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Immunology and Infection

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

doi: 10.3791/58061 Published: July 29, 2018

Summary

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

Abstract

골수성 창시자 호 중구, monocytes 및 모 수석 세포 (DCs)에서 확인 하 고 혈액 및 면역 분석에 대 한 생쥐의 골 수에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 골수성 조상 인구의 세포 및 분자 속성의 연구 leukemic 변환, 기본 메커니즘을 밝힐 수 또는 면역 시스템 병원 체 노출에 응답 하는 방법을 보여 줍니다. 이전 많은 분야에서 상당한 진보를 사용 하는 골수성 조상 식별에 대 한 설명된 흐름 cytometry 전략 하지만 그들을 식별 하는 분수는 아주 이질적인. 가장 일반적으로 사용 되는 제어 전략 정의 골 분수 원하는 인구에 대 한 풍성 하 게 하지만 또한 "오염" 창시자의 많은 수를 포함 합니다. 우리의 최근 학문이이 많이 해결 선물이 여기 프로토콜 oligopotent의 6 부분 모집단의 격리를 허용 하 고 혈통 커밋된 골수성 창시자 2에서 설명한 골 분수. 3 단계는 프로토콜에 설명 합니다: 1) 절연 골 수의 세포, 2) 농축 조 혈 창시자 자기 활성화 셀 정렬 (맥에 의해 혈통 소모), 및 3) 식별 골수성 조상 cytometry (를 포함 하 여 하위 집합에 대 한 형광 활성화 된 세포 분류, FACS, 원하는 경우). 이 이렇게 조상 정량화 및 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램의 다양 한 절연을 허용 하 고 경로 및 neutrophil, monocyte, 및 DC 차별화의 메커니즘에 새로운 통찰력을 나왔고 이미 있다.

Introduction

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Monocytes, 호 중구, 및 모 수석 세포 (DCs)는 주로 골 수에서 조 혈 창시자에서 myelopoiesis 라는 프로세스에 의해 발생 하는 골수성 세포. 일반적인 골수성 창시자 (CMPs) 골수성 세포로 없으며, 적혈구, 하지만 하지 림프 세포 생산 가능성이 있다. CMPs에서 파생 됩니다, granulocyte monocyte 창시자 (GMPs) granulocytes 그리고 monocytes, 생산 하지만 잃은 megakaryocyte 잠재적인 적혈구. Monocytes 그리고 클래식 plasmacytoid Dc (cDCs/Pdc) monocyte DC 창시자 (MDPs), CMPs. 서서히 제한 혈통 잠재력의 궁극적으로 혈통 커밋된 결과 의해 생산으로 알려진 일반적인 창시자에서 발생을 또한 생각 됩니다 창시자: granulocyte 창시자, monocyte 창시자, 및 수지상 세포 창시자 (그림 1).

와 이즈 맨과 동료 보고 CMPs 린- c-키트+ Sca-1- CD34 (LKS-)에서 발견 되는+ FcγRlo 의 분수 마우스 골 수, GMPs LKS- CD34에 포함 하는 동안+ FcγR 안녕하세요 분수1. 그러나, 이러한 "CMP"와 "GMP" 분수는 매우 이질적인. 예를 들어, "GMP" 분수 또한 포함 되어 혈통 커밋된 granulocyte 창시자 monocyte 창시자1,2. MDPs 했다 별도로 보고 CX3CR1+ Flt3+ CD115+ CD34 및 FcγR3,4익스프레스 창시자. MDPs는 cDC/pDC 생산 일반적인 DC 창시자 (Cdp), c-Kit (CD117)의 저수준을 표현 하기 위해 보고 하 고 LKS- 분수5에 포함 되지 않습니다.

그것은 이전 monocytes (CMP-GMP-민주당-monocyte) 단일 경로 통해 발생 간주 되었다. 제작한 GMPs (monocyte 창시자, MPs 라는)이 모델, monocyte 커밋된 창시자와 일치2 및 MDPs (라는 일반적인 monocyte 창시자, cMoPs)6 공유 표면 마커 식에 근거 하 여 동일한 셀 표시 . 그러나, 우리가 최근에 monocytes는 생산 하지 독립적으로 GMPs와 MDPs, 시연 하 고 단일 셀 RNA 시퀀싱7MPs와 cMoPs 사이 구별을 수 있었다.

우리는 최근에 다른 oligopotent 및 골수성 조상 계보 커밋된 하위 집합을 포함 하는 C57BL/6J 마우스 골 수의 6 subfractions 식별 하는 이즈 맨 "CMP" 및 "GMP" 제어 전략 수정. 처음 보고는 oligopotent GMPs granulocyte 창시자 (GPs) 및 monocyte 창시자 (MPs 및 cMoPs, 우리는 현재 별도 수)의 절연을 허용 Ly6C 및 CD115에 대 한 얼룩 "GMP" 분수2 (LKS에서 - CD34+ FcγR안녕하세요 게이트; 그림 1)입니다. 우리는 그 후 MDPs는 주로 "CMP" 분수 있는 시연 (LKS- CD34+ FcγRlo 게이트), 또한 Flt3 포함+ CD115lo 와 Flt3- 하위 집합7 (그림 1 ). CMP Flt3+ CD115lo 분수 입양 전송 시 GMPs와 MDPs를 생성합니다. CMP-Flt3- 하위 집합 CMP Flt3+ CD115lo 셀 사이의 GMPs 중간체 처럼 창시자를 포함 합니다. MDPs, 달리 CMP Flt3+ CD115lo 와 CMP Flt3- 분수 또한가지고 megakaryocyte 및 잠재적인 적혈구.

단, 그 그것은 현재 불분명 여부 "CMP" 분수 정말 oligopotent (예: 개별 셀 CMP Flt3+ CD115lo 분수 내 neutrophil, 소유 하는 창시자를 포함 하는 것이 중요 하다 monocyte, DC, megakaryocyte, 및 잠재적인 적혈구), 또는 양자 택일로, 더 제한 된 혈통 잠재력 창시자의 혼합물을 구성. 분석 실험 (스 문화)를 형성 하는 식민지 공개 셀 granulocyte (호 중구), 적혈구, monocyte와 megakaryocyte 잠재적인 (GEMM 세포) "CMP"에서 CMP Flt3+ CD115lo 분수 CMP Flt3- 1 ,7, 하지만 DC 잠재력의 평가 허용 하지 않습니다. 대조적으로, 분석 실험을 형성 하는 식민지 "GMP" 분수1,2, oligopotent GMPs (neutrophil와 잠재적인 monocyte 창시자)의 존재를 증명 하 고이 최근 단일 셀에 의해 지원 됩니다. transcriptomic 분석8. 그러나 그것은 현재 알 수 없습니다,, 또한 다른 granulocytes (호 산 구는, basophils 그리고 돛대 세포)을 생산 하는이 oligopotent GMPs 여부.

우리 지금 보여주는 이러한 연구에 따라 어떻게 7 표면 마커 (c 키트, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C 및 CD115) 사용할 수 있습니다 식별 하 고 이러한 6 하위 집합 oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자의 분리. 여기에 설명 된 프로토콜 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화)에 대 한 적용 될 수 있다 vivo에서 입양 전송 실험 쥐, 및 분자 분석 (대량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱, 부 럽, ).

프로토콜 구성 3 단계: 골의 단일 세포 현 탁 액의 준비 1) 세포, 조 혈 창시자 (자석 활성화 된 세포 분류), 및 3) 식별, 격리의 흐름에 의해 조상 하위 집합 원하는 경우 2) 농축 cytometry (또는 사용 하는 분석기는 다소 적절 한). 첫 번째 단계는 화관에서 골 수 세포의 분리 및 안락사 마우스의 tibias 이며 다른 앞에서 설명한 프로토콜9와 비슷합니다. 다음으로, 샘플 줄기와 조상 세포 적혈구, 호 중구, monocytes, lymphocytes, 의 세포 표면 표식에 대 한 항 체의 칵테일을 사용 하 여 차별화 된 세포를 고갈에 대 한 농축입니다. 이것은 필수, 하지만 조상 하위 집합의 검색을 최적화 하 고 cytometry에 필요한 시간과 조상 식별에 필요한 항 체의 양을 줄이기 위해 강력 하 게 권장 하지. Magnetic-Activated 셀 정렬 (맥) 마우스 계보 셀 고갈 키트를 사용 하 여 아래 계보 고갈 프로토콜에 설명 합니다 (CD5, CD45R에 대하여 biotinylated 항 체를 포함 된 (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, 그리고 Ter-119, 안티 비오 틴 플러스 microbeads)와 자동된 자석 분리기. 마지막 단계는 id (및 필요한 경우 정렬) cytometry에 의해 조상 하위 집합의. 항 체 패널 아래에 설명 된 4 레이저 분석기 (다소) 교류 cytometer에서 사용 하도록 설계 되었습니다 ( 표 1참조) (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figure 1
그림 1: Neutrophil, monocyte와 DC 창시자와 차별화 경로. 와 이즈 맨 게이츠 "CMPs" (파란색)와 "GMPs" (녹색)1 중첩에 대 한 myelopoiesis7 의 최근 수정된 모델은 나와 있습니다. 이 그림은 Yáñez 외. 20177에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Protocol

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여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 되었다.

1. 절연 마우스 골 수 및 단일 세포 현 탁 액의 준비

  1. 기관 지침에 따라 마우스를 안락사
  2. 그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓고 70% 에탄올 (EtOH) 스프레이 합니다. 작은 (3-5 m m) 절 개를 발목 수준 사용에서 각 뒷 다리 사지에 날카로운, 뾰족한가 위, 그리고 다리에서 그것을 제거 하 고 근육과 뼈를 노출 하는 몸 쪽으로 피부를 당겨 확인 합니다.
  3. 뼈의 방향 다음가 위로 트리밍에 의해 뼈에서 근육 (허벅지 근육, 근육, 등등)를 제거 합니다. 수 뼈를 손상 하지 않도록 주의 하십시오.
  4. 엉덩이 관절에서 화관을 탈 구 및 결합 조직 및 뼈를 잘라 하지 않도록 주의 되 고, 다리를 분리 하는 근육을 버려야.
  5. tibias에서 발목을 망가뜨리고 여 발을 제거, 뼈 살 균 PBS 또는 미디어, 튜브에 놓고 조직 문화 실에 얼음에 그들을 전송 합니다.
    참고: 일부 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 총 골 수 세포에서 세포 파생) 한 동안 얼음에 뼈를 두고 있지만 조상 격리의 downregulation를 피하기 위해 가능한 한 빨리 진행 하는 것이 중요 하다 중요 한 표면 마커 (특히 CD115)입니다.
  6. Biosafety 내각에서 휴지와 함께 그들을 문 지르고 하 여 모든 나머지 부드러운 조직 뼈에서 제거 합니다.
    참고: 프로토콜 멸 균 샘플 FACS 정렬 후 세포 배양 또는 vivo에서 분석 실험에 필요한 경우 biosafety 내각에서 수행 되어야 합니다. 살 균 세포는 필요 하지 않습니다, 경우 실험실 벤치에 전체 프로세스를 수행할 수 있습니다.
  7. 짧게 70%에 뼈를 담 궈 EtOH 그들, 그리고 그들을 씻어 살 균 PBS에서 소독.
  8. 화관 tibias fibulas에서 무릎까지 절단 하 여 고는 fibulas 삭제 합니다.
  9. 날카로운가 위는 뼈의 끝을 잘라.
  10. 수확 찬 메 마른 PBS 가진 골 같이 뼈 흰색 나타날 때까지:
    1. 집게와 각 뼈를 한쪽 끝에 뼈 샤프트에 찬 메 마른 PBS를 포함 10 mL 주사기에 연결 26 G 바늘을 삽입.
    2. 50 mL 원심 분리기 튜브 위에 뼈 고 수확 골 수 뼈를 통해 서 2-5 mL PBS를 플러시.
    3. 마우스 (2 화관과 2 tibias) 당 모든 4 뼈에서 골 수를 수확.
  11. 부드럽게 아래로 세포 현 탁 액을 형성 하 골 세분화를 1ml 피 펫과 플라스틱.
  12. 뼈 조각을 제거 하 고 따라서 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 집계 셀 30 μ m 나일론 메시의 조각을 통해 골 정지를 필터링 합니다.
  13. 원심 분리기 280 x g에서 단일 셀 서 스 펜 션 5 분, 그리고 resuspend (PBS 0.5 %FBS + 2 mM EDTA), 살 균 얼룩 버퍼에 셀 펠 릿에 대 한 사용 하는 마우스 (예를 들어, 셀 화관 2 마우스의 tibias에서 풀링된 10 mL) 당 버퍼 얼룩 5 mL.
  14. 10 μ 샘플의 aliquot, 10 μ와 믹스 Trypan 파랑 및 한 hemocytometer에 결과 Trypan 블루 레이블 샘플의 부하 10 μ. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    참고: 경우 셀은 너무 신뢰할 수 있는 계산에 대 한 집중, Trypan 파랑을 추가 하기 전에 샘플을 희석.

2. 조상 농축 자기 활성화 셀 (맥)을 정렬 하 여

  1. 전체 단일 세포 현 탁 액을 원심 (또는으로 많은 셀 원하는 수익률을 얻을 하는 데 필요한) 280 x g 4 ° C와 resuspend 40에서 셀 펠 릿에 5 분에서 107 셀 당 버퍼 (PBS 0.5 %FBS + 2 mM EDTA) 얼룩 μ.
    참고: 그것은 또한 맥 계보 고갈 키트 제조 업체에서 버퍼를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 얼룩 버퍼 대신.
  2. 혈통 고갈 계보 고갈 키트와 함께 제공 된 지침에 따라 수행 합니다. 다음 지침은 테이블의 자료에서 본 키트입니다. 다른 키트를 사용 하는 경우 제조업체의 지시에 따라 고 2.3 단계로 진행.
    1. 107 셀 당 10 μ biotin 항 체 칵테일을 추가 하 고 pipetting으로 혼합 하 고, 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
    2. 30 μ 추가 107 셀 당 버퍼 버퍼/맥 얼룩이 지 고 혼합.
    3. 107 셀 당 20 μ 안티 비오 microbeads를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 추가로 15 분 동안 품 어
      그들은 완전히 분산 되도록 참고: 소용돌이 있는 셀에 추가 하기 전에 microbeads
    4. 280 x g 5 분, 그리고 resuspend 500 μ 얼룩 버퍼/맥에서 셀 펠 릿 108 셀에 대 한 버퍼에서 세포를 원심, 얼룩 버퍼/맥 버퍼 107 셀 당 1 mL를 추가 합니다. 10 이상8 셀에 대 한 버퍼/맥 버퍼를 적절 하 게 얼룩의 볼륨을 확장할.
    5. 제조업체의 지침에 따라 자동된 자석 분리기를 준비 합니다.
    6. 구분 기호로 레이블이 지정 된 셀을 포함 하는 튜브 놓고 부정적인 선택 프로그램을 선택 합니다.
    7. 조상 농축 혈통 네거티브 (Lin-) 세포를 포함 하는 부정적인 분수를 수집 합니다. 혈통-긍정적인 자석으로 표시 된 셀을 포함 하는 긍정적인 분수를 삭제 합니다.
  3. Centrifuge 린- 에서 5 분, 280 x g 세포 및 마우스 (예를 들어, 골 2 마우스에서 풀링되는 경우 4 mL) 당 버퍼/맥 버퍼를 얼룩 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
    참고: 펠 릿 지금 해야 합니다 대신 빨간색 흰색는 적혈구 고갈 되어 있기 때문에.
  4. 10 μ 린- 세포의 aliquot, 10 μ와 믹스 Trypan 파랑 및 한 hemocytometer에 결과 Trypan 블루 레이블 샘플의 부하 10 μ. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    참고: 경우 셀은 너무 신뢰할 수 있는 계산에 대 한 집중, Trypan 파랑을 추가 하기 전에 샘플을 희석.

3. 골수성 조상 식별 및 격리 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)

  1. 라벨 9 microcentrifuge (1.5 또는 2 mL) 튜브: 1) 흠 없는 세포, 2-8) FcγR (CD16/32)에 대하여 fluorophore 활용 된 항 체와 스테인드 단일 셀 c-키트, Sca 1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C 및 CD115 전압 선택 및 색상 보정, 및 9에 대 한) 조상 식별 및 정렬에 대 한 모든 7 항 체와 스테인드를 샘플 셀.
  2. 샘플 튜브 (9 관)를 각각 제어 튜브 (튜브 1-8), 100000 셀 및 모든 나머지 셀 (또는 원하는 경우 적은)를 배포 합니다.
    참고: 샘플 볼륨 1.5-2 mL 보다 큰 경우에, 그것은 필요할 수 있습니다를 샘플 셀 15 mL 튜브로 배포, 그들 원심 및 펠 릿 (아래 단계 3.3)에 게, resuspend 다음 전송 셀 이후 착 단계에 대 한 microcentrifuge 관에.
  3. 5 분, 1500 x g에서 세포를 원심 및 제어 튜브 알 약 100 μ에 resuspend (예를 들어, 200 μ 1 x 107 셀) 셀 5 x 106 당 버퍼를 얼룩 얼룩 버퍼 (PBS 0.5 %FBS + 2 mM EDTA) 및 100 μ에 샘플 튜브 펠 릿.
  4. FcγR 단일 얼룩 튜브 및 샘플 튜브를 2 μ g/mL 안티-CD16/CD32-APC-Cy7를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하, 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 소용돌이
    참고: 일반적인 Fc 중재 항 체 바인딩 인해 경쟁을 방지 하기 위해 다른 항 체를 추가 하기 전에 FcγR (CD16/32) 항 체로 샘플 셀 얼룩 중요 하다. 시 약을 차단 하는 FcγR와 셀 품 어 하지 마십시오.
  5. 해당 단일 얼룩 튜브 (1 항 체 각)와 샘플 튜브 (모든 6 항 체)를 다른 항 체를 추가: 10 μ g/mL c-키트-태평양 파랑, 2 μ g/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μ g/mL CD34-FITC, 10 μ g/mL Flt3 APC, 2 μ g/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5, 및 4 μ g/mL CD115 PE. 소용돌이, 부드럽게와 4 ° c.에 15 분 동안 품 어
  6. 900 μ 얼룩 버퍼 제어 튜브 및 샘플 튜브를 107 셀 당 1 mL 얼룩 버퍼 추가 합니다. 1500 x g 5 분에 세포를 원심 및 버퍼 얼룩에 셀 펠 릿 resuspend: 제어 튜브 당 200 μ 및 샘플 튜브 25 x 106 셀 당 500 μ. 5 mL FACS 튜브에 resuspended 셀을 전송.
    참고: 샘플 볼륨 1.5-2 mL 보다 큰 경우, 그것 해야 원심 분리에 대 한 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다.
  7. 제조업체의 지침에 따라 교류 cytometer (분석기 또는 정렬)을 준비 합니다.
  8. 제어 셀 전압 및 색상 보정을 설정 하려면 흐름 cytometer 스테인드 흠 없는 및 단일를 실행 합니다.
  9. 샘플 셀을 실행 하 고 아래 설명 및 그림 2에 요약 된 조상 하위 집합 게이트 원하는 경우 수행 FACS 관련 조상 하위 집합을 정렬.
    참고: 그것은 일반적으로 약 200000 셀 각 조상 게이트에서 적어도 1000 이벤트를 수집할 필요가 있다.
    1. 모든 셀, FSC-A (x 축) 및 SSC-A (y 축), 표시의 점 줄거리를 만들고 파편과 죽은 세포를 제외 하려면 게이트 = > "라이브" 셀.
    2. "라이브" 셀, FSC-H (x 축) 및 FSC-W (y 축), 표시의 점 줄거리를 만들고 남자 제외 게이트 = > (FSC) 라이브/내의 게이트.
    3. 라이브/내의의 도트 줄거리를 SSC-H (x 축) 및 SSC-W (y 축), 표시 (FSC) 셀 만들고 남자 제외 게이트 = > (FSC) 라이브/내의 / 내의 (SSC) 게이트.
    4. 라이브/내의 (FSC)의 점 플롯 만들기 / 내의 (SSC) 세포, Sca-1 (x 축) 및 c-키트 (y 축), 표시와 게이트 c-키트+ Sca-1- 셀 선택 = > LKS- 셀.
    5. LKS- 셀, CD34 표시 점 플롯 만들기 (x 축)와 FcγR (y 축), 그리고 게이트 CD34 선택+ FcγRlo 셀 = > "CMPs", 및 CD34+ FcγR안녕하세요 셀 = > "GMPs".
      참고: "CMPs"와 "GMPs"로 정확 하 게 가능한 게이트 중요 하다. 정확한 게이팅에 대 한 모조 색상 밀도 음모 또는 등고선 플롯을 사용 하 여 도움이 됩니다.
    6. "CMPs" CD115 표시의 점 플롯 만들기 (x 축) 및 Flt3 (y)와 게이트 선택:
      Flt3+ CD115lo 셀 = > CMP Flt3+ CD115lo 셀,
      Flt3- CD115lo 셀 = > 셀, CMP Flt3-
      Flt3+ CD115안녕하세요 셀 = > MDPs.
    7. "GMPs" Ly6C 표시의 점 플롯 만들기 (x 축) FcγR (y)와 게이트 Ly6C를 선택-셀 = > "GMP-Ly6C- 세포", 그리고 Ly6C+ 셀 = > "GMP-Ly6C+ 세포".
    8. CD115 표시 ","GMP-Ly6C- 세포의 점 플롯 만들기 (x 축) 및 Flt3 (y)와 게이트 선택:
      Flt3- CD115lo 셀 = > GMPs.
    9. CD115 표시 ","GMP-Ly6C+ 세포의 점 플롯 만들기 (x 축) 및 Flt3 (y)와 게이트 선택:
      Flt3- CD115lo 셀 = > GPs,
      Flt3- CD115안녕하세요 셀 = > 원 + cMoPs.

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Representative Results

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위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, 그것은 화관과 한 C57BL/6J 마우스 (6-8 주 오래 된, 남성 또는 여성)의 tibias (2 다리)에서 ~ 100 백만 세포 (적혈구, 또는 ~ 50 백만 nucleated 세포를 포함 하 여)를 얻을 수 있습니다. 1-2 백만 린- 셀 린+ 세포의 맥 고갈 마우스 당 격리할 수 있습니다.

6 골수성 조상 하위 집합의 각 셀- Lin의 ~ 1-4%를 구성합니다. 리니지 고갈 차별화 된 세포를 없애고 효율적 이며 c-키트+ 창시자 (그림 3A) 뿐만 아니라 c-키트- 세포의 큰 비율을 포함 창시자, 하지만 린- 분수에 대 한 풍부. 시 조 후 FACS 정렬 정렬 설정 사용 (예를 들어, 최대 수율 최적의 순도 대)에 따라 다를 수 있습니다 하지만 일반적으로 그것은 분수 (그림 3B) 당 10000-40000 세포를 얻을 수를 생성 합니다. 정렬 후 교류 cytometry 분석 계시 한다 > 각 분수 (그림 3C)의 95% 순도.

Figure 2
그림 2: 6 골수성 조상 분수의 식별에 대 한 전략을 게이팅. (A) singlets (FSC)-> 라이브 린- 세포의 진보적인 게이팅-> singlets (SSC)는 LKS- -> 셀 CD34->+ FcγRlo ("CMP")와 CD34+ FcγR안녕 (이 하 "GMP") 분수-> 6 골수성 시 조 하위 집합입니다. (B) 6 뿌리 분수 표면 마커 식의 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 대표 조상 수율과 순도. (A) 대표 cytometry 플롯 표시 c-Kit 및 골 수 세포 계보 고갈, 창시자 (c-키트+ 세포)의 농축을 보여주는 전후 CD11b 식 합니다. (B) 세포로 평균 + 표준 편차 30 실험의 각 조상 분수에 대 한 생성 합니다. 최대 20 쥐에서 골 수 세포는 각 실험에 대 한 풀링된 했다. (C) 대표 cytometry 정렬 후 분석, FACS 정렬 조상 분수의 순도 보여주는 플롯 합니다. 패널 C Yáñez 외. 20177에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

레이저 채널 필터 미러
405 nm 1. 670/30 635LP
2. 525/50 505LP
C. c-키트-태평양 파랑 450/50
488 nm A. (FSC)
B. Ly6C-PerCP-Cy5.5 710/50 690LP
C. CD34-FITC 525/50 505LP
D. SSC 488/10
561 nm A. Sca-1-PE-Cy7 780/40 750LP
2. 710/50 690LP
C. 660/20 640LP
4. 610/20 600LP
E. CD115-PE 582/15
640 nm A. FcϒR-APC-Cy7 780/60 750LP
2. 730/45 690LP
C. Flt3 APC 670/30

표 1: 항 체 패널 및 교류 cytometer 구성.

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Discussion

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와 이즈 맨 마우스 골수성 조상 식별1 전략 게이팅 immunologists에 대 한 황금 표준 hematologists 거의 20 년 동안 왔지만 그것은 명백한 "CMP"와 "GMP" 게이츠는 매우 이질적인 더 정확한 지금 제어 전략 필요 합니다. 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 특정 골수성 창시자의 더 정확한 정량화 및 myelopoiesis 통로 조사에 대 한 C57BL/6J 쥐에 oligopotent 및 계보 커밋된 하위 집합의 식별을 허용 골수성 차별화의 특정 단계에서 운영 하는 분자 메커니즘. 조상 하위 집합 정렬할 수 있습니다, 경우, 분자 분석, 차별화 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가

프로토콜 영 (6-8 주 이전)을 사용 하 여 개발 되었다 C57BL/6J 쥐 남성 및 여성 쥐에 적합. 우리가 하지 이전 마우스에 조상 하위 집합 특징 있다. 우리가 예상 하지 않는 나이, 마커 변경 되지만 하위의 상대적 비율 다를 수 있습니다. 우리 하지 다른 마우스 긴장에서 조상 하위 집합 평가.

수정된 제어 전략의 첫 번째 응용 프로그램 녹음 방송 요인 인터페론 규정 요소 8 (IRF8)에 의해 기계적 통찰력 골수성 세포 운명 선택의 레 귤 레이 션을 제공 했다2. IRF8 이전 GMPs에 의해 표현 될 것으로 알려졌다 (와 이즈 맨 "GMP" 분수) 및 monocyte 유전자 발현 촉진, 호 중구 유전자 발현 억제 및 호 중구 apoptosis10홍보 monocyte 차별화 필수. 수정된 제어 전략을 사용 하 여, 우리 시연 IRF8 oligopotent GMPs, 표현 하지 하지만 GPs와 MPs + cMoPs2에 의해 표현 된다. 또한, 우리는 IRF8 조절 oligopotent GMPs에 의해 GP와 MP + cMoP 생존 및 차별화, 보다는 혈통 커밋된 창시자의 생산을 설명 했다. 마찬가지로, 우리는 최근 다시 정의 myelopoiesis, 모델 수정된 제어 전략을 사용 하 고 GMPs과 MDPs 생산 2 독립적인 경로7통해 기능적으로 뚜렷한 염증 monocytes 시연.

리니지 고갈 단계 자동된 자석 분리기, 대신 수동 마그네틱 구분 기호를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 및 혈통 고갈 cytometry biotinylated 계보 마커 항 체 칵테일을 사용 하 여도 얻을 수 있다 고는 fluorophore 활용 된 안티 비오 틴 항 체, 흠 없는 셀 선택 게이팅와. 리니지 고갈 가장 차별화 된 세포를 제외 하 고 c-키트+ (즉, cytometry, 분석기/정렬 시간, 항 체 볼륨 감소 이후 단계와 관련 된 비용과 시간을 최소화 하기 위해 창시자에 대 한 풍요롭게 등). 조사자는 효율적으로 특정 키트에 대 한 일 혈통 고갈 단계 사용 여부를 확인 하려면 제조업체의 데이터 시트를 참조 해야 합니다. 그러나, 그것은 리니지 소모 하지 않으면 100% (Lin+) 세포를 분화 하기 때문에 효율적인 c-키트, 어떤 차별화 된 세포 계보 고갈 후 남은 (다른 c-키트- 세포)는 연속적으로 표현 하지 않으면 상관 교류 cytometry 게이팅 하 여 제외. 그것은 또한는 GPs와 MPs 익스프레스 Ly6C 하지만,는 Ly6C와 달리 표현 monocytes, Ly6C 조상으로 하는 것이 중요 (아마도 다른 isoform) 종종 혈통 고갈 키트에 포함 된 Gr-1 항 체에 의해 인식 되지 않습니다 따라서 GPs와 MPs 후 유지 리니지 소모2.

좋은 얼룩 이지만 모든 표면 표식에 대 한 중요 한 FcγR는 FcγR "CMPs"와는 FcγR안녕하세요 "GMPs"의 정확한 게이팅 허용을 위한 특히 중요 한. 최적의 fluorophore 선택과 항 체 희석 좋은 분리에 대 한 필수 그리고 (일반적으로 얼룩이 cytometry에 대 한 이전 사용) FcγR 차단 시 해야 하지 사용 됩니다. 그것은 또한 유지 될 때 세포는 4 ° C에서 또는 얼음에 연장된 기간에 대 한 좋은 얼룩를 신속 하 게 작동 하는 것이 중요 하다 그래서 CD115는 downregulated 중요. 그들의 무결성을 유지 하기 위해 1-2 시간 이내 셀을 처리 하는 것이 좋습니다. 라이브 셀 필요 하지 않습니다, 스테인드 세포를 고정 하 고 48 시간 이내 취득 수 있습니다.

그것은 비록이 아마의 조합에 변화를 할 거 것 이다 더 정확 하 게 라이브 셀 게이트 생존 염료 (예를 들어, propidium 요오드 화물)를 포함 수 격리 된 분수 죽은 세포의 상당한 숫자를 포함 하는 경우 형광 색소 활용 된 항 체 원하는 경우, cytometry에 대 한 샘플을 알려진된 농도에 세 비즈를 추가 하 여 셀 수를 계산할 수 있습니다. 세 비즈는 FSC와 SSC-A에 의해 또는 그들의 높은 형광 강도 의해 셀에서 구별 될 수 있다 형광 라텍스 구슬. 핸드폰 번호는 다음 수식을 사용 하 여 계산할 수 있다:

(셀 이벤트의 숫자 / 구슬 이벤트의 수) x (샘플에 추가 하는 구슬의 숫자 / μ에 샘플의 볼륨) 세포/μ로 샘플의 농도 =

현재 프로토콜의 한 가지 한계는 MPs 및 cMoPs, 복잡 이러한 창시자, 그들의 유전자 발현 및 기능 속성, 등 의 조사의 평가 별도 식별을 허용 하지는 관찰 mp에서 증가 + cMoP 숫자 GMP 통로, 민주당 통로, 또는 둘 다를 통해 향상 된 monocyte 생산 발생 여부를 나타내지 않습니다. 지속적인 연구에 MPs와 cMoPs 사이 구별 하는 표면 마커를 식별 하겠습니다. 한편, 단일 셀 RNA 시퀀싱7 이 창시자의 평가 MPs 및 cMoPs의 상대 비율을 프로 파일링 사용 될 수 있습니다.

단일 셀 RNA 시퀀싱 연구도 일부는 다른 성숙 상태 예를 들어, 최근에 monocyte 잃은 GPs 반영 됩니다이 프로토콜에서 설명 하는 6 시 조 분수 내 추가 공개 가능성이 것입니다. 차별화의 다음 단계로 진행 하는 태세는 GPs 대 가능성이 있습니다. "GMP" 일부 하위 집합에 다른 granulocytes (호 산 구는, basophils 그리고 돛대 세포), 생산 잠재력 창시자 포함 될 수도 있습니다 하지만 우리는 이것을 조사 하지 않은. 소개에서 설명 했 듯이, 그것은 또한 현재 불분명 여부 CMP Flt3+ CD115lo, CMP Flt3- 및 민주당 분수 정말 예측된 oligopotent 창시자를 포함 하거나 또는 더 많은 창시자의 혼합물을 구성 제한 된 혈통 잠재적인, 하지만 단일 셀 RNA 시퀀싱이 중요 한 질문에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

새로운 접근은 이제 인간의 골수성 창시자의 하위 집합의 식별에 필요한. 와 이즈 맨과 동료 이전에 정의 된 골수성 하위 집합 (를 포함 하 여 "CMPs"와 "GMPs") 인간의 골 수, 탯 줄 혈액11, 하지만 그들은 마찬가지로 이종. 불행 하 게도, 인간의 창시자 전략 게이팅 마우스의 번역 표면 마커 식 인간 사이에서 주목할 만한 차이 의해 복잡 및 마우스 창시자; 예를 들어, CD34 식 마우스 하위 집합 골수성 조상 제한 이지만 조 혈 줄기 세포를 포함 하 여 인간의 창시자에 더 광범위 하 게 관찰 했다. 그러나 단일 셀 RNA 시퀀싱 연구 또한 인간의 조상 하위 집합을 후보 마커의 식별을 허용,.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 프로토콜 (바깥 HSG)를, Immunologists의 미국 협회에서 면역학 화목에서 경력 및 학술 상 수상 (HSG)을 보드의 총재 재생 의학 연구소에서 삼목 시 나이 의료 센터에 자금을 사용 하 여 개발 되었다 (하의) 혈액학의 미국 사회. FACS 정렬 지원에 감사 삼목 시 나이 의료 센터에서 Flow Cytometry 코어 하 고.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) The Jackson Laboratories Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec Cat#130-090-858
Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC BD Biosciences Cat#553733
Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 BioLegend Cat#101327
Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 BioLegend Cat#108114
Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue BioLegend Cat#105820
Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 BioLegend Cat#128012
Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE BioLegend Cat#135506
Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC BD Biosciences Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads Thermo Fisher Scientific Cat#C36950
AutoMACS Separator Miltenyi Biotec N/A Use the "deplete" program
BD LSRFortessa BD Biosciences N/A 5 lasers, 15 colors
BD FACS Aria III cell sorter BD Biosciences N/A 5 lasers, 13 colors
FlowJo FlowJo, LLC https://www.flowjo.com For further analysis of the .fcs files

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References

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, (6774), 193-197 (2000).
  2. Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125, (9), 1452-1459 (2015).
  3. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
  4. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, (5757), 83-87 (2006).
  5. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8, (11), 1207-1216 (2007).
  6. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14, (8), 821-830 (2013).
  7. Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47, (5), 890-902 (2017).
  8. Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537, (7622), 698-702 (2016).
  9. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  10. Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23, (1), 11-17 (2016).
  11. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (18), 11872-11877 (2002).
식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리
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Yáñez, A., Goodridge, H. S. Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (137), e58061, doi:10.3791/58061 (2018).More

Yáñez, A., Goodridge, H. S. Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (137), e58061, doi:10.3791/58061 (2018).

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