출생 시 생존 율 (새끼를 초래 하는 배아의 퍼센트)은이 논문에 기술 된 복 강경 기법의 효능을 입증 했습니다. 더 높은 값은 초기에 또는 조밀한 morulae의 모 룰라 단계에 있는 배아를 가진 ET가 수행 될 때 달성 되었습니다. 이러한 결과 들에 기초 하 여, 우리는 이러한 배아 들의 유리 화 후 생존 율을 입증 하기 위해 두 번째 실험을 수행 하였다. 따라서, 표 2 에서 우리는 동시에 회복 된 토끼 모 울 래를 전사 한 후 얻어진 결과를 보여주고, 양호한 정도의 다짐 정도에 도달한 배아 들을 분화 여부를 구별 한다. 출생 시 생존 율은 다른 배아 단계 간에 차이가 있었고, 압축 된 morulae에서 더 높다. 따라서 복 강경 배아 전달은 토끼에서 신선 하 고 유리 화 된 배아를 전달 하는 신뢰할 수 있는 기술 이다

Figure 4
그림 4: 토끼 배아. A)이 핵 클리어. B) 8 개의 세포. C) 조기 모 룰라. D) 컴팩트 모 룰라. E) 블 락 낭종. 별표는 두 개의 대명사를 나타낸다. 검은 화살은 소나 펠 루시 다를 나타냅니다. 백색 화살표는 일반적으로 배아 사이에서 변화 하는 뮤 신 코트를 나타낸다. ICM: 내부 세포 질량 TE: 트로 푸 덤. 축척 막대: 50 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .

개발 단계1 배아 받는 사람 전송 장소 임신 률 (%) 이식 속도 (%) 출생 시 생존 율 (%)2
대 핵 78 7 난관 7 (100) 50 (64.0)b 34 (43.6)b
8 셀 81 7 난관 7 (100) 60 (74.1)b 53 (65.4)
조기 모 룰라 81 7 난관 7 (100) 80 (98.8) 60 (74.1)
컴팩트 모 룰라 80 7 난관 7 (100) 80 (100) 58 (72.5)
배 반 포 80 7 자 궁 7 (100) 73 (91.3) 38 (47.5)b

표 1. 복 강경 검사에의 한 신선한 토끼 배아 전달의 효율성 (생체 내 파생). 1 개의 상이한 배아 들이 짝짓기 후 18-20h, 3638h(8 세포), 60-62 h (초기 70-72 모 룰라) 및 80-82 h (블 락 낭종)에서 회복 되었다. 콤팩트 (> 32 셀) 및 비 컴팩트 모 울 래 (≈ 32 세포)는 70-72 h에 설립 될 수 있지만 컴팩트 모 울 래에만 전사 되었다. 2 임산부는 받는 사람 으로부터 출생 시 생존 율. a, b 다른 수퍼스크립트가 있는 값은 통계적으로 다릅니다 (P < 0.001).

개발 단계 양도 된 배아 받는 사람 임신 률 (%) 출생 시 생존 율 (%)1
비 압축 135 10 90 (7) 62 (45.9)b
압축 150 10 10 (100.0) 98 (65.3)
285 20 19 (95) 160 (56.1)

표 2. 비 압축 vs 컴팩트 유리 화 된 모 룰라의 생존 능력. a,다른 수퍼스크립트가 있는 b 값은 통계적으로 다릅니다 (P < 0.001). 1 임산부는 받는 사람 으로부터 출생 시 생존 율. 배아를 동시에 회수 (70-72 h) 하 고 컴팩트 하 게 (> 32 세포) 및 비 컴팩트 모 울 래 (≈ 32 세포)로 구별 하였다.

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Discussion

최초에 기록 된 살아있는 출생 사건부터 배아9까지,이 기술과 토끼 종은 생식 연구에서 매우 중요 한 역할을 하 게 되었습니다. 게다가, 조작, 생산, 냉동 보존 을 포함 하는 배아 연구 연구는 건강 한 전체 기간 자식을 생성 하는 배아 용량의 평가를 마지막 단계로 요구 합니다. 따라서 배아 전달 기법은13,28에 필수적 이다. 수 년에 걸쳐, 태아를 모계 자 궁으로 이전 하기 위하여 처음에 채택 된 외과 방법은13종의 대다수에 있는 더 적은 침략 적인 방법으로 점차적으로 대체 되 고,14,15, 21 , 28 , 29 , 30. 그러나 토끼에서는 초기 배아 단계에서 개발 및 시험관 내에서 생산 된 배아는 자연 조건에 유사한 결과를 보장 하는 것이 불가피 하 게 된다. 토끼에서는 자 궁 뿔에 있는 배 반 낭종 팽창 동안 배아 코팅을 재 모델링 한 후에 일어나는 것 처럼, 태아의 뮤 신 코팅은 배아 주입을 허용 하는 결정적인 요소입니다. 그러나, 뮤 신 증 착은 배 란 후 3 일간의 난관로 제한 되며, 코팅 물질의 분자 기전은 크게 알려지지 않은 증 착 법 (31) 이다. 이러한 이유로, 시험관 내에서개발 된 배 반 낭종은 자 궁32,33,34및 배아를 손상 된 뮤 신으로 전달 했을 때 생존 율을 낮게 유지 하는 것으로 알려져 있다. 35. 마찬가지로 토끼에서 transcervical 배아 전달을 보고 한 그룹은 매우 낮은 실시간 출생 률11,26을 초래 했다. 여기에서 우리는 베 렌 펠 더와 Brem18에서 적응 하는 최소 침 습 기술을 제시 하 고 성공적인 출산 율로 배아를 전달 합니다. 표 1의 결과에 따르면, 토끼 배아에서의 모 룰라 단계는 출생 시 높은 생존 율을 달성 하기 위한 최고의 배아 단계 였다. 한 가지 가능한 설명은 초기 단계의 조작에 대 한 민감도가 더 크다는 것입니다. 흥미롭게도, 배아 단계가 진행 됨에 따라 성공률은 증가 하기 때문에 배아의 더 큰 노출로 인해 회복 하기 전에 분 비 물이 산란 됩니다. 그러나 배아가 배 반 낭종 단계에 도달 하 고 자 궁에 전달 되는 곳-매 염이 되 면 값이 급격히 감소 합니다. 언급 된 것 들을 배제 하는 것은 아니지만, 배아 들이 난관 내로 옮겨진 배아 들이 태아 조작 동안 뮤 신 층 내에서 발생 가능한 손상을 회복할 수 있다는 것이 가능한 설명 이다. 따라서 자 궁으로 옮겨진 배 반 낭종은이 메커니즘이 박탈 되어 이식 능력을 손상 시킬 수 있습니다.

이 기술은 약간의 간단한 조작으로 단일 포트 계측기 (5mm 내 시경 트로 카)를 사용 하 여 수행 됩니다. 따라서 the5 내 시경 트로 카의 절 개는 폐쇄를 필요로 하지 않는다. 복 강경 기술 혜택 포함 감소 수술 후 통증, 더 빠른 정상 활동으로 복귀, 그리고 적은 수술 후 합병증. 또한 내 시경 절차는 개복 수술21,36,37과 비교 하 여 더 적은 복 부 유착을 유도 하 고 수용자에의 한 더 나은 면역 반응을 가능 하 게 합니다. 우리 연구실의 증거를 축적 하는 것은 토끼 모델의이 ET 절차의 효과를 입증 했습니다. 따라서, 지난 5 년 동안 총 3909 배아 (1335 신선 및 2574 유리 화 된 배아)가 본 원고에 기재 된 절차를 거쳐 옮겼다. 이 기술의 결과로, 신선 하 고 유리 화 된 전달 배아의 자손 비율이 62.9% 및 42.5% 각각38,39,40, 41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. 많은 연구가이 기법을 기반으로 합니다: 마르코-지 메 네즈 외. 38 , 39 , 40 , 41, 비센테 외. 42, 비와 드 카스트로 외. 43, 사 츠 드 주 아 노 외. 44 , 45 , 47, 라바 라 외. 46.

이 기술을 수행 하기 위한 실용적인 권장 사항은 아래에 설명 되어 있습니다. 배아 배양 실험에서, 배양 배지와 조작 매체 사이에 배아를 이동 시키기 위해 사용 되는 것 대신에 배아 전달을 위한 새로운 카 테 터를 사용 하는 것이 또한 바람직하다. 이는 광 유전적 전달을 피하고 최적의 흐름을 보장 합니다. ET 동안 생식 기관의 처리를 최소화 하는 것이 중요 하며, 난관를 과도 하 게 조작 하면 유착이 발생할 수 있습니다. 난관 꼬인 경우, 배아를 포함 하 고 기계적 조작이 손실을 일으킬 수 있는 카 테 터가 아닌 올바르게 배치 하려고 경 막 외 주사기를 사용 합니다. 카 테 터가 oviduct를 통과 하면 쉽게 미끄러져 나옵니다. 그렇지 않으면 카 테 터가 이탈 했을 수 있습니다. 일단에는 oviduct, 미디어가 흐르지 않는 경우, 카 테 터를 약간 밖으로 이동 하 고 다시 삽입 하려고. 그래도 흐르지 않으면 카 테 터가 막혀 있습니다. 난관에서 제거 하 고 깨끗 한 매체와 함께 접시에 내용을 놓습니다. 다음, 다른 카 테 터에 배아를 다시 로드 하 고 다시 난관에 삽입 하려고. 배달 일반적으로 장소를 걸립니다 28-30 모 룰라 전송 후 일.

또한, 배아 발달 단계가 유사 임신 여성에서 자 궁 환경 보다 더 진보 될 수 있음을 나타내는 증거가 있지만, 반대는 아니다. 구체적으로, 배아는 유리한 자 궁 환경을 기다릴 수 있는 능력을가지고 있지만, 자 궁 환경은 이식10에 대 한 올바른 단계에서 배아를 기다릴 수가 없다. 유리 화 된 배아에 관해서는, 단기/장기 저장 후에 상응 하는 유리한 자 궁 환경과 배아의 발달 단계를 동기화 할 수 있다. 더욱이, 배아 공여 체가 또한 배아 수용자 인 경우, endometrium에 대 한 슈퍼 배 란의 해로운 영향은 바이 트리 화 기법을 사용 하 고 후속 사이클48에서 배아를 이송 함으로써 우회 될 수 있다. 토끼에서, 떨어뜨리고 60-62 h를 미리 (비동기)로 유도 한 수령인의 산란 관으로 옮겨진 배아는 매우 효율적인 기술44,49이다. 이와 관련 하 여, 10-12 h 동안 oviductal 배아 전이가 세포 생리학의 회복과 죽은 세포의 교체에 유익한 효과를 설명할 수 있다는 것이 시사 되었으며 배아 중에 뮤 신 코트에서 유발 된 손상을 복구 하는 것이 아마 조작. 게다가, 유리 화 된 배아는 저장 동안 대 사적으로 부유 했기 때문에 개발에서 지연을 제시 합니다. 따라서 냉동 보존 된 배아를 비동기식으로 받는 사람에 게 양도 하면 배아는 신진 대사 활성을 재 활성화 시킬 수 있으며, 따라서 발달의 배아 단계는 자 궁 환경과 동기화 된다. 대신에, 냉동 보존 된 배아가 동기화 수용 체로 전달 되는 경우, 어머니와 배아 사이의 교차 대화는 성공적인 임신의 발병을 방해 합니다. 토끼에서, 가장 높은 생존 율은 냉동 보존 된 morulae49의 전 하 전달 후에 얻어진 다. 우리의 데이터는이 보고서와 일치 하지만, morula 단계는 70-72 h (표 2)에서의 압축 정도에 따라 냉동 보존 다음에 다른 생존 율을 나타낸다. 여기에서, 압축 morulae는 비 압축 morulae에 비해 출생 시 더 높은 생존 율을 보였다,이는 개발의 모든 단계는 cryoprotectants의 투과에 상대적인 자신의 메커니즘을가지고 있음을 보여주는 이전 보고서와 일치 했다 동결 보존 용액50의 첨가 시 탈수의 정도. 이러한 기술에 기초 하 여, 우리는 유리 화 및 내부 배아 전달의 조합이 액체 질소에 저장 15 년 후에 토끼의 인구를 다시 확립 하는 성공적인 전략 이다, 그들의 부정적인 영향 없이 사후 융해 생존 및 살아있는 출생51.

이 기술을 성공적으로 수행 하려면 다음 세부 정보를 고려해 야 합니다. 유리 화 (DPBS, 평형 화 용액, 유리 화 용액)에 사용 되는 연속적인 매체의 증가 된 밀도는 점진적 배아 탈수로 인 한 배아 수 축을 유도할 수도 있음을 명심 하는 것이 중요 하다. 그러나, 배아가 배지와 평형 화 되 면 정상적인 외관이 회복 된다. 더욱이, 배아가 증가 하는 밀도 매체 사이에서 이동 되 면, 밀도 운동에의 한 매체의 표면으로 이동 하는 경향이 있다. 배아 손실을 방지 하 고 유리 화 하는 시간을 보장 하기 위해 배아를 제자리에 유지 하는 작은 양의 매체에서 유리 화가 수행 하는 것이 좋습니다.

결론적으로, 우리는 ET 기법과 토끼를 모델로 사용 하는 미래 연구를 용이 하 게 하는 배아 유리 화 방법을 모두 설명 합니다. 토끼와 인간 사이의 근접 계통 거리에 따라,이 모델의 사용은 쉽게 인간 임상 의학에 양도 결과를 제공 할 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 실험 동물의 인도적 치료를 개선 하는 목표를 유지 하면서 동물 복지 (교체, 감소 및 정제)의 3 Rs의 개념에 부합 하는 몇 가지 위생 적이 고 경제적인 이점을 제공 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 저작물은 스페인의 경제 및 경쟁력을 갖춘 기금 (AGL2017-85162)과 발렌시아 나 연구 2014/036 프로그램에서의 자금으로 지원 되었습니다. N. 마 오 완 영어 텍스트 버전 수정

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

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토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산
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Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

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