Summary
Vi visar hur att identifiera och isolera 6 delmängder av myeloida från murina benmärg med en kombination av magnetiska och fluorescens sortering (Mac och FACS). Detta protokoll kan användas för in vitro- kultur analyser (metylcellulosa eller vätska kulturer), in-vivo överföring experiment och RNA och protein analyser.
Abstract
Myeloida som ger neutrofiler, monocyter och dendritiska celler (DCs) kan identifieras i och isolerad från benmärgen hos möss för hematologiska och immunologiska analyser. Exempelvis kan studier av de cellulära och molekylära egenskaperna hos myeloida stamceller populationer avslöja mekanismerna bakom leukemiska transformation, eller demonstrera hur immunförsvaret reagerar på patogen exponering. Tidigare beskrivna flöde flödescytometri strategier för myeloida stamceller identifiering har aktiverat betydande framsteg på många områden, men de fraktioner som de identifierar är mycket heterogen. De vanligaste Usenets strategierna definiera benmärgen fraktioner som är berikad för önskad befolkningen, men också innehåller ett stort antal ”förorena” stamfäder. Vår nyligen genomförda studier har löst mycket av denna heterogenitet, och det protokoll som vi presenterar här tillåter isolering av 6 subpopulations av oligopotent och härstamning-begått myeloida från 2 tidigare beskrivits benmärgen fraktioner. Protokollet beskrivs 3 faser: 1) isolering av benmärg celler, 2) berikning för hematopoetiska progenitorceller genom magnetisk-aktiverad cell sortering (härstamning utarmning av Mac-datorer), och 3) identifiering av myeloida stamceller delmängder av flödescytometri (inklusive fluorescens-aktiverad cell sortering, FACS, om så önskas). Denna metod tillåter stamceller kvantifiering och isolering för en mängd olika in vitro - och in-vivo -program, och har redan gett roman insikt vägar och mekanismer av neutrofiler, monocyt och DC differentiering.
Introduction
Monocyter och neutrofiler dendritiska celler (DCs) är myeloida celler som uppstår från hematopoetiska progenitorceller, främst i benmärgen, genom en process som kallas myelopoiesis. Gemensamma myeloida (CMPs) har potential att producera myeloida celler, samt megakaryocyter och erytrocyter, men inte lymfoida celler. Granulocyt-monocyt stamfäder (god tillverkningssed), som härledas från CMPs, producera granulocyter och monocyter, men har förlorat megakaryocyt och erytrocyt potentiella. Monocyter och klassisk och dess DCs (cDCs/PDC) är också tänkt att uppstå från gemensamma stamfäder kallas monocyt-DC stamfäder (MDPs), som produceras av CMPs. successiv inskränkning av härstamning potential i slutändan resulterar i härstamning-begått föräldraparets: granulocyt stamfäder, monocyt stamfäder och dendritiska cellen stamfäder (figur 1).
Weissman och kollegor rapporterade att CMPs finns i Lin– c-Kit+ Sca-1– (LKS–) CD34+ FcγRlo bråkdel av mus benmärgen, medan god tillverkningssed ingår i den LKS– CD34+ FcγR Hej bråkdel1. Men är dessa ”CMP” och ”GMP” fraktioner mycket heterogen. Exempelvis innehåller ”GMP” fraktionen också härstamning-begått granulocyt stamfäder och monocyt föräldraparets1,2. MDPs rapporterades separat vara CX3CR1+ Flt3+ CD115+ stamfäder som också uttrycka CD34 och FcγR3,4. MDPs ge upphov till cDC/pDC-producerande gemensamma DC stamfäder (CDP), som har rapporterats att uttrycka lägre nivåer av c-Kit (CD117) och ingår inte i LKS– del5.
Tidigare antogs det att monocyter uppstå via en enda väg (CMP-GMP-MDP-monocyt). Konsekvent med denna modell, monocyt-begått stamfäder som produceras av god tillverkningssed (heter monocyt progenitorceller, MPs)2 och MDPs (heter gemensamma monocyt progenitorceller, cMoPs)6 verkar vara samma celler på grundval av delade ytan markör uttryck . Dock vi nyligen visat att monocyter produceras oberoende av god tillverkningssed och MDPs, och kunde urskilja mellan parlamentsledamöter och cMoPs av encelliga RNA-sekvensering7.
Vi ändrade nyligen den Weissman ”CMP” och ”GMP” Usenets strategi för att identifiera 6 och av C57BL/6J mus benmärgen som innehåller olika oligopotent och härstamning-begått myeloida stamceller deluppsättningar. Första rapporterade vi att färgning för Ly6C och CD115 tillåter isoleringen av oligopotent god tillverkningssed, och granulocyt stamfäder (GPs) samt monocyt stamfäder (MPs och cMoPs, som vi för närvarande inte att separera) från ”GMP” bråkdel2 (LKS - CD34+ FcγRHej gate; (Se figur 1). Vi visade senare att MDPs finns huvudsakligen i ”CMP” fraktionen (LKS– CD34+ FcγRlo gate), som också innehåller Flt3+ CD115lo och Flt3– delmängder7 (figur 1 ). Den CMP-Flt3+ CD115lo bråkdel ger både god tillverkningssed och MDPs vid överföring. Delmängden CMP-Flt3– innehåller stamfäder som verkar vara intermediärer mellan CMP-Flt3+ CD115lo celler och god tillverkningssed. Till skillnad från MDPs äger både CMP-Flt3+ CD115lo och CMP-Flt3– fraktioner också megakaryocyt och erytrocyt potentiella.
Det är viktigt att Observera dock att det är för närvarande oklart om ”CMP” fraktioner innehåller stamfäder som verkligen är oligopotent (t.ex. enskilda celler inom den CMP-Flt3+ CD115lo bråkdel som besitter neutrofiler, monocyt, DC, megakaryocyt och erytrocyt potentiella), eller alternativt kan bestå av en blandning av föräldraparets med mer begränsad härstamning potential. Kolonibildande analyser (metylcellulosa kulturer) avslöjade celler med granulocyt (neutrofila), erytrocyt, monocyt och megakaryocyt potentiella (GEMM celler) i ”CMP”, CMP-Flt3+ CD115lo och CMP-Flt3– fraktioner1 ,7, men tillåter inte bedömningen av DC potential. Däremot kolonibildande analyser visat förekomsten av oligopotent god tillverkningssed (föräldraparets med både neutrofila och monocyt potentiella) i ”GMP” bråkdel1,2, och detta stöds av senaste encelliga transcriptomic analys8. Det är för närvarande okänt, men huruvida dessa oligopotent genetiskt modifierade växter producerar även andra granulocyter (eosinofiler, basofiler och mastceller).
Baserat på dessa studier, visar vi nu kan hur 7 yta markörer (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C och CD115) användas för att identifiera och isolera dessa 6 undergrupper av oligopotent och härstamning-begått myeloida. Protokollet beskrivs här kan användas för in vitro- kultur analyser (metylcellulosa eller vätska kulturer), in-vivo överföring experiment på möss, och molekylär analys (bulk och encelliga RNA-sekvensering, Western blotting, etc.).
Protokollet består av 3 steg: (1) förberedelse av en enda cellsuspension av benmärg celler, 2) berikning för hematopoetiska progenitorceller (magnetisk-aktiverad cell sortering), och 3) identifiering och isolering om så önskas, av stamceller delmängder av flöde flödescytometri (med en analysator eller en sorterare, i förekommande fall). Det första steget är isoleringen av benmärgsceller från lårbenet och skenbenet euthanized möss och liknande till andra tidigare beskrivna protokoll9. Nästa, provet är berikad för stamceller och stamceller celler med en cocktail av antikroppar mot cell yta markörer av neutrofiler, lymfocyter, monocyter, erytrocyter, etc., för att tömma de differentierade cellerna. Detta är inte obligatoriskt, men rekommenderas starkt att optimera upptäckten av stamceller delmängder, och att minska mängden av antikroppar som behövs för identifiering av stamceller och den tid som krävs för flödescytometri. Lineage utarmning protokollet nedan beskriver Magnetic-Activated Cell sortering (Mac) med hjälp av en mus härstamning Cell utarmning Kit (som innehåller biotinylerade antikroppar mot CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, och Ter-119, plus anti biotin Mikrokulor) och en automatiserad magnetiska avskiljare. Det sista steget är att identifiera (och sortering, om så önskas) av stamceller delmängder av flödescytometri. Panelen antikropp beskrivs nedan (se även tabell 1) har utformats för att användas i en flödescytometer (analyzer eller sorterare) med 4 lasrar (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Figur 1: antal neutrofiler, monocyt och DC stamfäder och differentiering vägar. Den nyligen reviderade modellen av myelopoiesis7 illustreras, med Weissman grindarna för ”CMPs” (blå) och ”genetiskt modifierade växter” (grön)1 överlagras. Denna siffra har ändrats från Yáñez et al. 20177. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Cedars-Sinai Medical Center.
1. isolering av mus benmärg och förberedelse av en enda cellsuspension
- Avliva musen i enlighet med institutionella riktlinjer.
- Placera euthanized musen på ryggen och spraya den med 70% etanol (EtOH). Gör en liten (3-5 mm) snitt i varje bakbenen på den fotled nivå med skarpa, spetsiga sax, och dra huden mot kroppen för att ta bort den från benen och utsätter muskler och skelett.
- Ta bort musklerna (quadriceps, hamstrings, etc.) från benen genom att beskära dem med sax, efter riktning mot benet. Var noga med att inte skada benen.
- Rubba lårbenet från höftleder och skär bort bindväv och muskler att lossa benen, att vara noga med att inte skära i ben.
- Ta bort fötterna genom dislocating anklarna från förbenade, placera benen i ett rör med steril PBS eller media och transportera dem på is till vävnadsodling rummet.
Obs: För vissa andra program (t.ex. som följer makrofager från totala benmärgsceller) är det möjligt att lämna ben på is ett tag, men för stamceller isolering är det viktigt att gå vidare så snabbt som möjligt att undvika nedreglering av viktigt yta markörer (särskilt CD115). - I en biosäkerhet skåp, ta bort alla återstående mjuk vävnad från benen genom att gnugga dem med läskpapper.
Obs: Protokollet bör utföras i en biosäkerhet skåp om ett sterilt prov krävs för cell kultur eller i vivo analyser efter FACS sortering. Om sterila celler inte krävs, kan hela processen utföras på bänken lab. - Kort fördjupa ben i 70% EtOH desinficera dem, och sedan i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att tvätta dem.
- Separera lårbenet från skenben och vadben genom att skära genom knäet, och kassera vadben.
- Skär ändarna av benen med vass sax.
- Skörda benmärg med kall steril fosfatbuffrad Koksaltlösning som följer tills benen ser vita:
- Grepp varje ben med pincett, och infoga en 26G nål ansluten till en 10 mL spruta innehåller kall steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i ben axeln i ena änden.
- Håll benet ovanför ett 50 mL centrifugrör och spola 2-5 mL PBS genom benet att skörda märgen.
- Skörda märgen från alla 4 ben per mus (2 lårbenet och 2 förbenade).
- Pipettera försiktigt upp och ner med en 1 mL pipett att dela upp benmärgen att bilda en cellsuspension.
- Filtrera benmärgen suspensionen genom en bit av 30 μm nylon mesh att eliminera ben bitar och cell aggregat, därmed generera en enda cellsuspension.
- Centrifugera den enda cellsuspensionen vid 280 x g i 5 min, och resuspendera cellpelleten i steril färgning buffert (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), med 5 mL färgning buffert per mus (t.ex. 10 mL för celler poolade från lårbenet och skenbenet 2 möss).
- Ta en 10 μL delmängd av provet, blanda det med 10 μL Trypan blå och belastning 10 μL av resulterande Trypan blå-märkt provet vidare till en hemocytometer. Räkna cellerna använder ett ljusmikroskop.
Obs: Om cellerna är alltför koncentrerade för tillförlitlig inventering, späd provet innan du lägger till Trypan blå.
2. stamceller anrikning av magnetiska-aktiverad Cell sortering (Mac)
- Centrifugera hela enda cellsuspensionen (eller så många celler som krävs för att få önskad avkastningen) vid 280 x g i 5 min vid 4° C och resuspendera cellpelleten i 40 μl färgning buffert (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) per 107 celler.
Obs: Det är också möjligt att använda MACS buffert från härstamning utarmning kit tillverkaren (se Tabell för material) som ett alternativ till färgning bufferten. - Utföra härstamning utarmning enligt instruktionerna som medföljer den härstamning utarmning kit. Följande instruktioner är för kit ses i Tabell för material. Om ett olika kit används, följ tillverkarens anvisningar och fortsätt sedan till steg 2,3.
- Tillsätt 10 μL biotin-antikroppar cocktail per 107 celler, blanda genom pipettering och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 30 μL färgning buffert/MACS buffert per 107 celler och blanda.
- Tillsätt 20 μL anti biotin mikrokulor per 107 celler. Blanda väl och inkubera i en ytterligare 15 min vid 4 ° C.
Obs: Vortex mikrokulor innan du lägger dem i cellerna att se till att de sprids helt. - Tillsätt 1 mL färgning buffert/MACS buffert per 107 celler, Centrifugera cellerna vid 280 x g i 5 min, och resuspendera cellpelleten i 500 μL färgning buffert/MACS buffert för upp till 108 celler. För mer än 108 celler, skala upp volymen på färgning buffert/MACS buffert med detta.
- Förbereda den automatiserade magnetiska avskiljaren enligt tillverkarens anvisningar.
- Placera röret som innehåller märkta celler i separatorn och välja programmet negativa urval.
- Samla den negativa fraktionen, som innehåller stamceller-berikad härstamning-negativa (Lin–) celler. Kassera den positiva fraktionen, som innehåller magnetiskt-märkt härstamning-positiva celler.
- Centrifugera Lin– celler vid 280 x g i 5 min, och resuspendera cellpelleten i 2 mL färgning buffert/MACS buffert per mus (t.ex. 4 mL om benmärgen var poolats från 2 möss).
Obs: Pelleten bör nu vara vit istället för röd eftersom erytrocyterna har utarmat. - Ta en 10 μL alikvotens Lin– celler, blanda det med 10 μL Trypan blå och belastning 10 μL av resulterande Trypan blå-märkt provet vidare till en hemocytometer. Räkna cellerna använder ett ljusmikroskop.
Obs: Om cellerna är alltför koncentrerade för tillförlitlig inventering, späd provet innan du lägger till Trypan blå.
3. myeloida stamceller identifiering och isolering av fluorescens-aktiverad Cell sortering (FACS)
- Etikett 9 mikrocentrifugrör (1,5 eller 2 mL) för: 1) ofärgade celler, 2-8) celler enda färgas med fluorophore-konjugerade antikroppar mot FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C och CD115 för spänning urval och färg ersättning, och 9) prov celler att färgas med alla 7 antikroppar för stamceller identifiering och sortering.
- Fördela 100 000 celler till var och en av kontroll rör (rör 1-8), och alla återstående celler (eller färre om så önskas) till provet röret (tube 9).
Obs: Om provvolymen är större än 1,5-2 mL, kan det vara nödvändigt att fördela provet cellerna i en 15 mL tub, Centrifugera dem återsuspendera pelleten (steg 3.3 nedan) och sedan överföra cellerna i en mikrocentrifug rör för efterföljande färgning steg. - Centrifugera cellerna vid 1500 x g i 5 min, och återsuspendera kontroll tube pellets i 100 μL färgning buffert (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) och prov tube pelleten i 100 μL färgning buffert per 5 x 106 celler (t.ex. 200 μL 1 x 107 celler).
- Lägga till 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR enda fläcken röret och prov röret. Vortex försiktigt för att blanda och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
Obs: Det är viktigt att färga prov cellerna med FcγR (CD16/32) antikroppen innan du lägger till de andra antikropparna för att förhindra konkurrens på grund av icke-specifika Fc-medierad antikropp bindande. Inte att Inkubera cellerna med en FcγR som blockerar reagens. - Lägg de andra antikropparna till motsvarande enda fläcken rören (1 antikropp varje) och prov röret (alla 6 antikroppar): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 och 4 μg/mL CD115-PE. Vortex försiktigt, och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
- Lägga till 900 μl färgning buffert kontroll rören och 1 mL färgning buffert per 107 celler till provet röret. Centrifugera cellerna vid 1500 x g i 5 min och resuspendera cellpelleten i färgning buffert: 200 μl per kontrollrör och 500 μl per 25 x 106 celler i provet röret. Överföra de återsuspenderade cellerna till 5 mL FACS rör.
Obs: Om provvolymen är större än 1,5-2 mL, kan det vara nödvändigt att överföra cellerna till en 15 mL tub för centrifugering. - Förbereda flödescytometer (analyzer eller sorterare) enligt tillverkarens anvisningar.
- Kör ofärgade och enda målat kontroll celler genom en flödescytometer ställa upp spänningar och färg ersättningar.
- Kör provet cellerna, gate stamceller delmängder som beskrivs nedan och sammanfattas i figur 2och om så önskas, utföra FACS sortering för att isolera relevanta stamceller delmängder.
Obs: Det är vanligtvis nödvändigt att förvärva cirka 200.000 celler för att få minst 1000 händelser i varje stamceller utegångsförbud.- Skapa en dot tomt på alla celler, visning av FSC-A (x-axeln) och SSC-A (y-axeln), och utfärda utegångsförbud för att utesluta skräp och döda celler = > ”live” celler.
- Skapa en dot handling av ”live” celler, visning av FSC-H (x-axeln) och FSC-W (y-axeln), och utfärda utegångsförbud för att utesluta midjekort jacka = > live/singlet (FSC) gate.
- Skapa en dot tomt på live/singlet (FSC) celler, visning av SSC-H (x-axeln) och SSC-W (y-axeln), och utfärda utegångsförbud för att utesluta midjekort jacka = > live/singlet (FSC) / singlet (SSC) gate.
- Skapa en dot tomt på live/singlet (FSC) / singlet (SSC) celler, visning av Sca-1 (x-axeln) och c-Kit (y-axeln), och porten att välja c-Kit+ Sca-1– celler = > LKS– celler.
- Skapa en dot handling av LKS– celler, visar CD34 (x-axeln) och FcγR (y-axeln) och gate välja CD34+ FcγRlo celler = > ”CMPs” och CD34+ FcγRHej celler = > ”genetiskt modifierade växter”.
Obs: Det är viktigt att utfärda utegångsförbud för den ”CMPs” och ”god tillverkningssed” så exakt som möjligt. Det är bra att använda en falsk densitet tomt eller en kontur tomt för korrekt gating. - Skapa en dot tomt ”CMPs”, visar CD115 (x-axeln) och Flt3 (y-axeln), och porten att välja:
FLT3+ CD115lo celler = > CMP-Flt3+ CD115lo celler,
FLT3– CD115lo celler = > CMP-Flt3– celler,
FLT3+ CD115Hej celler = > MDPs. - Skapa en dot handling av ”genetiskt modifierade växter”, visar Ly6C (x-axeln) och FcγR (y-axeln) och utfärda utegångsförbud för att välja Ly6C–celler = > ”GMP-Ly6C– celler”, och Ly6C+ celler = > ”GMP-Ly6C+ celler”.
- Skapa en dot tomt ”GMP-Ly6C– celler”, visar CD115 (x-axeln) och Flt3 (y-axeln), och porten att välja:
FLT3– CD115lo celler = > god tillverkningssed. - Skapa en dot tomt ”GMP-Ly6C+ celler”, visar CD115 (x-axeln) och Flt3 (y-axeln), och porten att välja:
FLT3– CD115lo celler = > GPs,
FLT3– CD115Hej celler = > MPs + cMoPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, är det möjligt att få ~ 100 miljoner celler (inklusive röda blodkroppar eller ~ 50 miljoner kärnförsedda celler) från både lårbenet och förbenade (2 ben) av en C57BL/6J mus (6-8 veckor gammal, man eller kvinna). 1-2 miljoner Lin– celler kan isoleras per mus av MACS uttömning av Lin+ -celler.
Varje 6 myeloida stamceller delmängder utgör ~ 1-4% av Lin– celler. Lineage utarmning är effektiv på ozonnedbrytande differentierade celler och berikande för stamfäder, men andelen Lin– innehåller en stor andel av c-Kit– celler förutom c-Kit+ stamfäder (figur 3A). Stamceller ger efter FACS sortering kan variera beroende på vilka sorter inställningar används (t.ex. maximal avkastning jämfört med optimal renhet), men i allmänhet är det möjligt att erhålla 10,000-40,000 celler per fraktion (figur 3B). Efter sortera flödescytometri Flödesanalys bör avslöja > 95% renhet av respektive fraktion (figur 3 c).
Figur 2: Gating strategi för identifiering av 6 myeloida stamceller fraktioner. (A) progressiv gating levande Lin– celler -> undertröjor (FSC) -> undertröjor (SSC) -> LKS– celler -> CD34+ FcγRlo (”CMP”) och CD34+ FcγRHej (”GMP”) fraktioner -> 6 myeloisk stamceller delmängder. (B) Sammanfattning av surface markör uttryck av 6 stamfader fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa stamceller avkastning och renhet. (A) representativa flödescytometri tomter visar c-Kit och CD11b uttryck av benmärgsceller före och efter härstamning utarmning, visar anrikning av stamfäder (c-Kit+ celler). (B) Cell avkastning för varje stamceller bråkdel, presenteras som medelvärdet + standardavvikelsen för 30 experiment. Benmärgsceller från upp till 20 möss var poolade för varje experiment. (C) representativa flödescytometri tomter efter sortera analys, visar renheten av FACS-sorterade stamceller fraktioner. Panel C har ändrats från Yáñez et al. 20177. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Laser | Kanal | Filtret | Spegel |
| 405 nm | A. | 670/30 | 635LP |
| B. | 525/50 | 505LP | |
| C. c-Kit-Pacific Blue | 450/50 | ||
| 488 nm | A. (FSC) | ||
| B. Ly6C-PerCP-Cy5.5 | 710/50 | 690LP | |
| C. CD34-FITC | 525/50 | 505LP | |
| D. SSC | 488/10 | ||
| 561 nm | A. Sca-1-PE-Cy7 | 780/40 | 750LP |
| B. | 710/50 | 690LP | |
| C. | 660/20 | 640LP | |
| D. | 610/20 | 600LP | |
| E. CD115-PE | 582/15 | ||
| 640 nm | A. FcϒR-APC-Cy7 | 780/60 | 750LP |
| B. | 730/45 | 690LP | |
| C. Flt3-APC | 670/30 |
Tabell 1: Antikropp panel och flöde cytometer konfiguration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Weissman gating strategi för mus myeloida stamceller identifiering1 har varit guldmyntfoten för Immunologer och hematologer för nästan 20 år, men det framgår nu att ”CMP” och ”GMP” grindarna är mycket heterogen och mer exakt Usenets strategier behövs. Det protokoll som vi har beskrivit här tillåter identifiering av oligopotent och härstamning-begått delmängder i C57BL/6J möss för mer exakt kvantifiering av specifika myeloida och kartläggning av myelopoiesis vägar, liksom utredning av molekylära mekanismer vid specifika stadier av myeloisk differentiering. Stamceller delmängder kan sorteras, om så önskas, för molekylära analyser, in vitro- och in-vivo bedömning av differentiering osv
Protokollet har utvecklats med ung (6-8 veckor gamla) C57BL/6J möss och är lämplig för såväl kvinnliga som manliga möss. Vi har inte kännetecknas stamceller delmängder i äldre möss. Vi inte förutse markörerna kommer att förändras med åldern, men de relativa proportionerna av delmängder kan variera. Vi har inte bedömt stamceller delmängder i andra musen stammar.
Den första tillämpningen av vår modifierade Usenets strategi var att ge mekanistisk insikt i regleringen av myeloida cell öde val av transkription faktorn interferon reglerande faktorn 8 (IRF8)2. IRF8 redovisades tidigare till uttryckas av god tillverkningssed (Weissman ”GMP” bråkdel) och krävs för monocyt differentiering genom att främja monocyt genuttryck, undertrycka neutrofila genuttryck och främja neutrofila apoptos10. Använder vår modifierade Usenets strategi, visat vi att IRF8 inte är uttryckt av oligopotent god tillverkningssed, men uttrycks av både GPs och MPs + cMoPs2. Dessutom visade vi att IRF8 reglerar GP och MP + cMoP överlevnad och differentiering, snarare än produktion av härstamning-begått föräldraparets genom oligopotent god tillverkningssed. Likaså vi nyligen använt vår modifierade Usenets strategi för att omdefiniera modellen av myelopoiesis, och visat att god tillverkningssed och MDPs producerar funktionellt distinkta inflammatoriska monocyter via 2 oberoende vägar7.
Det härstamning utarmning steget kan utföras med en manuell magnetisk separator i stället för en automatiserad magnetisk separator och härstamning utarmning kan också uppnås genom flödescytometri med hjälp av biotinylerade härstamning markör antikroppar cocktail och en fluorophore-konjugerad anti biotin antikropp, med gating för att markera de ofärgade cellerna. Lineage utarmning utesluter mest differentierade cellerna och berikar att minimera den tid och kostnader i samband med de efterföljande stegen (dvs minskar antikropp volymer för flödescytometri, analysator/sorterare tid, stamfäder som c-Kit+ etc.). Utredare ska hänvisa till tillverkarens datablad att avgöra huruvida det härstamning utarmning steget arbetade så effektivt som förväntade för specifika kit används. Men det spelar ingen roll om härstamning utarmning inte är 100% effektiv eftersom differentierade (Lin+) celler inte express c-Kit, så alla differentierade cellerna som återstår efter härstamning utarmning (liksom andra c-Kit– celler) är därefter Exkluderad av flöde flödescytometri gating. Det är också viktigt att notera att GPs och MPs express Ly6C men, till skillnad från Ly6C uttryckt av monocyter, Fadern Ly6C (förmodligen en annan isoform) identifieras inte av Gr-1 antikroppen ofta ingår i härstamning utarmning kit, och således GPs och MPs kvar efter Lineage utarmning2.
Bra färgning är viktig för alla de yta markörerna, men särskilt kritisk för FcγR att tillåta korrekt gating den FcγRlo ”CMPs” och den FcγRHej ”genetiskt modifierade växter”. Optimal fluorophore val och antikropp utspädning är avgörande för god separation, och ett FcγR blockerande reagens (vanligen används före färgning för flödescytometri) måste inte användas. Det är också viktigt att notera att CD115 är nedreglerade när cellerna bibehålls vid 4° C eller på is för längre perioder, så det är viktigt att arbeta snabbt för att få bra färgning. Vi rekommenderar behandling cellerna inom 1-2 timmar för att bevara deras integritet. Om levande celler inte är obligatoriska, kan färgade celler vara fast och förvärvade inom 48 timmar.
Om de isolera fraktionerna innehåller betydande antal döda celler, är det möjligt att inkludera ett livskraft färgämne (t.ex. propidium jodid) för att mer exakt gate levande celler, även om detta skulle förmodligen kräva en förändring i kombinationen av fluorokrom-konjugerade antikroppar. Om så önskas, kan blodkroppar beräknas genom att lägga till räkna pärlorna på en känd koncentration i urvalet för flödescytometri. Räkna pärlorna är fluorescerande latex pärlor som kan särskiljas från cellerna av FSC-A och SSC- eller av deras höga fluorescensintensiteten. Cell nummer kan beräknas med följande formel:
(antal cell händelser / antal pärla händelser) x (antal pärlor tillsätts provet / provmängden i μL) = koncentration av provet som celler/μL
En begränsning av det nuvarande protokollet är att det inte medger separat identifiering av MPs och cMoPs, vilket försvårar utvärderingen av dessa progenitorceller, undersökning av deras genuttryck och funktionella egenskaper, etc. till exempel en observerats öka i MP + cMoP siffror anger inte om förbättrad monocyt produktion uppstår via GMP vägen, MDP vägen, eller båda. I pågående studier hoppas vi kunna identifiera yta markörer att skilja mellan MPs och cMoPs. Under tiden, skulle utvärdering av dessa stamfäder av encelliga RNA-sekvensering7 kunna användas att profilera de relativa proportionerna av MPs och cMoPs.
Encelliga RNA-sekvensering studier kommer sannolikt också avslöja ytterligare heterogenitet inom de 6 stamfader fraktioner som beskrivs i detta protokoll, av vilka några kommer att återspegla olika mognad sägs exempelvis GPs som nyligen har förlorat monocyt potential jämfört med GPs som är redo att gå vidare till nästa etapp av differentiering. ”GMP” bråkdel delmängder kan också innehålla föräldraparets med potential att producera andra granulocyter (eosinofiler, basofiler och mastceller), men vi har inte undersökt detta. Som nämnts i inledningen, är det också för närvarande oklart huruvida CMP-Flt3+ CD115lo, CMP-Flt3– och MDP fraktioner verkligen innehåller förutspådda oligopotent föräldraparets eller alternativt bestå av en blandning av föräldraparets med mer begränsade härstamning potentiella, men encelliga RNA-sekvensering kan ge insikt i denna viktiga fråga.
En ny metod är nu krävs för identifiering av delmängder av mänskliga myeloida. Weissman och kollegor tidigare definierad myeloisk undergrupper (inklusive ”CMPs” och ”god tillverkningssed”) i mänsklig benmärg och sladd blod11, men de är likaså heterogena. Tyvärr, översättning av mus gating strategier till mänskliga föräldraparets kompliceras av anmärkningsvärda skillnader i ytan markör uttryck mellan människa och mus föräldraparets; t.ex. CD34 uttryck är begränsat till myeloida stamceller delmängder i musen, men i huvudsak observerats på mänskliga föräldraparets inklusive hematopoetiska stamceller. Encelliga RNA-sekvensering studier bör dock också medger identifiering av kandidat markörer att separera mänskliga stamceller delmängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta protokoll har utvecklats med medel från styrelsen av guvernörer regenerativ medicin institutet vid Cedars-Sinai Medical Center (HSG), en karriär inom immunologi fellowship från den amerikanska Association av Immunologer (till AY och HSG) och en Scholar Award från American Society hematologi (till AY). Vi tackar Flow flödescytometri kärnan på Cedars-Sinai Medical Center för hjälp med FACS sortering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
