Summary
보조 생식 기술 (ARTs)은 결과를 개선 하 고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가를 하 고 있습니다. 이 원고는 인간 재생의 이상적인 동물 모델로 서 토끼의 사용을 허용 하는 효율적인 냉동 보존 프로토콜을 가진 최소 침 습 배아 전달 절차를 설명 합니다.
Abstract
시험관 내 배아 배양 또는 배아 동결 보존과 같은 보조 생식 기술 (ARTs)은 출산 및 출생 후의 결과와 함께 자연 개발 패턴에 영향을 미칩니다. 예술 응용 프로그램의 무해 함을 보장 하기 위해 동물 모델에 대 한 연구가 필요 합니다. 또한, 마지막 단계로, 태아 발달 연구는 완전 한 건강 한 자손을 개발 하는 그들의 능력의 평가를 요구 합니다. 여기에서 자 궁으로의 배아 전달은 예술 관련 실험을 수행 하는 데 필수적입니다.
토끼는 한 세기 이상 동안 포유류 재생을 연구 하는 모델 유기 체로 사용 되었습니다. 인간 종과 그것의 작은 크기 및 낮은 유지 관리 비용에 대 한 계통 적 근접성 외에도 유도 배 란, 인간과 유사한 초기 배아 개발의 연대기 및 짧은 임신과 같은 중요 한 생식 특성을가지고 있습니다. 그것은 우리가 쉽게 예술 응용 프로그램의 결과를 연구 할 수 있도록. 더욱이, 예술 (예를 들어, 내과 세포 정자 주사, 배아 배양 또는 동결 보존)은이 종에서 적절 한 효율로 적용 된다.
본 기사에 제시 된 복 강경 배아 전달 기술 및 동결 보존 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 1) 쉽게, 최소 침 습 적 기술 및 2) 토끼의 장기 저장을 위한 효과적인 프로토콜을 통해 배아를 전달 하는 방법을 설명 배아는 시간-유연한 물류 용량 및 샘플을 수송 할 수 있는 능력을 제공 한다. 다른 발달 단계에서 토끼 배아를 양도 한 후 얻어진 결과는 모 룰라가 토끼 배아 회복 및 전달에 이상적인 단계 임을 나타냅니다. 따라서, 외 과적 배아 전달은 수술 절차를 정당화 해야 합니다. 또한, 토끼 모 루 애는 성공적으로 유리 화 되 고 복 강경 전이 되어 기술 된 기술의 효과를 입증 합니다.
Introduction
인간 불모를 우회 하거나 높은 유전 가치를 가진 가축의 보급을 개량 하 고 동물성 유전 자원을 보전 하는의 목표를 가진, 일련의 기술의 세트는, 초 배 란과 같은 원조 재생산 기술 이라고 불렀습니다 시험관 내 시비, 배아 배양 또는 냉동 보존은1,2로 개발 되었다. 현재, 호르몬 치료는 난소를 자극 하 고 다 수의 배 승 난소 모 낭을 생성 하기 위하여 주어 집니다1. 이들 여 포 로부터 채취 된 난 모 세포는 냉동 보존 되거나 대리 모 (3)로 이송 될 때까지 시험관 내에서 성숙, 수정 및 개발 될 수 있다. 그러나, 이러한 치료법 중에,가 및 zygotes는 이러한 조건4,5에서 생존 하기 위해 배아 적응이 필요할 수 있는 일련의 비 생리 적 과정에 노출 된다. 이 적응은 유전자 발현 및 발달 프로그래밍6에서 배아 변화를 허용 하는 초기 배아가 소성으로 인해 가능 합니다. 그러나, 이러한 수정은 성인이 될 때까지 배아 발달의 후속 단계에 영향을 미칠 수 있고, 지금 널리 방법, 타이밍, 냉동 보존 절차 또는 배양 조건이 배아 운명에 다른 결과를 보여줍니다7 , 8. 따라서 예술의 특정 한 유도 효과를 밝히기 위해 잘 특성화 된 동물 모델을 사용 하는 것은 불가피 합니다.
포유동물 배아의 전사 로부터 발생 되는 최초 기록 된 살아있는 출생은 18909에서 일어났다. 오늘날, 대리 여성에 대 한 배아 이식 (ET)은 후속 배아 개발 단계10에 이식 하는 동안 당해 유발 효과를 연구 하는 중요 한 단계 이다. ET 기술은 각 동물의 크기 및 해부학 적 구조에 따라 달라 집니다. 대형 동물 모델의 경우, transcervical 비 수술 ET 기술에 의해 ET을 수행 할 수 있었지만, 자 궁 경부의 작은 크기의 카 테 터는 더 복잡 하 고 외과 기술이 자주 사용 됩니다11. 그러나 외과 ET는 혈액이 자 궁 루멘을 침범 하 여 태아 죽음10을 일으키는 원인이 되기 때문에 이식 및 배아 발달을 손상 시킬 수 있는 출혈 발생할 수 있습니다. Transcervical 비 수술 적 ET 기술은 인간, 개 코 원숭이, 소, 돼지 및 생쥐12,13,14,15,17에 여전히 적용 되지만 외과 ETs는 여전히 염소, 양 또는 기타 동물 들과 같은 종에서 사용 되 고 있으며이는 추가로 어려움을 겪고 있다10,18,19,20토끼와 같은 (2 독립 cervices) 또는 마우스 (작은 크기). 그럼에도 불구 하 고, 외과 적 전달 방법은 점차적으로 덜 침 습 적 방법으로 대체 되는 경향이 있습니다. 내 시경은 토끼, 돼지 및 작은 반추 위 제18,19,20등에서 배아를 전달 하는데 사용 되었다. 이러한 최소 침 습 내 시경 검사 법은 토끼에 필수적 이며 일부 종20에서 유익한 효과를 입증 한 infundibulum을 통해 암 울 라로 배아를 전달 하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 oviduct에 있는 초기 배아 단계 도중 태아와 어머니 사이 정확한 대화의 중요성에 근거를 두고 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 배아를 통해 이식 하는 동안 토끼에서 일어나는 배아 리 모델링은 이식22,23을 할 수 있는 배아를 달성 하는 것이 필수적 이다.
소 등의 대형 동물 모델은 생화학 적 및 이식 기능이 인간 종24와 유사 하기 때문에 흥미롭습니다. 그러나, 큰 동물은 예비 실험에서 사용 하기에는 너무 비싸지 고, 설치류는 실험실 연구25에 대 한 이상적인 모델로 간주 됩니다 (76% 모델 생물은 설치류). 그럼에도 불구 하 고, 토끼 모델은 생식 연구에서 설치류에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다, 인간에 의해 전시 된 일부 생식 생물학 과정은 쥐 보다 토끼에서 더 유사 하다. 인간과 토끼는 유사한 연대순으로 배아 게놈 활성화, gastrulation 및 혈우병 태 반 구조를 제시 한다. 또한, 토끼를 사용 하는 것은 그들의 배 란 (25)의 유도로 인 한 풍부 하 게 함 및 임신 단계의 정확한 타이밍을 알 수 있다. 토끼 라이프 사이클은 짧고, 31 일에 임신을 완료 하 고 약 4-5 개월에 사춘기에 도달; 동물의 유 순 및 비 공격적인 행동으로 인해 취급이 용이 하 고, 그 유지는 큰 동물의 비용에 비해 매우 경제적 이다. 더욱이, 토끼는 두 개의 독립적인 서 비 세스11,25를 가진 이중 자 궁을가지고 있다는 것을 언급 하는 것이 중요 합니다. 이것은 다른 실험 군의 배아가 동일한 동물로, 그러나 다른 자 궁 경적으로 전달 될 수 있기 때문에, 특혜 위치에 토끼를 배치 합니다. 이것은 우리가 결과에서 모성 요인을 감소, 두 실험 효과를 비교할 수 있습니다.
오늘, 비 외과 ET 방법은 토끼에 사용 되지 않습니다. Transcervical ET 기술을 사용 하 여 90 년대 후반에 수행 된 일부 연구는 외과 적 방법으로 5.5% ~ 20.0%,26 ~ 50-65%에 이르는 낮은 납품 율을 초래 했으며, 그 중에서 복 강경 수술 절차 베 센 펠 더와 브 렘18. 토끼에서 이러한 비 수술 ET 방법의 낮은 성공률은 transcervical ET에서 피할 수 있는 oviduct에 필요한 배아 리 모델링의 부족과 일치 합니다. 여기서, 우리는 모델 유기 체로 서 토끼를 사용 하는 효과적인 최소 침 습 복 강경 ET 절차를 설명 한다. 이 기술은 큰 동물 및 인간에서 추가 생식 연구를 위한 모델을 제공 합니다.
토끼는 특히 배아 이식에 대 한 좁은 시간 윈도우를가지고 있기 때문에,이 종에서는 ET에서 배아의 발달 단계와 수용자 (27)의 생리 적 상태 사이에 높은 수준의 동기화가 필요 하다. 어떤 경우에는 배아 개발을 느리게 하는 생식 치료 (예: 시험관 내 문화) 또는 자궁내 막 감수 (예: 배 란 치료)를 변경 하는 경우 배아와 모계 자 궁 사이에는 동기화가 없습니다. 이러한 상황은 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 맥락에서 응답 하기 위해, 우리는 실험을 일시 중지, 구성 및 재개 할 수 있는 효과적인 토끼 모 룰라 유리 화 프로토콜을 설명 합니다. 이 과정은 재생산 연구를 위해로 서 바람직 하 고 우리에 게 그들의 수송을 허용 하는 배아의 장기 저장을 위한 능력을 줍니다. 복 강경 절차 및 냉동 보존 전략은 적은 동물 연구의 더 나은 계획을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법론은 위생 적이 고 경제적 인 이점을 제공 하 고 실험 동물의 인간 치료를 개선 한다는 명시 된 목표로 동물 연구의 3Rs (교체, 감소 및 정제)의 개념을 준수 합니다. 따라서, 이러한 방법으로, 토끼는 생체 내 생식 분석을 위한 이상적인 모델 유기 체를 구성 한다.
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Protocol
이 연구에서 사용 된 모든 실험 절차는 동물 실험을 위한 지침 2010/63/EU EEC에 따라 수행 되었으며, 시고요 Politècnica 드 València의 동물 들과 실험을 위한 윤리적 위원회에 의해 검토 및 승인 되었습니다. 스페인 (연구 코드: 2015/VSC/완두콩/00170) XGD, FMJ, MPVC 및 JSV는 동물 실험을 위해 발렌시아 정부 행정부가 발급 한 인증 인증서를 보유 하 고 있습니다. XGD는 실험 중에 동물의 복지와 보살 핌을 현장에서 감독 하도록 승인 된다.
1. 배아 이식
- 수용자 여성 준비
- 성적으로 성숙한 여성만 사용 (> 4.5 개월).
- 1 주일 전, 여 포 성장 및 향상 된 여성 감수 성을 시작 하는 16 시간 빛/8 h 어둠 정권에 여성을 적응.
- 여성을 선택 하 고 외 음부의 색을 관찰 합니다. 외 음부는 turgid와 붉은 경우, 여성은 수용.
- 의 단일 근육 주사에 의해 의사 임신을 유도 (배 란) 1 µ g의 buserelin 아세테이트 (생식 샘 자극 호르몬의 합성 아날로그) 체중에 관계 없이.
참고: 일반적으로 0.8 µ g는 중간 크기의 토끼 (4-5 kg)에서 배 란 유도에 적합 한 용량 이므로 1 µ g는 일반적으로 배 란을 보장 합니다. - 배아의 나이가 전이 될 때까지 며칠 전에 미리 배 란을 유도 한다 (예를 들어, 70-72 h는 신선한 모 룰라 ET).
- 마 취 및 진통
- 토끼를 무게와 다음 마 취 제 및 진통제를 로드 합니다.
- 30Ml/kg의 바늘을 넣은 1 mL 주사기와 부 프레 노르 틴 염 산 (0.03 mg/kg)을 사용 하십시오. 다른 1Ml의 주사기에 23G의 pericranial 바늘, 하 중 케 타 민 히드로 클로 라 이드 (35 mg/kg).
- 토끼를 잡고 xylazine-부 프레 노르 핀 혼합물을 피하에 주입 하십시오.
- Pericranial 바늘을 한계 귀 정 맥에 케 타 민 삽입 하 고, 모든 주사기 내용물을 정 맥 내에 서서히 도입 합니다.
- 바늘을 고정 하 고 필요한 경우 더 마 취를 관리 할 수 있는 나머지 단계를 통해 삽입 남겨.
- 따뜻한 무대에서 (깨끗 하 고 다른 동물 없이) 케이지에 토끼를 남겨 주세요.
- 일단 무 의식, 눈의 건조를 방지 하 고 palpebral freflex의 부재를 확인 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다.
참고:이 프로토콜은 최소 30 분 동안 수술 마 취 평면을 제공 합니다. 더 긴 시간이 필요한 경우, 1.2.1에 설명 된 케 타 민 히드로 클로 라 이드의 양의 절반으로 추가 용량을 주입 30 분 후. - 페달 반사와 호흡 운동을 확인 하 여 마 취의 깊이를 모니터링 합니다. 불규칙 하 고 빠른 속도로 호흡 패턴의 변화는 마 취의 적절 한 평면의 손실을 나타냅니다.
- 점 막 (눈, 입술 등)의 색을 모니터 하 고 호흡 률 (120-325 분당 30-60 호흡)과 직장 온도 (38-39.6 ° c)를 모니터링 합니다.
- 전송 8 시간 전에, ET 과정이 끝날 때까지 큰 창 자 크기와 활동을 피하기 위해 동물에서 음식을 보류. 물에 대 한 무료 액세스를 남겨 주세요.
- 토끼를 무게와 다음 마 취 제 및 진통제를 로드 합니다.
- 배아 준비
- 배아 조작 매체를 25°c로 따뜻하게 하 여 소 혈 청 알 부 민의 0.2% (w/v)로 보충 되는 Dulbecco의 인산 완충 식 염 수 (DPBS)로 구성 된 베이스 배지 (BM).
- 실체 현미경으로 작업 하는 경우에는 BM을 사용 하 여 신선 또는 동결 해제 (2 단계) 배아를 씻어 냅니다.
- 멸 균 장갑을 사용 하 여 1 mL 주사기에 적절 하 게 구성 된 17G 경 막 외 카 테 터를 부착 하십시오.
- 작은 기포 다음에 카 테 터에 BM의 1 센티미터를 흡입.
- BM의 10 µ L의 부피에서 5-7 배아를 흡 인 하 고 또 다른 작은 기포를 따른다.
- BM의 1cm를 흡입 하 여 카 테 터 로드를 마칩니다.
- 배아 이식
- 멸 균 장갑, 가운 및 마스크를 사용 하 여 무 균 환경을 보장 하십시오.
- 수술 도구를 소독 하 고 수술이 수행 될 표면을 청소 하 고 70% 에탄올로 닦아 냅니다.
- 이전에 상세한 대로 마 취를 수행 (단계 1.2), 반사의 손실에 대 한 검사.
- 배 복 부에서 털을 전기 면도기로 면도 합니다.
- 복 부를 무 균 적으로 준비 합니다.
- 수술 부위를 청소 하 고 남은 모발을 제거 합니다. 수술 부위를 클 로르 헥 딘 글 루 콘 글 루 콘 비누로 씻으십시오. 클 로르 헥 세 딘 용액과 에탄올 96 º (3 회)으로 부위를 소독 하십시오.
- 트 렌 버그의 위치 (45 ° 아래로 머리)에 있는 따뜻한 수술 용 탁자 위에 동물을 놓고 위장과 내장이 위치 하 고 있는지 확인 하십시오. 방광의 대피를 고려 하십시오. 이 과정에서 내장이 손상 되 면 동물이 죽을 수 있습니다. 따라서 적절 하 게 배치 하는 것이 중요 합니다 (그림 1).
- 어떤 잠재적인 오염 지역에서 수술 부위를 분리, 면도 영역을 노출 구멍 (fenestration)와 함께 멸 균 타월을 사용 하 여 영역을 커버.
- 내 시경 트로 카 1 개를 복 강에 5cm 삽입 하 고 장티푸스 공정에 2cm 꼬리을 주입 하 고 압력 조절 기계식 취 입 기를 사용 하 여 복 막 캐비티를 통과 시킵니다.
참고: 복 부 내부 압력은 CO2와 8-12 mmHg 이어야 합니다 . - 내 시경 트로 카를 통해 내 시경 카메라를 삽입 합니다 (그림 1b).
참고: 생식 기관을 확인 하 고, 다음 단계를 용이 하 게 하기 위해 ET 이전의 상태와 중 위 수의 위치를 결정 합니다. - 17 G 경 막 외 바늘을 사 타 구니 부 위에 2-3 cm 사이에 삽입 하십시오 (그림 1b).
- 의 입구를 확인 합니다 (그림 2a, 2b).
- 로드 된 카 테 터 (단계 1.3)를 경 막 외 바늘을 통해 복 부에 삽입 합니다 (그림 1c).
- 암 울 라 (그림 2a-2c)의 안 위를 통해에 피 덕트를 찾아 경 막 외 카 테 터의 1-2 cm를 삽입 합니다. 손상 및 출혈을 방지 하기 위해 아주 멀리 난관로 진행 하지 마십시오.
- 배아를 카 테 터에 결합 된 주사기의 플런저를 가볍게 눌러 난관로 방출 한다 (도2d-2f). 두 기포가 카 테 터를 종료 해야 합니다.
- 배아가 방출 된 직후 카 테 터를 제거 하십시오.
- 카 테 터를 헹 구 고 조절 배지를 풀어 배아가 없는지 확인 하 고 성공적인 전달을 확인 하십시오.
- 원하는 경우 자 궁의 다른 쪽에서 1.4.16 1.4.11 단계를 반복 합니다.
- 경 막 외 바늘 및 내 시경 카메라를 제거 합니다.
- 내 시경 트로 카를 통해 co2를 방출 합니다. 과잉 가스가 동물의 복 부에 남아 있으면 통증과 불편 함이 있을 것입니다.
- 복 강에서 내 시경 트로 카를 제거 합니다. 수술 용 타월을 제거 하십시오.
- 마 취를 중단 하십시오.
- 트로 카가 만든 절 개를 클 로르 헥 딘 용액으로 청소 하십시오. 트로 카가 만든 절 개를 미 분화 알루미늄과 플라스틱 드레싱으로 닫습니다.
- 수술 후 관리
- 항생제로 동물을 치료: 엔로 플 록 사신 10 밀리 그램/kg, 피하, 5 일 동안 매 24 시간.
- 진통제 관리: 부 프레 노르 틴 염 산 (0.03 mg/kg), 피하, 각 12 시간 3 일 동안; 멜 록 시 캄 (0.2 밀리 그램/kg), 피하, 3 일 동안 매 24 시간.
- 수술 후 적어도 30 분 동안 동물을 모니터링 하십시오 (동물 및 마 취의 복용량에 따라 다름) 그들의 생리 적 상태를 회복 시킵니다.
- 적절 한 환경 조건으로 깨끗 한 케이지에 있는 받는 사람 (예: 귀 타 투) 및 집 동물을 개별적으로 식별 합니다.
그림 1: 복 강경 검사 (외부 보기)에 의해 보조 된 복 강경 배아 전달. A) 내 시경 트로 카 삽입 (1 포트) B) 내 시경 카메라와 경 막 외 바늘 (검정색 화살표)의 삽입. C) 경 막 외 바늘을 통과 하는 배아 이식 카 테 터 (백색 화살표)의 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 복 강경 검사 (내부 보기)에 의해 지원 복 강경 배아 전송. A: 복 부 구역에 경 막 외 바늘을 통해 카 테 터 삽입. 별표는 인 푼 디 bulum을 나타냅니다. B, C, D: 배아와 함께 적재 된 카 테 터는 전체에 걸쳐 ampulla 지역에 삽입 됩니다. E, F: 배아의 방출은, 팽 윤 된 oviduct의 가시화에 의해 확인 되었다. 이 그림은 마르코-지 메 네즈 외에서 조정 되었습니다 . 38. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 태아의 비 삼중 화와 온난화
- 상 온 (22 ° c 전후)에서 모든 조작을 수행 하 여 따뜻한 온도에서 유리 화 용액 독성을 감소 시킵니다.
참고: 배아는이 프로토콜에서 0.1-2 µ L 자동 피 펫을 사용 하 여 움직일 수 있지만, 다른 유사 장치는 배아를 이동 시켜 최소 부피를 드래그 하는 것이 적합할 수 있다. - 2 단계 추가 절차에서 배아를 vitrify:
- Equilibrating에 10%의 에틸렌 글리콜과 10% (v/v) 디 메 틸 설 폭 사이드로 이루어진 용액에 2 분간 배아를 넣고 BM에 용 해 시켰다.
- 단계 2.2.1에서 배아를 1 분간 20%의 에틸렌 글리콜과 20% (v/v) 디 메 틸 설 폭 사이드로 구성 된 유리 화 용액으로 이동 시켜 BM에 용 해 시켰다.
- 125 µ L 플라스틱 미니 밀 (면 마 개 플러그와 한 개의 열린 극단으로 한 개의 닫힌 끝이 포함 되어 있습니다)에 배아를 로드 합니다. 이 과정은 그림 3에서 스키마 화할 것입니다.
- 0.125 μ l 미니 스트로의 닫힌 말단을 적절 한 마이크로 디스펜서 (예: Captroll III®)와 함께 사용 하십시오.
- 작은 기포에 의해 다음 빨 대 길이의 1/3까지 BM을 흡 기.
- 40 µ L의 부피로 배아를 흡 인 하 고, 또 다른 작은 기포를가 하였다.
- 첫 번째 액체 분 획까지 BM을 흡입 합니다 (단계 2.3.2)가 면에 도달 합니다.
- 빨 대 플러그가 있는 오픈 엔드를 닫습니다.
- 2.3 단계를 수행 하는 동안 2.2.2 단계에서 1 분 이상 경과 하지 않으면 배아에 독성이 있을 수 있습니다.
- 미니 스트로를 액체 질소에 직접 플런지 하 여 유리 화를 얻습니다.
- 원하는 시간 동안 질소에 대 한 dewar에 미니 밀을 저장 합니다.
- 배아를 단일 단계로 해 동 한다.
- 20-30 s에 대 한 액체 질소 증기에서 수평으로 10cm의 미니 밀을 배치 합니다.
- 결정 화 과정이 미니 스트로 내부에서 시작 될 때, 10-15의 경우 25 ° c의 수조에 미니 스트로를 담가 보십시오.
- 미니 스트로 플러그를 분리 하 고 코 튼 플러그를 자릅니다.
- 결합 된 마이크로 디스펜서를 사용 하 여 모든 미니 밀의 내용물을 BM의 25 ° c에서 0.33 M 자당 용액을 포함 하는 플레이트에 5 분간 배출 합니다.
참고:이 단계는 유리 화 솔루션에 대 한 배아 노출을 줄이기 위해 신속 하 게 수행 해야 합니다. - 다른 5 분 동안 BM 용액을 포함 하는 새로운 플레이트에 배아를 이동.
- ET를 계속 하려면 손상 되지 않은 배아만 고려 하십시오 (온전한 뮤 신 코트와 조 나 펠 루시와 함께).
참고: 해 동 배아에서 비동기 전송 (예 : 모 룰라 전송에서 60-62 h)은 배아와 모계 endometrium 간의 재 동기화를 허용 하 여 결과를 향상 시킬 수 있음을 고려 하십시오.
그림 3: 올바르게 로드 된 빨 대의 식 각. A) BM은 비 삼중 화 중에 사용 되는 배아 조작 매체를 지칭 한다. 배아는 유리 화 용액으로 로딩 되어야 한다. B) 배아 위치에 대 한 확대 된 디테일과 함께 로드 된 짚의 거시적 모습. 이 대용량 장치를 사용 하면 최소 볼륨 장치와 달리 많은 수의 배아를 vitrify 할 수 있습니다. 또한,이 장치의 처리는 최소 부피 장치에 비해 용이 하며, 결과는 토끼41에서 유사 하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Representative Results
최소 침 습 복 강경은 생식 연구를 위한 가장 좋은 모델 동물 중 토끼를 배치 하는 신선 또는 유리 화 된 배아의 전송. 표 1 은 전이 된 배아의 상이한 발달 단계 (도 4)에서의 신선한 ET의 결과를 보여준다. 출생 시 생존 율 (새끼를 초래 하는 배아의 퍼센트)은이 논문에 기술 된 복 강경 기법의 효능을 입증 했습니다. 더 높은 값은 초기에 또는 조밀한 morulae의 모 룰라 단계에 있는 배아를 가진 ET가 수행 될 때 달성 되었습니다. 이러한 결과 들에 기초 하 여, 우리는 이러한 배아 들의 유리 화 후 생존 율을 입증 하기 위해 두 번째 실험을 수행 하였다. 따라서, 표 2 에서 우리는 동시에 회복 된 토끼 모 울 래를 전사 한 후 얻어진 결과를 보여주고, 양호한 정도의 다짐 정도에 도달한 배아 들을 분화 여부를 구별 한다. 출생 시 생존 율은 다른 배아 단계 간에 차이가 있었고, 압축 된 morulae에서 더 높다. 따라서 복 강경 배아 전달은 토끼에서 신선 하 고 유리 화 된 배아를 전달 하는 신뢰할 수 있는 기술 이다
그림 4: 토끼 배아. A)이 핵 클리어. B) 8 개의 세포. C) 조기 모 룰라. D) 컴팩트 모 룰라. E) 블 락 낭종. 별표는 두 개의 대명사를 나타낸다. 검은 화살은 소나 펠 루시 다를 나타냅니다. 백색 화살표는 일반적으로 배아 사이에서 변화 하는 뮤 신 코트를 나타낸다. ICM: 내부 세포 질량 TE: 트로 푸 덤. 축척 막대: 50 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오 .
| 개발 단계1 | 배아 | 받는 사람 | 전송 장소 | 임신 률 (%) | 이식 속도 (%) | 출생 시 생존 율 (%)2 |
| 대 핵 | 78 | 7 | 난관 | 7 (100) | 50 (64.0)b | 34 (43.6)b |
| 8 셀 | 81 | 7 | 난관 | 7 (100) | 60 (74.1)b | 53 (65.4) |
| 조기 모 룰라 | 81 | 7 | 난관 | 7 (100) | 80 (98.8) | 60 (74.1) |
| 컴팩트 모 룰라 | 80 | 7 | 난관 | 7 (100) | 80 (100) | 58 (72.5) |
| 배 반 포 | 80 | 7 | 자 궁 | 7 (100) | 73 (91.3) | 38 (47.5)b |
표 1. 복 강경 검사에의 한 신선한 토끼 배아 전달의 효율성 (생체 내 파생). 1 개의 상이한 배아 들이 짝짓기 후 18-20h, 3638h(8 세포), 60-62 h (초기 70-72 모 룰라) 및 80-82 h (블 락 낭종)에서 회복 되었다. 콤팩트 (> 32 셀) 및 비 컴팩트 모 울 래 (≈ 32 세포)는 70-72 h에 설립 될 수 있지만 컴팩트 모 울 래에만 전사 되었다. 2 임산부는 받는 사람 으로부터 출생 시 생존 율. a, b 다른 수퍼스크립트가 있는 값은 통계적으로 다릅니다 (P < 0.001).
| 개발 단계 | 양도 된 배아 | 받는 사람 | 임신 률 (%) | 출생 시 생존 율 (%)1 |
| 비 압축 | 135 | 10 | 90 (7) | 62 (45.9)b |
| 압축 | 150 | 10 | 10 (100.0) | 98 (65.3) |
| 총 | 285 | 20 | 19 (95) | 160 (56.1) |
표 2. 비 압축 vs 컴팩트 유리 화 된 모 룰라의 생존 능력. a,다른 수퍼스크립트가 있는 b 값은 통계적으로 다릅니다 (P < 0.001). 1 임산부는 받는 사람 으로부터 출생 시 생존 율. 배아를 동시에 회수 (70-72 h) 하 고 컴팩트 하 게 (> 32 세포) 및 비 컴팩트 모 울 래 (≈ 32 세포)로 구별 하였다.
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Discussion
최초에 기록 된 살아있는 출생 사건부터 배아9까지,이 기술과 토끼 종은 생식 연구에서 매우 중요 한 역할을 하 게 되었습니다. 게다가, 조작, 생산, 냉동 보존 등 을 포함 하는 배아 연구 연구는 건강 한 전체 기간 자식을 생성 하는 배아 용량의 평가를 마지막 단계로 요구 합니다. 따라서 배아 전달 기법은13,28에 필수적 이다. 수 년에 걸쳐, 태아를 모계 자 궁으로 이전 하기 위하여 처음에 채택 된 외과 방법은13종의 대다수에 있는 더 적은 침략 적인 방법으로 점차적으로 대체 되 고,14,15, 21 , 28 , 29 , 30. 그러나 토끼에서는 초기 배아 단계에서 개발 및 시험관 내에서 생산 된 배아는 자연 조건에 유사한 결과를 보장 하는 것이 불가피 하 게 된다. 토끼에서는 자 궁 뿔에 있는 배 반 낭종 팽창 동안 배아 코팅을 재 모델링 한 후에 일어나는 것 처럼, 태아의 뮤 신 코팅은 배아 주입을 허용 하는 결정적인 요소입니다. 그러나, 뮤 신 증 착은 배 란 후 3 일간의 난관로 제한 되며, 코팅 물질의 분자 기전은 크게 알려지지 않은 증 착 법 (31) 이다. 이러한 이유로, 시험관 내에서개발 된 배 반 낭종은 자 궁32,33,34및 배아를 손상 된 뮤 신으로 전달 했을 때 생존 율을 낮게 유지 하는 것으로 알려져 있다. 35. 마찬가지로 토끼에서 transcervical 배아 전달을 보고 한 그룹은 매우 낮은 실시간 출생 률11,26을 초래 했다. 여기에서 우리는 베 렌 펠 더와 Brem18에서 적응 하는 최소 침 습 기술을 제시 하 고 성공적인 출산 율로 배아를 전달 합니다. 표 1의 결과에 따르면, 토끼 배아에서의 모 룰라 단계는 출생 시 높은 생존 율을 달성 하기 위한 최고의 배아 단계 였다. 한 가지 가능한 설명은 초기 단계의 조작에 대 한 민감도가 더 크다는 것입니다. 흥미롭게도, 배아 단계가 진행 됨에 따라 성공률은 증가 하기 때문에 배아의 더 큰 노출로 인해 회복 하기 전에 분 비 물이 산란 됩니다. 그러나 배아가 배 반 낭종 단계에 도달 하 고 자 궁에 전달 되는 곳-매 염이 되 면 값이 급격히 감소 합니다. 언급 된 것 들을 배제 하는 것은 아니지만, 배아 들이 난관 내로 옮겨진 배아 들이 태아 조작 동안 뮤 신 층 내에서 발생 가능한 손상을 회복할 수 있다는 것이 가능한 설명 이다. 따라서 자 궁으로 옮겨진 배 반 낭종은이 메커니즘이 박탈 되어 이식 능력을 손상 시킬 수 있습니다.
이 기술은 약간의 간단한 조작으로 단일 포트 계측기 (5mm 내 시경 트로 카)를 사용 하 여 수행 됩니다. 따라서 the5 내 시경 트로 카의 절 개는 폐쇄를 필요로 하지 않는다. 복 강경 기술 혜택 포함 감소 수술 후 통증, 더 빠른 정상 활동으로 복귀, 그리고 적은 수술 후 합병증. 또한 내 시경 절차는 개복 수술21,36,37과 비교 하 여 더 적은 복 부 유착을 유도 하 고 수용자에의 한 더 나은 면역 반응을 가능 하 게 합니다. 우리 연구실의 증거를 축적 하는 것은 토끼 모델의이 ET 절차의 효과를 입증 했습니다. 따라서, 지난 5 년 동안 총 3909 배아 (1335 신선 및 2574 유리 화 된 배아)가 본 원고에 기재 된 절차를 거쳐 옮겼다. 이 기술의 결과로, 신선 하 고 유리 화 된 전달 배아의 자손 비율이 62.9% 및 42.5% 각각38,39,40, 41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. 많은 연구가이 기법을 기반으로 합니다: 마르코-지 메 네즈 외. 38 , 39 , 40 , 41, 비센테 외. 42, 비와 드 카스트로 외. 43, 사 츠 드 주 아 노 외. 44 , 45 , 47, 라바 라 외. 46.
이 기술을 수행 하기 위한 실용적인 권장 사항은 아래에 설명 되어 있습니다. 배아 배양 실험에서, 배양 배지와 조작 매체 사이에 배아를 이동 시키기 위해 사용 되는 것 대신에 배아 전달을 위한 새로운 카 테 터를 사용 하는 것이 또한 바람직하다. 이는 광 유전적 전달을 피하고 최적의 흐름을 보장 합니다. ET 동안 생식 기관의 처리를 최소화 하는 것이 중요 하며, 난관를 과도 하 게 조작 하면 유착이 발생할 수 있습니다. 난관 꼬인 경우, 배아를 포함 하 고 기계적 조작이 손실을 일으킬 수 있는 카 테 터가 아닌 올바르게 배치 하려고 경 막 외 주사기를 사용 합니다. 카 테 터가 oviduct를 통과 하면 쉽게 미끄러져 나옵니다. 그렇지 않으면 카 테 터가 이탈 했을 수 있습니다. 일단에는 oviduct, 미디어가 흐르지 않는 경우, 카 테 터를 약간 밖으로 이동 하 고 다시 삽입 하려고. 그래도 흐르지 않으면 카 테 터가 막혀 있습니다. 난관에서 제거 하 고 깨끗 한 매체와 함께 접시에 내용을 놓습니다. 다음, 다른 카 테 터에 배아를 다시 로드 하 고 다시 난관에 삽입 하려고. 배달 일반적으로 장소를 걸립니다 28-30 모 룰라 전송 후 일.
또한, 배아 발달 단계가 유사 임신 여성에서 자 궁 환경 보다 더 진보 될 수 있음을 나타내는 증거가 있지만, 반대는 아니다. 구체적으로, 배아는 유리한 자 궁 환경을 기다릴 수 있는 능력을가지고 있지만, 자 궁 환경은 이식10에 대 한 올바른 단계에서 배아를 기다릴 수가 없다. 유리 화 된 배아에 관해서는, 단기/장기 저장 후에 상응 하는 유리한 자 궁 환경과 배아의 발달 단계를 동기화 할 수 있다. 더욱이, 배아 공여 체가 또한 배아 수용자 인 경우, endometrium에 대 한 슈퍼 배 란의 해로운 영향은 바이 트리 화 기법을 사용 하 고 후속 사이클48에서 배아를 이송 함으로써 우회 될 수 있다. 토끼에서, 떨어뜨리고 60-62 h를 미리 (비동기)로 유도 한 수령인의 산란 관으로 옮겨진 배아는 매우 효율적인 기술44,49이다. 이와 관련 하 여, 10-12 h 동안 oviductal 배아 전이가 세포 생리학의 회복과 죽은 세포의 교체에 유익한 효과를 설명할 수 있다는 것이 시사 되었으며 배아 중에 뮤 신 코트에서 유발 된 손상을 복구 하는 것이 아마 조작. 게다가, 유리 화 된 배아는 저장 동안 대 사적으로 부유 했기 때문에 개발에서 지연을 제시 합니다. 따라서 냉동 보존 된 배아를 비동기식으로 받는 사람에 게 양도 하면 배아는 신진 대사 활성을 재 활성화 시킬 수 있으며, 따라서 발달의 배아 단계는 자 궁 환경과 동기화 된다. 대신에, 냉동 보존 된 배아가 동기화 수용 체로 전달 되는 경우, 어머니와 배아 사이의 교차 대화는 성공적인 임신의 발병을 방해 합니다. 토끼에서, 가장 높은 생존 율은 냉동 보존 된 morulae49의 전 하 전달 후에 얻어진 다. 우리의 데이터는이 보고서와 일치 하지만, morula 단계는 70-72 h (표 2)에서의 압축 정도에 따라 냉동 보존 다음에 다른 생존 율을 나타낸다. 여기에서, 압축 morulae는 비 압축 morulae에 비해 출생 시 더 높은 생존 율을 보였다,이는 개발의 모든 단계는 cryoprotectants의 투과에 상대적인 자신의 메커니즘을가지고 있음을 보여주는 이전 보고서와 일치 했다 동결 보존 용액50의 첨가 시 탈수의 정도. 이러한 기술에 기초 하 여, 우리는 유리 화 및 내부 배아 전달의 조합이 액체 질소에 저장 15 년 후에 토끼의 인구를 다시 확립 하는 성공적인 전략 이다, 그들의 부정적인 영향 없이 사후 융해 생존 및 살아있는 출생51.
이 기술을 성공적으로 수행 하려면 다음 세부 정보를 고려해 야 합니다. 유리 화 (DPBS, 평형 화 용액, 유리 화 용액)에 사용 되는 연속적인 매체의 증가 된 밀도는 점진적 배아 탈수로 인 한 배아 수 축을 유도할 수도 있음을 명심 하는 것이 중요 하다. 그러나, 배아가 배지와 평형 화 되 면 정상적인 외관이 회복 된다. 더욱이, 배아가 증가 하는 밀도 매체 사이에서 이동 되 면, 밀도 운동에의 한 매체의 표면으로 이동 하는 경향이 있다. 배아 손실을 방지 하 고 유리 화 하는 시간을 보장 하기 위해 배아를 제자리에 유지 하는 작은 양의 매체에서 유리 화가 수행 하는 것이 좋습니다.
결론적으로, 우리는 ET 기법과 토끼를 모델로 사용 하는 미래 연구를 용이 하 게 하는 배아 유리 화 방법을 모두 설명 합니다. 토끼와 인간 사이의 근접 계통 거리에 따라,이 모델의 사용은 쉽게 인간 임상 의학에 양도 결과를 제공 할 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 실험 동물의 인도적 치료를 개선 하는 목표를 유지 하면서 동물 복지 (교체, 감소 및 정제)의 3 Rs의 개념에 부합 하는 몇 가지 위생 적이 고 경제적인 이점을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 저작물은 스페인의 경제 및 경쟁력을 갖춘 기금 (AGL2017-85162)과 발렌시아 나 연구 2014/036 프로그램에서의 자금으로 지원 되었습니다. N. 마 오 완 영어 텍스트 버전 수정
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV - technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV - technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV - technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
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