Summary
항 체에 신의 cyclopropene 파생 통합 tetrazine 베어링 분자 생성 항 체 약물 어원이 같은 말의 사이트별, 신속 하 고 효율적인 결합 수 있습니다.
Abstract
마약 항 체 어원이 같은 말 (Adc) 임상 연습에서 현재 사용 되는 여러 다른 위치에서 독에 연결 하는 항 체 분자의 혼합물. 전 임상 연구 치료 인덱스 이러한 전통적인 Adc의 독 소의 사이트 연결 향상 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 그러나, 현재 접근 균질 Adc를 생산 하는 낮은 단백질 표정, 느린 반응 속도 론 등 여러 제한이 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 항 체 유전자 코드 확장을 사용 하 여에 리 (CypK)의 cyclopropene 파생을 통합 하는 식의 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다. 이 최소한의 bioorthogonal 핸들 역 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition 통해 tetrazine 파생 상품의 급속 한 활용 가능 여기 보고 식 시스템에 손쉬운 생산과 trastuzumab 무거운 체인의 각 CypK 베어링의 정화 수 있습니다. 우리는 독 소 monomethyl auristatin 전자에 항 체를 연결 하 고 소수 성 상호 작용 착 색 인쇄기 질량 분석에 의해 immunoconjugate를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 활용에서 발생 하는 dihydropyridazine 결합의 인간 혈 청에서 안정성을 평가 하 고 HER2 수용 체의 상부를 가진 유방암 세포에 대 한 ADC의 선택적 세포 독성 테스트 분석을 설명 합니다.
Introduction
마약 항 체 어원이 같은 말 (Adc) biotherapeutics의 선택도 및 작은 세포 독성 분자의 힘을 결합 한다. 대부분의 Adc는 암 세포1DNA 또는 microtubule 중 합에 영향을 주는 약물을 대상으로 전통적인 화학 요법의 부작용을 감소 하고자 합니다. 식품의 약 청 (FDA)에 의해 승인 세대 Adc 감소 pharmacokinetic 속성2다른 위치에 분자의 혼합물을 생성 하는 lysines 및 시스테인, 수정에 의존 합니다. 대조적으로, 항 체 약품의 사이트 활용 향상 된 치료 indeces3,4화합물을 생성할 수 있습니다. 균질 Adc를 생산의 문제 해결을 추구, 몇 가지 선택적 화학과 효소 수정을 보고1,5되었습니다. 그러나, 현재 방법 수 대상 항 체에만 특정 위치, 낮은 단백질 표정에서 고통을, 낮은 안정성, 링커 제공 또는 느리고 낮은 저조한 반응에 의존.
유전자 코드 확장을 통해 비정규 아미노산 (ncAA)의 수 있습니다 잠재적으로 생성 하는 데 사용 하는 다른 방법의 한계를 극복 하는 단백질으로 bioorthogonal 반응 그룹의 과다의 사이트별 설치를 Adc입니다. 인코딩 대상 (중지) 코 돈에 대응에서 ncAAs 정식 아미노산6통합 생 쌍을 직교 하는 aminoacyl-tRNA 합성/tRNA 쌍에 의존 합니다. 여러 ncAAs Adc 생성 항 체에 통합 되었습니다. 그러나, 가장 치료 약물 활용에 응용 프로그램에 대 한 다양 한 부채에서 고통. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 아니다 완전히 bioorthogonal, 낮은 pH (4.5)와 긴 반응 시간 (> 60 h), p-azidophenylalanine (pAzF)7,,910, 등 azides 동시에 요구 p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11및 lysine (AzK)12,13 의 아 지 드 파생 셀14에서 감소 될 수 있습니다 및 Huisgen cycloadditions를 촉매 하는 데 사용 하는 구리 산화 손상을 일으킬 수 있다 15.
대체 ncAAs 트랜스-cyclooctene (TCO)에 따라, cyclooctyne (SCO)와 bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) 최근 인코딩되어 항 체에 바이오 이미징 목적, 표현 시스템 매우 낮은 수율 (0.5 mg/L)16에서 겪고 있다. 또한, cyclooctenes와 cyclooctynes는 큰 및 집계-ADC 페이로드에 대 한 ADC의 민감성을 증가 시킬 수 있습니다 소수 성 처리는 전통적으로 소수 링커의 물리 화학적 특성을 크게 표시 되었습니다. 약 동학 및 치료 인덱스17영향. 대조적으로, 1, 3-disubstitued cyclopropenes은 작은 반응 그룹 단백질 구조와 physichochemical 속성18에 최소한의 변경 발생입니다. Cyclopropenes 역 전자-수요 Diels 오리 나무 cycloaddition19통해 tetrazines와 선택적으로 그리고 급속 하 게 반작용 한다. 이 프로토콜에서 우리가 만드는 작은 메 틸 cyclopropene 더 큰 긴장된 불포화 주기 보다 입체 방해에 의해 영향을 하 고 1-30 M-1의 순서 반응 속도 상수 lysine (CypK, 그림 1b) 베어링의 파생의 사용 -1 수성 미디어18,20에서.
우리는 최근 CypK tetrazine 베어링 분자21이 최소 bioorthogonal 핸들 반응 하 여 Adc를 생성 하는 항 체로 통합 하는 방법을 했다. 여기는 가장 어려운 단계에 중점을 두고 좀 더 자세하게 ADC 준비 절차에 설명합니다. CypK의 pyrrolysyl-tRNA 합성 (PylRS)를 사용 하 여 이동은 / tRNACUA(PylT) 쌍 항 체 무거운 사슬에 도입 하는 호박 codon에 대 한 응답에서 (HC)22. 여기 두 개의 플라스 미드 사용 하 여 (그림 1a) 과도 transfection, 하나는 항 체의 무거운 체인 인코딩 인코딩 모두 포함 된 PylRS/PylT 카세트 빛 체인 (LC), 다른 하나에 대 한. 또는, 더 높은 항 체 수익률을 가능 하 게 안정적인 셀 라인21더 힘 드는 절차 통해 생성할 수 있습니다.
상기 식 시스템 1 (IgG1) 치료 안티 HER2 면역 글로불린을 생산할 수 있는 trastuzumab 야생 유형 항 체를 비슷한 수준에서 CypK와 함께. 우리는 ncAA (HC-118TAG)를 인코딩하는 데 무거운 체인 CH1 도메인의 첫 번째 위치를 선택. 하지만 이것은 Adc23 에 가장 일반적으로 수정 된 사이트와 HC-118 (EU 번호)로 알려져 있다 되었습니다 라고도 HC-121 (시퀀스 위치)와 HC-114 (Kabat 번호)24. 이 위치는 모든 IgG1s에 걸쳐 보존은, 이후 이러한 식 시스템 의무가 가장 치료 항 체 이어야 한다입니다.
우리는 trastuzumab(CypK)2 수 쉽게 순화 될 단백질에 의해 한 뒤 소수 성 상호 작용 열 (FPLC-HIC)와 고속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 표시. 그 후 항 체 covalently microtubule 중 합 억제제 monomethyl auristatin E (MMAE), FDA 승인 ADC Adcetris에서 사용 되는에 3 h 이내 연결 된다. 여기 우리가 사용 MMAE (tetrazine-vcMMAE)의 벤 질 tetrazine 파생 링커 glutarate 스페이서 및 valine 시트 룰 린 효소 정한 구성 요소 뒤에 p-aminobenzylalcohol self-immolative 단위; 이 링커는 독 소25traceless 릴리스 결과 ADC의 국제화에 따라 리소좀에 Cathepsin b 죽 습. 반응의 광범위 한 범위를 보여, 항 체는 또한 fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA)에 연결 됩니다. 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC-MS)를 결합 하 여는 공액의 정체성을 확인 하 고 소수 성 상호 작용 열 (HPLC-HIC)와 고성능 액체 착 색 인쇄기를 사용 하 여 약물을 항 체 비율 (DAR)을 계산 하는 방법을 설명합니다 .
항 체 성능 특성화의 일환으로, 우리는 인간의 혈 청에 dihydropyridazine 연결의 안정성을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 간단한 ELISA에 의해 정해질 수 있습니다 및 결과의 해석 하지 trastuzumab(MMAE)2의 효소 정한 구성 요소에 의해 복잡 하 게 하기 때문에이 매개 변수는 더 쉽게 trastuzumab TAMRA에 평가 됩니다. 마지막으로, 선택도 및 trastuzumab(MMAE)2 의 힘 HER2의 다른 레벨을 표현 하는 셀 라인에 걸쳐 ADC의 cytoxicity를 비교 하 여 평가 됩니다. 이 분석 결과 인간의 혈 청에 immunoconjugate 잠복기 후 수행 하는 경우 ADC 안정성의 기능 증명을 제공 합니다.
Protocol
1. 생산 및 항 체의 특성
- 항 체를 표현
- 표현 매체와 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 250 ng/mL 암포 8% CO2 에서 37 ° C에서 셀 습도 incubators 장착 B. 유지 보충의 50 mL를 포함 하는 250 mL 플라스 크에 HEK 현 탁 액 셀의 유리병을 녹여 125 rpm에서 쉐를 커와 함께 Transfecting 전에 셀 0.3-0.5 x 106 셀/mL (2-3 일 마다)을 2 회 이상 분할.
- 때 2.5 x 106 셀/mL의 조밀도 도달된 (2-3 일 분한 후), 100 mM CypK의 신선한 솔루션을 준비입니다. 이 목적을 위해 CypK의 64 밀리 그램의 무게, 복구 모든 소화 입자를 sonicate 내려 0.1 나트륨 수산화, 소용돌이, 스핀의 2.5 mL를 추가 합니다.
- 항생제로 보충 하는 표현 매체의 42.5 ml CypK (0.1 M NaOH에 100 m m)의 2.5 mL를 추가 합니다. 잘 섞어, 0.1 M HCl의 250 µ L을 추가 하 고, 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독.
- HC 및 LC pKym1 플라스 미드21 감소 된 혈 청 매체와 2.5 mL를 50 µ g을 희석. 별도 튜브에 감소 된 혈 청 매체와 2.5 ml transfection 시 약의 135 µ L를 희석.
- 솔루션을 준비 후 5 분 믹스는 플라스 미드와 transfection 시 솔루션 및 DNA와 transfection 시 사이 단지의 형성 수 있도록 20 분 동안 품 어.
- 한편, x 500g에 5 분 동안 대상 밀도에서 125 백만 세포를 원심, CypK를 포함 하는 표현 매체와 resuspend 고 DNA-transfection 시 혼합물을 추가 합니다. CypK 구입 하거나 이전18보고 합성 될 수 있습니다.
- 20 h에 대 한 셀을 잠복기 후 transfection 시 강화 키트에 포함 된의 250 µ L를 추가 합니다.
- CypK (매체의 변화가 식은 동안 필요)의 추가 후에 표면에 뜨는 6-7 일에서 항 체를 수확.
* 또는 높은 하 고 더 일관 된 수익률을 얻으려면, 안정적인 셀 라인 생성 될 수 있습니다 Oller 샐비어 외 에 설명 된 대로 201821. 이 경우에, trastuzumab(CypK)2 식 매체 m m CypK 5의 추가 의해 간단 하 게 표현 된다.
- 항 체 정화
- 3000 x g에서 15 분 동안 셀 원심
- 필터는 0.45 또는 0.22 μ m 필터 상쾌한. 필터 차단 되는 경우 새로운 한 그것을 대체 하 고 필터링을 계속 합니다. 이 몇 밀리 리터 후 경우, 원심 7000 x g에서 추가로 15 분에 대 한 상쾌한.
- 빈 폴 리 프로필 렌 크로마토그래피 칼럼에서 단백질 A 수 지 (2 mL/100 mL의 상쾌한)를 추가 하 고 비드 워시 버퍼 (0.1 M 인산 나트륨, 150 mM NaCl)의 적어도 5 볼륨 수 지 equilibrate.
- 두 50 mL 원뿔 관으로는 상쾌한 분할 하 고 뒤에 미리 equilibrated 단백질 A 수 지 비드 워시 버퍼 (0.5 M 나트륨 인산 염, 150 mM NaCl) x 5를 추가 합니다. 풀 다운은 상쾌한에 항 체를 상 온에서 3 h에 대 한 롤러에 원뿔 튜브를 놓습니다.
또는: 수 지의 권장 량이 적어도 두 배 열에는 상쾌한을 추가 하 고를 통해 흐름을 허용. SDS 페이지 상쾌한에 남아 있는 항 체의 상당한 아니다 다는 것을 확인 하십시오. 있다면, 다시 한 번 수 지 통해 상쾌한 elute. - 열에는 상쾌한 수 지 단백질 A 전송 하 고 액체를 통해 흐름을 허용.
- 워시 버퍼 (또는 적어도 10 수 지 볼륨) 25 mL를 추가 하 고를 통해 흐름을 허용.
- 4 mL의 0.1 M 나트륨 구 연산 염, 3, 1 M 인산 염 버퍼, 150 mM NaCl의 1 mL에 pH와 항 체 elute
- PBS의 10 mL와 항 체 희석, 0.5-1 집중 원심 여과 및 exchange 버퍼 PBS 세 번 하 여 mL.
- FPLC 0.5 mL/min와 0-100의 흐름으로 부 틸 HIC 열을 사용 하 여 샘플을 정화 높은 소금 버퍼에 낮은 소금 버퍼 (50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 20% 소 프로 파 놀)의 30 분 기온 변화도 % (1.5 M (NH4)2등4, 50 m m 인산 나트륨 pH 7.0 5% 소 프로 파 놀). 모든 분수를 수집 하 고 모니터링 280에서 차입 nm. 소량 (< 1 mg) 수율 및 순도 최대화 하기 위해 2.4에 설명 된 조건에서 HPLC HIC와 정화 수 있습니다.
- 포함 하는 항 체, PBS 가진 적어도 4 mL에 희석 원심 여과 및 교환 버퍼 PBS 세 번 하 여 집중 분수 풀.
- 항 체를 계량
- 280에서 흡 광도 측정 하 여 대략적인 농도 구하는 nm 마이크로 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- 정확 하 게 측정 해야 하는 경우 인간의 IgGs를 측정 하는 ELISA 키트를 사용 합니다. 대략적인 견적에 대 한 SDS 페이지 Coomassie 기반 얼룩으로 다음과 같이 사용.
- 1 mg/mL에서 ELISA에 의해 계량 trastuzumab 표준 6 배 두 배를 diluting 하 여 표준을 준비 합니다.
- 표준 및 샘플을 로딩 버퍼 줄이는 약 0.25 mg/mL에서 끓인 다.
- 사용 하 여 4-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지에 그들을 실행 MES SDS 버퍼와 Coomassie 기반 염료와 얼룩. 마지막으로 빛 또는 무거운 체인 ImageJ를 사용 하 여 해당 밴드의 색상 밀도 측정 하 고 표준 곡선의 샘플에서 신호 보간.
- 4 ° c.에 항 체를 저장
2. 항 체 단백 결합 하 고 ADC를 특성화
- Tetrazine-방위 분자와 항 체 켤레
- 20 µ L의 이기와 작은 원뿔 튜브 (예를 들어,PCR 튜브)에 PBS의 76 µ L tetrazine-vcMMAE (4 µ L, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 3.4 m m)의 10 어 금 니 동등을 희석.
- Trastuzumab(CypK)2 (100 µ L, 2mg/mL PBS에)의 1 어 금 니 동등을 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 trastuzumab(MMAE)2를 실 온 (25 ° C)에서 3 h 반응 허용.
참고: tetrazine-5-TAMRA 같은 다른 분자는 tetrazine-vcMMAE이이 프로토콜을 사용 하 여 대신 항 체에 연결할 수 있습니다.
- ADC를 정화
- 사전에 제조업체의 지침에 따라 PBS를 가진 크기 제외 스핀 열 equilibrate.
- 스핀 열과 1 분 1500 x g에서 원심 분리기에는 반응의 전체 볼륨을 추가 합니다.
- SDS 페이지 여 켤레를 분석 하 고 ADC를 계량
- 1.3.2에 설명 된 대로 ADC를 계량. SDS 페이지에 빛 체인의 색상 밀도 측정 하 여 표준 곡선에 대 한 수정 되지 않은 항 체를 사용 하 여.
- 무거운 사슬 한다 약간 이동 했다는 활용에 따라 분자 무게가 증가 보여주는.
참고: trastuzumab(TAMRA)2와 같은 fluorophore와 항 체를 수정 하는 경우만 해당 하는 무거운 체인 밴드 얼룩이 지기 전에 젤에 형광을 표시 해야 합니다.
- HPLC hic 공액 분석
- 100% 버퍼 A와 HPLC HIC 열 equilibrate (1.5 M (NH4)2등4, 50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 5% 소 프로 파 놀) 5 분.
- 혼합 15 µ L (67 pmol) trastuzumab (CypK) 2 15 µ L의 2 배와 1 mg/mL 해결책의 버퍼는 유리병에 A. 다음에 HPLC에서 10 µ L 주입 프로그램.
- 1 분 뒤 15 분 그라데이션 100에서 버퍼 A b (50 m m 인산 나트륨 pH 7.0, 20% 소 프로 파 놀)의 0% 100% 버퍼 A와 isocratic 1 mL/min 흐름에서 elute. 280에서 차입 모니터링 nm.
- 스 피크에 해당 각 종 하 고 다음 식을 결과 영역을 사용 하 여 통합 하 여 계산.
DAR = (1 x trastuzumab(MMAE) + 2 x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 , trastuzumab(MMAE)2)
Trastuzumab(CypK)2 에 대 한 예상된 보존 시간 trastuzumab (CypK, MMAE)은 9.1-9.6 분, 그리고 trastuzumab(MMAE)2 는 10.5 11.0 분 7.5-8.0 분입니다.
- LC-MS에 의해 공액 분석
- Deglycosylate 30 µ L 1 mg/mL ADC 및 비 감소에 수정 되지 않은 항 체의 적어도 6 h 37 ° c.에 대 한 250 PNGase F 단위를 사용 하 여 조건
- 항 체는 c 4에서 질량 분 서 계에 물에 2% ~ 80% 이기의 20 분 그라디언트를 사용 하 여 1-5 µ m 1.0 x 100 m m 열 elute. 콘 전압 150v의 긍정적인 이온 모드에서 350-4000의 m/z 범위 데이터를 취득.
- 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 원시 데이터 deconvolute 수정 하 고 수정 되지 않은 항 체 질량에서 차이 계산 합니다.
3. 분석 결과 혈 청에서 Trastuzumab(TAMRA)2 Dihydropyridazine 링크의 안정성
- 무 균 조건 하에서 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 혈 청을 필터링 합니다. 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μ g/mL 스를 추가할 수 있습니다.
- 96 잘 접시의 외부 우물 물으로 채우십시오. 중앙 우물에서 0.1 mg/mL의 최종 농도에 PBS에 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 의 10 µ L로 필터링 된 혈 청의 triplicate 90 µ L에 혼합. 37 ° C와 4-5% CO2습도 포화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 5 일, 피펫으로 각 전역 마다 24 시간 잘 철저 하 게 혼합, 5 µ L aliquot, 액체 질소, 플래시 동결과-80 ° c.에 저장
- 일단 모든 샘플 수집 되어, 해 동이 aliquots 및 분석 간접적인 ELISA를 사용 하 여 이전으로 보고12 일부 수정:
- 0.25 µ g/mL HER2 4 ° c.에와 하룻밤 96 잘 접시 코트 다른 모든 단계는 상 온에서 수행 됩니다.
- 다음 날, PBS 0.05% 트윈 (PBS-T)와 5 번을 세척 하 고 1% 소 혈 청 알 부 민 1 h와 차단 합니다.
- 세척 하 고 2 시간에 대 한 PBS에 1:10000 희석에서 샘플을 품 어.
- 세척 하 고 안티 TAMRA 항 체 1: 2000 PBS-T h 1에 대 한 0.5 %BSA에서 희석에서 마우스에서 품 어.
- 세척 하 고 PBS-T h 1에 대 한 0.5 %BSA에서 반대로 마우스 HRP 어원이 1:1000를 품 어.
- TMB을 추가 하 고 5-10 분 반응 허용.
- 그래서 50 µ H L2반응 중지 450에서4 1 M과 측정 흡 광도 nm. 570에서 측정 배경 빼기 nm.
- 표준 희석에 4-매개 변수 로지스틱 회귀 곡선을 적합 하 고 샘플에서 측정을 보간.
참고: trastuzumab(MMAE)2 의 안정성 수 부과 상업 ELISA 키트 3.3에서 설명 하는 분석 결과 변경 하 여 동일한 프로토콜을 사용 하 여 ADC의 농도 측정 하.
4. ADC의 세포 독성 평가
참고:이 프로토콜은 이전에 보고 된 분석 실험23,26 일부 수정에 기반.
- SK-BR-3 및 MCF-7 셀 thaw 고 10% 열 보충 DMEM 비활성화 소 태아 혈 청, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 µ g/mL 스 완전 한 매체를 포함 하는 것은 즉 p25 플라스 크에 정착 하도록 허용.
- 80-90% 합류 (매 3-4 일) 분석 결과 전에 적어도 2 번에 셀을 분할 합니다.
- 분석 결과, 이전 2 일 96 잘 접시의 외부 우물 물을 채우십시오. 0.5 m EDTA, 분리기 250g x 3 분 m에서 0.05 %trypsin 리프트 셀 새로운 매체에 resuspend 그리고 3000 셀 (빈) 잘 96 잘 접시에서 당 100 µ L 씨.
- 셀, 시드 후 2 일 완전 한 매체에서 0.1 %DMSO 3 중에서 모든 샘플의 10 연속 희석을 준비 합니다. 다음 샘플 및 컨트롤을 고려 하십시오: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab 야생 타입, tetrazine vcMMAE, MMAE.
- 각 잘에서 각 샘플의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C와 4-5% CO2에서 5 일 동안 품 어.
- 5 일에 세포 생존 능력을 측정 합니다. 이 위해 상업 키트를 사용 하 여 세포를 lyse 발표 ATP 측정을. 0.1 %DMSO 치료 하는 제어 셀 기준 신호 백분율을 플롯 합니다.
참고: Adc 혈 청에서 5 일 동안 알을 품을 고 기능 안정성을 증명 하기 위해 세포 독성에 대 한 분석 될 수 있습니다.
주의: MMAE은 매우 독성이 있습니다. 따라서 사용 장갑 및 고글 MMAE 파생 상품을 취급 합니다. 사용 하는 경우 수정 되지 않은 MMAE 컨트롤로 실험에서 DMSO에 재고 솔루션을 준비할 때, 증기 두건 안쪽 고체 제품을 처리 합니다.
Representative Results
보고 된 과도 식 시스템 (그림 1a) 22 ± trastuzumab(CypK)2 (그림 1c) 동일한 조건 하에서 생산 하는 야생 타입 항 체의 2/3를 대표 하는 문화 매체의 리터 당 2 밀리 그램을 생성 합니다. 안정적인 셀 라인 31 ± 2mg/L21까지이 수익률을 높일 수 있습니다.
Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-vcMMAE, 이며 25 ° C (그림 2)에서 3 h 이내 즉 균질 trastuzumab(MMAE)2 와 함께 활용 될 수 있습니다. 이 cytotoxin의 높은 hydrophobicity 10% 이기 때 5의 추가 또는 CypK 당 독 소의 어 금 니 등가물을 더는 데 사용 됩니다. 또는, cycloaddition는 또한 20 h 2 등가물 tetrazine vcMMAE 이기 (그림 2c) 없이를 사용 하 여 내 완료 됩니다. Trastuzumab(CypK)2 tetrazine-25 ° C에서 2 시간 이내 TAMRA 반응 하 고 온도 4 ° C (그림 3c)을 감소 하는 경우 3-6 h는 필요.
Trastuzumab(MMAE)2 HPLC hic 측정에 대 한 예상된 DAR은 1.9 (그림 2b). 8.0 분 크로마에서 처음 관찰 된 피크 결합형된 항 체 (DAR 0) 나타내고, 반응이 완료 되 면 완전히 사라진가지고 해야 합니다. 9.1-9.6 분 elutes 고 3 h; 후 지역 < 10% 있어야 합니다 스 1 종 그리고 스 2 대상 제품은 10.5-11.0 예상된 지역 > 90%의 보존 기간. 이동성 변화와 SDS 페이지 젤에 형광 TAMRA (그림 3b)의 설립은 immunoconjugates의 정체와 LC-MS (그림 2d-e 및 그림 3d)에 의해 확인 된다 확인 합니다.
인간의 혈 청 ELISA 후속 분석에서 5 일 동안 trastuzumab(TAMRA)2 의 부 화를 페이로드 (그림 4b) 항 체에 연결 된 남아 확인 합니다. Trastuzumab(MMAE)2 는 SK-BR-3 (높은 HER2) 가슴에 높은 힘 55 ±의 절반 최대한 효과적인 농도 (EC50)와 암 세포, 세포 독성 분석 결과에 대해서 오후 10 시 (그림 4 d). Trastuzumab(MMAE)2 인간의 혈 청 (그림 4c)에서 보육의 5 일 후는 세포 독성을 유지합니다. 반대로, ADC MCF-7 (HER2 낮은) 분석은 EC50 은 200-fold (그림 4 d) 낮은. 야생 유형 항 체, trastuzumab(CypK)2 , tetrazine-vcMMAE MMAE 두 셀 라인 (그림 4e)에서 높은 비 선택적 세포 독성을 표시 하는 반면 (그림 4 d 및 4e), 매우 낮은 독성을 보여줍니다.
그림 1: 과도 식 시스템. A. 과도 transfection HEK293 세포에서 사용 하는 플라스 미드의 관련 지역. CMV: 세포 발기인, WPRE: 마 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: 특정 발기인, PylRS: pyrrolysil tRNA 합성, >와 <: 전사의 방향. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. 식 야생 타입 (WT) trastuzumab의 있고 trastuzumab(CypK)2 로 측정 된 서쪽 오 점 단백질 후는 정화 있습니다. 오차 막대는 생물 triplicates의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: tetrazine-vcMMAE와 trastuzumab(CypK)2 의 활용. A. 항 체에서 CypK 잔류물 및 MMAE의 tetrazine 파생 사이 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition. 반응 그룹은 빨간색으로 강조 표시, p-aminobenzylalcohol 녹색 파란색에서 valine 시트 룰 린 dipeptide 묘사 이다. B. HPLC HIC chromatograms 항 체의 활용의 진행률을 표시. 1.9 다른 시 약 농도 사용 하 여 최대 스 기준 변환의 C. 정도. D-e. 전후에 활용 전체 길이 항 체의 질량 스펙트럼을 deconvoluted. Trastuzumab(CypK)2 는 안정적인 셀 라인을 사용 하 여 얻은 했다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: trastuzumab(CypK)2 tetrazine TAMRA의 활용. A. 항 체에서 CypK 잔류물 사이 TAMRA의 tetrazine 파생 역 전자 수요 Diels 오리 나무 cycloaddition. B. SDS 페이지 젤 기동성 교대 TAMRA의 활용에 의해 발생 하는 젤에 형광을 보여주는. C. 활용 론 2 개의 다른 온도에. D. trastuzumab(TAMRA)의 질량 스펙트럼을 Deconvoluted2. Trastuzumab(CypK)2 는 안정적인 셀 라인을 사용 하 여 얻은 했다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 혈 청 및 세포 독성 trastuzumab 어원이 같은 말의 안정성. A. internalizing ADC에 원하는 기능을 강조 하는 만화. B. 인간의 혈 청 ELISA에 측정에서 trastuzumab(TAMRA)2 의 안정성. C. 인간의 혈 청 (+ 혈 청, 블랙) 5 일 후에 생존 능력 분석 결과 trastuzumab(MMAE)2 셀. 컨트롤 샘플 혈 청 대신 PBS에서 incubated (-혈 청, 적색) 동일한 분석 결과에 포함 됐다. D. 세포 생존 능력 분석 결과 갓 희석된 항 체 샘플. E. 세포 생존 능력 분석 결과 갓 희석된 MMAE 파생 상품. 오차 막대 3 독립적인 실험의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림 Oller 샐비어 외 허가 수정 되었습니다. 201821. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 trastuzumab(CypK)2 를 생산 하기 위해 과도 식 절차 간단 하 고 높은 모듈화에 대 한 수 있습니다. 획득 수익률은 학문 설정27 에서 예상 하는 것 고 안정적인 셀 라인 추가21의 생산 수율 향상을 생성할 수 있습니다. 식, 동안 CypK의 농도가 낮은 5 m m 낮은 ncAA 법인으로 발생할 수 있습니다 보다 더 높은 금액 세포 성장에 영향을 줄 수 있으며 항 체 생산량 감소. CypK 무료 아미노산으로는 낮은 물 가용성, 따라서 그것은 해야 될 처음 녹 0.1 M NaOH에 100 m m이 고 문화 매체에 추가. 매체에서와 셀에 추가 하기 전에 CypK를 diluting, 후 소독 HCl와 필터 매체를 중화에 중대 하다. 그 후, transfection 시 약을 사용 하 여이 프로토콜에 지정 된 이며 제조 업체에서 권장 보육 시간에 따라 높은 항복 식에 대 한 중요 한. 에 대 한 추가 내용은 인간 항 체의 과도 식, 독자가 다른 게시 된 프로토콜31,32이라고 합니다.
항 체 정화 때 단백질 A 수 지의 높은 초과 전체 항 체 풀 다운은 상쾌한에서 되도록 표시 필요 합니다. 방지 하기 위해 차입 중 trastuzumab의 강수량, 높은 용량, PBS와 즉시 희석 버퍼링 솔루션을 사용 하 여 과도 한 집중을 피하고 버퍼 교환 추천입니다. 항 체를 항상 유지 < 5 mg/mL.
Tetrazine-vcMMAE와 trastuzumab(CypK)2 의 활용은 Adc에 대 한 다른 bioorthogonal 핸들을 보고 대부분 반응 보다 빠릅니다. 또한,이 cycladdition 매우 온화한 조건에서 발생 합니다: 실내 온도 또는 낮은 및 생리 적 pH. PBS와 항 체;의 추가 이전 이기와 반응의 DMSO 재고 솔루션을 희석 하는 것이 중요 하다 그렇지 않으면 tetrazine 파생 상품 침전 됩니다. 이기는 MMAE와 TAMRA, 높은 hydrophobicity 때문 에서만 필요 하지만 적은 소수 성 분자의 공동 용 매 추가 필요 하지 않을 수 있습니다. 또는 tetrazine vcMMAE 이기와 단 2 어 금 니의 tetrazine-vcMMAE 20 h 이내 없이 활용 될 수 있습니다. 이 작은 양의 독 소의 ADC 현재 ncAA 기반 기술에 비해 제조 비용에서 상당한 감소를 포함할 수 있었다. Trastuzumab(CypK)2 는 4 ° c.에 보존 하는 때 적어도 4 개월 동안 완전히 반응
HPLC HIC MMAE 매우 소수 이며, 0, 1 및 2 독 항 체 어원이 같은 말에 해당 하는 봉우리의 뛰어난 해상도 제공 합니다 이후 다 르의 정확한 결정을 수 있습니다. Unreacted tetrazine-vcMMAE 13.7 분 약을 elutes 고 280에서 감지 되 면 nm. 이 기술은 높은 순수성을 가진 시작 물자를 요구 한다. 또한, 그것 때문에 그들은 보존 시간과 봉우리의 모양을 변경할 수 있는 BCN-오 등 다른 tetrazine-반응성 분자와 반응을 풀기 위해 추천 되지 않습니다. 그것은 샘플의 소금 농도 맞는 모바일 단계에 하나 그라데이션의 시작에 좋은 분리를 얻기 위하여 10-20 µ L 주입 하는 경우에 특히 중요.
LC MS 분석에 대 한 항 체 샘플의 deglycosylation는 원시 스펙트럼의 deconvolution 시 단일 피크를 얻을 필요 합니다. 총 항 체와 ADC의 정확도 악기의 callibration에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 수정에 대 한 질량을 계산 하기 위해 ADC에 대 한 얻은 것에서 수정 되지 않은 항 체에 대 한 얻은 질량을 뺍니다. 현대 고해상도 질량 분석기는 1:10000 아래 상대적 오류를 제공 해야 합니다. LC MS 다른 종 사이의 비율을 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다, 있지만이 값은 일반적으로과 수정 생성 된 종의 이온화 용량에 영향을 미칠 수 있기 때문에 낮은 양의 불순물 감지 되지 않을 수 있습니다.
약물의 조기 출시 높은 독성과 낮은 효능;에서 발생 하기 때문에 Adc에서 링커의 안정성은 중요 한 무료 cytotoxin 건강 한 조직을 손상 하 고 벌 거 벗은 항 체 병 셀에 대상 바인딩 사이트에 대 한 무장 한 경쟁 한다. 안정성 분석 결과의 가변성은, 5% 아래 릴리스 예상 되어야 한다.
마지막으로,와 같은 trastuzumab(MMAE)2 SK-BR-3 셀 (HER2 높은)에서 세포 독성을 비교 하 여 평가 될 수 있습니다 후자의 이후 MCF-7 세포 (낮은 HER2) 표현 전28 보다 적은 15 HER2 수용 체 HER2를 표적으로 하는 ADC의 선택도 . immunoconjugate 2 배나 SK-BR-3 MCF-7에 비해 낮은 세포 생존 능력으로 발생 하는 것으로 예상 된다. SK-BR-3에서 EC50 이 ADC29,30의 높은 힘을 반영 하는 두 자리 nanomolar 범위에 있어야 합니다. 수정 되지 않은 항 체 trastuzumab(MMAE)2 또는 trastuzumab,이 분석 결과에 아무 독성을 표시 해야 합니다. Tetrazine-vcMMAE peptidomimetic 독 소의 활동을 제거 하는 링커 이후는 효과가 3 배나 ADC 보다 낮은 있어야 합니다. 반대로, MMAE 세포 막30침투를 수 있기 때문에, 그것은 야 ADC에 유사한 독성 하지만 HER2 높은 HER2 낮은 셀 라인 사이 차별 표시. 또한,이 분석 결과 혈 청에서 ADC의 5 일 배양 후 수행 하는 경우 사용할 수 있습니다 링커의 안정성의 기능 증거를 제공 하기: 릴리스 독 소의 결과 중에 SK-BR-3에서 ADC 효율 감소 MMAE p로 릴리스 되었습니다 하는 경우 링커 또는 링커 traceless 방식에서 죽 습 했다 경우 선택도 감소의 예술.
여기에 설명 된 ADC 기술 IgG1s에 신의 cyclopropene 파생의 효율적이 고 사이트 설립이 있습니다. 손쉬운 정화 다음 항 체 빠르게 tetrazine 포함 된 분자로, 동종 제품 저조한 활용 될 수 있습니다. 작은 크기 및 cyclopropene 최소 핸들의 높은 반응성 때문에이 방법은 sterically 방해 페이로드의 활용을 사용 해야 합니다. 결과 immunoconjugates은 혈 청에서 안정 되며 매우 강력 하 고 선택. 전반적으로, CypK 항 체 및 치료 또는 진단에 사용 될 다른 단백질 어원이 같은 말, 사이트별 빠르고 안정적인 bioorthogonal 결합을 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 영국 의료 연구 위원회에 의해 지원 되었다. 사운드 미 EMBO 친교 (ATLF 158-2016)를 보유 하 고 헤 펠 럼 및 지원, jw 메리어트 턱 및 G. 김, C. W. 모건과 O. Perisic 도움과 조언을 위해 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
| Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
| 125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
| Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
| Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
| Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
| Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
| Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
| Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
| HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
| Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
| Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
| Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | - | Costum synthesized |
| Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
| Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
| PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
| NanoAcquity | Waters | ||
| C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
| 96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
| CO2 incubator | Panasonic | ||
| HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
| Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
| Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| TMB | BioLengend | 421101 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
| PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
| SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
| Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
| Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
| MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
| Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
| Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
| Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |
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