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Developmental Biology

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

doi: 10.3791/58055 Published: May 16, 2019

Summary

As técnicas reprodutivas assistidas (ARTs) estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Este manuscrito descreve um procedimento de transferência de embriões minimamente invasivo com um protocolo de criopreservação eficiente que permite o uso de coelhos como um modelo animal ideal de reprodução humana.

Abstract

Técnicas reprodutivas assistidas (ARTs), como cultura embrionária in vitro ou criopreservação embrionária, afetam os padrões de desenvolvimento natural com conseqüências perinatais e pós-natais. Para garantir a inocuidade das aplicações de arte, são necessários estudos em modelos animais. Além disso, como último passo, estudos de desenvolvimento embrionário necessitam de avaliação de sua capacidade de desenvolver progênies saudáveis a termo. Aqui, a transferência de embriões para o útero é indispensável para realizar qualquer experimento relacionado a artes.

O coelho tem sido usado como um organismo modelo para estudar a reprodução de mamíferos há mais de um século. Além de sua proximidade filogenética com a espécie humana e seu pequeno tamanho e baixo custo de manutenção, tem características reprodutivas importantes, como a ovulação induzida, uma cronologia do desenvolvimento embrionário precoce semelhante aos humanos e uma curta gestação que nos permitem estudar facilmente as conseqüências da aplicação ART. Além disso, as artes (tais como a injeção intracytoplasmic do esperma, a cultura do embrião, ou a criopreservação) são aplicadas com eficiência apropriada nesta espécie.

Usando a técnica de transferência de embriões laparoscópica e o protocolo de criopreservação apresentado neste artigo, descrevemos 1) como transferir embriões através de uma técnica fácil, minimamente invasiva e 2) um protocolo eficaz para armazenamento a longo prazo de coelhos embriões para proporcionar capacidades logísticas flexíveis no tempo e a capacidade de transportar a amostra. Os desfechos obtidos após a transferência de embriões de coelhos em diferentes estágios de desenvolvimento indicam que a mórula é o estágio ideal para recuperação e transferência de embriões de coelhos. Assim, é necessária uma transferência de embriões oviductais, justificando o procedimento cirúrgico. Além disso, as mórulas do coelho são vitrificadas com sucesso e transferidas laparoscopically, provando a eficácia das técnicas descritas.

Introduction

Com os objetivos de contornar a infertilidade humana ou melhorar a disseminação de gado de alto valor genético e preservar os recursos genéticos animais, um conjunto de técnicas denominadas coletivamente tecnologias de reprodução assistida, como a superovulação, em fertilização in vitro , cultura embrionária ou criopreservação, foram desenvolvidas1,2. Atualmente, tratamentos hormonais são administrados para estimular os ovários e produzir um grande número de folículos ovarianos antrais1. Os oócitos coletados desses folículos podem ser amadurecidos, fertilizados e desenvolvidos in vitro até serem criospreservados ou transferidos para mães substitutas3. Entretanto, durante esses tratamentos, os gâmetas e os zigitos são expostos a uma série de processos não fisiológicos que podem requerer a adaptação embrionária para sobreviver nessas condições4,5. Esta adaptação é possível devido à plasticidade embrionária precoce, que permite alterações embrionária na expressão gênica e programação do desenvolvimento6. No entanto, essas modificações podem influenciar os estágios subsequentes do desenvolvimento embrionário até a idade adulta, e agora é amplamente aceito que métodos, cronometragem, procedimento de criopreservação ou condições de cultura mostram resultados diferentes sobre o destino do embrião7 , 8. Conseqüentemente, para elucidar os efeitos induzidos específicos das artes, o uso de modelos animais well-caracterizados é inevitável.

O primeiro nascimento vivo documentado resultante da transferência de embriões mamíferos ocorreu em 18909. Hoje, a transferência de embriões (ET) para uma fêmea substituta é um passo crucial no estudo dos efeitos induzidos pela arte durante o pré-implante em estágios subsequentes de desenvolvimento embrionário10. As técnicas de ET dependem do tamanho e da estrutura anatômica de cada animal. No caso de modelos animais de grande porte, foi possível realizar ET por técnicas de ET não-cirúrgicas transcervicais, mas no cateterismo de espécies de menor porte do colo do útero é mais complexa e as técnicas cirúrgicas são freqüentemente utilizadas11. No entanto, o ET cirúrgico pode causar hemorragia que pode prejudicar a implantação e o desenvolvimento embrionário, pois o sangue pode invadir o lúmen uterino, causando morte embrionária10. Técnicas transcervicais e não cirúrgicas ainda são aplicadas em humanos, babuínos, bovinos, suínos e camundongos12,13,14,15,16,17, mas cirúrgicas Os ETs ainda estão sendo usados em espécies como caprinos, ovinos ou outros animais que apresentam dificuldades adicionais10,18,19,20,21, como coelhos (dois independentes) ou camundongos (tamanho pequeno). No entanto, os métodos de transferência cirúrgica tendem a ter sido gradualmente substituídos por métodos menos invasivos. A endoscopia foi utilizada para transferir embriões, por exemplo, em coelhos, suínos e pequenos ruminantes18,19,20. Estes métodos de endoscopia minimamente invasivos podem ser utilizados para transferir embriões para a ampola através do infundíbulo, que é essencial em coelhos e demonstrou efeitos benéficos em algumas espécies20. Isto é baseado na importância do diálogo correto entre o embrião e a mãe durante estágios adiantados do embrião no oviduct. Como mencionado acima, o remodelamento embrionário que ocorre em coelhos durante a migração embrionária através do oviduto é essencial para a obtenção de embriões capazes de implantar22,23.

Modelos animais de maior tamanho, como bovinos, são interessantes porque as características bioquímicas e pré-implante são semelhantes às da espécie humana24. No entanto, grandes animais são muito caros para uso em ensaios preliminares, e roedores são considerados um modelo ideal (76% organismos modelo são roedores) para pesquisa laboratorial25. No entanto, o modelo do coelho fornece algumas vantagens sobre roedores em estudos reprodutivos, como alguns processos biológicos reprodutivos expostos por seres humanos são mais semelhantes em coelhos do que aqueles em camundongos. Humanos e coelhos apresentam uma ativação do genoma embrionário cronológico semelhante, gastrulação e estrutura da placenta hemocorial. Além disso, usando coelhos é possível saber o momento exato da fertilização e estágios de gravidez devido à sua ovulação induzida25. Os ciclos de vida do coelho são curtos, completando a gestação em 31 dias e atingindo a puberdade em cerca de 4-5 meses; o animal é fácil de manusear devido ao seu comportamento dócil e não agressivo, e sua manutenção é muito econômica em comparação com a despesa de animais maiores. Além disso, é crucial mencionar que os coelhos têm um útero duplex com dois Cervixes independentes11,12. Isso coloca o coelho em uma posição preferencial, como os embriões dos diferentes grupos experimentais podem ser transferidos para o mesmo animal, mas em um chifre uterino diferente. Isso nos permite comparar ambos os efeitos experimentais, reduzindo o fator materno dos resultados.

Hoje, os métodos de ET não cirúrgicos não estão em uso no coelho. Alguns estudos realizados no final dos anos 90 utilizando uma técnica de et transcervical resultaram em baixas taxas de entrega variando de 5,5% a 20,0%11,12 versus 50-65% por métodos cirúrgicos, entre eles o procedimento de laparoscopia descrito por Besenfelder e Brem18. As baixas taxas de sucesso desses métodos de ET não cirúrgicos em coelhos coincidem com a falta de remodelação embrionária necessária no oviduto, o que é evitado em ET transcervical. Aqui, nós descrevemos um procedimento Laparoscopic minimamente invasor eficaz do ET usando coelhos como um organismo modelo. Esta técnica fornece um modelo para a pesquisa reprodutiva mais adicional em animais e em seres humanos grandes.

Como os coelhos têm uma janela de tempo particularmente estreita para a implantação de embriões, a ET nesta espécie requer um alto grau de sincronia entre o estágio de desenvolvimento do embrião no ET e o estado fisiológico do receptor27. Em alguns casos, após um tratamento reprodutivo que retarda o desenvolvimento embrionário (como a cultura in vitro ) ou altera a receptividade endometrial (como os tratamentos de superovulação), não há sincronia entre o embrião e o útero materno. Essas situações podem afetar negativamente o desfecho. Para responder nesses contextos, descrevemos um protocolo de vitrificação de mórula de coelho eficaz que nos permite pausar, organizar e retomar os experimentos. Este processo é logisticamente desejável para estudos reprodutivos e nos dá a capacidade de armazenamento a longo prazo de embriões, permitindo o seu transporte. O procedimento laparoscópico e as estratégias de criopreservação permitem melhor planejamento de estudos com menos animais. Assim, nossa metodologia oferece vantagens higiênicas e econômicas e está em conformidade com o conceito de 3Rs (substituição, redução e refinamento) da pesquisa animal com o objetivo declarado de melhorar o tratamento humano de animais experimentais. Assim, com estes métodos, os coelhos constituem um organismo modelo ideal para ensaios in vivo reprodutivos.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais utilizados neste estudo foram realizados de acordo com a diretiva 2010/63/UE CEE para experimentos com animais e revisados e aprovados pelo Comitê de ética para experimentação com animais da Universitat Politècnica de València, Espanha (código de investigação: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detém um certificado de autorização emitido pela administração governamental Valenciana para experimentar em animais. A XGD está autorizada a supervisionar in situ o bem-estar e o cuidado dos animais durante o experimento.

1. transferência de embriões

  1. Preparação de fêmeas receptoras
    1. Use apenas fêmeas sexualmente maduras (> 4,5 meses de idade).
    2. Uma semana antes do ET, adaptar as fêmeas a um regime de 16 h Light/8 h escuro para iniciar o crescimento folicular e maior receptividade feminina.
    3. Selecione as fêmeas destinatárias, observando a turgidez e a cor da vulva. Se a vulva é turgid e avermelhada, a fêmea é receptiva.
    4. Induzir pseudogravidez (ovulação) por uma única injeção intramuscular de 1 μg de acetato de buserelin (análogo sintético do hormônio liberador de gonadotropina), independentemente do peso corporal.
      Nota: normalmente, 0,8 μg é uma dose adequada para a indução da ovulação em coelhos de tamanho médio (4-5 kg), pelo que 1 μg geralmente garante a ovulação.
    5. Induzir a ovulação como muitos dias de antemão como a idade dos embriões a serem transferidos (por exemplo, 70-72 h antes de mórula fresca et).
  2. Anestesia e analgesia
    1. Pesar o coelho e carregar os seguintes anestésicos e analgésicos.
      1. Numa seringa de 1 ml com uma agulha de 30g: xilazina de carga (5mg/kg) e cloridrato de buprenorfina (0, 3 mg/kg). Em outra seringa de 1 mL com uma agulha pericranial 23G, cloridrato de cetamina de carga (35 mg/kg).
    2. Segure o coelho e injete a mistura de xilazina-buprenorfina por via intramuscular.
    3. Insira a agulha pericranial com cetamina na veia marginal da orelha, introduzindo lentamente todos os conteúdos da seringa intravenosamente.
    4. Fixe a agulha e deixe-a inserida durante as restantes etapas para administrar mais anestesia, se necessário.
    5. Deixe o coelho na gaiola (limpo e sem quaisquer outros animais) em um estágio quente.
    6. Uma vez inconsciente, aplique pomada ocular para evitar a secura do olho e verificar a ausência do freflex palpebral.
      Nota: Este protocolo fornece um plano de anestesia cirúrgica para um mínimo de 30 min. Se for necessário mais tempo, injete dosagens adicionais com metade da quantidade de cloridrato de cetamina descrita em 1.2.1 após 30 min.
    7. Monitore a profundidade da anestesia verificando o reflexo do pedal e o movimento respiratório. Mudanças no padrão respiratório para uma taxa irregular e mais rápida indicam a perda do plano adequado de anestesia.
    8. Monitore a cor das membranas mucosas (olhos, lábios, etc.), a frequência respiratória (30-60 respirações por minuto), a frequência cardíaca (120-325 batimentos por minuto) e a temperatura retal (38-39,6 ° c).
    9. Oito horas antes da transferência, reter alimentos de animais para evitar o maior tamanho do intestino e atividade até que o processo de ET é terminado. Deixe o acesso livre à água.
  3. Preparação do embrião
    1. Aqueça a mídia de manipulação do embrião a 25 ° c: Medium base (BM), consistindo de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado com 0,2% (p/v) de albumina sérica bovina.
    2. Trabalhando um estereomicroscópio, enxague os embriões frescos ou descongelados (passo 2) com a BM.
    3. Usando luvas estéreis, prenda um cateter epidural 17G apropriadamente configurado a uma seringa de 1 mL.
    4. Aspirar 1 cm de BM para o cateter, seguido por uma pequena bolha de ar.
    5. Aspirar 5-7embriões em um volume de 10 μL de BM, seguido por uma outra bolha de ar pequena.
    6. Termine de carregar o cateter aspirando 1 cm de BM.
  4. Transferência de embriões
    1. Considere o uso de luvas estéreis, vestido e máscara para garantir um ambiente asséptico.
    2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos, limpe as superfícies onde a cirurgia será executada, e limpe-as com o etanol 70%.
    3. Realize a anestesia como previamente Detalhado (etapa 1,2), verificando a perda de reflexos.
    4. Raspar a pele do abdômen ventral com uma navalha elétrica.
    5. Prepare o abdômen ventral assepticamente.
      1. Limpe a área cirúrgica e remova todo o cabelo restante. Lave a área cirúrgica com um sabão gluconato de clorexidina. Higienizar a área com solução de clorexidina e etanol 96 º (3 vezes).
    6. Coloc o animal em uma tabela cirúrgica morna, na posição de Trendelenburg (cabeça para baixo em 45 °) para assegurar-se de que o estômago e os intestinos sejam situados cranialmente. Considere a evacuação da bexiga se for turgid. Se qualquer vísceras são danificados no processo, o animal pode morrer. Portanto, é importante tê-los adequadamente localizados (Figura 1).
    7. Cubra a área usando uma toalha estéril, com um furo (fenestração) expondo a área raspada, para separar o local cirúrgico de todas as áreas contaminando potenciais.
    8. Insira um trocarte endoscópico de 5 cm na cavidade abdominal, 2 cm caudal ao processo xifóide, e insuflar através dele a cavidade peritoneal com um insuflador mecânico regulador de pressão.
      Nota: a pressão intra-abdominal deve ser de 8-12 mmHg com CO2 (Figura 1a).
    9. Inserir a câmara do endoscópio através do trocarte endoscópico (Figura 1b).
      Nota: identifique o trato reprodutivo, determinando o estado e a posição do infundíbulo e da ampola antes do ET para facilitar os próximos passos.
    10. Insira a agulha peridural 17-G na região inguinal entre 2-3 cm do infundíbulo (Figura 1b).
    11. Identifique a entrada do infundíbulo (Figura 2a, 2B).
    12. Insira o cateter carregado (passo 1,3) através da agulha epidural no abdômen (Figura 1C).
    13. Localize o oviduto e insira 1-2 cm do cateter epidural através do infundíbulo na ampola (Figura 2a-2C). Não progrida muito longe no oviduto para evitar danos e hemorragia.
    14. Solte os embriões no oviduto pressionando suavemente o êmbolo da seringa acoplado ao cateter (Figura 2D-2F). Ambas as bolhas de ar devem sair do cateter.
    15. Retire o cateter logo após os embriões terem sido liberados.
    16. Enxágüe o cateter, aspirando e liberando o meio de manipulação para verific a ausência dos embriões e confirme sua transferência bem sucedida.
    17. Repita os passos 1.4.11 para 1.4.16 no outro lado do útero, se desejado.
    18. Retire a agulha epidural e a câmara do endoscópio.
    19. Liberação CO2 através do trocarte endoscópico. Se o excesso de gás permanece no abdômen do animal, ele terá dor e desconforto.
    20. Retire o trocarte endoscópico da cavidade abdominal. Retire a toalha cirúrgica.
    21. Interrompa a anestesia.
    22. Limpe a incisão feita pelo trocarte com solução de clorexidina. Fechar a incisão feita pelo trocarte com um alumínio micronizado e um curativo de plástico.
  5. Cuidados pós-operatórios
    1. Trate os animais com antibióticos: 10 mgs/quilograma de enrofloxacin, subcutaneously, cada 24-h por 5 dias.
    2. Administrar analgésicos: cloridrato de buprenorfina (0, 3 mg/kg), intramuscularmente, a cada 12 horas durante 3 dias; Meloxicam (0,2 mg/kg), subcutaneamente, a cada 24-h durante 3 dias.
    3. Monitorizar os animais durante pelo menos 30 minutos após a cirurgia (dependendo do animal e da dose de anestesia utilizada) certificando-se de que recuperam as suas condições fisiológicas.
    4. Identifique o receptor (por exemplo, tatuagem de orelha) e os animais da casa individualmente em uma gaiola limpa com a condição ambiental apropriada.

Figure 1
Figura 1: transferência de embriões laparoscópicos assistida por laparoscopia (visão externa). A ) inserção do trocarte endoscópico (um porto). B) inserção da câmara endoscópica e da agulha peridural (seta preta). C) inserção do cateter de transferência do embrião (seta branca) através da agulha epidural. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: transferência de embriões laparoscópicos assistida por laparoscopia (visão interna). A: Inserção do cateter através da agulha epidural na zona abdominal. Asterisco indica o infundibulum. B, C, D: O cateter carregado com os embriões é introduzido na região de ampulla através do infundibulum. E, F: Liberação dos embriões, confirmado pela visualização de um oviduto inchado. Este número foi adaptado de Marco-Jiménez et al. 38. Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. vitrificação e aquecimento embrionário

  1. Realize todas as manipulações à temperatura ambiente (cerca de 22 ° c) para reduzir a toxicidade da solução de vitrificação em temperaturas mais quentes.
    Nota: os embriões podem ser movidos usando 0.1-2 μL de pipeta automática neste protocolo, mas outros dispositivos similares para mover os embriões arrastando o volume mínimo podem ser adequados.
  2. Vitrificar os embriões em um procedimento de adição em duas etapas:
    1. Coloque os embriões por 2 minutos em solução equilibrada consistindo de 10% (v/v) etileno glicol e 10% (v/v) dimetil sulfóxido dissolvido em BM.
    2. Mova os embriões (da etapa 2.2.1) para 1 minuto na solução da vitrificação que consiste em 20% (v/v) etileno glicol e 20% (v/v) dimetil sulfóxido dissolvido em BM.
  3. Coloque os embriões em um ministraw plástico de 125 μL (que contenha uma extremidade fechada com um plugue do algodão e um extremo aberto). O processo é esquematizado na Figura 3.
    1. Acople o fim fechado de 0,125 μl ministraw com o pipetas apropriado (por exemplo captroll III®).
    2. Aspirar BM até 1/3 do comprimento da palha, seguindo por uma pequena bolha de ar.
    3. Aspirar os embriões num volume de 40 μL de solução de vitrificação, seguidos por outra pequena bolha de ar.
    4. Aspirar BM até a primeira fração líquida (etapa 2.3.2) atinge o algodão.
    5. Feche a extremidade aberta com um plugue de palha.
  4. Execute a etapa 2.2.2 enquanto o passo 2,3 está sendo feito para garantir que não mais de um minuto decorrido, o que seria tóxico para os embriões.
  5. Mergulhe o ministraw diretamente no nitrogênio líquido para conseguir a vitrificação.
  6. Armazene o ministraw em um Dewar para o nitrogênio para o tempo desejado.
  7. Descongelar os embriões em um único passo.
    1. Coloc o ministraw horizontalmente 10 cm do vapor líquido do nitrogênio para 20-30 s.
    2. Quando o processo de cristalização começa dentro do ministraw, mergulhe o ministraw em um banho de água a 25 ° c para 10-15 s.
    3. Retire o plugue ministraw e corte o plugue de algodão.
    4. Com um microdispenser acoplado, expelir todo o conteúdo ministraw em uma placa contendo 0,33 M de solução de sacarose a 25 ° c em BM por 5 minutos.
      Nota: esta etapa deve ser feita rapidamente a fim reduzir a exposição do embrião à solução da vitrificação.
    5. Mova os embriões para uma nova placa contendo a solução BM por mais 5 min.
    6. Considere apenas embriões não danificados (com revestimento de mucina intacta e zona pellucida) para continuar com o ET.
      Nota: levar em conta que em embriões descongelados, transferências assíncronas (por exemplo, 60-62 h em transferências de mórula) podem melhorar os resultados, permitindo uma ressincronização entre o embrião e o endométrio materno.

Figure 3
Figura 3: esquematização da palha corretamente carregada. A ) BM refere-se ao embrião que manipula a mídia empregada durante a vitrificação. Os embriões devem ser carregados em solução de vitrificação. B) aspecto macroscópico da palha carregada com um detalhe ampliado da posição embrionária. Este dispositivo de grande volume nos permite vitrificar grande número de embriões, ao contrário de dispositivos de volume mínimo. Além disso, o manuseio deste dispositivo é mais fácil em comparação com os dispositivos de volume mínimo, enquanto os resultados são semelhantes em coelhos41. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

A transferência laparoscópica minimamente invasiva de embriões frescos ou vitrificados coloca o coelho entre os melhores animais modelo para estudos reprodutivos. A tabela 1 mostra os resultados do et fresco em diferentes estágios de desenvolvimento (Figura 4) dos embriões transferidos. A taxa de sobrevida ao nascimento (percentual de embriões resultando em um filhote) provou a eficácia da técnica laparoscópica descrita neste trabalho. Os valores mais elevados foram alcançados quando o te foi realizado com embriões no estágio da mórula, morulae precoce ou compacta. Com base nesses resultados, realizou-se um segundo experimento para demonstrar a sobrevida após a vitrificação desses embriões. Assim, na tabela 2 mostramos os resultados obtidos após a transferência de mórulas de coelhos vitrificados recuperados ao mesmo tempo, diferenciando-se entre os embriões que atingiram um bom grau de compactação ou não. A taxa de sobrevida ao nascer foi diferente entre os diferentes estágios embrionárias, sendo maior nas morulas compactadas. Portanto, a transferência de embriões laparoscópicos é uma técnica confiável para transferir embriões frescos e vitrificados em coelhos

Figure 4
Figura 4: embriões de coelhos. A) pronuclear. B) oito células. C) Morula precoce. D) Morula compacta. E) blastocist. Asterisco indica os dois pronuclei. As setas pretas indicam a zona pellucida. As setas brancas indicam o revestimento do mucin, que varia normalmente entre embriões. ICM: massa interna da pilha. TE: Trophectoderm. Barra de escala: 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fase de desenvolvimento1 Embriões Destinatários Local de transferência Taxa de gravidez (%) Taxa de implantação (%) Taxa de sobrevida ao nascimento (%)2
Pronuclear 78 7 Oviduct 7 (100) 50 (64,0)b 34 (43,6)b
8 células 81 7 Oviduct 7 (100) 60 (74,1)b 53 (65,4)a
Mórula adiantada 81 7 Oviduct 7 (100) 80 (98,8)a 60 (74,1)a
Mórula compacta 80 7 Oviduct 7 (100) 80 (100)a 58 (72,5)a
Blastocisto 80 7 Útero 7 (100) 73 (91,3)a 38 (47,5)b

Tabela 1. Eficiência da transferência de embriões de coelho fresco (in vivo derivado) por laparoscopia. 1embriões diferentes foram recuperados às 18-20h (pronuclear), 36-38h (8 células), 60-62 h (Morula precoce), 70-72 h (Morula compacta) e 80-82 h (blastocist) após o acasalamento. Compacto (> 32 células) e mórulas não-compactos (≈ 32 células) pode ser fundada em 70-72 h, mas apenas mórulas compactos foram transferidos. 2. º Taxa de sobrevivência ao nascimento de beneficiário grávida faz. a, b Os valores com diferentes sobrescritos são estatisticamente diferentes (P < 0,001).

Estágio de desenvolvimento Embriões transferidos Destinatários Taxa de gravidez (%) Taxa de sobrevida ao nascimento (%)1
Não compactada 135 10 9 (90) 62 (45,9)b
Compactado 150 10 10 (100,0) 98 (65,3)a
Total 285 20 19 (95) 160 (56,1)

Tabela 2. Viabilidade da Morula vitrificada compacta vs não compactada. a, bvalores com diferentes sobrescrito são estatisticamente diferentes (P < 0,001). 1. º Taxa de sobrevivência ao nascimento de beneficiário grávida faz. Os embriões foram recuperados ao mesmo tempo (70-72 h) e foram distinguidos em compacto (> 32 pilhas) e mórulas non-Compact (≈ 32 pilhas).

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Discussion

Desde o primeiro caso de nascimento documentado ao vivo de embriões transferidos9, esta técnica e as espécies de coelhos tornaram-se cruciais em estudos reprodutivos. Além disso, estudos de pesquisa de embriões envolvendo manipulação, produção, criopreservação, etc. exigem como último passo a avaliação da capacidade embrionária para gerar progênies saudáveis a termo. Portanto, a técnica de transferência de embriões é indispensável13,28. Ao longo dos anos, os métodos cirúrgicos inicialmente utilizados para transferir embriões para o útero materno foram gradualmente substituídos por métodos menos invasivos na grande maioria das espécies13,14,15, 21 anos de , 27 anos de , 29. º , 30. no entanto, em coelhos, o intraoviductal et em estágios iniciais de embriões de desenvolvimento e embriões produzidos in vitro torna-se inevitável para garantir um resultado semelhante às condições naturais. Em coelhos, o revestimento intraoviductal de mucina é um fator crucial que permite a implantação do embrião, pois ocorre após a remodelação dos revestimentos embrionários durante a expansão do blastocisto nos chifres uterinos. Entretanto, o depósito do revestimento do mucin é limitado ao oviduto por 3 dias que seguem a ovulação, e os mecanismos moleculars do depósito material do revestimento são pela maior parte desconhecidos31. Por estas razões, sabe-se que os blastocistos in vitro-desenvolvidos não sobreviveram quando transferidos ao útero32,33,34, e os embriões com um revestimento danificado do mucin têm uma taxa de sobrevivência mais baixa 35. da mesma forma, os grupos que relataram uma transferência transcervical de embriões em coelhos resultaram em taxas de nascidos vivos muito baixas11,12. Aqui, apresentamos uma técnica minimamente invasiva, adaptada de Besenfelder e Brem18, para transferir embriões com taxas de natalidade bem-sucedidas. De acordo com os resultados da tabela 1, o estágio de mórula em embriões de coelhos foi o melhor estágio embrionário para atingir uma alta taxa de sobrevida ao nascer. Uma possível explicação é a maior sensibilidade à manipulação dos estágios iniciais. Curiosamente, a taxa de sucesso aumenta à medida que o estágio embrionário progride, possivelmente devido à maior exposição do embrião a secreções oviductais antes da sua recuperação. Mas quando os embriões alcançam o estágio do blastocisto e são transferidos lugar-concordantes ao útero, os valores diminuem dràstica. Não excluindo o que foi dito, uma possível explicação poderia ser que os embriões transferidos para o oviduto podem restaurar os possíveis danos gerados na camada de mucina durante a manipulação do embrião. Portanto, os blastocistos transferidos para o útero seriam privados desse mecanismo, o que poderia comprometer sua capacidade de implantação.

A técnica é realizada utilizando-se um único instrumento portuário (5 mm de endoscópio), com leve e breve manipulação. Conseqüentemente, a incisão trocar do endoscópio de the5 milímetros não exige o fechamento. Os benefícios da técnica laparoscópica incluem diminuição da dor pós-operatória, retorno mais rápido à atividade normal e menos complicações pós-operatórias. Além disso, os procedimentos endoscópicos induzem menos aderências abdominais e permitem uma melhor resposta imune pelo receptor em comparação com a cirurgia aberta21,36,37. Acumulando evidências de nosso laboratório demonstrou a eficácia deste procedimento de ET no modelo de coelho. Assim, nos últimos cinco anos, um total de 3.909 embriões (1.335 embriões frescos e 2.574 vitrificados) foram transferidos através do procedimento descrito no presente manuscrito. Como resultado desta técnica, as taxas de descendentes de embriões de transferência fresca e vitrificada foram 62,9% e 42,5%, respectivamente38,39,40,41,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47. muitos estudos baseiam-se nesta técnica: Marco-Jiménez et al. 38 , 39 , 40 , 41, Vicente et al. 42, viudes-de-Castro et al. 43, Saenz-de-juano et al. 44 , 45 , 47, lavara et al. 46.

As recomendações práticas para a realização desta técnica são descritas abaixo. Em experimentos de cultura embrionária, também é aconselhável a utilização de um novo cateter para transferência de embriões em vez do usado para mover os embriões entre os meios de cultura e meios de manipulação. Isto evita a transferência de óleo mineral e assegura um fluxo óptimo. Durante o ET é importante minimizar o manuseio do trato reprodutivo, pois a manipulação excessiva do oviduto pode resultar em aderências. Se o oviduto for torcido, empregue a seringa epidural para tentar posicioná-la corretamente, não o cateter, porque contem os embriões e a manipulação mecânica poderia causar sua perda. Uma vez que o cateter passa através do oviduct, desliza facilmente. Se não o fizer, o cateter pode ter desviado. Uma vez dentro do oviduto, se a mídia não fluir, mova o cateter ligeiramente para fora e tente reinseri-lo novamente. Se ainda não fluir, o cateter está entupido. Retire-o do oviduto e solte o conteúdo em um prato com um meio limpo. Em seguida, recarregar os embriões em outro cateter e tentar reinseri-lo no oviduto novamente. A entrega toma geralmente lugares 28-30 dias após a transferência do mórula.

Além disso, há evidências indicando que o estágio de desenvolvimento embrionário pode ser mais avançado do que o ambiente uterino em fêmeas pseudográvidas, mas não o oposto. Especificamente, os embriões têm a capacidade de aguardar o ambiente favorável do útero, mas o ambiente do útero não pode esperar os embriões no estágio certo para a implantação10. Em relação aos embriões vitrificados, após um armazenamento de curto/longo prazo, é possível sincronizar o estágio de desenvolvimento do embrião com o ambiente favorável do útero correspondente. Além disso, se o doador do embrião é também o receptor do embrião, os efeitos prejudiciais da superovulação no endométrio podem ser contornado usando a técnica da vitrificação e transferindo os embriões em um ciclo subseqüente48. Em coelhos, os embriões vitrificados transferidos para ovidutos de receptores induzidos a ovular 60-62 h de antemão (asynchrony) é uma técnica altamente eficiente44,49. Relacionado com este, sugeriu-se que a transição convoluta do embrião durante 10-12 h poderia explicar os efeitos benéficos na restauração da fisiologia e da recolocação da pilha de pilhas inoperantes, e repara provavelmente o dano induzido no revestimento do mucin durante o embrião Manipulação. Além disso, os embriões vitrificados apresentam um atraso no desenvolvimento, pois foram suspensos metabolicamente durante o armazenamento. Portanto, a transferência de embriões criopreservados para receptores assíncronos permite que o embrião reative sua atividade metabólica e, portanto, o estágio embrionário do desenvolvimento é sincronizado com o ambiente do útero. Em vez disso, se os embriões criopreservados forem transferidos para receptores sincronizadores, a conversa cruzada entre a mãe e o embrião dificulta o início de uma gravidez bem-sucedida. No coelho, a maior taxa de sobrevida foi obtida após a transferência intraoviductal de mórulas criopreservados49. Nossos dados são consistentes com este relato, embora o estágio de mórula apresente diferentes taxas de sobrevida após a criopreservação, dependendo do grau de compactação em 70-72 h (tabela 2). Aqui, as mórulas compactadas apresentaram maiores taxas de sobrevida ao nascer em comparação com as mórulas não compactadas, o que estava em concordância com relatos prévios, mostrando que todas as etapas do desenvolvimento tinham seu próprio mecanismo em relação à permeação de criprotectantes e a extensão da desidratação durante a adição da solução de criopreservação50. Subjacente a estas técnicas, Nós demonstramos que uma combinação de vitrificação e de transferência intraoviductal do embrião é uma estratégia bem sucedida para restabelecer populações do coelho após 15 anos de armazenamento no nitrogênio líquido, sem efeito adverso em seus sobrevivência pós-descongelamento e nascimento ao vivo51.

Os seguintes detalhes devem ser levados em conta para executar com êxito essa técnica. É importante ter em mente que a crescente densidade dos médiuns consecutivos utilizados para a vitrificação (DPBS, solução de equilíbrio, solução de vitrificação) poderia induzir a contração embrionária devido à desidratação progressiva do embrião. No entanto, sua aparência normal é recuperada quando o embrião é equilibrado com o meio. Além disso, quando o embrião é movido entre o aumento dos meios de densidade, ele tende a se mover para a superfície da mídia devido aos movimentos de densidade. Para evitar a perda do embrião e garantir o tempo de vitrificação, é recomendável realizar a vitrificação em pequenas gotas da mídia que manterá o embrião no lugar.

Em conclusão, aqui nós descrevemos uma técnica do et e um método do vitrificação do embrião que facilitam os estudos futuros que usam coelhos como um modelo. Com base na distância filogenética estreita entre coelhos e seres humanos, o uso deste modelo poderia fornecer resultados facilmente transferíveis para a medicina clínica humana. Além disso, nosso método oferece algumas vantagens higiênicas e econômicas, em conformidade com o conceito de 3 RS de bem-estar animal (substituição, redução e refinamento), mantendo o objetivo de melhorar o tratamento humano de animais experimentais.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos do Ministério da economia e da competitividade da Espanha (AGL2017-85162-C2-1-R) e do programa de investigação Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versão de texto em inglês revisada por N. Macowan English Language Service

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 332
Buprenorphine hydrochloride Alvet Escartí 626 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate Sigma Aldrich B3303
Clorhexidine digluconate soap Alvet Escartí 0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution Alvet Escartí 0265DCCA500B
CO2 Air Liquide 99921 CO2 N48.
CO2 Incubator Fisher scientific 15385194
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Sigma Aldrich D5773 Without calcium chloride.
Electric razor Oster Golden A5 078005-140-002
Endoscope camera Optomic Spain S.A OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 30114GK Lightweight trocar model.
Enrofloxacin Alvet Escartí 9993046 To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G Alvet Escartí 514056353 Smaller needles can be also used.
Epidural catheter Vygon corporate 187.10
Epidural needle Vygon corporate 187.10
Ethylene Glycol Sigma Aldrich 102466-M
Eye ointment Alvet Escartí 5273
Ketamine hydrochloride Alvet Escartí 184 To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 26003 AA Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source Optomic Spain S.A Fibrolux 250
Liquid Nitrogen Air Liquide P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. Endoflator®
Meloxicam Alvet Escartí 9993501 To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm Sigma Aldrich CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan) IBOR medica 7140028
Plastic Straw 0.25 mL IMV - technologies 6431
Povidone iodide solution Alvet Escartí 02656DPYS500S
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. 20400040
Stereomicroscope Leica MZ16F There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves Alvet Escartí 087GL010075
Sterile gown Alvet Escartí 12261501
Sterile mask Alvet Escartí 058B15924B
Straw Plug IMV - technologies 6431
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Syringe, 1-mL Fisher scientific 11750425
Syringe, 5-mL Fisher scientific 11773313
Urinary catheter IMV - technologies 17722
Waterbath RAYPA BAE-4
Xylazine Alvet Escartí 525225 To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits Universitat Politècnica de València Line A Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.

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Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho
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Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).More

Garcia-Dominguez, X., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Vicente, J. S. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (147), e58055, doi:10.3791/58055 (2019).

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