Summary
ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール プロトコルについて述べる。
Abstract
識別される新薬の数によって、伝統的な体外画面は暮れゆき、多剤耐性を戦闘に新たな武器を求めてこのアプローチの成功を減らすこと。これは、研究者はのみ新しい薬を見つける必要はありませんが、またそれらを見つける新しい方法を開発する必要があります結論につながっています。最も有望な候補の中でメソッドは、全体の生物、生体内でその使用の高スループット、表現型のリードアウトを試金して動脈分布を線虫からその範囲をホストします。これらのホストには、ホストまたは biounavailable に有毒な化合物は、通常を高価なフォローする前に、最初の画面にドロップした時に誤検出での劇的な削減を含むいくつかの強力な利点があります。
ここで我々 の分析が定評のc. の elegansのホスト変化を調査する使用されている方法を紹介-緑膿菌液殺害病態システム。よく働いたこの技術のいくつかの拡張機能を紹介します。たとえば、我々 は 24 または 96 ウェルで RNAi を用いた高スループット遺伝スクリーンをこのホスト病原体の相互作用でクエリ ホスト要因にプレート フォーマットを運ぶことができます。この試金を使用して、可能性のある骨の折れるの生化学的な浄化方法を必要とせず、創薬のターゲットを識別するタスクを大幅に効率化できる、少数の月だけで全ゲノム スクリーンを完了できます。
我々 もここでグラム陰性病原菌膿のグラム陽性菌腸球菌を代替となる手法の変化を報告します。ずっと膿の場合に、腸球菌による殺害は時間依存です。以前c. の elegansのとは異なり、腸球菌の試金、我々 の分析腸球菌は、preinfection を必要としない、その安全性の向上、液体処理機器の汚染の可能性を減らすこと。試金は非常に堅牢な 〜 95% 死亡率 96 h ポスト感染を示します。
Introduction
身分証明書と有効な広域スペクトル抗生物質の開発今ほぼ世紀前に、公衆衛生における重要な分岐点につながった病気は過去の惨劇になる感染が広まった信念があった。いくつかの短い十年以内この楽天主義は病原体病原体がこれらの一度奇跡的な治療法が限られて抵抗機構を開発した後として、衰え始めた。いくつかの時間のため、薬剤の発見の努力と病原体の間の軍拡はバランスの取れたように見えた。しかし、抗菌薬の誤用は最近肺炎桿菌、アシネトバクター属 baumanii、セラチア、および膿1、パン薬剤耐性菌の出現に結実して 2,3,4。
膿は、人免疫不全状態、または嚢胞性線維症のある重症の熱傷患者へ深刻な脅威である日和見のグラム陰性、マルチホスト菌です。それはまたますます特に抗菌薬耐性の継続的な買収のための深刻な院内感染の原因となるエージェントとして識別されます。この脅威に対処するには、我々 は、定評のc. の elegans-膿感染システム5を使用しています。私たちの研究室6ホストを殺すために病原体の能力を制限する新規化合物を識別するために液体ベース、高スループット、高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを開発するこのシステムが活用されています。興味深いことに, これらの化合物は抗菌剤7および病原性阻害剤8を含む少なくとも 3 つの一般的なカテゴリに属しているようです。線虫c.エレガンス他高コンテンツ薬物検出アッセイ結核菌 tuberculosum、クラミジア ・ トラコマチス、仮性結核菌、リステリア菌、野兎病菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ ・ アルビカンス、報告されていると腸球菌、他の中で9,10、11,12,13,14,,1516。これらの種類のアッセイのホストと病原体、化学画面とを超えてヒットを識別する能力に比べてバイオアベイラビリティの可能性の増大に有毒かもしれない誤検出の制限など、いくつかのよく知られている利点があります。単に反 virulents、免疫促進分子、またはそれ以外の場合前者を支持して宿主-病原体相互作用のバランスを傾ける化合物など、微生物の増殖を制限すること。さらに、これらの画面で発見された化合物は、哺乳類のホストで効果的。
それは、少なくとも 2 つ他の試金17,18が液体にc. の elegansの高スループット画面を実行する使用できることは注目に値するです。しかし、これらのアッセイのそれぞれは液体で実行する遅い殺害として知られている、典型的な腸の植民地化アッセイができる変更のスループットが向上しより容易に選別する化合物。慎重に評価は決定的な細菌の病原性のメカニズムがこれらの試金および液体ベースのスクリーン7間で異なっていることを示しています。病原性の両方のタイプは、哺乳類システムで観察される、ので、アッセイの選択前に実験者の利益に最も関連するどの病原性を規定を検討することが重要です。
液体ベースの最適化されたバージョンを示すC. elegans P. 緑膿菌の試金。グラム陽性の細菌の病原体に対応する液体を用いた測定手法の適応を述べる腸球菌。膿のようなe. フェカリスますます深刻な院内の脅威として抗菌薬耐性経路1の成長している兵器で識別されます。腸球菌の高速スクリーニング法の前に14が存在する病原体は、手順が複雑になりますし、COPAS FlowSort のような機器に汚染の可能性が高くなると preinfection が必要です。提案プロトコルの安全性プロファイルを改善、感染前の必要があります。最後に、これらのアッセイのいずれかは、確立の役割を果たすホストの要因を検索するユーザーを許可する RNAi や感染に対する抵抗性を餌と併用できる手段を報告します。
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Protocol
注意:膿と腸球菌バイオ セーフティ レベル 2 の病原体は、偶発的な感染を防ぐため、表面の汚染を最小限に抑えるため、適切な安全対策が取られなければなりません。すべてのメディアや病原体と接触する材料を滅菌または破棄する必要があります。CDC の文書バイオ セーフティの微生物学的および生物医学研究所 (BMBL)、第 5 版からさらにガイドラインがあります。
1. 準備や膿のメンテナンス
- ストリーク (ホストゲノム スープ) LB 寒天培地プレート冷凍ストックから膿。37 ° C で 16 ~ 24 時間インキュベートします。
注: は、BSL 2 生物学的安全キャビネットの無菌性を確保するための内部の膿の実験を行います。病原菌の感染や汚染の可能性を最小限に抑えるために適切な安全予防策を使用します。 - このプレートを 4 ° C に転送します。このプレートを 4 ° C に保持し、1 週間文化を接種するために使用可能性があります。1 週間後染しプレートを破棄し、新しい LB ストリーク プレートを作る。
注: P. 緑膿菌の病原性は、長期貯蔵後低下します。 - アッセイ プレートを設定する前に 2 日間は、1.1 で作られたプレートから膿の単一コロニーを滅菌流体培養基 LB の 3-5 mL を接種します。12 に 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
注: はない 16 h 以上孵化させなさい。豊富な液体培養膿PA14 は溶解を開始します。 - 遅い殺すメディアで滅菌 10 cm プレートを準備 (3 g, 塩化ナトリウム 3.5 g ペプトン, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4、25 mL のリン酸バッファー (1 リットルあたりの量: 132 mL K2HPO4 (1 M)、868 mL KH2PO4 (1 M)) と 18 g 寒天/L)。
注: 事前にプレートを準備します。4 ° C で気密の容器で 3 週間まで格納できます。 - 各 10 cm 低速殺すプレート (SK) を新鮮な一晩 LB 文化から緑膿菌 350 μ l をシードします。滅菌細菌拡散機を使用すると、メディアの表面を渡って均等に細菌を広げるし、BSL 2 生物学的安全キャビネットで乾燥することができます。
- 24 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
2. RNAi 細菌の準備
- うち連勝またはピン転送希望凍結ストックから適切な抗生物質 (100 μ g/mL で carbenicillin) と Ahringer やヴィダル ライブラリ 15 μ G/ml にテトラサイクリンを含む LB 寒天培地プレートに RNAi を含む細菌系統。
注: 非病原性細菌を扱う場合を使用、BSL 2 A/B の生物学的安全キャビネットまたは BSL 1 層流フード文化の無菌性を確保するため、ライブラリの交差汚染の可能性を最小限にします。 - 37 ° C で 24 時間の版を孵化させなさい
- 2 週間の 4 ° C でプレートを格納します。
- 2 週間後、プレートを破棄し、たての板に置き換えてください。
- 並列で複数の RNAi 系統をテストするには、carbenicillin 補足ポンド、24 ウェルのディープ ウェル プレートのシングルで 4 mL にまたは滅菌試験管に各クローンから単一コロニーを個別に接種します。
注: テトラサイクリンは RNAi の効率が低下する報告されています。このメディアには使用しないでください。 - Multiwell プレートの最適振動定温器に 24 井戸ディープウェル プレートを置き、950 rpm で揺れながら 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
注: それは従来の振動インキュベーターを使用して multiwell の板で均一の細菌の増殖を取得するは難しいです。揺れのインキュベーターは、正常に成長する文化のために 750 rpm 以上で振ることができる必要があります。専用シェーカーがない場合は、個々 の管でそれぞれの文化を育てることは可能です。文化は、必要な場合、遠心分離後、24 ウェル プレートに転送できます。 - 2,000 x g で 5 分間遠心分離によって細菌を収集します。
- 上清をデカント プレートを反転、活発に揺することによって。RNAi の S の基底 (5.85 g 食塩 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4純水 1 L に溶解し、オートクレーブで滅菌) 100 μ L の細菌を再懸濁します。
- Multiwell NGM プレートの井戸の適切な数にピペットの再懸濁の細菌 (マツ材線虫病の成長媒体、3 g, 塩化ナトリウム 2.5 g ペプトン, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4、25 mL のリン酸バッファー (1 リットルあたりの量: 132 mL K2HPO4 (1 M) の868 mL KH2PO4 (1 M))、水 1 リットル当たり 18 g 寒天) IPTG (最終濃度が 1 ミリメートル) と carbenicillin (100 μ g/mL 最終濃度) 補われます。
- 6 ウェル プレート、24 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL または 150 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートのウェルあたり 3.5 mL NGM メディアを使用します。
- 6 ウェル プレートを 100 μ L/ウェル菌を使用します。50 μ L/ウェル; 24 ウェル用または 20 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート。乾燥することができます。
注: 急速、均一な乾燥を促進するため滅菌流フードでは、乾燥が行われる通常。均一乾燥は、非常に重要です。寒天のひび割れを促進するワームの穴を掘る、過剰乾燥は避けてください。これは、ワームの損失および液体ハンドリング システムの潜在的な詰まりに します。
- すぐに準備されたプレートを使用してまたは 2 週間後で使用のための 4 ° C で保存します。
注: を乾燥から防ぐためにプレート、プラスチック パラフィン フィルムで密封したり少し湿らせたペーパー タオルでしっかりと密封されたコンテナーに配置されます。
3. メンテナンスと線虫の準備
注: 実験を開始する前に妊娠、アダルト的雌雄同体ワームの同期された人口をとおり生成します。
- 洗って妊娠からの大人 (すなわち、生殖腺内で目に見える複数の胚を) 4 6 10 cm NGM プレート プレート、優しく、旋回し、15 mL の円錐管に注ぐ S 基底の 4 つの mL を追加して 15 mL の円錐管に。
- 1,000 x g で 30 秒間遠心分離を介してワームをペレットします。
- ワームのペレットを妨害しないように世話上清を吸引します。
- ワームの漂白剤の解決の 3.5 mL を追加 (最終濃度 0.5 M NaOH、1% ナトリウム次亜塩素酸、滅菌水で) ワーム ペレットとミックス 1分間反転します。
- 簡単に渦と 1,000 x g で 30 秒間遠心します。
- 吸引またはワーム ペレットを邪魔しないように世話、上清をデカントします。
- ワームの餌に 3.5 mL の新鮮なワーム漂白剤溶液を追加します。
- 積極的に漂白剤溶液でワームをミックスします。定期的に (約 10 秒) が視覚的に解剖顕微鏡の下でワームを検査します。卵を解放を破るワーム キューティクルを監視します。成虫のほとんどは溶存 (~ 95%) をされている、消化を停止する基底 S と 15 mL に漂白剤を希釈します。
注: 卵の殻は、成体よりも漂白剤に抵抗力があるが、長時間露光中に解散することができます。卵解散を避けるためには、7 分以上の漂白剤溶液をワームの卵を公開しません。卵の殻が過度に破損している場合は、胚が死んでしまいます。 - 30 秒間 1,000 x g で胚をペレットし吸引または胚のペレットを削除せず、上清をデカントします。
- 残りの漂白剤溶液を希釈する 15 mL の最終巻に基底 S でワームを再懸濁します。
- 4 連続洗浄の合計のための洗浄のステップ (3.9 3.10) 3 回を繰り返します。
- 4 その後、上清を吸引し、滅菌 S 基底 15 mL の円錐管に 5 または 6 mL 追加します。目的は、〜 50 μ L 当たりワームの濃度に胚を再懸濁します。
注: S 基底の量によって異なります; 卵ペレットのサイズなるほどのペレットより S 基礎必要です。 - 一晩常温でテーブル トップ回転子または 15 ° C で 48 h に円錐形の管を孵化させなさい幼虫が孵化、幼虫の発育、栄養欠乏による L1 段階 (L1 休眠) で逮捕。
- それらのほとんどが孵化、開発の L1 段階で逮捕されたことを確認する解剖顕微鏡下で胚を確認します。
- ワームの準備の 20 μ L を取り、S 基底の 80 μ L で希釈によってワームの数を決定します。空白 NGM プレートに直接希釈ワーム液の 10 μ L をピペットします。2 回を繰り返します。
- 各スポットで幼虫の数し、平均数を決定します。ワームはワームの準備で μ 1 のおおよその数を取得する 2 でこの平均値を除算します。ワームの準備は、伝搬板または実験のために、使用できます。
注: 4-5 日後飢えた幼虫が死ぬことを始めます。この時点で、準備を破棄します。
- 各スポットで幼虫の数し、平均数を決定します。ワームはワームの準備で μ 1 のおおよその数を取得する 2 でこの平均値を除算します。ワームの準備は、伝搬板または実験のために、使用できます。
- ひずみを反映するためピペット 3 4 10 cm NGM プレート L1 ワーム (5,000-6,000) の適切な数の斑点のある集中 OP50大腸菌- "superfood"(エシェリヒア属大腸菌OP50 が 25 倍の濃度で発見 (すなわち、 1 L の一晩 OP50LB の栽培文化収率 40 mL スーパー フード X OP50 25 の);この濃厚の細菌懸濁液 2 mL、NGM にある各 10 cm のプレートに斑点を付ける)。
- 実験のプレートを準備をするには、(「基本的なプロトコル」使用 3.17.1 の設定、「RNAi スクリーニング設定"の使用手順 3.17.2 - に応じて 3.17.4) 次のいずれかの操作を行います。
- ピペット 〜 5,000 ワーム/10 cm プレート RNAi や OP50 スーパー フードを播種します。
- ピペット 〜 ワーム/井戸 6 ウェル プレートで 500 は RNAi でシードします。
- ピペット 〜 300 ワーム/ウェル 24 ウェル プレートでは、RNAi でシード。
- ピペット 100 〜 ワーム/ウェルの 96 ウェル プレートは、RNAi でシード。
注: RNAi がシードだった方法について手順 2.7 2.9 RNAi 菌の準備を参照してください。
- ワームの肥沃なひずみを使用している場合孵化させなさい 44 〜 48 使用のための 25 の ° C でワームこれらのワーム、できるだけ早く人口が適切な年齢に達した後。これは、アッセイの中にワーム内孵化卵の影響を最小限に抑えます。
- ひずみを使用している場合は滅菌温度 (例えば、fer-15(b26);fem-1(hc17)またはglp-4(bn2))、15 ~ 16 h ° C でワームをインキュベートし、開発を完了し、胚発生を防ぐ 44 h の 25 ° C に転送。
4. 液体測定セットアップ (基本的なプロトコル) を殺す
注: これは 1 つの菌株とワームの 1 つのソースのためのプロトコルです。
- SK プレートから膿を削除し、で再懸濁します細胞スクレーパーを使用して、~ S 基底の 5 mL。スケール アップに必要な場合。(外径 φ600) 分光光度計を使用して細菌懸濁液の光学密度を測定します。
- S 基底で OD600 ≒ 0.09 (3 X 最終濃度) で膿の希薄化後の株式の 24 mL を準備します。4.6.2 好評につき、最終的なコンテンツを参照してください、それに応じて細菌希釈量を拡張します。
- 21 mL 液体低速を殺すメディア (3 g, 塩化ナトリウム 3.5 g ペプトン/l CaCl2と MgSO4最終濃度 1 mM 添加) を追加します。マルチ チャンネル ピペットを使用すると、384 ウェル プレートの各ウェルに細菌やメディアの 45 μ L を転送します。
- 50 mL の円錐管にソース (すなわち、ステップ 3.17.1) からワームを洗浄し、重力の力の下で解決するワームを許可します。5 mL に上清を吸引します。基底の 50 mL の S の合計で再懸濁します。
- 4.4 の手順を 2 回繰り返します。
- ワームの並べ替えアイコンを使用して、並べ替える 384 ウェル プレートの各ウェルに約 22 ワームです。
注: セットアップは、液体の ~1.1 μ L の各ワームを削除します。22 ワーム 25 μ L、70 μ L/ウェルに総試金ボリュームをもたらすことになるだろう。- 各ウェルの最終組成物から成っている 70 μ。 45 μ l このボリュームの、細菌の培地として追加されます (24 μ S 基底部、および 21 μ l SK で 0.03 外径600細菌は CaCl2と MgSO4補足)。その他の 25 μ L が 22 のワームに追加されます。
- ソーターを使用する場合ここで (材料の表を参照) は使用できません、ワーム 1 ワーム/μ L の S の基底と戻 25 μ L/ウェルは、マルチ チャンネル ピペットを使用しての最終濃度に希釈できます。しかし、結果は高められた可変性を示すことがあります。レオンと同僚の19のとおりまた、ぜん動流路内の液体ディスペンサーを使用することが可能です。
- 384 ウェル プレートにワームがソートされているガス透過性フィルム プレート シール、25 ° C 24-48 h でプレートを孵化させなさい。
- 希望の時間に S 基底と 384 ウェル プレートを洗浄するのに合計 5 回マイクロ プレート ウォッシャーを使用します。
- 第 2 洗浄後メディアのほとんどを吸引、井戸の底から任意の破片を緩めるに、少なくとも 30 秒間マイクロ プレート vortexer を使用して板を振る残して 〜 20 μ L. 積極的に)。
- 最終的な洗浄、吸引清 0.98 μ M 核酸の 20 μ L。 追加 50 μ まで染色 (材料表参照) 後/384 ウェル プレート、0.7 μ m の最終的な集中のための。
- 12-16 時間室温で孵化させなさい。この染料は死んでワームを汚れるだけ。必要な潜伏期間後洗浄皿マイクロ プレート ウォッシャーを使用して任意の過剰を削除する染色 (最低 3 洗浄) です。
- データ集録、画像の透過光と蛍光 (531 nm 励起と 593 の排出) を分光光度計や自動顕微鏡を使用します。
- 低倍率の目的を使用すると、キャプチャする全体の井戸の画像を許可できます。
- また、フローの vermimetry を使用します。この手法は、測定サイズと全体の生物 (すなわち、 c. の elegans) は cytometry 流れに強く類似しているファッションの蛍光ワーム蛍光としてラージ オブジェクト フローサイトを使用します。
- 自動画像解析ソフトウェア (CellProfiler、MatLab http://cellprofiler.org/に基づいて無料の画像分析スタジオ) などを使用して公平なファッションによくあたり蛍光および合計のワームの面積を求めます。
注: これらの数値の商各ウェルの分数死を表します。1 つをも持っていた場合 7 染色 20 のワーム、合計分数死 0.35 または 35% を構成し、.- 初めて使用する前は、自動画像処理パイプラインは手動スコアリングによって検証される必要があります。これは、視覚的に画像を検査し、それらのそれぞれに死んでワームの分数を記録によって得られたスコアに自動化されたパイプラインからの結果を比較することによって行われます。検証プロセスは、自動画像処理のパラメーターは正確であり、データを正しく表すことを保証します。
5. スクリーニング複数線虫株またはノックダウン (RNAi 画面セットアップ) の適応
注: これは 24 ウェル プレート セットアップの説明されている RNAi スクリーニングです。
- S 基底 24 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL を追加 (手順 3.17.3 参照)。優しくプレートを揺することによってワームを扇動し、空、滅菌 24 ディープ ウェル プレートにワームを転送します。重力 (~ 5 分) を解決するワームを許可します。
- 約 1 mL を残して上清を吸引します。7 mL の S の基底を各ウェルに追加します。
- 2 回以上の手順 5.1 5.2 以上を繰り返します。最終的な洗浄の後に、約 400 μ L を残して上清を吸引します。
- ワーム ソーターのリサンプラ関数を使用して、(24 ウェル プレート利回り 8-12 の井戸は 384 ウェル プレートの各ウェル) 384 ウェル プレートの各ウェルに 24 ウェル プレート ワーム サスペンションから 22 ワームを並べ替えます。
- 飢餓を避けるためには、細菌の 384 ウェル プレート (OP50 などの食品としてのみ機能するひずみまたは病原性株) に並べ替えする前にピペットします。
注: 2.3 2.5 または 6.4 6.5 では、次の手順と食料源の細菌を希釈、膿と同じスキームを次に追加できる病原体を追加できます。
- 飢餓を避けるためには、細菌の 384 ウェル プレート (OP50 などの食品としてのみ機能するひずみまたは病原性株) に並べ替えする前にピペットします。
- ワームは、384 ウェル プレートにソートされている後、は、小さな分子やその他特定の実験材料を追加します。
6。腸球菌の適応
メモ:膿アッセイからの差分のみが表現されます。
- 腸球菌の新鮮なソースを準備する (脳心臓注入) BHI 寒天培地プレート上に凍結ストックから細菌をストリー キングし、37 ° C で 16 ~ 24 時間インキュベート
注: は、BSL 2 生物学的安全キャビネットの無菌性を確保するための内部の腸球菌の実験を実行します。病原菌の感染や汚染の可能性を最小限に抑えるために適切な安全予防策を使用します。 - プレートは、4 ° C で 1 週間保存できます。この期間の後、新鮮なプレートで置き換えます。
- ワーム、並べ替え前に、の晩は 3 ~ 5 mL を接種する単一コロニーを滅菌 BHI e. フェカリス。撹拌で 37 ° C で 12-16 時間孵化させなさい。
- 膿(S 基底、外径600≈0.09 で 3 x 細菌) は井戸に細菌を追加します。
注: e. フェカリス、ためよくの最終的な組成です: e. フェカリス(外径600≈0.03)、BHI = 10 %v/v の S の基底で構成された残りのボリューム。覚えているワームを 25 μ L の S の基底が届けられます。
注: e. フェカリスは、ぼやけた画像の原因と蛍光染色を吸収するバイオ フィルムの厚さを生成します。広範な洗浄は、このバイオ フィルム除去に十分かもしれません。この場合、ワームは、マルチ チャンネル ピペットを使用して空のプレートに転送できます。転送を容易にするには、最終濃度 0.1% (v/v) トゥイーン 20 の S の基底に S の基底には、トゥイーン 20 が追加できます。バイオからワームを除去するに役立ちます。
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Representative Results
分析パフォーマンスのための重要なパラメーター
トラブルシューティングと分析を最適化するために必要なこの試金の基礎となる生物学の正しい理解が。そのために、私たちを参照してください最初いくつか主要なペーパー,緑膿菌の発症のメカニズムを解明-リキッド7,20で殺害を介する。上記で説明した手順に従っている (試金のプロトコルの概略は図 1を参照)、線虫の時間依存の殺害は (図 2 a) 病原体の存在下でのみ観察します。対照的に、キーの栄養補助食品 (例えばペプトン、メディアから外されますのみ S 基底が追加された場合) がない場合は、ほとんどない殺害が観察される (図 2 b)。興味深いことに、(37 ° c、25 ° c 24 時間 24 h) の従来の遅い殺害アッセイのために重大でありもともと膿の 2 段階培養実装する液体を殺す21、この試金 (に不可欠であるは図 2)。追加することはできますが大幅そう一晩 LB 文化から直接膿は致死速度を変更しはお勧めしません。
適切かつ望ましい場合は、アッセイの簡素化を試金の生物学を理解することも可能です。たとえば、ホストこのアッセイで殺害の最も重要なドライバーは担鉄細胞 pyoverdine と pyoverdine によるホスト毒性鉄7をバインドする能力に依存しています。試金がc. の elegans の転写応答として生きたバクテリアの pyoverdine 豊富な濾液、精製された pyoverdine、またはさらにいくつかの合成鉄キレート物質 (例えば、 1, 10-フェナントロリン) に置き換えることで簡略化できますよう、これらの治療法は非常に似ている (図 3)22。
いくつかの異なるラインの証拠は実験装置のロバスト性に話しかけます。最初に、セットアップは、初期の細菌濃度の広い範囲を許容します。OD600 として低濃度 = 0.0025 (約 10 倍低い推奨値より) まだ展示時間と濃度依存の殺害、タイミングは (図 4 a) をシフトします。第二に、アッセイの再現性はそのような少数としてその 4 井戸としては頻繁に統計的に有意なデータ (図 4 b) を得るのに十分な。
推奨されませんいくつかの変更があります。プロトコルに記載されているよりもはるかに高い濃度の初期菌接種の使用などその場合得点致死を複雑に困難または不可能効果的に洗い流すには、厚さ、バイオ フィルムのようなの素材。さらに、高濃度により接種も酸素を競うでき非固有のホスト殺害7をトリガーできます。
もう一つ重要な注意点はアッセイを停止し、死んでワームを画像間の時間の期間を制限します。効率的であることが重要ですのでこの時間枠が染色を含める必要があることに注意してください。死の後、ワーム内生物材料は押し出しや細菌によって消費されるを開始します。24-32 h 以内、キューティクルだけが残っています。キューティクルは非常に悪い汚れや、洗浄中に失うしやすく、非常に軽いです。この現象を (すなわち、まだ、いくつかのワームが生きていること、他の人は自分のコンテンツを既に失っているし、イメージすることは不可能) で、系統または殺害の非常に異なる反応速度でひずみ/RNAi 条件などが複雑になることに注意してくださいすることが重要です。図 4 aプレートの左側にワームとしてこの現象を示しています非常に低濃度の細菌を接種した、まだ主として生きているプレートの右側にあるワームの多くは高濃度にさらされました。細菌が流されました。
アッセイの成功の非常に重要な決定要因は、収集し、データを分析するために使用方法です。私たちの研究室でこれらの試金からデータを収集するために少なくとも 3 つの方法を使いました: 流 vermimetry (すなわち、 c. の elegansを流れ cytometry 技術の適応; 文字通り、測定、自動化された顕微鏡は、吸光光度法液流動のワーム)。これらのメソッドの最初は、spectophotometer を使用して染料または問題のワームの記者の蛍光を読み取ります。このメソッドは、かなりユビキタス機器 (マイクロ プレート リーダー、分光光度計標準) を使用しての利点を持って、データを取得する最速の方法です。しかし、それは自動顕微鏡から利用可能な情報コンテンツと流 vermimetry の統計的検出力を欠いています。
自動顕微鏡は別の実行可能なオプションです。マイクロ プレートのイメージング システムの数は現在市場より高価な価格が大きいほど、(例えばバイオ-tek 社 Cytation5) に単一の調査官に手頃な価格に至るまで、コアでより一般的に見られる高品質マシン施設 (例えば、分子デバイス ImageXpress 顕微鏡)。実際には、これらのソリューションのほとんど、ほとんどの画面とアッセイをスコアリングのため。最も自動化された画像処理プラットフォームは、画像情報の収量を促進する (例えば久万、ImageJ、Gene5、またはセル プロファイラー) 処理のため下流のソフトウェアにも結合できます。処理のユーティリティの例を図 5と図 6に示します。信号対雑音比が高い (図 5) のように、分析は簡単、正と負の条件を区別はたやすい。これらのケースでは、弱いかもヒットを容易に識別できます。多くの試金、しかし、弱い信号対雑音比があります。たとえばの 1, 10 フェナントレン啉と (とその pharynges の構成 mCherry 式) ピンク 1::GFP22寄生虫の治療はピンク 1::GFP のレベルを増加します。データ分析用誘導型 GFP レポーターは構成の mCherry 信号 (図 6) に正規化されます。この場合、記者は弱い表現を持っているおよび/またはワームの大半ではアクティブ化されません。したがって、バック グラウンドを低減でき、信号を増幅する携帯プロファイラーのような追加ツール画像処理を実装する有利かもしれません。
最後に、COPAS FlowPilot が利用可能な場合、フロー vermimetry 経由でデータを取得する使用できます。はるかフローサイトメトリーのもっと身近な概念のような少なくとも 2 つまたは 3 つのチャンネルで同時にc. の elegansの蛍光を測定するこの楽器を使用できます。この方法は、統計の重要性が高いデータの取得に非常に適してが、スループットは非常に自動化された顕微鏡に比べて減少しました。流 vermimetry の最も重要な利点は、複製ではなく複数の井戸に分割し、井戸のなかを分析するための 1 つのグループとして全体のワームの集団を分析する能力。劇的にこの方法で大規模なグループの分析統計の力を向上させるし、も小さな効果の検出が可能します。
液体殺害アッセイの変更
アッセイの最近の動向は、蛍光レポーター (図 6) - ハイスループット RNAi 技術 (図 3)、および元の置換も使用しての活性化を試金、その有用性を拡張しています。病原体。
RNAi のセットアップを使用する最も明白な理由は、膿(または他の病原体) に対するホストの防衛の経路をテストします。遺伝子関連アッセイで生存のための RNAi ノックダウンの例を図 3に示します。以前観測20,23,24,25に一貫した、 daf-2(RNAi)強化daf 16 (中に膿露光中にc. の elegans生存RNAi)、 zip-2(RNAi)とcebp-1(RNAi)はそれを短縮します。前述のように、RNAi は multiwell プレートの各ウェルに異なる RNAi クローンを表示上のワームの成長の分析で最も単に含まれています。寒天と小さなボリューム関係の高粘度のため特別な機器なし 96 ウェル プレートの制服、バブル無料充填を実現することは困難です。さらに、外部井戸乾燥寒天割れの不均一性と大きな可能性につながる内部の井戸より速く乾燥菌株、RNAi を運ぶ問題することができますも。上述したように、これはスクリーニング、液体処理機械を目詰まりのリスクのため利用できる動物の数を減らす、巣穴にワームを奨励しています。これらの理由の両方について, 24 ウェル プレート、96 ウェルのプレートよりも簡単です。これは、アッセイのスループットが減少、それ、信頼性向上、提案は、初期画面の特に。
最後に、アッセイに膿を置き換えるe. フェカリスアッセイを変更されています。(原則として、他の細菌種の置換提供しないでください不当な困難される適切な培養と照射条件が識別されます。)考慮すべき最も重要な要因は病原体、成長と発展と病原性の誘導のためのメディアの要件です。たとえば、(BHI) のような栄養豊富なメディアと膿14,26に比べて高温培養、グラム陽性、日和見病原体腸球菌が必要です。考慮これらの要因の適応によって、腸球菌を使用する分析は簡単だった。P. aeruginosaで述べたように、我々 は時間依存の殺害 (図 7) を見た。興味深いことに、死のタイミングは、寒天プレート26日に病因に関与するメカニズムが異なることを示唆するこのステップの不在にもかかわらず感染前を使用される以前に発行されたアッセイに似ていた。
図 1: 液体ベースのc. の elegans -膿感染試験方式。線虫増殖と準備に関連する手順は、左側にある、右の細菌の準備。両方に関連する手順が中心です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: c. の elegans 膿の殺害は、適切な細菌の栄養が必要です。大腸菌と膿の存在 (A) c. の elegansの死。(B) (右) と膿の存在下ではc. の elegans死とミックスに追加されます (左) 低速を殺すメディアのない (すなわち、 S 根元のみ)。S 基底は最小限のメディアと細菌の増殖に必要な栄養素が含まれていない、pyoverdine の生産を排除します。(C) 別様に準備された膿の存在下での線虫の死。p < 0.01、スチューデントtに基づいて-テストします。誤差範囲は、生物学的条件あたりあたり使用された井戸 S.E.M. 10 を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:線虫抵抗性膿はホストの免疫のパスに依存します。膿(A) または 1, 10-フェナントロリン (液体の膿への暴露を模倣化学キレート剤) の内服で選択した RNAi ノックダウンのパネル (B)。p < # 0.01、p < 0.05、スチューデントtに基づいて-テストします。誤差範囲は、生物学的条件あたりあたり使用された井戸 S.E.M. 10 を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:膿にc. の elegansの殺害は堅牢と細菌の集中によって決まります。(A B) 代表的な画像 (A) と緑膿菌のさまざまな濃度への暴露後 72 h pのc. の elegans死の定量化 (B)-学生を算出した t-テストします。(A) スケール バーは生物学的条件あたりあたり 1 mm. 16 井戸が使用されました。BF: 明るい分野, フロリダ: 蛍光。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 強い信号でアッセイのデータ集録および画像処理します。(A) 代表的なイメージのライブ (マイナス コントロール) と死者 (肯定的な制御)線虫。(B) の正と負のコントロール データ取得法、処理モード、および分析の井戸の数に基づいて統計解析。(C) 蛍光 (2 つ陽性および陰性対照の 2 つの井戸) 96 ウェル プレートの 4 つの個々 の井戸からワームを調べた。それぞれはよく 〜 100 ワームを含まれています。グラフの各ドットは、飛行時間 (これと相関するが、生きているワームの巻き線、により不完全サイズを表します) と Sytox オレンジ色のステンドがワームの測定された蛍光を示す 1 つのワームを表します。肯定的な制御のワームは、加熱によって殺された前。緊張と死んでワームの形状が変更されたのため ((A) でわかるように、死んでワームよりロッドのようなが表示され、数体の屈曲がある) 生きている相手と比較して、死んでワームがある長い TOF。p-値算出スチューデントのt-テストします。(A) スケール バーは 1 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 6: 中等度の信号とアッセイのデータ集録および画像処理します。(A) 誘導ピンク 1::GFP 記者と mCherry 構成マーカー (染色体外の配列からの遺伝子発現を正常化) に運ぶのc. の elegansの代表的なイメージ。C. の elegans DMSO (マイナス コントロール) または 1, 10-フェナントロリン (肯定的な制御) にさらされます。(B) の正と負のコントロール データ取得法、処理モード、および分析の井戸の数に基づいて統計解析。96 ウェル プレート (2 つ陽性および陰性対照の 2 つの井戸) の 4 (C) 個々 の井戸流 vermimetry を用いていた。p-値算出スチューデントのt-テストします。(A) スケール バーは 1 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 7:腸球菌による線虫の殺害は、堅牢かつ時間依存です。(A B) 代表的な画像 (A) と腸球菌への暴露後にc. の elegans死の定量化 (B)。p < 0.01、スチューデントtに基づいて-テストします。10 井戸は、生物学的条件あたりあたり使用されました。誤差範囲を表すにある S.E.M. スケール バー (A)です 1 mmこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この試金 (または他の病原体が膿や腸球菌の代わりに使用と同様の試金)、様々 な創の目的に役立ちます。また、特定病原因子、ホストの防衛の経路の解明と宿主-病原体相互作用に関わる規制機械を決定するなどの基本的な生物学的問題に対処するため便利です。
膿液殺害アッセイは、堅牢な失敗の可能性を最小限に抑えるための細心の注意の支払われる、いくつかのポイントがあります。まず、前述のように、細菌は LB で一晩成長にもかかわらず、病原性を失うしないように膿予防接種のため細菌ソース プレートは、新鮮ななりません。第二に、カルシウムとマグネシウムが膿の試金を殺すに追加されていることを確認するキーであります。それがなければ、病原性が著しく低下します。最後に、それは HT115 (RNAi に基づく試金) の飼育ワームはワーム飼育 OP50 以降大幅死んでしまうことは注目に値する (N. キリエンコ、パーソナル通信)。このため、RNAi ベースの研究に切り替える場合は、経験的に試金のための最高の時間ポイントを判断することが重要です。
膿または腸球菌でアッセイを殺害、アッセイに使用する準備ができるまで、L1 ステージからワームの開発に十分な食糧があることを確認することが重要です。でも短期的には、飢餓は、シグナリング ネットワーク27DAF 2/DAF 16 インスリン/IGF などのホスト防御経路の数をアクティブにする知られています。我々 のデータでは、DAF-16/FOXO を液体20、培養されてアクティブに既に若干、DAF-16/FOXO 広域病原体抵抗23を促進するため、更なる活性化が強く望まを示唆しています。
最後に、それは読み出しとして死亡率に依存する任意のアッセイで完全に滅菌ワームを使用する重要です。ワームは、肥沃な場合は、産卵の難しさを引き起こす液体中します。その結果、胚の一部は最終的に、死の原因、親の中で孵化します。このため、我々 は一般的にglp-4(bn2)28,これらの試金のための完全に浸透無菌の表現型を示すなどの遺伝的病変を使用します。彼らはまた細菌の成長と開発を妨げる可能性がある、萌芽期の開発を防ぐため、なおかつ産卵、5 フルオロデオキシウリジン (FUdR) など化学物質の使用を避けてください。
一般的に、我々 はそれを分析のためのいくつかの時間ポイントを計画に非常に有用発見しました。堅牢なアッセイを一般に一貫したタイミングが確率とごくわずかな変化は、2 4 時間以内アッセイの死のタイミングをシフトします。まず、最も単純な答えに便利ですのトラブルシューティングが必要な場合すなわち、新鮮なメディアの準備、最新の細菌文化を破棄し、非常にまれこれらの措置に復元しない分析機能だけ再凍結する在庫等から菌株を連勝します。
メソッドの相対的なシンプルさのためさまざまな変更を簡単に実行できます。ハイスループット RNAi の画面一様glp-4(bn2)背景からワームを変更するなど本明細書で述べるもの化学物質と有毒な化学薬品の広い範囲のホスト応答経路を識別するために役立ちます。たとえば、追加する同じ化学物質や毒素と(例えばCry5B の毒素、フェナントロリン等)RNAi プレートの各ウェルに、これらの毒素に感度を変更する経路は容易に識別できます。画面のこれらのタイプは、線虫に感染する病原体の盛装のいずれかに対して防衛ネットワークを識別するためにも使用できます。
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Disclosures
著者は、明らかに利益相反があるないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、がんの予防およびテキサスの研究所 (CPRIT) 賞 RR150044、ウェルチ財団研究助成金 C-1930 年、国立機関の健康 K22 AI110552 NVK に授与、支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
References
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