Summary
Мы показали, как идентифицировать и изолировать 6 подмножеств миелоидного прародителей из мышиных костного мозга с помощью комбинации магнитных и флуоресценции, сортировка (MACS и СУИМ). Этот протокол может использоваться для в vitro assays культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи экспериментов и РНК/белка анализа.
Abstract
Миелоидные прародителей, которые дают нейтрофилов, моноцитов и дендритных клеток (DCs) могут быть определены в и изолированы от костного мозга мышей для гематологических и иммунологические анализы. Например исследования клеточном и молекулярном свойств миелоидного progenitor населения можно выявить механизмы, лежащие в основе лейкозных преобразования, или продемонстрировать, как иммунная система реагирует на патогенные воздействия. Ранее описанных потока цитометрии стратегии для идентификации миелоидного progenitor позволили значительных успехов во многих областях, но фракций, которые они определяют весьма неоднородны. Наиболее часто используемые стробирования стратегии определить костного фракций, которые обогащаются для желаемого населения, но и содержат большое количество «заражая» прародителей. Наши недавние исследования решили большую часть этой неоднородности и протокол, который мы представляем здесь позволяет изоляции 6 субпопуляции oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителей от 2 ранее описанных костного дробей. Протокол описывает 3 этапа: 1) изоляции костного клеток, 2) обогащения гемопоэтических прародителями сортировки магнитные активации клеток (линии истощение, MACS), и 3) идентификация миелоидного progenitor подмножеств подачей cytometry (включая флуоресценции активированный ячейку Сортировка, FACS, при необходимости). Этот подход позволяет прародитель квантификации и изоляции для различных приложений в пробирке и в естественных условиях и уже принесли Роман понимание путей и механизмов нейтрофилов, моноцитов и DC дифференциации.
Introduction
Моноциты, нейтрофилов и дендритных клеток (DCs) являются миелоидных клеток, возникающих от гемопоэтических прародителями, главным образом в костном мозге, этот процесс называется myelopoiesis. Общие миелоидного прародителями (CMPs) имеют потенциал для производства миелоидных клеток, а также megakaryocytes и эритроцитов, но не лимфоидных клеток. Предшественники гранулоцитов и моноцитов (ГИП), которые являются производными от CMPs, производят гранулоцитов и моноцитов, но потеряли мегакариоцитов и эритроцитов потенциал. Моноциты и классические и плазмоцитарная DCs (cDCs/PDC) также считается вытекают из общих прародителей, известный как предшественники Моноцит DC (MDPs), которые производятся CMPs. постепенное ограничение потенциал линии в конечном итоге приводит родословную, совершенные прародители: предшественники гранулоцитов, моноцитов прародителями и Предшественники дендритных клеток (рис. 1).
Вайсман и коллеги сообщили, что CMPs находятся в Линь– c комплект+ Sca-1– (ЛКС–) CD34 FcγRЛо часть костного мозга мыши, в то время как ГИП содержатся в CD34 ЛКС– + + FcγR Привет часть1. Однако эти «КПВ» и «GMP» фракции являются весьма разнородными. Например «GMP» фракции также содержит восходящей линии, совершенные гранулоцитов и моноцитов прародителями1,2. MDPs отдельно сообщается CX3CR1+ Flt3+ CD115+ прародителей, которые также выразить CD34 и FcγR3,4. MDPs привести к cDC/pDC производство общих DC прародителями (CDP), сообщившие выразить более низкие уровни c-Kit (CD117) и не включаются в ЛКС– часть5.
Ранее предполагалось, что моноциты возникают по одной дорожке (CMP-GMP-MDP-Моноцит). В соответствии с этой модели, совершенные Моноцит прародителями, производимые ГИП (названный Моноцит прародителями, м/с)2 и MDPs (названный общих Моноцит прародителями, cMoPs)6 , по-видимому, те же клетки на основе общей поверхности маркер выражения . Однако мы недавно продемонстрировали, что моноциты производятся независимо ГИП и MDPs и были в состоянии провести различие между депутаты и cMoPs сингл клеточной РНК последовательности7.
Мы недавно изменен Вайсман «КПВ» и «GMP» стробирования стратегии для выявления 6 подфракций костного C57BL/6J мыши, содержащих различные oligopotent и совершенные линии миелоидного progenitor подмножеств. Мы впервые сообщили, что окрашивание для Ly6C и CD115 позволяет изоляции oligopotent ГИП, так как предшественники гранулоцитов (GPs) и Моноцит прародителями (MPs и cMoPs, который мы в настоящее время не в состоянии отделить) от «GMP» часть2 (ЛКС - CD34+ FcγRПривет ворота; Рисунок 1). Впоследствии мы показали, что MDPs преимущественно находятся в «КПВ» фракции (CD34 ЛКС– + FcγRЛо ворота), который также содержит Flt3+ CD115Ло и Flt3– подмножеств7 (Рисунок 1 ). CMP-Flt3+ CD115Ло фракция дает ГИП и MDPs после приемных передачи. CMP-Flt3– подмножество содержит прародителей, которые представляются промежуточные между CMP-Flt3+ CD115Ло клетки и ГИП. В отличие от MDPs CMP-Flt3+ CD115Ло и CMP-Flt3– фракции также обладают мегакариоцитов и эритроцитов потенциал.
Важно отметить, однако, что это в настоящее время неясно ли «КПВ» фракции содержат прародителей, которые действительно oligopotent (например, отдельных ячеек в CMP-Flt3+ CD115Ло фракции обладают нейтрофилов, Моноцит, DC, мегакариоцитов и потенциальных эритроцитов), или альтернативно, составляют смесь прародителями с более ограниченным потенциалом линии. Колонии, формируя assays (метилцеллюлоза культуры) показали клетки с гранулоцитарный (нейтрофилов), эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов потенциальных (ГЭММ клетки) в «СС», CMP-Flt3+ CD115Ло и фракции CMP-Flt3– 1 ,7, но не позволяют оценку потенциала постоянного тока. В отличие от колонии, формируя assays продемонстрировал существование oligopotent ГИП (предшественники нейтрофилов и моноцитов потенциальных) в «GMP» часть1,2, и это подтверждается недавно одноклеточного транскриптомики анализ8. Это не известно в настоящее время, однако, является ли эти oligopotent ГИП также производить другие гранулоцитов (эозинофилов, базофилов и тучных клеток).
На основании этих исследований, мы теперь продемонстрировать как 7 поверхности маркеры (c комплект Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C и CD115), может использоваться для идентифицировать и изолировать эти 6 подмножества oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителями. Протокол, описанные здесь может применяться для анализов в vitro культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи эксперименты в мышей и молекулярный анализ (насыпных и одноклеточного последовательности РНК, Западный blotting, и т.д.).
Протокол состоит из 3 этапов: 1) подготовка подвески одной клетки костного мозга клетки, 2) обогащения гемопоэтических прародителями (сортировки) магнитные активации клеток и 3) выявления и изоляции, при желании, прародитель подмножеств потоком цитометрии (с использованием анализатора или сортировщик, в соответствующих случаях). Первым шагом является изоляция клетки костного мозга от бедра и tibias Усыпленных мышей и похож на другие ранее описанные протоколы9. Затем образец обогащен для стволовых и прогениторных клеток с помощью коктейль антител против клеток поверхностных маркеров эритроцитов, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и т.д., чтобы истощить дифференцированных клеток. Это не является обязательным, но настоятельно рекомендуется оптимизировать обнаружения подмножеств прародителю и уменьшить количество антител, необходимых для идентификации прародителем и время, необходимое для проточной цитометрии. Родословная истощения протокол ниже описывает Magnetic-Activated ячейку Сортировка (ПДК) с помощью мыши Lineage ячейки истощение Kit (который содержит биотинилированным антитела CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 и тер-119, плюс анти биотин микрошарики) и автоматизированных магнитный сепаратор. Последним шагом является идентификация (и сортировки, если это необходимо) Прародитель подмножеств подачей cytometry. Группа антител, описанных ниже (см. также таблицу 1) была разработана для использования в проточный цитометр (анализатор или Сортировщике) с 4 лазеры (405 нм, 488 нм, 561 Нм, 640 Нм).
Рисунок 1: нейтрофилов, моноцитов и DC прародителями и дифференциация путей. Недавно пересмотренная модель myelopoiesis7 иллюстрирован, Вайсман ворота для «CMPs» (синий) и «ГИП» (зеленый)1 обложил. Эта цифра была изменена Яньес et al. 20177. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) от Медицинский центр Седарс-Синай.
1. изоляция костного мозга мыши и приготовление суспензии одну ячейку
- Усыпить мыши институциональных руководящих принципов.
- Место Усыпленных мышь на его спине и распылить его с 70% этанола (EtOH). Сделайте разрез маленьких (3-5 мм) в каждой задние конечности на лодыжки уровня используя острый, острые ножницы и подтянуть кожу к телу, чтобы удалить его из ноги и разоблачить мышц и костей.
- Удалите мышцы (четырехглавой мышцы, бедра и т.д.) из костей, обрезки их ножницами, после направления кости. Будьте осторожны, чтобы не повредить кости.
- Вывихнуть бедра от тазобедренных суставов и отрезать соединительной ткани и мышцы, чтобы отсоединить ноги, стараясь не нарезать кости.
- Удалите ноги, лодыжки от tibias отводе, место кости в трубке стерильных PBS или средства массовой информации и транспортировать их на льду в зале культуры ткани.
Примечание: Для некоторых других приложений (например, вытекающие макрофагов из клеток всего костного) можно оставить кости на льду на некоторое время, но для изоляции прародитель важно действовать быстро, как можно избежать Даунрегуляция из важные поверхностных маркеров (особенно CD115). - В области биобезопасности кабинета удалите любые оставшиеся мягких тканей из костей, потерев их папиросной бумаги.
Примечание: Протокол должен выполняться в биобезопасности кабинета если образец стерильных требуется для клеток культуры или vivo анализов после сортировки СУИМ. Если стерильные ячейки не требуется, весь процесс может выполняться на стенде лаборатории. - Кратко погружать костей в 70% EtOH вылечить их, а затем в стерильных PBS мыть их.
- Отделить бедра от tibias и фибулы, проходящем через колено и отбросить фибулы.
- Отрежьте концы офф кости с острыми ножницами.
- Урожай костного мозга с холодного стерильного PBS следующим до костей появляются белые:
- Захват каждой кости с щипцами и вставьте иголку 26G, подключенных к шприц 10 мл, содержащих холодного стерильного PBS в кости вала на одном конце.
- Держите кости выше 50 мл пластиковых пробирок и очистить 2-5 мл PBS через кость урожай костного мозга.
- Урожай костного мозга от всех 4 кости на мышь (2 бедра и 2 tibias).
- Осторожно, Пипетка вверх и вниз, с 1 мл пипетки дезагрегировать костного мозга в форме суспензии клеток.
- Фильтр костного подвеска через кусок 30 мкм нейлоновая сетка для ликвидации части кости и мобильных агрегатов, создавая тем самым одну ячейку подвеска.
- Центрифуга одноклеточного подвеска на 280 x g 5 мин, и Ресуспензируйте Пелле клеток в стерильных окрашивание буфера (PBS + 0.5% FBS + 2 мм ЭДТА), используя 5 мл, окрашивание буфера на мышь (например, 10 мл для ячеек, объединения от бедра и tibias 2 мышей).
- Возьмите 10 мкл аликвота образца, смешать его с 10 мкл Трипановый синий и нагрузки 10 мкл результате Трипановый синий-меченых образца на Горяева. Подсчет количества ячеек с использованием световой микроскоп.
Примечание: Если клетки слишком сосредоточены для надежной подсчета, разбавляют образца перед добавлением Трипановый синий.
2. прародитель обогащение магнитные активации клеток, сортировка (Mac)
- Центрифуга для подвески всего одну ячейку (или столько же ячеек как требуются для получения желаемой доходности) на 280 x g 5 мин при 4° C и Ресуспензируйте Пелле клеток в 40 мкл, окрашивание буфера (PBS + 0.5% FBS + 2 мм ЭДТА) за 107 клеток.
Примечание: Это также можно использовать MACS буфер от производителя комплект истощения линии (см. Таблицу материалы) как альтернативу окрашивание буфер. - Выполните линии истощение согласно инструкции, поставляется с комплектом истощения линии. Следующие инструкции предназначены для комплекта видно в Таблице материалов. Если используется другой набор, следуйте инструкциям производителя и затем перейдите к шагу 2.3.
- Добавить 10 мкл биотин антитела коктейль за 107 клеток, смешивать, закупорить и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
- Добавить 30 мкл пятнать буфера/MACS буфер за 107 клеток и перемешать.
- Добавьте 20 мкл анти биотина микрошарики за 107 клеток. Хорошо перемешайте и инкубировать еще 15 мин при 4 ° C.
Примечание: Vortex микрошарики перед их добавлением в клетках чтобы убедиться, что они полностью рассеяны. - Добавьте 1 mL, окрашивание буфера буфера/Маки на 107 клеток, центрифуга клетки на 280 x g за 5 мин и Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл окрашивание буфера/Маки буфера для до 108 клеток. Для более чем 108 клеток наращивать объем пятнать буфера буфера/MACS соответственно.
- Подготовьте автоматизированных магнитный сепаратор согласно инструкциям производителя.
- Поместите трубка, содержащая помеченные клетки в сепаратор и выберите негативный выбор программы.
- Соберите негативные фракция, которая содержит клетки предшественники обогащенный (Лин–) линии отрицательных. Отказаться от положительных фракция, которая содержит магнитно меченых линии положительных клеток.
- Центрифуга Линь– клетки на 280 x g 5 минут и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл, окрашивание буфера буфера/Маки на мышь (например, 4 мл, если костный мозг был пул от 2 мышей).
Примечание: Гранулы теперь должен быть белым вместо красного потому что были истощены эритроцитов. - Возьмите 10 мкл аликвота Линь– клеток, смешать его с 10 мкл Трипановый синий и нагрузки 10 мкл результате Трипановый синий-меченых образца на Горяева. Подсчет количества ячеек с использованием световой микроскоп.
Примечание: Если клетки слишком сосредоточены для надежной подсчета, разбавляют образца перед добавлением Трипановый синий.
3. миелоидного Progenitor выявление и изоляция по активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS)
- Этикетка 9 microcentrifuge (1,5 или 2 мл) трубы для: 1) незапятнанное клетки, 2-8) одной клетки окрашивали Флюорофор конъюгированных антител против FcγR (CD16/32), c комплект, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C и CD115 для выбора и цвет компенсации напряжения и 9) образец клеток к быть запятнано с все 7 антитела для прародителя идентификации и сортировки.
- Распространить образец трубки (трубки 9) 100000 клеток для каждого элемента управления труб (трубы 1-8) и все остальные ячейки (или меньше, по желанию).
Примечание: Если объем образца больше чем 1,5-2 мл, это может быть необходимо распространять образец клеток в 15 мл трубку, центрифуга их Ресуспензируйте Пелле (шаг 3.3 ниже) и затем передать клетки пробки microcentrifuge для последующего окрашивания шагов. - Центрифуга клетки на 1500 x g 5 минут и Ресуспензируйте управления пробки гранул в 100 мкл окрашивание буфера (PBS + 0.5% FBS + 2 мм ЭДТА) и образец трубки Пелле в 100 мкл пятнать буфера за 5 х 106 клеток (например, 200 мкл для клетки 1 x 10-7 ).
- Добавьте 2 мкг/мл анти CD16/CD32-БТР-Cy7 трубка FcγR одно пятно и образец трубки. Вихревой мягко для микширования и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
Примечание: Важно, чтобы пятно образец клеток с FcγR (CD16/32) антитела до добавления других антител, чтобы предотвратить конкуренцию за неспецифической Fc опосредованной антитела связывая. Не инкубировать клетки с FcγR, блокирование реагента. - Добавьте другие антитела соответствующие трубы одного пятна (по 1 антител) и образец трубки (все 6 антитела): 10 мкг/мл c комплект-Тихоокеанский синий, 2 мкг/мл Sca-1-PE-Cy7, 25 мкг/мл CD34-FITC, 10 мкг/мл Flt3-APC, 2 мкг/мл Ly6C-PerCP-Cy5.5 и 4 мкг/мл CD115-PE. Вихревой мягко и Инкубируйте 15 мин при 4 ° C.
- Добавьте 900 окрашивание мкл буфера для управления трубы и окрашивание буфера 1 мл на 107 клеток в образец трубки. Центрифуга клетки на 1500 g x 5 мин и Ресуспензируйте Пелле клеток в пятнать буфера: 200 мкл за управления трубки и 500 мкл за 25 х 106 клеток в пробирку образца. Передача ресуспензированы клетки до 5 мл СУИМ трубы.
Примечание: Если объем образца больше чем 1,5-2 мл, это может быть необходимо перевести клетки 15 мл трубки для центрифугирования. - Подготовьте проточный цитометр (анализатор или Сортировщике) согласно инструкциям производителя.
- Запустите безупречный и одного окрашенные клетки управления через проточный цитометр напряжений и цвет компенсаций.
- Запустите образец клеток, ворота прародитель подмножеств как говорится ниже и кратко на рисунке 2и при желании выполнить СУИМ, сортировка изолировать подмножества соответствующих прародитель.
Примечание: Это обычно необходимо приобрести приблизительно 200.000 клетки, чтобы получить по крайней мере 1000 события в каждом прародитель ворот.- Создайте точку участок всех клеток, отображая FSC-A (ось x) и SSC-A (ось y) и ворота для исключения мусор и мертвые клетки = > «живут» клетки.
- Создайте точку участка «живой» клеток, отображая FSC-H (ось x) и FSC-W (ось y) и ворота исключить Дуплеты = > ворота жить/синглетно (FSC).
- Создайте точку участок жить/синглетно (FSC) клетки, отображая SSC-H (ось x) и SSC-W (ось y) и ворота исключить Дуплеты = > жить/синглетно (FSC) / ворота синглетно (SSC).
- Создайте точку участок жить/синглетно (FSC) / синглетно (SSC) клетки, отображая Sca-1 (ось x) и c комплект (ось y) и ворота выбрать c комплект+ Sca-1– клетки = > ЛКС– клетки.
- Создайте точку участок ЛКС– клетки, отображение CD34 (ось x) и FcγR (ось y) и ворота для выбора CD34+ FcγRЛо клетки = > «CMPs» и CD34+ FcγRПривет клетки = > «ГИП».
Примечание: Важно ворот «CMPs» и «ГИП» как точно как можно скорее. Это полезно использовать для точного стробирования участке плотность псевдоцветном или контурное. - Создайте точку участка «CMPs», отображение CD115 (ось x) и Flt3 (ось y) и ворота для выбора:
Flt3+ CD115Ло клеток = > CMP-Flt3+ CD115Ло клетки,
Flt3Ло клетки– CD115 = > CMP-Flt3– клетки,
Flt3+ CD115Привет клеток = > MDPs. - Создайте точку участок «ГИП», отображение Ly6C (ось x) и FcγR (ось y) и ворота для выбора Ly6C–клетки = > «GMP-Ly6C– клетки» и Ly6C+ клеток = > «GMP-Ly6C+ клетки».
- Создайте точку участка «GMP-Ly6C– клетки», отображение CD115 (ось x) и Flt3 (ось y) и ворота для выбора:
Flt3Ло клетки– CD115 = > ГИП. - Создайте точку участка «GMP-Ly6C+ клетки», отображение CD115 (ось x) и Flt3 (ось y) и ворота для выбора:
Flt3Ло клетки– CD115 = > GPs,
Flt3Привет клетки– CD115 = > м/с + cMoPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, описанных выше, можно получить от бедра и tibias (2 ноги) одной C57BL/6J мыши (6-8 недель старый, мужчина или женщина) ~ 100 миллионов клеток (включая красные кровяные клетки, или ~ 50 миллионов ядерных клеток). 1-2 миллионов Линь– клетки могут быть изолированы на мышь на MACS истощение Линь+ клеток.
Каждый из 6 подмножеств миелоидного progenitor составляет ~ 1-4% Лин– клетки. Lineage истощения является эффективным в истощению дифференцированных клеток и обогащения для прародителями, но Лин– фракция содержит большое количество клеток c комплект– в дополнение к c комплект+ прародителями (рис. 3A). Прародитель дает после того, как СУИМ сортировка может варьироваться в зависимости от параметров сортировки используется (например, максимальная доходность по сравнению с оптимальной чистоты), но в целом это можно получить 10 000-40 000 ячеек на фракции (рис. 3B). После сортировки потока cytometry анализ должен выявить > 95% чистоты каждой фракции (рис. 3 c).
Рисунок 2: стробирования стратегии для идентификации 6 фракций миелоидного progenitor. (A) прогрессивного стробирования живых клеток Лин– -> Майки (FSC) -> Майки (SSC) -> ЛКС– клетки -> CD34+ FcγRЛо («КПВ») и CD34+ FcγRПривет («GMP») фракций -> 6 миелоидного прародитель подмножества. (B) резюме поверхности маркер выражения 6 прародитель фракций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель прародитель урожайности и чистоты. (A) представитель проточной цитометрии участков показаны c комплект и выражение CD11b клетками костного мозга до и после истощения lineage, демонстрируя обогащения прародителями (c комплект+ клеток). (B) клеток дает для каждой фракции прародителю, представлены как mean + стандартное отклонение 30 экспериментов. Клетки костного мозга от до 20 мышей были объединены для каждого эксперимента. (C) представитель проточной цитометрии участки от анализа выполняемых после сортировки, демонстрируя чистоту фракций СУИМ сортировка прародителя. Группа C была изменена Яньес et al. 20177. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Лазер | Канал | Фильтр | Зеркало |
| 405 нм | А. | 670/30 | 635LP |
| Б. | 525/50 | 505LP | |
| C. c комплект Тихоокеанский синий | 450/50 | ||
| 488 нм | A. (FSC) | ||
| Б. Ly6C-PerCP-Cy5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. SSC | 488/10 | ||
| 561 Нм | А. Sca-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| Б. | 710/50 | 690LP | |
| C. | 660/20 | 640LP | |
| D. | 610/20 | 600LP | |
| Е. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640 Нм | А. FcϒR БТР Cy7 | 780/60 | 750LP |
| Б. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
Таблица 1: Антитела группы и потока цитометр конфигурации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вайсман, стробирование стратегия для мыши миелоидного progenitor идентификации1 был золотым стандартом для иммунологов и гематологи почти 20 лет, но сейчас очевидно, что «КПВ» и «GMP» ворота являются весьма разнородными и более точные шлюзовые стратегии необходимы. Протокол, который мы описали здесь позволяет выявить oligopotent и совершенные линии подмножеств мышей C57BL/6J более точную количественную оценку конкретных миелоидного прародителей и картирование myelopoiesis путей, а также расследование молекулярные механизмы, действующие на определенных стадиях миелоидного дифференциации. Прародитель подгруппы могут быть отсортированы, при желании, для молекулярного анализа, in vitro и in vivo оценки дифференцировки и т.д.
Протокол был разработан с использованием Янг (6-8 недель) мышей C57BL/6J и подходит для мужчин и женщин мышей. Мы не были характерны прародитель подмножества в старых мышей. Мы не ожидаем маркеров будет меняться с возрастом, но относительные пропорции подмножеств может варьироваться. Мы еще не оценены прародитель подмножества в других штаммов мыши.
Первое применение модифицированных стробирования стратегия заключается в предоставлении механистический проницательность в регуляции миелоидных клеток судьба выбор транскрипционного фактора интерферона регулирования фактора 8 (IRF8)2. IRF8 сообщалось ранее выраженную ГИП (Вайсман «GMP» фракции) и необходимые для дифференцировки моноцитов путем поощрения Моноцит экспрессии генов, подавление экспрессии генов нейтрофилов и поощрение нейтрофилов апоптоз10. Используя наши модифицированных стробирования стратегию, мы показали, что IRF8 не выраженные oligopotent ГИП, но выражается с помощью GPs и м/с + cMoPs2. Кроме того мы показали, что IRF8 регулирует GP и MP + cMoP выживания и дифференциация, а не производство линии, совершенные прародителями oligopotent ГИП. Аналогично мы недавно использовали нашей модифицированных стробирования стратегии для повторного определения модели myelopoiesis и продемонстрировал, что ГИП и MDPs производить функционально различных воспалительных моноциты через 2 независимых пути7.
Шаг линии истощение может производиться с использованием ручной магнитный сепаратор вместо автоматических магнитный сепаратор, и истощение линии также может быть достигнуто подачей cytometry, используя биотинилированным линии маркера антитела коктейль и Флюорофор конъюгированных анти биотина антитела, с стробирования выбрать неокрашенных клетки. Родословная истощения исключает наиболее дифференцированных клеток и обогащает для c комплект+ прародителями свести к минимуму время и затраты, связанные с последующих шагов (то есть, уменьшает объемы антитела для проточной цитометрии, анализатор/сортировщик время, и т.д.). Следователи должны относиться к таблицы производителя чтобы определить, используется ли шаг истощения родословную, работал эффективно, как ожидалось для конкретного набора. Однако это не имеет значения, если истощение линии не является 100% эффективным, потому что продифференцированы (Линь+) клетки не Экспресс c-Kit, поэтому любой дифференцированных клеток, оставшихся после истощения линии (а также другие клетки c комплект– ), впоследствии исключается потока цитометрии стробирования. Важно также отметить, что GPs и Экспресс Ly6C м/с, в отличие от Ly6C выраженные моноцитов, прародитель Ly6C (предположительно разные изоформы) не обнаруживается антител Gr-1, часто входят в наборы истощения линии, и таким образом GPs и депутаты остаются после истощение Lineage2.
Хорошее окрашивание является важным для всех поверхностных маркеров, но особенно важно для FcγR разрешить Точная стробирования FcγRЛо «CMPs» и FcγRПривет «ГИП». Оптимальное Флюорофор выбор и антитела разведение важны для хорошее разделение, и FcγR блокировки реагента (часто используется до окрашивания для проточной цитометрии) должны не использоваться. Важно также отметить, что CD115 является downregulated, когда клетки сохраняются при температуре 4° C или на льду для длительных периодов времени, поэтому очень важно работать быстро, чтобы получить хорошее окрашивание. Мы рекомендуем, обработка клетки в течение 1-2 часов, чтобы сохранить их целостность. Если не требуются живые клетки, окрашенные клетки могут фиксированной и приобрел в течение 48 часов.
Если изолированные фракции содержат значительное количество мертвых клеток, можно включить жизнеспособности краситель (например, пропидий йодидом) для более точного ворот живых клеток, хотя это, вероятно, потребует изменений в комбинации флюрохром конъюгированных антител. При желании, клеток может рассчитываться путем добавления подсчета бусины в известных концентрациях в образец для проточной цитометрии. Подсчитывая бусы, флуоресцентный латексные шарики, которые могут быть отделены от клетки FSC-A и SSC-A, или по их интенсивности флуоресценции высокой. Число клеток можно рассчитать по следующей формуле:
(количество событий клеток / количество бисера события) x (количество бусин, добавлен пример / объем выборки в мкл) = концентрация образца как клеток/мкл
Одно ограничение текущего протокола является, что она не идентификации отдельных депутатов и cMoPs, что затрудняет оценку этих прародителями, исследование их экспрессии генов и функциональные свойства и т.д. например, наблюдается увеличение MP + cMoP номера не указывают, происходит ли расширение Моноцит производства через GMP путь, путь MDP или оба. В текущих исследований мы надеемся, для выявления поверхностных маркеров, которые отличают между депутаты и cMoPs. В то же время оценки этих прародителями сингл клеточной РНК последовательности7 может использоваться для профилирования относительные пропорции депутатов и cMoPs.
Сингл клеточной РНК последовательности исследования будет вероятно также выявить дополнительные гетерогенность в пределах 6 прародитель фракций, указанных в настоящем Протоколе, некоторые из которых будут отражать различные созревания говорится, например, GPs, которые лишь недавно потеряли Моноцит потенциал по сравнению с GPs, которые готовы перейти к следующему этапу дифференциации. Подмножества фракция «GMP» может также содержать прародителями с потенциалом для производства других гранулоцитов (эозинофилов, базофилов и тучных клеток), но мы не исследовали это. Как отмечалось во введении, неясно также в настоящее время ли CMP-Flt3+ CD115Ло, CMP-Flt3– и ПРУ фракций действительно содержат прародителями предсказал oligopotent или альтернативно составляют смесь прародителями с более ограниченные линии потенциальных, но одноклеточных РНК последовательности может обеспечить понимание этот важный вопрос.
Новый подход в настоящее время требуется для определения подмножества человека миелоидного прародителями. Вайсман и коллеги ранее определенных миелоидного подмножеств (в том числе «CMPs» и «ГИП») в костного мозга человека и пуповинной крови11, но аналогичным образом они неоднородны. К сожалению, перевод мыши стробирования стратегии для человека прародителями осложняется заметные различия в поверхности маркер выражения между человека и мыши прародителями; например, CD34 выражение ограничивается миелоидного progenitor подмножества в мыши, но более широко отмечаемый человека прародителями, включая гемопоэтических стволовых клеток. Сингл клеточной РНК последовательности исследования следует однако, также позволяют идентифицировать кандидата маркеров, чтобы отделить человека прародитель подмножеств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот протокол был разработан с использованием средств от Совета управляющих регенеративной медицины института в медицинский центр Седарс-Синай (HSG), карьеру в иммунологии стипендий от Американской ассоциации иммунологов (Ай и HSG) и ученый награду от Американского общества гематологии (для AY). Мы благодарим основной поток Cytometry в медицинский центр Седарс-Синай для помощи с СУИМ сортировки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
