Summary
हम कैसे पहचान करने के लिए और murine अस्थि मज्जा से माइलॉयड progenitors के 6 सबसेट चुंबकीय और प्रतिदीप्ति छंटाई (एमएसीएस और FACS) का एक संयोजन का उपयोग कर अलग करने के लिए प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल के लिए इन विट्रो संस्कृति परख (methylcellulose या तरल संस्कृतियों) में इस्तेमाल किया जा सकता है, vivo adoption हस्तांतरण प्रयोगों में , और आरएनए/
Abstract
माइलॉयड progenitors कि उपज न्यूट्रोफिल, monocytes और वृक्ष कोशिकाओं (dc) में पहचाना जा सकता है और रक्त और प्रतिरक्षा विश्लेषण के लिए चूहों की अस्थि मज्जा से अलग । उदाहरण के लिए, सेलुलर और माइलॉयड जनक आबादी की आणविक संपत्तियों के अध्ययन ल्यूकेमिया से प्रभावित परिवर्तन, या प्रदर्शन कैसे प्रतिरक्षा प्रणाली रोगजनक जोखिम का जवाब देने के लिए अंतर्निहित तंत्र प्रकट कर सकते हैं । पहले वर्णित माइलॉयड जनक पहचान के लिए प्रवाह cytometry रणनीतियों कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण प्रगति सक्षम है, लेकिन अंशों वे की पहचान बहुत विषम हैं । सबसे अधिक इस्तेमाल किया गेटिंग रणनीतियों अस्थि मज्जा भिन्न है कि वांछित आबादी के लिए समृद्ध कर रहे हैं को परिभाषित, लेकिन यह भी "दूषित" progenitors की बड़ी संख्या में होते हैं. हमारे हाल के अध्ययनों से इस विविधता का ज्यादा हल किया है, और प्रोटोकॉल हम यहां मौजूद oligopotent और वंश की 6 उपआबादी के अलगाव की अनुमति-2 से प्रतिबद्ध माइलॉयड progenitors पहले अस्थि मज्जा भिंन वर्णित है । प्रोटोकॉल 3 चरणों का वर्णन करता है: 1) अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव, 2) टेम progenitors के लिए संवर्धन चुंबकीय द्वारा सक्रिय कोशिका छँटाई (एमएसीएस द्वारा वंश कमी), और 3) (सहित) प्रवाह cytometry द्वारा माइलॉयड जनक उपसमुच्चय की पहचान प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई, FACS, यदि वांछित). इस दृष्टिकोण जनक ठहराव और अलगाव की एक किस्म के लिए इन विट्रो और vivo अनुप्रयोगों में अनुमति देता है, और पहले से ही रास्ते और न्युट्रोफिल, monocyte, और डीसी भेदभाव के तंत्र में उपंयास अंतर्दृष्टि झुकेंगे ।
Introduction
Monocytes, न्यूट्रोफिल, और वृक्ष कोशिकाओं (dc) माइलॉयड कोशिकाओं है कि टेम progenitors से पैदा होते हैं, मुख्य रूप से अस्थि मज्जा में, एक प्रक्रिया द्वारा myelopoiesis बुलाया । आम माइलॉयड progenitors (CMPs) माइलॉयड कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता है, साथ ही megakaryocytes और एरिथ्रोसाइट्स, लेकिन नहीं लसीकावत् कोशिकाओं । Granulocyte-monocyte progenitors (GMPs), जो CMPs से प्राप्त होते हैं, granulocytes और monocytes का उत्पादन करते हैं, लेकिन megakaryocyte और एरिथ्रोसाइट क्षमता खो चुके हैं. Monocytes और शास्त्रीय और plasmacytoid dc (cDCs/पीडीसी) भी progenitors द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, जो आम monocyte से उत्पन्न करने के लिए सोचा-डीसी progenitors (MDPs), CMPs के रूप में जाना जाता है । वंश क्षमता के क्रमिक प्रतिबंध अंततः वंश में परिणाम प्रतिबद्ध progenitors: granulocyte progenitors, monocyte progenitors, और वृक्ष सेल progenitors (figure 1).
Weissman और सहकर्मियों ने बताया कि CMPs में पाए जाते हैं कि लिन- सी-किट+ Sca-1- (LKS-) CD34+ FcγRलो अंश माउस की अस्थि मज्जा, जबकि GMPs में समाहित हैं LKS- CD34+ FcγR हाय अंश1। हालांकि, इन "सीएमपी" और "जीएमपी" भिन्न बहुत विषम हैं. उदाहरण के लिए, "जीएमपी" अंश में वंश-कमिट granulocyte progenitors और monocyte progenitors1,2भी शामिल हैं । MDPs को CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitors होने की सूचना अलग से दी गई थी जो CD34 और FcγR3,4को भी व्यक्त करती है । MDPs सीडीसी/pDC-उत्पादन आम डीसी progenitors (CDPs), जो सी-किट (CD117) के निचले स्तर व्यक्त करने के लिए सूचित किया गया है और LKS- अंश5में शामिल नहीं है दे ।
यह पहले से ही माना जाता था कि monocytes एक मार्ग (सीएमपी-जीएमपी-एचडीपी-monocyte) के माध्यम से उठता है । इस मॉडल के अनुरूप, monocyte प्रतिबद्ध progenitors द्वारा उत्पादित GMPs (नामित monocyte progenitors, एमपीएस)2 और MDPs (नामांकित कॉमन monocyte progenitors, cMoPs)6 को साझा सतह मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर एक ही कोशिकाओं को दिखाई . हालांकि, हम हाल ही में प्रदर्शित किया कि monocytes स्वतंत्र रूप से GMPs और MDPs द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण7द्वारा सांसदों और cMoPs के बीच भेद करने में सक्षम थे.
हम हाल ही में संशोधित Weissman "सीएमपी" और "जीएमपी" गेटिंग रणनीति C57BL के 6 उपभागों की पहचान करने के लिए/6J माउस अस्थि मज्जा अलग oligopotent और वंश-प्रतिबद्ध माइलॉयड जनक सबसेट युक्त. हम पहले की रिपोर्ट है कि Ly6C और CD115 के लिए धुंधला oligopotent GMPs के अलगाव परमिट, साथ ही साथ granulocyte progenitors (जीपीएस) और monocyte progenitors (दोनों सांसदों और cMoPs, जो वर्तमान में हम अलग करने में असमर्थ हैं) से "जीएमपी" अंश2 (LKS - CD34+ FcγRहाय गेट; चित्रा 1) । हम बाद में प्रदर्शन किया है कि MDPs मुख्य रूप से "सीएमपी" अंश में पाया जाता है (LKS- CD34+ FcγRलो गेट), जो भी शामिलFlt3 + CD115lo और Flt3- सबसेट7 (चित्रा 1 ). सीएमपी-Flt3+ CD115lo भिन्न पैदावार दोनों GMPs और MDPs अपनाने पर स्थानांतरण. सीएमपी-Flt3- सबसेट progenitors सीएमपी-Flt3+ CD115लो कोशिकाओं और GMPs के बीच मध्यवर्ती होने के लिए दिखाई देते हैं. MDPs के विपरीत, दोनों सीएमपी-Flt3+ CD115लो और सीएमपी-Flt3- भिन्न भी megakaryocyte और एरिथ्रोसाइट क्षमता के अधिकारी.
यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि क्या "सीएमपी" भिन्न progenitors होते हैं कि वास्तव में oligopotent हैं (जैसे, सीएमपी के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं-Flt3+ CD115lo अंश कि अधिकारी न्युट्रोफिल, monocyte, डीसी, megakaryocyte, और एरिथ्रोसाइट क्षमता), या वैकल्पिक रूप से, और अधिक प्रतिबंधित वंश क्षमता के साथ progenitors का एक मिश्रण शामिल हैं । कॉलोनी बनाने की परख (methylcellulose संस्कृतियों) granulocyte के साथ कोशिकाओं से पता चला (न्युट्रोफिल), एरिथ्रोसाइट, monocyte और megakaryocyte क्षमता (GEMM कोशिकाओं) में "सीएमपी", सीएमपी-Flt3+ CD115lo और सीएमपी-Flt3- भिन्न1 ,7, लेकिन डीसी क्षमता के आकलन की अनुमति नहीं है । इसके विपरीत, कॉलोनी बनाने की परख oligopotent GMPs के अस्तित्व को प्रदर्शित किया (दोनों न्युट्रोफिल और monocyte क्षमता के साथ progenitors) "जीएमपी" अंश1,2में, और यह हाल ही में एकल सेल द्वारा समर्थित है transcriptomic विश्लेषण8. यह वर्तमान में ज्ञात नहीं है, तथापि, क्या इन oligopotent GMPs भी अंय granulocytes (इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और मस्तूल कोशिकाओं) का उत्पादन ।
इन अध्ययनों के आधार पर, अब हम प्रदर्शन कैसे 7 सतह मार्करों (सी-किट, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C और CD115) की पहचान और oligopotent और वंश की प्रतिबद्ध माइलॉयड progenitors के इन 6 सबसेट को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल में इन विट्रो संस्कृति परख (methylcellulose या तरल संस्कृतियों) के लिए लागू किया जा सकता है, में vivo अपनाने चूहों में स्थानांतरण प्रयोगों, और आणविक विश्लेषण (थोक और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण, पश्चिमी सोख्ता, आदि) ।
प्रोटोकॉल 3 चरणों के होते हैं: 1) अस्थि मज्जा कोशिकाओं के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी, 2) टेम progenitors के लिए संवर्धन (चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई), और 3) पहचान, और अलगाव अगर वांछित, जनक के प्रवाह द्वारा सबसेट cytometry (एक विश्लेषक या एक सॉर्टर, के रूप में उपयुक्त का उपयोग करके) । पहला कदम femurs और euthanized चूहों के tibias से अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव है और अन्य पहले वर्णित प्रोटोकॉल9के समान है. अगला, नमूना स्टेम और जनक कोशिकाओं एरिथ्रोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, monocytes, लिम्फोसाइटों, आदि के सेल सतह मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का एक कॉकटेल का उपयोग करने के लिए समृद्ध है , विभेदित कोशिकाओं को चूस । यह अनिवार्य नहीं है, लेकिन दृढ़ता से जनक सबसेट का पता लगाने का अनुकूलन की सिफारिश की है, और जनक पहचान और प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक समय के लिए जरूरत एंटीबॉडी की मात्रा को कम करने के लिए. वंश घट प्रोटोकॉल नीचे का वर्णन चुंबकीय-सक्रिय कक्ष छँटाई (एमएसीएस) एक चूहे वंश सेल कमी किट का उपयोग (जो CD5 के खिलाफ biotinylated एंटीबॉडी शामिल हैं, CD45R (B220), CD11b, जीआर-1 (Ly6G/ग), 7-4, और तेर-११९, प्लस विरोधी बायोटिन microbeads) और एक स्वचालित चुंबकीय विभाजक । अंतिम चरण की पहचान है (और छंटाई, यदि वांछित) जनक उपसमुच्चय के प्रवाह cytometry द्वारा । एंटीबॉडी पैनल नीचे वर्णित (भी तालिका 1देखें) 4 पराबैंगनीकिरण (४०५ एनएम, ४८८ एनएम, ५६१ एनएम, ६४० एनएम) के साथ एक प्रवाह cytometer (विश्लेषक या सॉर्टर) में इस्तेमाल किया जा करने के लिए डिजाइन किया गया है ।
चित्रा 1: न्युट्रोफिल, monocyte और डीसी progenitors और भेदभाव रास्ते । myelopoiesis7 के हाल ही में संशोधित मॉडल "CMPs" (नीला) और "GMPs" (हरा)1 मढ़ा के लिए Weissman गेट्स के साथ, सचित्र है । यह आंकड़ा Yáñez एट अल. २०१७7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Protocol
यहां बताए गए सभी तरीकों देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. माउस अस्थि मज्जा और एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के अलगाव
- संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार माउस को Euthanize ।
- अपनी पीठ पर euthanized माउस रखें और यह ७०% इथेनॉल (ेतोः) के साथ स्प्रे । एक छोटा (3-5 मिमी) टखने के स्तर पर प्रत्येक हिंद अंग में तेज, कहा कैंची का उपयोग कर चीरा, और त्वचा खींच शरीर की ओर इसे पैरों से हटाने के लिए और मांसपेशियों और हड्डियों को बेनकाब ।
- हड्डियों से मांसपेशियों (quadriceps, हैमस्ट्रिंग, आदि) को कैंची से ट्रिम करके, हड्डी की दिशा का पालन करके निकालें । हड्डियों को नुकसान न हो इसके लिए सावधानी बरतें ।
- कूल्हे के जोड़ों से femurs को दूर करना और पैरों को अलग करने के लिए संयोजी ऊतक और मांसपेशियों में कटौती, हड्डियों में कटौती करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा.
- tibias से एड़ियों का पता लगाने के द्वारा पैर निकालें, हड्डियों बाँझ पंजाब या मीडिया की एक ट्यूब में जगह है, और उन्हें बर्फ पर ऊतक संस्कृति के कमरे के लिए परिवहन.
नोट: कुछ अन्य अनुप्रयोगों के लिए (जैसे, कुल अस्थि मज्जा कोशिकाओं से मैक्रोफेज पाने) यह थोड़ी देर के लिए बर्फ पर हड्डियों को छोड़ने के लिए संभव है, लेकिन जनक अलगाव के लिए यह downregulation से बचने के लिए जितना जल्दी संभव हो आगे बढ़ना करने के लिए महत्वपूर्ण है महत्वपूर्ण सतह मार्करों (विशेष रूप से CD115) । - एक सुरक्षा कैबिनेट में, हड्डियों से किसी भी बचे हुए कोमल ऊतक को टिशू पेपर से रगड़कर निकाल दें ।
नोट: प्रोटोकॉल एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए अगर एक बाँझ नमूना सेल संस्कृति के लिए या FACS छंटाई के बाद vivo परख में आवश्यक है । यदि बाँझ कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है, पूरी प्रक्रिया लैब बेंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है । - संक्षेप में ७०% ेतोः में हड्डियों विसर्जित उंहें संक्रमित करने के लिए, और फिर बाँझ पंजाबियों में उंहें धोने के लिए ।
- tibias और fibulas से femurs को घुटने के माध्यम से काट कर अलग कर दें, और fibulas को त्याग दें ।
- तेज कैंची से हड्डियों के सिरों को काट लें.
- फसल ठंड बाँझ पंजाबियों के साथ अस्थि मज्जा के रूप में इस प्रकार जब तक हड्डियों सफेद दिखाई देते हैं:
- पकड़ संदंश के साथ प्रत्येक हड्डी है, और एक 26G एक छोर पर अस्थि शाफ्ट में ठंड बाँझ पंजाब युक्त सिरिंज एक 10 मिलीलीटर से जुड़ा सुई डालें.
- अस्थि के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और फ्लश 2-5 एमएल पंजाबियों के ऊपर पकड़ मज्जा फसल के लिए ।
- (2 femurs और 2 tibias) माउस प्रति सभी 4 हड्डियों से मज्जा हार्वेस्ट ।
- धीरे पिपेट ऊपर और नीचे एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ एक कोशिका निलंबन फार्म के लिए अस्थि मज्जा को समग्र ।
- फ़िल्टर 30 माइक्रोन नायलॉन जाल का एक टुकड़ा के माध्यम से अस्थि मज्जा निलंबन हड्डी टुकड़े और सेल समुच्चय को खत्म करने के लिए, जिससे एक एकल सेल निलंबन पैदा ।
- 5 मिनट के लिए २८० x g पर एकल सेल निलंबन केंद्रापसारक, और बाँझ धुंधला बफर में सेल गोली resuspend (पंजाबियों + ०.५% FBS + 2 मिमी EDTA), माउस प्रति 5 मिलीलीटर धुंधला बफर का उपयोग कर (जैसे, femurs और 2 चूहों के tibias से परित कक्षों के लिए 10 मिलीलीटर).
- एक 10 μL aliquot के नमूने ले लो, यह 10 μL Trypan नीले रंग के साथ मिश्रण है, और एक μL पर परिणामी Trypan ब्लू-लेबल नमूना के 10 hemocytometer लोड । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना.
नोट: यदि कोशिकाओं को भी विश्वसनीय गिनती के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, Trypan नीले जोड़ने से पहले नमूना पतला ।
2. जनक संवर्धन चुंबकीय द्वारा सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस)
- पूरे एक सेल निलंबन केंद्रापसारक (या के रूप में कई कोशिकाओं के रूप में वांछित उपज प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं) 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २८० x जी में और ४० μL धुंधला बफर (पंजाब + ०.५% FBS + 2 मिमी EDTA) 107 कोशिकाओं प्रति में सेल गोली resuspend ।
नोट: यह भी वंश घट किट निर्माता से एमएसीएस बफर का उपयोग करने के लिए संभव है ( सामग्री की तालिकादेखें) धुंधला बफर के लिए एक विकल्प के रूप में । - वंश कमी किट के साथ आपूर्ति की निर्देशों के अनुसार वंश घट प्रदर्शन । निंनलिखित निर्देश सामग्री की तालिकामें देखा किट के लिए कर रहे हैं । किसी भिन्न किट का उपयोग किया जाता है, तो निर्माता के निर्देशों का पालन करें और उसके बाद चरण २.३ करने के लिए आगे बढ़ें ।
- 107 कोशिकाओं प्रति 10 μL बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें, pipetting द्वारा मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
- 107 कोशिकाओं और मिश्रण प्रति 30 μL धुंधला बफर/
- 107 कोशिकाओं प्रति 20 μL विरोधी बायोटिन microbeads जोड़ें । अच्छी तरह से मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए गर्मी ।
नोट: भंवर microbeads उंहें कोशिकाओं को जोड़ने से पहले यकीन है कि वे पूरी तरह से फैला रहे है बनाने के लिए । - 107 कोशिकाओं के अनुसार 1 मिलीलीटर धुंधला बफर/एमएसीएस बफर जोड़ें, 5 मिनट के लिए २८० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, और 108 कोशिकाओं के लिए अप करने के लिए ५०० μL धुंधला बफर में सेल गोली resuspend/ 10 से अधिक8 कोशिकाओं के लिए, के अनुसार धुंधला बफर की मात्रा पैमाने/
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्वचालित चुंबकीय विभाजक तैयार करें ।
- लेबल वाले कक्षों को विभाजक में रखने वाली ट्यूब रखें और ऋणात्मक चयन प्रोग्राम चुनें.
- नकारात्मक अंश लीजिए, जिसमें जनक-समृद्ध वंश-नकारात्मक (लिन-) कोशिकाएं शामिल हैं । धनात्मक अंश को छोड़ें, जिसमें चुंबकीय-लेबल वाले वंश-धनात्मक कक्ष हों.
- लिन- २८० x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं, और 2 मिलीलीटर धुंधला बफर में सेल गोली resuspend (जैसे, 4 मिलीलीटर अगर अस्थि मज्जा 2 चूहों से जमा किया गया था) के केंद्रापसारक ।
नोट: गोली अब लाल के बजाय सफेद होना चाहिए क्योंकि एरिथ्रोसाइट्स समाप्त हो गया है । - लिन- कोशिकाओं के एक 10 μL aliquot ले लो, यह 10 μL Trypan नीले रंग के साथ मिश्रण, और एक μL के परिणामस्वरूप Trypan नीले लेबल वाले नमूने के 10 hemocytometer लोड । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना.
नोट: यदि कोशिकाओं को भी विश्वसनीय गिनती के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, Trypan नीले जोड़ने से पहले नमूना पतला ।
3. माइलॉयड जनक पहचान और अलगाव प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा
- लेबल 9 microcentrifuge (१.५ या 2 मिलीलीटर) ट्यूबों के लिए: 1) unstain हुआ कोशिकाओं, 2-8) कोशिकाओं एकल fluorophore के साथ दाग-संयुग्मित एंटीबॉडी के खिलाफ FcγR (CD16/32), सी-किट, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C और CD115 वोल्टेज चयन और रंग क्षतिपूर्ति के लिए, और 9) नमूना कोशिकाओं जनक पहचान और छंटाई के लिए सभी 7 एंटीबॉडी के साथ दाग हो ।
- प्रत्येक नियंत्रण ट्यूबों के लिए १००,००० कोशिकाओं को वितरित (ट्यूबों 1-8), और शेष सभी कोशिकाओं (या कम अगर वांछित) के लिए नमूना ट्यूब (ट्यूब 9).
नोट: यदि नमूना मात्रा से अधिक है १.५-2 मिलीलीटर, यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना कोशिकाओं को वितरित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, उन्हें केंद्रापसारक और गोली resuspend (नीचे चरण ३.३), और फिर बाद में धुंधला कदम के लिए एक microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण. - 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, और १०० μL धुंधला बफर में नियंत्रण ट्यूब छर्रों resuspend (पंजाबियों + ०.५% FBS + 2 मिमी EDTA) और १०० μL में नमूना ट्यूब गोली 5 x 106 कोशिकाओं के प्रति बफर धुंधला (जैसे, २०० μL के लिए 1 x 107 कोशिकाओं) ।
- FcγR एकल दाग ट्यूब और नमूना ट्यूब के लिए 2 μg/एमएल विरोधी CD16/CD32-APC-Cy7 जोड़ें । भंवर धीरे मिश्रण करने के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: यह FcγR के साथ नमूना कोशिकाओं दाग महत्वपूर्ण है (CD16/32) अंय एंटीबॉडी को जोड़ने के लिए गैर विशिष्ट एफसी-मध्यस्थता एंटीबॉडी बाध्यकारी कारण प्रतियोगिता को रोकने से पहले एंटीबॉडी । एक FcγR अवरुद्ध एजेंट के साथ कोशिकाओं की मशीन नहीं है । - इसी एकल दाग ट्यूबों के लिए अंय एंटीबॉडी जोड़ें (1 एंटीबॉडी प्रत्येक) और नमूना ट्यूब (सभी 6 एंटीबॉडी): 10 μg/एमएल सी-किट-पैसिफिक ब्लू, 2 μg/एमएल Sca-1-पे-Cy7, 25 μg/एमएल CD34-FITC, 10 μg/एमएल Flt3-APC, 2 μg/एमएल Ly6C-PerCP-cy 5.5, और 4 μg/एमएल CD115-पे । धीरे भंवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
- नियंत्रण ट्यूबों के लिए ९०० μL धुंधला बफर जोड़ें, और नमूना ट्यूब करने के लिए 107 कोशिकाओं प्रति 1 मिलीलीटर धुंधला बफर । 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और धुंधला बफर में सेल गोली resuspend: २०० μL प्रति नियंत्रण ट्यूब, और ५०० μL प्रति 25 x 106 नमूना ट्यूब में कोशिकाओं । resuspend कोशिकाओं 5 मिलीलीटर FACS ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
नोट: नमूना मात्रा १.५-2 मिलीलीटर से अधिक है, तो यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । - निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लो cytometer (विश्लेषक या सॉर्टर) तैयार करें ।
- वोल्टेज और रंग मलता है सेट अप करने के लिए प्रवाह cytometer के माध्यम से दाग और एकल दाग नियंत्रण कोशिकाओं चलाएँ.
- नमूना कक्षों को चलाने, gate जनक उपसमुच्चय के रूप में नीचे दिए गए और आकृति 2में सारांशित, और यदि इच्छित, FACS सॉर्ट करने के लिए संगत जनक सबसेट को अलग करें ।
नोट: यह आमतौर पर लगभग २००,००० कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के लिए प्रत्येक जनक गेट में कम से १,००० घटनाओं ।- सभी कोशिकाओं के एक डॉट भूखंड बनाएं, FSC प्रदर्शित-एक (x-अक्ष) और एसएससी-एक (y-अक्ष), और गेट मलबे और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए = > "लाइव" कोशिकाओं ।
- "लाइव" कोशिकाओं की एक डॉट प्लॉट बनाएँ, FSC-H (x-अक्ष) और FSC-W (y-अक्ष), और गेट को बाहर दोहरी = > live/स्वेटर (FSC) गेट प्रदर्शित ।
- live/स्वेटर (FSC) कक्षों की एक डॉट प्लॉट बनाएं, ssc-H (x-अक्ष) और ssc-W (y-अक्ष), और गेट को बाहर दोहरी = > live/स्वेटर (FSC)/singlet (SSC) gate प्रदर्शित करना ।
- live/स्वेटर (FSC)/singlet (SSC) कक्षों की एक डॉट प्लॉट बनाएं, Sca-1 (x-अक्ष) और c-किट (y-अक्ष) प्रदर्शित करें, और c-किट+ Sca-1- कक्ष = > LKS- कक्षों का चयन करने के लिए गेट ।
- LKS की एक डॉट प्लॉट बनाएं- कोशिकाओं, CD34 प्रदर्शित (x-अक्ष) और FcγR (y-अक्ष), और गेट का चयन करने के लिए CD34+ FcγRlo कोशिकाओं = > "CMPs", और CD34+ FcγRहाय कोशिकाओं = > "GMPs" ।
नोट: यह "CMPs" और "GMPs" के रूप में ठीक संभव के रूप में गेट करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह एक pseudocolor घनत्व भूखंड या सटीक गेटिंग के लिए एक समोच्च भूखंड का उपयोग करने के लिए उपयोगी है । - एक डॉट प्लॉट बनाएं "CMPs", प्रदर्शित CD115 (x-अक्ष) और Flt3 (y-अक्ष), और गेट का चयन करने के लिए:
Flt3+ CD115लो सेल = > सीएमपी-Flt3+ CD115लो सेल,
Flt3- CD115lo कोशिकाओं = > सीएमपी-Flt3- कोशिकाओं,
Flt3+ CD115हाय कोशिकाओं = > MDPs । - "GMPs" की एक डॉट भूखंड बनाएं, Ly6C प्रदर्शित (x-अक्ष) और FcγR (y-अक्ष), और गेट का चयन करने के लिए Ly6C-कोशिकाओं = > "जीएमपी-Ly6C- कोशिकाओं", और Ly6C+ कोशिकाओं = > "जीएमपी-Ly6C+ कोशिकाओं".
- एक डॉट प्लॉट बनाएं "जीएमपी-Ly6C- कोशिकाओं", CD115 (x-अक्ष) और Flt3 (y-अक्ष), और गेट का चयन करने के लिए प्रदर्शित:
Flt3- CD115lo कोशिकाओं = > GMPs । - एक डॉट प्लॉट बनाएं "जीएमपी-Ly6C+ कोशिकाओं", प्रदर्शित CD115 (x-अक्ष) और Flt3 (y-अक्ष), और गेट का चयन करने के लिए:
Flt3- CD115lo कोशिकाओं = > जीपीएस,
Flt3- CD115hi cells = > MPs + cMoPs ।
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Representative Results
प्रोटोकॉल का प्रयोग ऊपर वर्णित है, यह ~ १००,०००,००० कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव है (लाल रक्त कोशिकाओं, या ~ ५०,०००,००० nucleated कोशिकाओं सहित) दोनों femurs और tibias (एक C57BL/6J माउस के 2 पैर) से (6-8 सप्ताह पुराने, पुरुष या महिला) । 1-2 लाख लिन- कोशिकाओं लिन की स्थापना के द्वारा प्रति माउस पृथक किया जा सकता+ कोशिकाओं ।
6 माइलॉयड जनक उपसेट में से प्रत्येक लिन- कोशिकाओं के ~ 1-4% का गठन किया । वंशावली घट रही है progenitors के लिए विभेदित कोशिकाओं और समृद्ध में कुशल है, लेकिन लिन- अंश सी किट के अलावा सी के एक बड़े अनुपात- किट+ progenitors (चित्रा 3ए) शामिल हैं । FACS छंटाई के बाद जनक पैदावार सॉर्टर सेटिंग्स इस्तेमाल के आधार पर भिंन हो सकते है (जैसे, अधिकतम उपज बनाम इष्टतम शुद्धता), लेकिन सामांय में यह १०,०००-अंश प्रति ४०,००० कोशिकाओं (चित्र बी) प्राप्त करने के लिए संभव है । पोस्ट सॉर्ट प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रकट करना चाहिए > 95% प्रत्येक अंश (चित्रा 3सी) की शुद्धता ।
चित्रा 2:6 माइलॉयड जनक अंशों की पहचान के लिए गेटिंग रणनीति । (क) प्रगतिशील गेटिंग के जीवित लिन- कोशिकाओं-> singlets (FSC)-> singlets (एसएससी)-> LKS- कोशिकाओं-> CD34+ FcγRlo ("सीएमपी") और CD34+ FcγRहाय ("जीएमपी") भिन्न-> 6 माइलॉयड जनक सबसेट । (ख) 6 जनक अंश द्वारा सतह मार्कर अभिव्यक्ति का सारांश । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: प्रतिनिधि जनक पैदावार और पवित्रता । (क) प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंडों सी किट और CD11b अभिव्यक्ति दिखा अस्थि मज्जा कोशिकाओं से पहले और बाद वंश कमी, progenitors के संवर्धन का प्रदर्शन (सी-किट+ कोशिकाओं) । (ख) प्रत्येक जनक अंश के लिए कोशिका पैदावार, मतलब के रूप में प्रस्तुत + 30 प्रयोगों के मानक विचलन । अप करने के लिए 20 चूहों से अस्थि मज्जा कोशिकाओं प्रत्येक प्रयोग के लिए परित थे । (ग) प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंडों से पोस्ट-सॉर्ट विश्लेषण, FACS-क्रमबद्ध जनक अंशों की शुद्धता का प्रदर्शन. पैनल सी Yáñez एट अल. २०१७7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| लेजर | चैनल | फ़िल्टर | दर्पण |
| ४०५ एनएम | ए. | 670/30 | 635LP |
| बी. | 525/50 | 505LP | |
| c. सी-किट-प्रशांत नीला | 450/50 | ||
| ४८८ एनएम | ए. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-cy 5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. एसएससी | 488/10 | ||
| ५६१ एनएम | अ. Sca-1-पे-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| बी. | 710/50 | 690LP | |
| सी. | 660/20 | 640LP | |
| डी. | 610/20 | 600LP | |
| ड. CD115-पे | 582/15 | ||
| ६४० एनएम | अ. fcυr-सुरक्ष-Cy7 | 780/60 | 750LP |
| बी. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
तालिका 1: एंटीबॉडी पैनल और प्रवाह cytometer विंयास ।
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Discussion
माउस माइलॉयड जनक पहचान के लिए Weissman गेटिंग रणनीति1 लगभग 20 वर्षों के लिए immunologists और hematologists के लिए सोने के मानक किया गया है, लेकिन यह अब स्पष्ट है कि "सीएमपी" और "जीएमपी" गेट्स बहुत विषम और अधिक सटीक रहे है गेटिंग रणनीतियों की जरूरत है । प्रोटोकॉल है कि हम यहां वर्णित है oligopotent और वंश की पहचान-C57BL/6J चूहों में प्रतिबद्ध सबसेट विशिष्ट माइलॉयड progenitors और myelopoiesis रास्ते के मानचित्रण के और अधिक सटीक ठहराव के लिए परमिट, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की जांच के रूप में , माइलॉयड भेदभाव के विशिष्ट चरणों में ऑपरेटिंग आणविक तंत्र । जनक सबसेट सॉर्ट किया जा सकता है, यदि वांछित, आणविक विश्लेषण के लिए, इन विट्रो में और vivo में भेदभाव का आकलन आदि
प्रोटोकॉल जवान (6-8 सप्ताह पुरानी) C57BL/6J चूहों का उपयोग कर विकसित किया गया था और दोनों पुरुष और मादा चूहों के लिए उपयुक्त है । हम पुराने चूहों में जनक सबसेट की विशेषता नहीं है । हम मार्करों उम्र के साथ बदल जाएगा आशा नहीं है, लेकिन उपसमुच्चय के सापेक्ष अनुपात भिन्न हो सकते हैं. हम अंय माउस उपभेदों में जनक सबसेट का आकलन नहीं किया है ।
हमारे संशोधित गेटिंग रणनीति का पहला आवेदन प्रतिलेखन कारक इंटरफेरॉन विनियामक कारक 8 (IRF8)2द्वारा माइलॉयड सेल भाग्य विकल्प के विनियमन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया गया था । IRF8 पहले GMPs द्वारा व्यक्त की रिपोर्ट (Weissman "जीएमपी" अंश) और monocyte जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के द्वारा monocyte भेदभाव के लिए आवश्यक था, न्युट्रोफिल जीन अभिव्यक्ति को दबा, और न्युट्रोफिल apoptosis10को बढ़ावा देने । हमारे संशोधित गेटिंग रणनीति का प्रयोग, हम प्रदर्शन किया है कि IRF8 oligopotent GMPs द्वारा व्यक्त नहीं है, लेकिन दोनों जीपीएस और सांसदों + cMoPs2द्वारा व्यक्त की है । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि IRF8 जीपी और सांसद + cMoP अस्तित्व और भेदभाव, बजाय वंश का उत्पादन-oligopotent GMPs द्वारा प्रतिबद्ध progenitors नियंत्रित करता है । इसी तरह, हम हाल ही में हमारे संशोधित गेटिंग रणनीति का इस्तेमाल फिर से myelopoiesis के मॉडल को परिभाषित, और प्रदर्शन किया है कि GMPs और MDPs कार्यात्मक अलग भड़काऊ monocytes 2 स्वतंत्र रास्ते7के माध्यम से उत्पादन ।
वंश घट कदम के बजाय एक स्वचालित चुंबकीय विभाजक के एक मैनुअल चुंबकीय विभाजक का उपयोग किया जा सकता है, और वंश कमी भी biotinylated वंश मार्कर एंटीबॉडी कॉकटेल का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और एक fluorophore-संयुग्मित विरोधी बायोटिन एंटीबॉडी, गेटिंग के साथ दाग कोशिकाओं का चयन करने के लिए । वंश घट सबसे विभेदित कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है और सी के लिए किट+ progenitors समय और बाद के चरणों के साथ जुड़े लागत को कम करने के लिए (यानी, प्रवाह cytometry के लिए एंटीबॉडी मात्रा कम कर देता है, विश्लेषक/सॉर्टर समय, आदि) । जांचकर्ताओं निर्माता के डेटा पत्रक का उल्लेख करने के लिए निर्धारित करना चाहिए कि क्या वंश कमी कदम कुशलता के रूप में विशिष्ट इस्तेमाल किया किट के लिए प्रत्याशित के रूप में काम किया । हालांकि, यह कोई फर्क नहीं पड़ता अगर वंश कमी १००% कुशल नहीं है क्योंकि विभेदित (Lin+) कोशिकाओं सी किट व्यक्त नहीं है, तो किसी भी विभेदित कोशिकाओं वंश कमी के बाद शेष (के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंय सी किट- कोशिकाओं) बाद में कर रहे है प्रवाह cytometry गेटिंग द्वारा बहिष्कृत । यह भी ध्यान दें कि जीपीएस और सांसदों Ly6C एक्सप्रेस लेकिन, monocytes द्वारा व्यक्त Ly6C के विपरीत, जनक Ly6C (संभवतः एक अलग isoform) जीआर-1 एंटीबॉडी अक्सर वंश घट किट में शामिल द्वारा पता नहीं है, और इस तरह जीपीएस और सांसदों के बाद रहने के लिए महत्वपूर्ण है वंश घट2.
अच्छा धुंधला सभी सतह मार्करों के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन FcγR के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण FcγRlo "CMPs" और FcγRहाय की सही गेटिंग की अनुमति "GMPs" । इष्टतम fluorophore पसंद और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने अच्छी जुदाई के लिए आवश्यक हैं, और एक FcγR अवरुद्ध एजेंट (आमतौर पर प्रवाह cytometry के लिए धुंधला करने से पहले इस्तेमाल किया) नहीं किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान रखें कि CD115 downregulated है जब कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखा जाता है, तो यह अच्छा धुंधला प्राप्त करने के लिए जल्दी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है कि महत्वपूर्ण है । हम 1-2 घंटे के भीतर कोशिकाओं प्रसंस्करण उनकी अखंडता को बनाए रखने की सलाह देते हैं । यदि जीवित कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है, सना हुआ कोशिकाओं को निर्धारित किया जा सकता है और ४८ घंटे के भीतर अधिग्रहण कर लिया ।
यदि अलग भागों मृत कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या में होते हैं, यह संभव है एक व्यवहार्यता डाई शामिल करने के लिए (जैसे, propidium आयोडाइड) और अधिक सही करने के लिए गेट लाइव सेल, हालांकि यह शायद जरूरत के संयोजन में एक परिवर्तन होगा fluorochrome-संयुग्मित एंटीबॉडी. यदि वांछित, सेल गिनती प्रवाह cytometry के लिए नमूने के लिए एक ज्ञात एकाग्रता पर गिनती मोतियों जोड़कर गणना की जा सकती है । गिनती मोतियों फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती है कि FSC द्वारा कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है-a और एसएससी-एक या उनके उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता से । कक्ष संख्याओं की गणना निंन सूत्र के उपयोग से की जा सकती है:
(सेल घटनाओं की संख्या/मनका घटनाओं की संख्या/x (μL में नमूना की मात्रा/नमूना के लिए जोड़े गए मोतियों की संख्या) = कोशिकाओं के रूप में नमूने की एकाग्रता/μL
वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह सांसदों और cMoPs, जो इन progenitors का मूल्यांकन पेचीदा, उनके जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक गुण, आदि की जांच के लिए अलग पहचान की अनुमति नहीं है उदाहरण के लिए, एक MP में मनाया गया वृद्धि + cMoP संख्या से संकेत मिलता है कि क्या बढ़ाया monocyte उत्पादन जीएमपी मार्ग, एचडीपी मार्ग, या दोनों के माध्यम से होता है नहीं है । चल रहे अध्ययन में, हम सतह मार्करों कि सांसदों और cMoPs के बीच भेद की पहचान की उंमीद है । इस बीच, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण7 द्वारा इन progenitors का मूल्यांकन सांसदों और cMoPs के रिश्तेदार अनुपात प्रोफाइल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययन की संभावना भी इस प्रोटोकॉल में वर्णित 6 जनक भिन्नताओं के भीतर अतिरिक्त विविधता प्रकट होगा, जिनमें से कुछ विभिन्न परिपक्वता राज्यों जैसे, जीपीएस है कि हाल ही में खो दिया है प्रतिबिंबित करेगा monocyte संभावित बनाम जीपीएस कि भेदभाव के अगले चरण के लिए आगे बढ़ने की ओर अग्रसर हैं । "जीएमपी" भिन्न सबसेट भी अन्य granulocytes (इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और मस्तूल कोशिकाओं) का उत्पादन करने के लिए क्षमता के साथ progenitors शामिल हो सकते हैं, लेकिन हम यह जांच नहीं की है । के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, यह भी वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि सीएमपी-Flt3+ CD115lo, सीएमपी-Flt3- और एचडीपी अंश वास्तव में भविष्यवाणी oligopotent progenitors होते है या वैकल्पिक रूप से अधिक के साथ progenitors का एक मिश्रण शामिल सीमित वंश क्षमता, लेकिन एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण इस महत्वपूर्ण प्रश्न में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है ।
एक नया दृष्टिकोण अब मानव माइलॉयड progenitors के सबसेट की पहचान के लिए आवश्यक है । Weissman और उनके सहयोगियों ने मानव अस्थि मज्जा और गर्भनाल रक्त11में ("CMPs" और "GMPs") सहित माइलॉयड उपसमुच्चय को पहले परिभाषित किया है, लेकिन वे इसी तरह विषम हैं । दुर्भाग्य से, मानव progenitors के लिए माउस गेटिंग रणनीतियों का अनुवाद मानव और माउस progenitors के बीच सतह मार्कर अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय अंतर से जटिल है; उदा., CD34 अभिव्यक्ति को माउस में माइलॉयड जनक सबसेट तक ही सीमित है, लेकिन अधिक मोटे तौर पर टेम स्टेम सेल सहित मानव progenitors पर मनाया । एकल सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययन, तथापि, भी मानव जनक सबसेट अलग करने के लिए उंमीदवार मार्करों की पहचान की अनुमति चाहिए ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल को देवदारों-सिनाई मेडिकल सेंटर (HSG), अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ Immunologists (प्र और HSG) से इम्यूनोलॉजी फैलोशिप में एक कॅरिअर, और एक विद्वान पुरस्कार से बोर्ड ऑफ गवर्नर्स का पुनर्उत्पादक चिकित्सा संस्थान से धन का उपयोग कर विकसित किया गया था अमेरिकन सोसायटी ऑफ रुधिर (प्र.). हम देवदारों पर प्रवाह Cytometry कोर धंयवाद-FACS छंटाई के साथ सहायता के लिए सिनाई चिकित्सा केंद्र ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
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- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
