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Immunology and Infection

एक उच्च प्रवाह, उच्च सामग्री, तरल आधारित सी. एलिगेंस Pathosystem

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/58068
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biosciences, Rice University

Summary

यहाँ हम एक अनुकूलनीय, पूरे मेजबान, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उपकरण है कि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और दवा की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

नए पारंपरिक द्वारा पहचान की दवाओं की संख्या, इन विट्रो स्क्रीन कम हो गया है, नए हथियारों के लिए खोज में इस दृष्टिकोण की सफलता को कम करने के लिए कई दवा प्रतिरोध का मुकाबला । यह निष्कर्ष है कि शोधकर्ताओं ने न केवल नई दवाओं को खोजने की जरूरत है, लेकिन यह भी उंहें खोजने के नए तरीके विकसित करने की आवश्यकता के लिए नेतृत्व किया है । सबसे होनहार उंमीदवार के बीच में पूरे जीव हैं, vivo परख में है कि उच्च प्रवाह का उपयोग करें, phenotypic readouts और मेजबान है कि Caenorhabditis एलिगेंस से ढाणियो rerioको सीमा । इन मेजबानों कई शक्तिशाली लाभ है, झूठी सकारात्मक हिट में नाटकीय कटौती सहित, यौगिकों कि मेजबान के लिए विषाक्त कर रहे है के रूप में और/आम तौर पर प्रारंभिक स्क्रीन में गिरा रहे हैं, महंगा पालन करने से पहले ।

यहां हम बताएंगे कि कैसे हमारे परख के लिए अच्छी तरह से प्रलेखित सी एलिगेंस-Pseudomonas aeruginosa तरल हत्या pathosystem में मेजबान भिंनता पूछताछ इस्तेमाल किया गया है । हम यह भी अच्छी तरह से बाहर काम तकनीक के कई एक्सटेंशन का प्रदर्शन । उदाहरण के लिए, हम उच्च प्रवाह आनुवंशिक स्क्रीन 24-या ९६-well प्लेट स्वरूपों में RNAi का उपयोग करने के लिए इस होस्ट-रोगज़नक़ सहभागिता में क्वेरी होस्ट कारकों को पूरा करने में सक्षम हैं । इस परख का प्रयोग, पूरे जीनोम स्क्रीन केवल कुछ ही महीनों में पूरा किया जा सकता है, जो नाटकीय रूप से दवा लक्ष्य की पहचान के कार्य को सरल कर सकते हैं, संभावित श्रमसाध्य जैव रासायनिक शोधन दृष्टिकोण के लिए आवश्यकता के बिना ।

हम यहां अपनी विधि की एक भिंनता भी रिपोर्ट करते है जो ग्राम-धनात्मक जीवाणु Enterococcus faecalis को चने-नकारात्मक रोगजनक पी aeruginosaके लिए प्रतिस्थापित करता है । बहुत के रूप में पी aeruginosaके लिए मामला है, ई. faecalis द्वारा हत्या समय निर्भर है । के विपरीत पिछले सी एलिगेंस-ई. faecalis परख, हमारे ई. faecalis के लिए परख संक्रमण की आवश्यकता नहीं है, अपनी सुरक्षा प्रोफ़ाइल में सुधार और तरल पदार्थ-हैंडलिंग उपकरण दूषित होने की संभावना को कम करने । परख अत्यधिक मजबूत है, दिखा ~ ९५% मृत्यु दर ९६ एच पद संक्रमण ।

Introduction

पहचान और प्रभावी, व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के विकास, अब लगभग एक सदी पहले, सार्वजनिक स्वास्थ्य में एक वाटरशेड पल के लिए नेतृत्व किया जहां एक व्यापक प्रसार विश्वास है कि संक्रामक रोग अतीत की एक संकट होगा था । कुछ ही दशकों के भीतर, यह आशावाद कम करने के लिए शुरू हुआ, रोगज़नक़ के बाद रोगज़नक़ प्रतिरोध तंत्र विकसित किया है कि इन सीमित एक बार चमत्कारी उपचार । कुछ समय के लिए, दवा की खोज के प्रयासों और रोगजनकों के बीच हथियारों की दौड़ संतुलित लग रहा था । हालांकि, रोगाणुरोधी के दुरुपयोग Klebsiella निमोनिया, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens, और पी aeruginosa1के पान दवा प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव में हाल ही में समापन किया गया है, 2,3,4.

पी aeruginosa एक अवसरवादी, ग्राम नकारात्मक, मल्टी होस्ट रोगज़नक़ कि गंभीर जलता है, जो प्रतिरक्षा हैं, या सिस्टिक फाइब्रोसिस है के साथ रोगियों के लिए एक गंभीर खतरा है । यह भी तेजी से गंभीर nosocomial संक्रमण, विशेष रूप से रोगाणुरोधी प्रतिरोध के अपने चल रहे अधिग्रहण के कारण में एक प्रेरणा का एजेंट के रूप में पहचान की है । इस खतरे को हल करने के लिए शुरू करने के लिए, हम अच्छी तरह से प्रलेखित सी एलिगेंस-P. aeruginosa संक्रमण प्रणाली का इस्तेमाल किया है5. हमारी प्रयोगशाला इस प्रणाली के लिए एक तरल आधारित विकसित करने के लिए leveraged है, उच्च प्रवाह, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग मंच उपंयास यौगिकों कि रोगज़नक़ की क्षमता को सीमित करने के लिए मेजबान6को मारने की पहचान । साज़िश, इन यौगिकों7 रोगाणुरोधी और डाह अवरोध करनेवाला8सहित सामान्य से कम तीन श्रेणियों, से संबंधित करने के लिए लग रहे हैं. सी. एलिगेंस में अन्य उच्च सामग्री औषध खोज परख माइकोबैक्टीरियम tuberculosum, क्लैमाइडिया trachomatis, Yersinia pestis, लिस्टिरिया monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, के लिए सूचित किया गया है और Enterococcus faecalis,9,10,11,12,13,14,15,16अंय लोगों के बीच । परख के इन प्रकार के कई अच्छी तरह से मांयता प्राप्त लाभ, ऐसे झूठी सकारात्मक हिट है कि दोनों मेजबान और रोगज़नक़, जैव उपलब्धता की एक रासायनिक स्क्रीन की तुलना में वृद्धि की संभावना को विषाक्त हो सकता है सीमित के रूप में है, और हिट से परे की पहचान करने की क्षमता बस ऐसे विरोधी virulents, प्रतिरक्षा stimulatory अणुओं, या यौगिकों कि अंयथा पूर्व के पक्ष में मेजबान रोगज़नक़ संपर्क के संतुलन झुकाव के रूप में माइक्रोबियल विकास, सीमित । साथ ही, इन स्क्रीन में खोजे गए यौगिकों अक्सर स्तनधारी होस्ट्स में प्रभावी होते हैं ।

यह ध्यान देने योग्य है कि दो अंय परख17,18 के लिए बाहर तरल में सी एलिगेंस में उच्च प्रवाह स्क्रीन ले उपलब्ध है लायक है । हालांकि, इन परख के प्रत्येक एक संशोधन है कि prototypical आंत्र-औपनिवेशीकरण परख, धीमी हत्या के रूप में जाना जाता है की अनुमति देता है, तरल में प्रदर्शन किया जा करने के लिए, प्रवाह में वृद्धि और अनुमति यौगिकों और अधिक आसानी से दिखलाई जा सकता है । सावधान लक्षण वर्णन निर्णायक प्रदर्शन किया है कि बैक्टीरियल डाह के तंत्र इन परख और हमारे तरल आधारित स्क्रीन7के बीच अलग हैं । के बाद से डाह के दोनों प्रकार के स्तनधारी प्रणालियों में मनाया जाता है, यह महत्वपूर्ण है पर विचार जो डाह निर्धारक है प्रयोगकर्ता हितों के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक है परख चयन से पहले ।

यहां हम तरल आधारित सी. एलिगेंस-P. aeruginosa परख के एक अनुकूलित संस्करण प्रदर्शित करता है । हम भी हमारे तरल आधारित परख विधि के अनुकूलन के लिए ग्राम-सकारात्मक जीवाणु रोगज़नक़ Enterococcus faecalis को समायोजित करने की रिपोर्ट । aeruginosaकी तरह, ई. faecalis तेजी से रोगाणुरोधी प्रतिरोध रास्ते1के बढ़ते आयुध के साथ एक गंभीर nosocomial खतरा के रूप में पहचान की है । हालांकि faecalis के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए पिछले एक विधि14मौजूद है, यह रोगज़नक़, जो प्रक्रिया पेचीदा और कोपा FlowSort की तरह दूषित उपकरणों की संभावना बढ़ जाती है के साथ संक्रमण की आवश्यकता है । हमारे प्रोटोकॉल पूर्व संक्रमण के लिए की जरूरत है, सुरक्षा प्रोफ़ाइल में सुधार समाप्त । अंत में, हम एक साधन है जिसके द्वारा इन परख के या तो खिला RNAi के साथ जोड़ा जा सकता है की रिपोर्ट, उपयोगकर्ता की अनुमति मेजबान कारकों है कि की स्थापना में एक भूमिका निभाने के लिए खोज करने के लिए, या प्रतिरोध करने के लिए, संक्रमण ।

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Protocol

सावधानी: aeruginosa और ई. faecalis है-सुरक्षा स्तर 2 रोगजनकों, और उचित सुरक्षा सावधानियों आकस्मिक संक्रमण को रोकने के लिए और सतहों के संदूषण को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए । सभी मीडिया और सामग्री है कि रोगजनकों के साथ संपर्क में आते है और निष्फल होना चाहिए/ इसके अलावा दिशानिर्देश सीडीसी प्रकाशन जैव सुरक्षा सूक्ष्मजीवविज्ञानी और बायोमेडिकल प्रयोगशालाओं में (BMBL), 5 वीं संस्करण से उपलब्ध हैं ।

1. तैयारी और पी aeruginosa के रखरखाव

  1. लकीर aeruginosa एक पौंड (Lysogeny शोरबा) पर एक जमे हुए शेयर से प्लेट आगर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 से 24 घंटे की मशीन
    नोट: बाँझता सुनिश्चित करने के लिए एक बीएसएल-2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पी aeruginosa प्रयोगों प्रदर्शन. रोगजनक संक्रमण या संदूषण की संभावना को कम करने के लिए उपयुक्त सुरक्षा सावधानियों का प्रयोग करें ।
  2. इस प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफर करें । यह प्लेट 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है और एक सप्ताह तक के लिए संस्कृतियों inoculate करने के लिए इस्तेमाल किया । एक सप्ताह के बाद, दूषित और थाली त्याग और एक नई पौंड लकीर प्लेट बनाते हैं ।
    नोट: लंबे समय तक भंडारण के बाद P. aeruginosa डाह घटाता है ।
  3. दो दिन पहले तक की स्थापना के लिए परख प्लेटें, १.१ में बनी प्लेट से पी aeruginosa की एक एकल कॉलोनी के साथ बाँझ पौंड शोरबा की inoculate 3-5 मिलीलीटर । 12 से 16 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    नोट: 16 एच से अधिक समय तक न करें । समृद्ध तरल संस्कृतियों में, P aeruginosa PA14 लाइसे करने के लिए शुरू होता है ।
  4. धीमी गति से मार मीडिया के साथ बाँझ 10 सेमी प्लेटें तैयार (3 जी NaCl, ३.५ ग्राम peptone, 1 मिमी CaCl2, 1 मिमी MgSO4, फॉस्फेट बफर की 25 मिलीलीटर (मात्रा प्रति लीटर: कश्मीर के2HPO4 (1m) और ८६८ मिलीलीटर की KH2पीओ4 (1m)) और 18 ग्राम आगर/
    नोट: प्लेटें समय से आगे तैयार करें । इन्हें 4 ° c पर हवा बद डब्बे में रखकर 3 हफ्तों तक स्टोर किया जा सकता है ।
  5. बीज प्रत्येक 10 सेमी धीमी मार प्लेट (एसके प्लेट) के साथ ३५० μL की ताजा रातोंरात पौंड संस्कृति से पी aeruginosa । एक बाँझ जीवाणु फैलाव का उपयोग करना, मीडिया की सतह भर में समान रूप से बैक्टीरिया फैल और एक बीएसएल-2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. ३७ ° c 24 घंटे के लिए पर मशीन प्लेटें

2. RNAi बैक्टीरिया की तैयारी

  1. एक जमे हुए शेयर से (१०० µ जी/एमएल और टेट्रासाइक्लिन पर 15 µ g/एमएल पर carbenicillin और Ahringer पुस्तकालयों के लिए) RNAi-युक्त जीवाणुओं के पौंड पर बैक्टीरिया की वांछित उपभेदों के बाहर लकीर या पिन स्थानांतरण ।
    नोट: जब गैर-रोगजनक बैक्टीरिया के साथ काम कर रहे हैं, या तो एक बीएसएल-2 a/B जैविक सुरक्षा कैबिनेट या एक बीएसएल-1 लामिना फ्लो हूड संस्कृतियों की बाँझ सुनिश्चित करने के लिए और पुस्तकालय के पार संदूषण की संभावना को कम करने के लिए का उपयोग करें ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मशीन प्लेट ।
  3. प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह तक के लिए स्टोर ।
    1. दो हफ्तों के बाद, प्लेटों को त्यागें और उन्हें हौसले से बने प्लेटों से बदलें ।
  4. परीक्षण के समानांतर में एकाधिक RNAi उपभेदों व्यक्तिगत रूप से inoculating carbenicillin के 4 मिलीलीटर में प्रत्येक क्लोन से एक ही कॉलोनी के एक अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली या एक बाँझ परीक्षण ट्यूब के रूप में £ पूरक में ।
    नोट: टेट्रासाइक्लिन में RNAi की कुशलता कम होने की सूचना मिली है । इस मीडिया में इसका प्रयोग न करें ।
  5. प्लेस 24-अच्छी तरह से एक मिलाते हुए मशीन multiwell प्लेटों और 16 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए अनुकूलित जबकि ९५० rpm में मिलाते हुए एक हिलती में गहरी खैर प्लेटें ।
    नोट: यह multiwell प्लेटों में एक पारंपरिक मिलाते हुए मशीन का उपयोग कर वर्दी बैक्टीरियल विकास प्राप्त करने के लिए कठिन है । मिलाते हुए मशीन के लिए ७५० rpm की एक ंयूनतम पर संस्कृतियों के लिए ठीक से विकसित करने में मिलाने में सक्षम होने की जरूरत है । एक विशेष शेखर के अभाव में, यह एक व्यक्तिगत ट्यूब में प्रत्येक संस्कृति विकसित करने के लिए संभव है । संस्कृतियों 24 में हस्तांतरित किया जा सकता है अच्छी तरह से थाली केंद्रापसारक के लिए बाद में, यदि वांछित ।
  6. २,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया इकट्ठा ।
  7. प्लेट पलटने से supernatant और जोरदार झटकों से काँप उठा. एस बेसल (५.८५ जी NaCl, 1 जी कश्मीर2HPO4, 6 जी KH2पीओ4 ultrapure पानी की 1 एल में भंग और आटोक्लेव द्वारा निष्फल) के १०० µ एल में RNAi बैक्टीरिया reसस्पेंड ।
  8. पिपेट एक multiwell NGM प्लेट के कुओं की एक उपयुक्त संख्या में बैक्टीरिया reसस्पैंड (निमेटोड वृद्धि मीडिया, 3 जी NaCl, २.५ जी peptone, 1 मिमी CaCl2, 1 मिमी MgSO4, फॉस्फेट बफर की 25 मिलीलीटर (राशि प्रति लीटर: १३२ K2HPO4 (1m) की मिलीलीटर और KH के ८६८ मिलीलीटर2पीओ4 (1m)), और 18 ग्राम पानी की प्रति लीटर) IPTG के साथ पूरक (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) और carbenicillin (१०० μg/एमएल अंतिम एकाग्रता) ।
    1. 6 अच्छी तरह से थाली, एक 24 अच्छी तरह से थाली, या ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से १५० µ एल की अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर के प्रति अच्छी तरह से NGM मीडिया के ३.५ मिलीलीटर का प्रयोग करें ।
    2. 6-वेल प्लेट के लिए बैक्टीरिया के १०० μL/कुआं का प्रयोग करें; ५० μL/खैर के लिए 24-well; या ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए 20 μL/ शुष्क करने की अनुमति दें ।
      नोट: सुखाने सामांय रूप से एक बाँझ प्रवाह हुड में प्रदर्शन के लिए तेजी से बढ़ावा देने, वर्दी सुखाने । वर्दी सुखाने बहुत महत्वपूर्ण है । अधिक सुखाने से बचें, के रूप में दरार के रूप में आगर कीड़े के burrowing को बढ़ावा देने । यह कीड़ा नुकसान और तरल-हैंडलिंग सिस्टम के संभावित कॉलेस्ट्रॉल की ओर जाता है ।
  9. तैयार प्लेटों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें बाद में उपयोग के लिए दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर दें ।
    नोट: बाहर सुखाने से प्लेट को रोकने के लिए, वे प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ बंद किया जा सकता है या नम कागज तौलिए के साथ एक कसकर सील कंटेनर में रखा ।

3. C. एलिगेंस का अनुरक्षण और तैयारी

नोट: प्रयोगों की शुरुआत करने से पहले, इस प्रकार के रूप में gravid, वयस्क उभयलिंगी कीड़े की एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या उत्पन्न करते हैं ।

  1. धो gravid वयस्कों (यानी, gonad के भीतर दिखाई एकाधिक भ्रूण के साथ) से 4-6 10-सेमी NGM प्लेट्स एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 4 एमएल के एस बेसल प्लेट को जोड़कर, धीरे घूमता, और फिर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डालना ।
  2. 30 सेकंड के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक के द्वारा गोली कीड़े ।
  3. महाप्राण supernatant, देखभाल करने के लिए कीड़ा गोली बाधित नहीं ले ।
  4. कीड़ा ब्लीच समाधान की ३.५ मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 0.5 मीटर NaOH, 1% सोडियम हाइपोक्लोराइट, बाँझ पानी में) कीड़ा गोली करने के लिए जोड़ें, और 1 मिनट के लिए पलटने से मिश्रण.
  5. संक्षेप में भंवर और 30 सेकंड के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. महाप्राण या खिचड़ी भाषा supernatant, देखभाल करने के लिए कीड़ा गोली परेशान नहीं ले ।
  7. कीड़ा गोली के लिए ताजा कृमि ब्लीच समाधान के ३.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. जोरदार ब्लीच सॉल्यूशन में कीड़े मिलाएं. आवधिक (लगभग हर दस सेकंड) नेत्रहीन एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कीड़े का निरीक्षण । कीड़ा cuticles के लिए देखो तोड़ने के लिए, अंडे जारी । एक बार वयस्क कीड़े की सबसे (~ ९५%) भंग किया गया है, एस बेसल के साथ 15 मिलीलीटर के लिए ब्लीच पतला पाचन बंद करो ।
    नोट: अंडा गोले वयस्क ऊतकों की तुलना में ब्लीच के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, लेकिन वे लंबे समय तक प्रदर्शन के दौरान भंग किया जा सकता है । अंडा विघटन से बचने के लिए, अंडे से अधिक 7 मिनट के लिए कृमि ब्लीच समाधान के लिए बेनकाब नहीं है । यदि अंडे के गोले ज्यादा क्षतिग्रस्त होते हैं, तो भ्रूण मर जाएंगे ।
  9. १,००० पर गोली भ्रूण 30 सेकंड और महाप्राण या भ्रूण की गोली को हटाने के बिना supernatant को खिचड़ी भाषा के लिए एक्स जी ।
  10. शेष ब्लीच समाधान पतला करने के लिए 15 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए एस बेसल में कीड़े reसस्पेंड ।
  11. धोने के कदम दोहराएं (३.९-३.१०) तीन बार कुल 4 लगातार धुल के लिए ।
  12. चौथे धोने के बाद, महाप्राण supernatant और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में बाँझ एस बेसल के 5 या 6 मिलीलीटर करने के लिए जोड़ें । लक्ष्य को µ एल प्रति ~ ५० कीड़े की एकाग्रता के लिए भ्रूण reसस्पेंड है
    नोट: एस बेसल की राशि अंडे की गोली के आकार पर निर्भर करता है; बड़ा गोली, अधिक एस बेसल आवश्यक है ।
  13. 15 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान या ४८ ज पर एक मेज टॉप रोटेटर पर रात भर शंकु ट्यूब की मशीन । लार्वा हैच होगा, लेकिन लार्वा विकास पोषक तत्व अभाव के कारण L1 मंच (L1 diapause) पर गिरफ्तारी होगी ।
  14. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करने के लिए सत्यापित करें कि उनमें से ज्यादातर में रची है और विकास के L1 मंच पर गिरफ्तार किया ।
  15. कीड़ा तैयारी के 20 µ एल लेने के द्वारा कीड़ा गिनती निर्धारित करें और यह एस बेसल के ८० µ एल के साथ कमजोर । पिपेट एक खाली NGM प्लेट पर सीधे पतला कीड़ा समाधान के 10 µ एल । दोहराएं 2 अधिक बार ।
    1. प्रत्येक स्थान में लार्वा की गणना करें और औसत संख्या निर्धारित करे । 2 से इस औसत विभाजित करने के लिए कीड़ा तैयारी में µ एल प्रति कीड़े की एक अनुमानित गिनती प्राप्त करने के लिए । कीड़ा तैयारी तो प्रसार प्लेटों या प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      नोट: 4-5 दिनों के बाद भूखे लार्वा मरने का सिलसिला शुरू हो जाएगा; इस बिंदु पर प्रस्तुत करना छोड़ें ।
  16. प्रचार के लिए तनाव, पिपेट L1 कीड़े की एक उपयुक्त संख्या (५,०००-६,०००) 3-4 10 पर-cm NGM प्लेट्स केंद्रित OP50 ई. कोलाई के साथ देखा-"सुपरफूड" (ई. कोलाई OP50 25X एकाग्रता में देखा (यानी, 1 रात के एल OP50 संस्कृति में बढ़ी पौंड की पैदावार ४० मिलि च्या 25X OP50 सुपरफूड); इस केंद्रित बैक्टीरियल सस्पेंशन के 2 मिलीलीटर प्रत्येक 10 सेमी NGM प्लेट पर देखा जाता है) ।
  17. उपयोग के लिए प्लेटें तैयार करने के लिए, निम्न में से कोई एक कार्य करें (के लिए "मूल प्रोटोकॉल" का उपयोग 3.17.1 सेटअप, के लिए "RNAi स्क्रीन सेट अप" 3.17.2-3.17.4 के रूप में उपयुक्त चरणों का प्रयोग करें):
    1. पिपेट ~ ५,००० कीड़े/10 सेमी प्लेट RNAi या OP50 सुपरफूड के साथ वरीयता प्राप्त ।
    2. पिपेट ~ ५०० कीड़े/अच्छी तरह से एक 6-खैर थाली RNAi के साथ वरीयता में ।
    3. पिपेट ~ ३०० कीड़े/अच्छी तरह से एक 24 में अच्छी तरह से थाली RNAi के साथ बीज ।
    4. पिपेट ~ १०० कीड़े/अच्छी तरह से एक ९६ में RNAi के साथ वरीयता प्राप्त थाली ।
      नोट: कैसे RNAi वरीयता प्राप्त किया गया था पर निर्देशों के लिए कृपया RNAi बैक्टीरिया की तैयारी में कदम २.७-२.९ देखें ।
  18. यदि कीड़े का एक उपजाऊ तनाव इस्तेमाल किया जा रहा है, के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन कीड़े ~ ४४-४८ एच । जनसंख्या उपयुक्त आयु तक पहुँच जाने के बाद यथासंभव जल्दी इन कीड़ों का उपयोग करें. यह परख के दौरान कीड़ों के भीतर अंडे सेने के प्रभाव को कम करता है ।
  19. यदि उपयोग किया जा रहा तनाव तापमान बाँझ (जैसे, fer-15 (b26); फेम-1 (hc17) या जीएलपी-4 (bn2)), 15 ° ~ 16 घंटे के लिए पर मशीन कीड़े और फिर ४४ के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण के लिए विकास पूर्ण और embryogenesis को रोकने के लिए एच ।

4. तरल हत्या परख सेटअप (बुनियादी प्रोटोकॉल)

नोट: यह एक जीवाणु तनाव और कीड़े के एक स्रोत के लिए एक प्रोटोकॉल है ।

  1. एक सेल खुरचनी का उपयोग करना, पी aeruginosa एक एसके प्लेट से निकालें और एस बेसल के ~ 5 मिलीलीटर में reसस्पेंड । यदि आवश्यक हो तो स्केल । एक spectrophotometer (आयुध डिपो६००) का उपयोग कर बैक्टीरियल निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व को मापने
  2. aeruginosa एस बेसल में६०० ≈ ०.०९ (3x अंतिम एकाग्रता) में पी. के पतला स्टॉक के 24 मिलीलीटर तैयार करें । अच्छी तरह से प्रति अंतिम सामग्री के लिए 4.6.2 देखें, और तदनुसार बैक्टीरियल कमजोर पड़ने की मात्रा पैमाने ।
  3. तरल धीमी गति से मार मीडिया के 21 मिलीलीटर जोड़ें (NaCl के 3 जी, peptone/एल के ३.५ g2 और MgSO4 के लिए एक अंतिम एकाग्रता 1 मिमी) के साथ पूरक । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, एक ३८४ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से बैक्टीरिया और मीडिया के ४५ µ एल हस्तांतरण ।
  4. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में अपने स्रोत (यानी, कदम 3.17.1) से कीड़े धोने और कीड़े गुरुत्वाकर्षण बल के तहत बसने के लिए अनुमति देते हैं । महाप्राण supernatant को 5 मि. ५० एमएल एस बसाल के कुल में पुनर्स्थगित ।
  5. दोहराएं चरण ४.४ दो बार ।
  6. एक कीड़ा सॉर्टर का प्रयोग, ३८४-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में लगभग 22 कीड़े तरह ।
    नोट: सेटअप तरल के ~ १.१ µ एल में प्रत्येक कीड़ा गिरता है । 22 कीड़े 25 µ एल के लिए राशि होगी, कुल परख मात्रा लाने के लिए ७० µ एल/
    1. इस खंड के ७० µ एल ४५ µ एल के अंतिम संरचना के होते है बैक्टीरियल मध्यम (24 µ एल एस बेसल में ०.०३ आयुध डिपो६०० बैक्टीरिया के रूप में जोड़ा जाता है, और 21 µ एल एसके CaCl2 और MgSO4के साथ पूरक) । अंय 25 µ एल 22 कीड़े के साथ जोड़ा जाता है ।
    2. यदि सॉर्टर यहां इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें) उपलब्ध नहीं है, कीड़े 1 कीड़ा/µ एल के अंतिम एकाग्रता के लिए पतला किया जा सकता है एस बेसल और pipetted 25 µ l/अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । हालांकि, परिणाम वृद्धि परिवर्तनशीलता प्रदर्शित हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, यह एक सिकुड़नेवाला तरल मशीन का उपयोग करने के लिए संभव है, Leung और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित के रूप में19.
  7. के बाद कीड़े ३८४ में हल किया गया है अच्छी तरह से थाली, एक गैस के साथ प्लेट सील-पारगंय फिल्म और 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन प्लेट 24-48 एच के लिए ।
  8. वांछित समय पर, एक microplate वॉशर का उपयोग करने के लिए ३८४-अच्छी तरह से थाली एस बेसल के साथ 5 बार की कुल धोने ।
    1. दूसरा धोने के बाद, मीडिया के अधिकांश महाप्राण, जा ~ 20 µ एल तेजी से कम 30 सेकंड के लिए एक microplate भंवर का उपयोग कर प्लेटें शेक को कुओं के नीचे से किसी भी मलबे ढीला) ।
  9. अंतिम धोने के बाद, महाप्राण supernatant नीचे 20 µ एल के लिए ०.९८ µ एम न्यूक्लिक एसिड दाग के ५० µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ३८४ अच्छी तरह से थाली के/well, ०.७ µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  10. 12-16 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । यह डाई केवल मृत कीड़े दाग होगा । वांछित मशीन अवधि के बाद, धोने microplate वॉशर का उपयोग करने के लिए किसी भी अतिरिक्त दाग हटाने प्लेटों (3 बहाकर की एक ंयूनतम) ।
  11. डेटा प्राप्ति के लिए, दोनों संचारित प्रकाश और प्रतिदीप्ति (५३१ एनएम उत्तेजना और ५९३ उत्सर्जन) की छवि के लिए एक spectrophotometer या एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ।
    1. एक कम आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करने के लिए पूरी तरह से एक छवि पर कब्जा कर लिया जा अनुमति देते हैं ।
    2. वैकल्पिक रूप से, उपयोग प्रवाह vermimetry । इस तकनीक का उपयोग करता है एक बड़ी वस्तु एक कीड़ा fluorimeter के रूप में प्रवाह cytometer, आकार और पूरे जीव के प्रतिदीप्ति को मापने (यानी, सी एलिगेंस) एक फैशन है कि दृढ़ता से प्रवाह cytometry के समान है में ।
  12. स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे CellProfiler, MatLab http://cellprofiler.org/के आधार पर एक मुफ्त छवि विश्लेषण स्टूडियो) एक निष्पक्ष फैशन में प्रति अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट और कुल कीड़ा क्षेत्रों की गणना करने के लिए उपयोग करें ।
    नोट: इन संख्याओं का गुणांक प्रत्येक कुआं के लिए भिंन मृत्यु का प्रतिनिधित्व करता है । अगर एक अच्छी तरह से 20 कुल के बाहर 7 दाग कीड़े था, तो अंश मृत्यु ०.३५ या ३५% शामिल हैं ।
    1. पहली बार उपयोग करने से पहले, स्वचालित छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन मैनुअल स्कोरिंग द्वारा मान्य किया जाना चाहिए. यह नेत्रहीनों छवियों और उनमें से प्रत्येक के लिए मृत कीड़े की रिकॉर्डिंग अंशों का निरीक्षण द्वारा प्राप्त स्कोर करने के लिए स्वचालित पाइपलाइन से परिणामों की तुलना द्वारा किया जाता है । मांयता प्रक्रिया सुनिश्चित करता है कि स्वचालित इमेजिंग प्रोसेसिंग के लिए पैरामीटर सही है और डेटा सही ढंग से प्रतिनिधित्व करते हैं ।

5. एकाधिक C. एलिगेंस उपभेदों या Knockdowns (RNAi स्क्रीन सेटअप) स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलन

नोट: यह एक RNAi स्क्रीन 24-well प्लेट सेटअप के लिए वर्णित है ।

  1. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से एस बेसल के 1 मिलीलीटर जोड़ें (चरण 3.17.3 देखें) । धीरे थाली मिलाते हुए कीड़े आंदोलन, तो एक खाली, बाँझ 24 गहरी अच्छी तरह से थाली के लिए कीड़े हस्तांतरण । कीड़े गुरुत्वाकर्षण (~ 5 मिनट) बसने के लिए अनुमति दें ।
  2. महाप्राण supernatant, लगभग 1 मिलीलीटर छोड़कर । प्रत्येक अच्छी तरह से एस बेसल के 7 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. दोहराएँ चरण ५.१-५.२ की एक न्यूनतम 2 अधिक बार. अंतिम धोने के बाद, महाप्राण supernatant, लगभग ४०० µ जा l
  4. कीड़ा सॉर्टर का नमूना समारोह का प्रयोग, 24 अच्छी तरह से एक ३८४-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में प्लेट कीड़ा सस्पेंशन से 22 कीड़े सॉर्ट (एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली की पैदावार 8-12 कुओं की एक ३८४-अच्छी प्लेट) ।
    1. भुखमरी से बचने के लिए, ३८४ में पिपेट बैक्टीरिया-अच्छी तरह से प्लेटें (या तो एक तनाव है कि जैसे OP50, या एक रोगजनक तनाव के रूप में केवल भोजन के रूप में कार्य करता है) छंटाई से पहले ।
      नोट: रोगजनकों चरणों का पालन करके जोड़ा जा सकता २.३-२.५ या ६.४-६.५, और खाद्य स्रोत बैक्टीरिया को पतला किया जा सकता है और पी aeruginosaके लिए के रूप में एक ही योजना का पालन करके जोड़ा ।
  5. के बाद कीड़े ३८४ में हल किया गया है अच्छी तरह से थाली, छोटे अणुओं या अंय प्रयोग विशेष सामग्री जोड़ें ।

6. ई. faecalis के लिए अनुकूलन

नोट: केवल P aeruginosa परख से मतभेद वर्णित हैं ।

  1. ई. faecalis का एक ताजा स्रोत पर एक जमे हुए शेयर से एक BHI (ब्रेन हार्ट अर्क) आगर प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 से 24 घंटे के लिए मशीनिंग के लिए तैयार कर रहे हैं ।
    नोट: बाँझता सुनिश्चित करने के लिए एक बीएसएल-2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर ई. faecalis प्रयोगों प्रदर्शन. रोगजनक संक्रमण या संदूषण की संभावना को कम करने के लिए उपयुक्त सुरक्षा सावधानियों का प्रयोग करें ।
  2. प्लेटें एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । इस अवधि के बाद, एक ताजा थाली के साथ बदलें ।
  3. कीड़े छंटाई से पहले रात, ई. faecalis की एक भी कॉलोनी के साथ inoculate 3-5 मिलीलीटर बाँझ BHI । आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 12-16 एच मशीन ।
  4. पी aeruginosa (एस बेसल, आयुध डिपो६००≈ ०.०९) में 3x बैक्टीरिया के लिए के रूप में कुओं में बैक्टीरिया जोड़ें ।
    नोट: ई. faecalisके लिए, अंतिम अच्छी तरह से रचना है: ई. faecalis (आयुध डिपो६००≈ ०.०३), BHI = 10% v/वी, शेष एस बेसल के शामिल मात्रा के साथ । याद रखें कि एस बसाल के 25 µ l को कीड़े के साथ दिया जाएगा ।
    नोट: ई. faecalis मोटी फिल्म है कि फ्लोरोसेंट दाग को अवशोषित, धुंधला छवियों के कारण पैदा करता है । व्यापक धुलाई इस फिल्म को हटाने के लिए अपर्याप्त हो सकती है । इस मामले में, कीड़े एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक खाली थाली को हस्तांतरित किया जा सकता है । स्थानांतरण की सुविधा के लिए, 20 के बीच एस बेसल को ०.१% की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा जा सकता है (v/ इस फिल्म से कीड़े को हटाने में यह एड्स.

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Representative Results

परख प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों

इस परख अंतर्निहित जीव विज्ञान की एक उचित समझ समस्या निवारण और परख के अनुकूलन के लिए आवश्यक है । कि अंत करने के लिए, हम aeruginosaके रोगजनन के तंत्र elucidating कई प्रमुख कागजात के लिए पहले उल्लेख-तरल में हत्या मध्यस्थता7,20. बशर्ते कि ऊपर उल्लिखित चरणों का पालन कर रहे हैं (एक परख प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध के लिए चित्र 1 देखें) एक समय एलिगेंस के आश्रित की हत्या केवल रोगज़नक़ (चित्रा 2a) की उपस्थिति में मनाया जाएगा । इसके विपरीत, मुख्य पोषण की खुराक के अभाव में (उदाहरण के लिए, यदि peptone मीडिया के बाहर छोड़ दिया है, और केवल एस बेसल जोड़ा जाता है), कोई हत्या करने के लिए थोड़ा (चित्रा बी) मनाया जाएगा । दिलचस्प है, दो aeruginosa के कदम की मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर तो 24 घंटे) जो पारंपरिक धीमी गति से हत्या की परख के लिए महत्वपूर्ण है, और मूल रूप से लागू किया गया था तरल21हत्या, इस परख में औषधालय है ( चित्र 2c). हालांकि यह पी aeruginosa सीधे रातोंरात पौंड संस्कृति से जोड़ने के लिए संभव है, तो काफी परिवर्तन घातकता कैनेटीक्स कर रही है और अनुशंसित नहीं है ।

परख जीवविज्ञान को समझना भी परख के सरलीकरण परमिट, यदि उचित और वांछनीय है । उदाहरण के लिए, इस परख में हत्या मेजबान के सबसे महत्वपूर्ण चालक siderophore pyoverdine है, और मेजबान विषाक्तता pyoverdine की वजह से अपने को7लौह बांध की क्षमता पर आकस्मिक है । जैसे, परख pyoverdine-रिच निस्पंदन, शुद्ध pyoverdine, या यहां तक कि कुछ सिंथेटिक लौह-chelating रसायनों (जैसे, 1, 10-phenanthroline) जीवित जीवाणुओं के लिए, सी transcriptional के एलिगेंस प्रतिक्रिया के रूप में प्रतिस्थापन द्वारा सरलीकृत किया जा सकता है इन उपचार के लिए बहुत समान है (चित्रा 3)22।

कई सबूत के विभिंन लाइनों प्रयोगात्मक सेटअप की मजबूती के लिए बोलते हैं । सबसे पहले, सेटअप प्रारंभिक बैक्टीरियल सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला को सहन । सांद्रता के रूप में कम के रूप में OD600 = ०.००२५ (लगभग 10 गुना कम की सिफारिश की तुलना में) अभी भी समय प्रदर्शन और एकाग्रता पर निर्भर हत्या, हालांकि समय बदलाव (4a आंकड़ा) करता है । दूसरा, परख के reproducibility ऐसी है कि के रूप में कुछ के रूप में 4 कुओं अक्सर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा (चित्रा 4B) प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।

वहां कई परिवर्तन है कि हम अनुशंसा नहीं करते हैं । उदाहरण के लिए, प्रारंभिक बैक्टीरिया inocula प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध की तुलना में बहुत अधिक सांद्रता के साथ प्रयोग; ऐसा करने में परिणाम मोटी, फिल्म सामग्री की तरह है कि मुश्किल या असंभव को प्रभावी ढंग से धो दूर है, जो घातकता स्कोरिंग पेचीदा है । इसके अलावा, उच्च एकाग्रता बैक्टीरियल inocula भी ऑक्सीजन के लिए प्रतिस्पर्धा और गैर विशिष्ट मेजबान7हत्या ट्रिगर कर सकते हैं ।

एक और महत्वपूर्ण नोट को रोकने के बीच समय की अवधि की सीमा है परख और इमेजिंग मृत कीड़े । ध्यान दें कि इस समय सीमा धुंधला शामिल करना चाहिए, तो यह कुशल होना महत्वपूर्ण है । मौत के बाद, कीड़े के भीतर जैविक सामग्री को बाहर निकालना शुरू होता है और/ 24-32 ज के एक मामले के भीतर, केवल छल्ली रहता है । छल्ली दाग बहुत खराब है और बहुत हल्का है, यह आसानी से बहाकर के दौरान खोने के लिए बना । यह ध्यान रखें कि उपभेदों या तनाव की हत्या के बहुत अलग कैनेटीक्स के साथ/RNAi शर्तों इस घटना से जटिल हो सकता है महत्वपूर्ण है (यानी, कुछ कीड़े अभी भी जीवित हो सकता है जबकि अंय पहले से ही अपनी सामग्री खो दिया है और छवि के लिए असंभव है) । चित्रा 4a इस घटना से पता चलता है, प्लेट के बाईं ओर कीड़े के रूप में, बहुत कम प्रारंभिक जीवाणु सांद्रता के साथ inoculated, अभी भी काफी हद तक जीवित हैं, जबकि थाली के दाईं ओर कीड़े, जो की बहुत उच्च सांद्रता को उजागर किया गया बैक्टीरिया, दूर धोया गया है ।

परख सफलता का एक बहुत ही महत्वपूर्ण निर्धारक को इकट्ठा करने और डेटा का विश्लेषण किया विधि है । हमारी प्रयोगशाला में, हम इन परख से डेटा इकट्ठा करने के लिए कम से कम तीन तरीकों का इस्तेमाल किया है: spectrophotometry, स्वचालित माइक्रोस्कोपी, और प्रवाह vermimetry (यानी, C. एलिगेंसकरने के लिए प्रवाह cytometry तकनीकों के अनुकूलन; वस्तुतः, माप एक बह समाधान में कीड़े की) । सबसे पहले इन तरीकों में से एक spectophotometer का उपयोग करता है एक प्रश्न में कीड़े के डाई या रिपोर्टर के प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए । इस विधि उपकरणों का एक काफी सर्वव्यापी टुकड़ा (एक microplate रीडर के साथ एक मानक spectrophotometer) का उपयोग करने का लाभ है और सबसे तेजी से विधि डेटा प्राप्त करने के लिए है । हालांकि, यह स्वचालित माइक्रोस्कोपी और प्रवाह vermimetry के सांख्यिकीय शक्ति से उपलब्ध सूचनात्मक सामग्री का अभाव है ।

स्वचालित माइक्रोस्कोपी एक और व्यवहार्य विकल्प है । microplate इमेजिंग प्रणालियों के एक नंबर बाजार पर वर्तमान में कर रहे हैं, कीमतों में है कि एक अंवेषक को सस्ती कर रहे है (जैसे, एक जैव टेक Cytation5) बड़ा, अधिक महंगी और उच्च गुणवत्ता मशीनों है कि अधिक सामांयतः कोर में पाए जाते है में लेकर सुविधाएं (जैसे, एक आणविक उपकरणों ImageXpress माइक्रोस्कोप) । व्यवहार में, इन समाधानों के अधिकांश सबसे स्क्रीन और परख स्कोरिंग के लिए उत्तरदायी हैं । अधिकांश स्वचालित इमेजिंग प्लेटफार्मों भी जानकारी की उपज को आगे करने के लिए छवि प्रसंस्करण (जैसे, MetaMorph, ImageJ, Gene5, या सेल Profiler) के लिए बहाव सॉफ्टवेयर के लिए युग्मित किया जा सकता है । प्रोसेसिंग की उपयोगिता के उदाहरण चित्रा 5 और चित्रा 6में दिखाए गए हैं । जब संकेत करने वाली शोर अनुपात ( चित्रा 5के रूप में) उच्च है, विश्लेषण सरल और सकारात्मक और नकारात्मक परिस्थितियों के बीच भेदभाव है तुच्छ है । इन मामलों में, यहां तक कि कमजोर हिट आसानी से पहचाना जा सकता है । कई परख, तथापि, एक कमजोर संकेत करने वाली शोर अनुपात है । उदाहरण के लिए, गुलाबी के उपचार-1:: GFP22 कीड़े (उनके pharynges में गठित mCherry अभिव्यक्ति के साथ) 1, 10 के साथ-phenathroline गुलाबी के स्तर को बढ़ाता है-1:: GFP । डेटा विश्लेषण के लिए, inducible GFP रिपोर्टर mCherry संकेत (चित्रा 6) के लिए सामान्यीकृत है । इस मामले में, रिपोर्टर कमजोर अभिव्यक्ति और/या कीड़े के बहुमत में सक्रिय नहीं है । इसलिए, सेल Profiler की तरह अतिरिक्त छवि प्रसंस्करण उपकरण, लागू करने, कि पृष्ठभूमि को कम करने और संकेत बढ़ाना हो सकता है लाभप्रद हो सकता है ।

अंत में, यदि कोई कोपा FlowPilot उपलब्ध है, तो यह प्रवाह vermimetry के माध्यम से डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । बहुत प्रवाह cytometry की अधिक परिचित अवधारणा की तरह, इस उपकरण के लिए एक समय में कम से कम दो या तीन चैनलों में सी. एलिगेंस के प्रतिदीप्ति उपाय किया जा सकता है । यह विधि बहुत उच्च सांख्यिकीय महत्व के साथ डेटा के अधिग्रहण के लिए उत्तरदायी है, लेकिन प्रवाह बहुत स्वचालित माइक्रोस्कोप की तुलना में कम है. प्रवाह vermimetry का सबसे महत्वपूर्ण लाभ को दोहराने के लिए एक समूह के रूप में पूरे कीड़ा आबादी का विश्लेषण करने की क्षमता में है, बजाय उंहें कई कुओं में बंटवारे और कुओं के औसत का विश्लेषण । इस फैशन में बड़े समूहों का विश्लेषण नाटकीय रूप से सांख्यिकीय शक्ति में सुधार और भी छोटे प्रभाव का पता लगाने की अनुमति देता है ।

तरल हत्या परख के संशोधन

परख के हाल के घटनाक्रम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (चित्रा 6) के सक्रियकरण परख सहित द्वारा अपनी उपयोगिता बढ़ा दिया है, मध्यम उच्च प्रवाह RNAi तकनीक (चित्रा 3) का उपयोग कर, और यहां तक कि मूल के प्रतिस्थापन रोगज़नक़.

सबसे स्पष्ट कारण RNAi सेट का उपयोग करने के लिए पी aeruginosa (या अंय रोगजनकों) के खिलाफ मेजबान रक्षा रास्ते के लिए परीक्षण है । परख में अस्तित्व के लिए प्रासंगिक जीन के RNAi पछाड़ना के उदाहरण चित्रा 3में दिखाया गया है । पिछले टिप्पणियों के साथ संगत20,23,24,25, डीएएफ-2 (RNAi) P aeruginosaको एक्सपोजर के दौरान एन्हांस्ड C. एलिगेंस उत्तरजीविता, जबकि डीएएफ-16 ( RNAi), ज़िप-2 (RNAi) और cebp-1 (RNAi) इसे छोटा करें । के रूप में उल्लेख किया है, RNAi सबसे अधिक बस multiwell प्लेटों पर कीड़े बढ़ रही है जहां एक अच्छी तरह से एक अलग RNAi क्लोन शामिल है । के कारण उच्च चिपचिपापन और छोटी मात्रा में शामिल है, यह मुश्किल है वर्दी, बुलबुला मुक्त भरने प्राप्त करने के लिए ९६-अच्छी तरह से विशेष उपकरणों के बिना प्लेटें । इसके अलावा, जीवाणु उपभेदों RNAi ले जाने के सुखाने भी एक मुद्दा हो सकता है, बाहरी कुओं की तुलना में तेजी से सूखी भीतरी कुओं के रूप में, गैर एकरूपता और आगर खुर के लिए महत्वपूर्ण क्षमता के लिए अग्रणी । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, यह कीड़े चिपमंक को प्रोत्साहित, स्क्रीनिंग और जोखिम कॉलेस्ट्रॉल तरल हैंडलिंग मशीनरी के लिए उपलब्ध पशुओं की संख्या को कम करने । इन दोनों कारणों से, के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों के साथ काम करने के लिए आसान कर रहे हैं ९६-अच्छी तरह से प्लेटों. हालांकि यह परख प्रवाह कम कर देता है, यह विश्वसनीयता में सुधार, और विशेष रूप से प्रारंभिक स्क्रीन के लिए सुझाव दिया है ।

अंत में, परख को संशोधित किया गया है परख ई. faecalisके साथ पी aeruginosa की जगह है । (सिद्धांत रूप में, अंय जीवाणु प्रजातियों के साथ प्रतिस्थापन अनुचित कठिनाइयों प्रदान नहीं करना चाहिए, बशर्ते कि उचित संवर्धन और जोखिम शर्तों की पहचान कर रहे हैं.) सबसे महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए रोगज़नक़ की मीडिया आवश्यकताओं, दोनों विकास और विकास के लिए और डाह की प्रेरण के लिए है । उदाहरण के लिए, ग्राम सकारात्मक, अवसरवादी रोगज़नक़ ई. faecalis aeruginosa14,26की तुलना में अधिक तापमान पर पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया (जैसे BHI) और गर्मी की आवश्यकता है । खाते में इन कारकों को लेकर, परख के अनुकूलन ई. faecalis का उपयोग करने के लिए सीधा था । के रूप में aeruginosaके लिए उल्लेख किया है, हमने देखा समय पर निर्भर हत्या (7 चित्रा) । दिलचस्प है, मौत के समय पहले प्रकाशित किया गया था परख के समान है कि पूर्व में इस्तेमाल किए गए, इस कदम है, जो सुझाव है कि हो सकता है कि रोगजनन में शामिल तंत्र के अभाव के बावजूद,26प्लेटों आगर पर संक्रमण भिंन ।

Figure 1
चित्रा 1: योजना के लिए तरल-आधारित C. एलिगेंस – P. aeruginosa संक्रमण परख. निमेटोड प्रचार और तैयारी को शामिल कदम बाईं ओर हैं, बैक्टीरियल तैयारी सही पर हैं । दोनों को शामिल कदम केंद्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पी aeruginosa द्वारा सी. एलिगेंस की हत्या विशिष्ट है और उचित बैक्टीरियल पोषण की आवश्यकता है । (क) सी. ई. कोलाई और पी. aeruginosaकी मौजूदगी में एलिगेंस ृ. (ख) C. एलिगेंस के साथ पी aeruginosa की उपस्थिति में मृत्यु (दाएं) और बिना (बाएं) धीमी गति से मार मीडिया मिश्रण करने के लिए जोड़ा (यानी, एस बेसल केवल) । एस बेसल एक ंयूनतम मीडिया है और जीवाणु विकास के लिए आवश्यक पोषक तत्वों को शामिल नहीं करता है और pyoverdine के उत्पादन precludes । (ग) सी. एलिगेंस की उपस्थिति में अलग से तैयार पी. aeruginosa. *p < 0.01, छात्र के t-परीक्षण के आधार पर । त्रुटि पट्टियां S.E.M. 10 कुओं प्रति जैविक प्रतिकृति शर्त के अनुसार इस्तेमाल किया गया प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: C. एलिगेंस प्रतिरोध करने के लिए पी aeruginosa मेजबान प्रतिरक्षा रास्ते पर निर्भर करता है । चयनित RNAi knockdowns का एक पैनल या तो पी. aeruginosa (ए) या 1, 10-phenanthroline (एक रासायनिक chelator कि तरल में पी aeruginosa के लिए जोखिम की नकल) (ख) के साथ इलाज किया गया था । छात्र के t-परीक्षण के आधार पर *p < 0.01, #p < 0.05 । त्रुटि पट्टियां S.E.M. 10 कुओं प्रति जैविक प्रतिकृति शर्त के अनुसार इस्तेमाल किया गया प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: C. एलिगेंस पी aeruginosa द्वारा हत्या मजबूत है और बैक्टीरियल एकाग्रता पर निर्भर करता है । (a-b) प्रतिनिधि चित्र (a) और ठहराव (b) C. एलिगेंस ृ के ७२ h. p-मानों के लिए p. aeruginosa के भिन्न सांद्रता के लिए जोखिम के बाद छात्र की टी के आधार पर गणना की गई थी -टेस्ट । में स्केल बार (A) है 1 मिमी. 16 कुओं प्रति जैविक प्रतिकृति शर्त प्रति इस्तेमाल किया गया । BF: ब्राइट फील्ड, FL: प्रतिदीप्ति. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक मजबूत संकेत के साथ एक परख के डेटा अधिग्रहण और छवि प्रसंस्करण । (एक) लाइव (नकारात्मक नियंत्रण) और मृत (सकारात्मक नियंत्रण) सी. एलिगेंसके प्रतिनिधि छवियों । (ख) नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का सांख्यिकीय विश्लेषण डेटा अधिग्रहण विधि, प्रसंस्करण मोड, और कुओं की संख्या के आधार पर विश्लेषण किया । (ग) प्रतिदीप्ति एक ९६-अच्छी तरह से थाली के चार व्यक्तिगत कुओं से कीड़े के लिए विश्लेषण किया गया था (दो सकारात्मक और दो नकारात्मक नियंत्रण कुओं) । प्रत्येक अच्छी तरह से निहित ~ १०० कीड़े । ग्राफ पर प्रत्येक डॉट एक एकल कीड़ा का प्रतिनिधित्व करता है, समय की उड़ान (जो के साथ संबंधित है, लेकिन, कीड़े रहने का coiling के कारण, अपूर्णता आकार का प्रतिनिधित्व करता है) और कीड़े के लिए मापा प्रतिदीप्ति कि Sytox ऑरेंज के साथ दाग रहे है दिखा । सकारात्मक नियंत्रण कीड़े पूर्व गर्मी जोखिम से मारे गए थे । तनाव और मृत कीड़े के आकार में परिवर्तन के कारण (के रूप में (क) में देखा जा सकता है, मृत कीड़े और रॉड की तरह दिखाई देते है और कुछ शरीर झुकता है) उनके रहने वाले समकक्षों की तुलना में, मृत कीड़े एक लंबा तोफ है । छात्र के टी-टेस्ट के आधार पर पी-मान की गणना की गई । (A) में स्केल बार 1 मिमी है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: डेटा अधिग्रहण और एक उदारवादी संकेत के साथ एक परख के छवि प्रसंस्करण । (एक) एलिगेंस के प्रतिनिधि छवियां एक inducible गुलाबी-1:: GFP रिपोर्टर और एक mCherry गठन मार्कर (extrachromosomal सरणी से जीन की अभिव्यक्ति को सामांय) ले जाने । C. एलिगेंस DMSO (नकारात्मक नियंत्रण) या 1, 10-phenanthroline (सकारात्मक नियंत्रण) से अवगत कराया । (ख) नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का सांख्यिकीय विश्लेषण डेटा अधिग्रहण विधि, प्रसंस्करण मोड, और कुओं की संख्या के आधार पर विश्लेषण किया । (ग) एक ९६ के चार व्यक्तिगत कुओं-अच्छी तरह से प्लेट (दो सकारात्मक और दो नकारात्मक नियंत्रण कुओं) प्रवाह vermimetry का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । छात्र के टी-टेस्ट के आधार पर पी-मान की गणना की गई । (A) में स्केल बार 1 मिमी है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: C. एलिगेंस ई. faecalis द्वारा हत्या मजबूत और समय निर्भर है । (क-ख) प्रतिनिधि बिंब (क) और ठहराव (ख) के सी. ई. faecalisको एक्सपोजर के बाद एलिगेंस ृ. *p < 0.01, छात्र के t-परीक्षण के आधार पर । 10 कुओं प्रति जैविक प्रतिकृति शर्त के अनुसार इस्तेमाल किया गया । त्रुटि पट्टियां (A) में S.E.M. स्केल बार का प्रतिनिधित्व 1 mm है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस परख (या इसी तरह की परख जहां अंय रोगजनकों aeruginosa या ई. faecalisके लिए प्रतिस्थापित कर रहे हैं) प्रयोजनों की एक किस्म के लिए उपयोगी है, दवा की खोज सहित । यह भी डाह कारकों की पहचान, मेजबान रक्षा रास्ते के elucidation के रूप में मौलिक जैविक प्रश्नों, को संबोधित करने के लिए उपयोगी है, और नियामक की मेजबानी में शामिल मशीनरी-रोगज़नक़ बातचीत का निर्धारण ।

हालांकि पी aeruginosa तरल हत्या परख मजबूत है, वहां कई अंक जहां सावधान ध्यान विफलता की संभावना को कम करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, के रूप में उल्लेख किया, aeruginosa टीकाकरण के लिए बैक्टीरियल स्रोत प्लेट ताजा रहना चाहिए, ऐसा न हो कि बैक्टीरिया डाह खो, पौंड में रातोंरात विकास के बावजूद । दूसरा, यह सुनिश्चित करें कि कैल्शियम और मैग्नीशियम aeruginosa हत्या की परख के लिए जोड़ रहे है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके बिना डाह काफी समझौता हो जाएगा । अंत में, यह ध्यान देने योग्य बात है कि कीड़े HT115 पर (RNAi के लिए आधारित परख) काफी बाद में कीड़े से मर जाएगा लायक है OP50 (N. Kirienko, व्यक्तिगत संचार) पर येते । इस कारण से, यदि RNAi के लिए स्विचन आधारित अध्ययन, यह महत्वपूर्ण है empirically परख के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु निर्धारित करते हैं ।

या तो पी aeruginosa या ई. faecalisके साथ परख हत्या के लिए, यह सुनिश्चित करें कि वहां L1 मंच से कीड़े के विकास के लिए पर्याप्त भोजन जब तक वे तैयार है परख में इस्तेमाल किया जा रहा है महत्वपूर्ण है । भुखमरी, यहां तक कि अल्पकालिक में, इस तरह के डीएएफ-2/डीएएफ-16 इंसुलिन/IGF सिग्नलिंग नेटवर्क27के रूप में मेजबान रक्षा रास्ते, के एक नंबर को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है. हमारे डेटा का सुझाव है कि डीएएफ-16/FOXO पहले से ही थोड़ा तरल20में किया जा रहा द्वारा सक्रिय है, और आगे सक्रियण दृढ़ता से अवांछनीय है, के बाद से डीएएफ-16/FOXO व्यापक स्पेक्ट्रम रोगज़नक़ प्रतिरोध23को बढ़ावा देता है ।

अंत में, यह एक readout के रूप में मृत्यु पर निर्भर करता है कि किसी भी परख में पूरी तरह से बाँझ कीड़े का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कीड़े उपजाऊ हैं, तरल में जा रहा है अंडा बिछाने में कठिनाइयों का कारण बनता है । नतीजतन, भ्रूण के कुछ माता पिता के भीतर हैच, अंततः अपनी मौत के कारण । इस कारण से, हम आम तौर पर एक आनुवंशिक घावों का उपयोग करें, जैसे जीएलपी-4 (bn2)28, कि इन परख के लिए एक पूरी तरह से व्याप्ति बाँझ phenotype दर्शाता है । रसायनों का उपयोग है कि भ्रूण विकास को रोकने पर अभी भी अंडे बिछाने की अनुमति, जैसे 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), के रूप में वे भी जीवाणु विकास और विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते है बचा जाना चाहिए ।

सामांय में, हम यह काफी विश्लेषण के लिए कई समय अंक की योजना मददगार मिल गया है । हालांकि परख मजबूत है और समय आम तौर पर संगत है, stochastic और अगोचर परिवर्तन 2-4 घंटे के भीतर परख में मौत के समय बदलाव कर सकते हैं । जब समस्या निवारण आवश्यक है, यह अक्सर सबसे पहले जवाब का सरलतम पर विचार करने के लिए उपयोगी है; यानी, ताजा मीडिया तैयार, सबसे हाल ही में बैक्टीरियल संस्कृतियों का त्याग, और फिर से लकीर जमे हुए शेयरों से बैक्टीरियल उपभेदों, आदि केवल बहुत शायद ही कभी इन उपायों कार्यक्षमता को परख बहाल नहीं करते हैं ।

विधि के सापेक्ष सादगी के कारण, संशोधनों की एक विस्तृत विविधता आसानी से किया जा सकता है । एक समान जीएलपी-4 से कीड़े बदलने (bn2) उच्च प्रवाह RNAi स्क्रीन, जैसे उन हम यहां वर्णन के लिए पृष्ठभूमि, xenobiotics और विषाक्त रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मेजबान प्रतिक्रिया रास्ते की पहचान के लिए उपयोगी है । उदाहरण के लिए, RNAi प्लेटों के प्रत्येक कुआं में एक ही रासायनिक या विष जोड़कर (जैसे, Cry5B विष, phenanthroline, आदि), रास्ते है कि इन विषाक्त पदार्थों के प्रति संवेदनशीलता को बदलने के लिए आसानी से पहचाना जा सकता है । स्क्रीन के इन प्रकार भी रोगजनकों कि संक्रमित सी एलिगेंसके panoply में से किसी के खिलाफ रक्षा नेटवर्क की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे हित का खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में कैंसर प्रिवेंशन एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्सास (CPRIT) अवार्ड RR150044, वेल्च फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट सी-१९३०, और स्वास्थ्य K22 AI110552 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा NVK को सम्मानित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३७ Caenorhabditis एलिगेंस उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग उच्च सामग्री स्क्रीनिंग Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत
एक उच्च प्रवाह, उच्च सामग्री, तरल आधारित <em>सी. एलिगेंस</em> Pathosystem
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Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

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