Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/58068
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biosciences, Rice University

Summary

Hier beschrijven we een protocol dat is een aanpasbaar, hele gastheer, hoge-content screening tool die kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties en worden gebruikt voor drugontdekking.

Abstract

Het aantal nieuwe drugs geïdentificeerd door traditionele, in vitro schermen is afgenomen, vermindering van het succes van deze aanpak in de zoektocht naar nieuwe wapens ter bestrijding van meerdere resistentie. Dit heeft geleid tot de conclusie dat onderzoekers niet alleen maar hoeft te vinden van nieuwe geneesmiddelen, maar ook ontwikkelen van nieuwe manieren moeten van het vinden van hen. Onder de meest veelbelovende kandidaat methoden zijn geheel-organisme, in vivo onderzoek dat gebruik high-throughput, fenotypische uitlezingen en gastheren variërend van Caenorhabditis elegans tot Danio rerio. Deze hosts hebben verschillende krachtige voordelen, met inbegrip van dramatische vermindering valse positieve hits, zoals verbindingen die giftig voor de host en/of de biounavailable zijn vallen meestal in het eerste scherm, voorafgaand aan dure follow up.

Hier laten we zien hoe onze test is gebruikt om het ondervragen van host variatie in de goed gedocumenteerde C. elegans—Pseudomonas aeruginosa vloeibare doden pathosystem. We tonen ook diverse uitbreidingen van deze techniek goed uitgewerkt. Wij zijn bijvoorbeeld kunnen uitvoeren van high-throughput genetische schermen met behulp van RNAi in 24 - of 96-wells plaat formaten naar query gastheer factoren in deze host-pathogen interactions. Met behulp van deze test, kunnen hele genoom schermen worden uitgevoerd in slechts een paar maanden, die de taak van de identificatie van de doelstellingen van de drug, mogelijk zonder de noodzaak voor een aanpak van de moeizame biochemische zuivering dramatisch kunnen vereenvoudigen.

Ook rapporteren we hier een variatie op onze methode die de gram-positieve bacterie Enterococcus faecalis voor de gram-negatieve pathogen P. aeruginosa vervangt. Veel zoals het geval voor P. aeruginosa, is doden door E. faecalis afhankelijk van de tijd. In tegenstelling tot eerdere C. elegans—E. faecalis testen, onze assay voor E. faecalis geen preinfection vereist, verbetering van haar veiligheidsprofiel en vermindering van de kans op besmetting van de vloeistof-behandelingsapparatuur. De bepaling is zeer robuust, ~ 95% sterftecijfers 96 h post infectie tonen.

Introduction

De identificatie en ontwikkeling van een effectief, breedspectrum antibiotica, inmiddels bijna een eeuw geleden, geleid tot een moment van de waterscheiding in de volksgezondheid waar er een wijdverbreide geloof dat besmettelijke ziekte zou een gesel van het verleden. Binnen een paar korte decennia begon dit optimisme te afnemen, als pathogeen nadat pathogen resistentie mechanismen die deze keer miraculeuze behandelingen beperkt ontwikkeld. Voor enige tijd leek de wapenwedloop tussen drug discovery inspanningen en de ziekteverwekkers evenwichtig. Echter, het misbruik van antimicrobiële middelen onlangs heeft geresulteerd in het ontstaan van pan-resistente stammen van Klebsiella pneumoniae, immunodeficientie baumanii, Serratia marcescensen P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa is een opportunistische, gram negatieve, meerdere host pathogenen die een ernstige bedreiging vormt voor patiënten met ernstige brandwonden, degenen die zijn immuungecompromitteerde, of cystic fibrosis. Het wordt ook in toenemende mate aangeduid als een ziekteverwekker in ernstige ziekenhuisinfecties, met name als gevolg van de voortdurende overname van antimicrobiële resistentie. Om te beginnen met het inspelen op deze dreiging, hebben we de goed gedocumenteerde C. elegans-P. aeruginosa infectie systeem5gebruikt. Onze lab heeft dit systeem voor de ontwikkeling van een vloeistof gebaseerde, high-throughput, hoge-content screening platform ter identificatie van nieuwe verbindingen die de mogelijkheid van het pathogene agens te doden de host6beperken leveraged. Deze verbindingen lijken intrigerend, tot ten minste drie algemene categorieën, met inbegrip van antimicrobiële stoffen7 en virulentie remmers8te behoren. Andere hoge-inhoud drug discovery testen in C. elegans voor Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, zijn gerapporteerd en Enterococcus faecalis, o.a.9,10,11,12,13,14,15,16. Deze types van tests hebben verschillende goed erkende voordelen, zoals het beperken van vals positieve hits die mogelijk toxisch voor zowel de host en de pathogenen, verhoogde kans op biologische beschikbaarheid ten opzichte van een chemische scherm, en het vermogen om te identificeren hits voorbij microbiële groei, zoals anti-virulents, immuun stimulerend moleculen of verbindingen die anders het kantelen van het saldo van de host-pathogen interactions ten gunste van de voormalige gewoon te beperken. Bovendien zijn de verbindingen ontdekt in deze schermen vaak effectief in zoogdieren hosts.

Het is vermeldenswaard dat ten minste twee andere testen17,18 zijn beschikbaar voor het verrichten van high-throughput schermen in C. elegans in vloeistof. Elk van deze tests is echter een wijziging waarmee de prototypische intestinale-kolonisatie assay, bekend als traag-doden, moet worden uitgevoerd in vloeibare, verhoging van de doorvoer en waardoor verbindingen gemakkelijker worden vertoond. Zorgvuldige karakterisering overtuigend heeft aangetoond dat de mechanismen van bacteriële virulentie tussen deze testen en onze vloeistof gebaseerde scherm7 verschillen. Aangezien beide soorten virulentie bij zoogdieren systemen worden waargenomen, is het belangrijk om na te gaan welke virulentie determinant meest relevant voor de de experimentator belangen vóór assay selectie.

Hier tonen we een geoptimaliseerde versie van de vloeistof gebaseerde C. elegans-P. aeruginosa assay. Ook melden wij de aanpassing van onze assay vloeistof gebaseerde methode om de gram-positieve bacteriële pathogenen Enterococcus faecalis. E. faecalis wordt met een toenemende bewapening van antimicrobiële resistentie trajecten1steeds meer als een bedreiging van ernstige nosocomiale geïdentificeerd zoals P. aeruginosa. Hoewel een vorige methode voor high-throughput screening van E. faecalis 14 bestaat, vereist het preinfection met het pathogene agens oplevert, die compliceert de procedure en verhoogt de kans op besmetting van apparatuur zoals de COPAS-FlowSort. Ons protocol elimineert de noodzaak voor pre-infectie, verbetering van de veiligheidsprofiel. Tot slot melden wij een middel waarmee ofwel van deze tests kunnen worden gecombineerd met het voeden van RNAi, waardoor de gebruiker kan zoeken voor gastheer factoren die een rol in de oprichting van spelen, of weerstand tegen infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: P. aeruginosa en E. faecalis zijn Biosafety Level 2 ziekteverwekkers, en juiste voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om toevallige besmetting te voorkomen en om te minimaliseren van verontreiniging van oppervlakken. Alle media en materialen die in contact met ziekteverwekkers worden geleverd moeten worden gesteriliseerd en/of verwijderd. Verdere richtsnoeren zijn verkrijgbaar bij de CDC publicatie bioveiligheid in microbiologische en biomedische laboratoria (BMBL), 5e editie.

1. voorbereiding en onderhoud van P. aeruginosa

  1. Streak P. aeruginosa uit een bevroren voorraad op een bord van de agar LB (lysogenie Bouillon). Incubeer 16 tot 24 h bij 37 ° C
    Opmerking: Voer P. aeruginosa experimenten binnenkant van een BSL-2 biologische veiligheidskast zodat steriliteit. Gebruiken passende veiligheidsmaatregelen om te minimaliseren van de kans van pathogene besmetting of verontreiniging.
  2. Overdracht van deze plaat tot 4 ° C. Deze plaat worden bewaard bij 4 ° C en gebruikt om te enten culturen voor maximaal een week. Na een week, ontsmetten en negeren de plaat en maken een nieuwe plaat van LB streak.
    Opmerking: P. aeruginosa virulentie vermindert na langdurige opslag.
  3. Twee dagen voor het opzetten van assay platen, beënten 3-5 mL steriele de pond-Bouillon met een één kolonie van P. aeruginosa van de plaat gemaakt in punt 1.1. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 tot 16 uur.
    Opmerking: Niet meer dan 16 h incuberen. In rijke vloeibare culturen begint P. aeruginosa PA14 lyse.
  4. Bereiden van steriele 10 cm platen met langzaam doden media (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL fosfaatbuffer (bedrag per liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) en KH2PO4 (1 M) 868 mL) en 18 g agar/L).
    Opmerking: Bereiden platen tevoren. Ze kunnen voor maximaal 3 weken worden opgeslagen in een luchtdichte verpakking bij 4 ° C.
  5. Elke 10 cm langzaam doden plaat (SK plaat) met 350 μL van P. aeruginosa uit verse overnachting LB cultuur zaad. Met behulp van een steriele bacteriële strooier, bacteriën gelijkmatig over de oppervlakte van media verspreid en laten drogen in een BSL-2 biologische veiligheidskast.
  6. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur.

2. voorbereiding van RNAi bacteriën

  1. Streak uit of de gewenste stammen pin-overdracht van RNAi-bevattende bacteriën op LB agar platen met de juiste antibiotica (carbenicillin bij 100 µg/mL) en tetracycline bij 15 µg/mL voor Ahringer en Vidal bibliotheken uit een bevroren voorraad.
    Opmerking: Wanneer u werkt met nonpathogenic bacteriën, gebruik een BSL-2 A / B biologische veiligheidskast of een BSL-1 laminar flow hood om de steriliteit van de culturen en om te minimaliseren van de kans op kruisbesmetting van de bibliotheek.
  2. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 ° C.
  3. Bewaar de platen bij 4 ° C voor maximaal twee weken.
    1. Na twee weken, het negeren van de platen en vervang ze met vers bereide platen.
  4. Test meerdere RNAi stammen parallel door het individueel het enten van een één kolonie van elke kloon in 4 mL voor carbenicillin-aangevuld LB in enig goed van een 24-well diep-well-plaat of in een steriele reageerbuis.
    Opmerking: Tetracycline heeft gemeld om de efficiëntie van RNAi. Gebruik het niet in deze media.
  5. Plaats 24-well diep goed platen in een schudden incubator geoptimaliseerd voor multiwell platen en Incubeer bij 37 ° C voor 16 h terwijl het schudden bij 950 rpm.
    Opmerking: Het is moeilijk te verkrijgen van uniforme bacteriegroei in multiwell platen met behulp van een conventionele schudden incubator. De schudden incubator moet kunnen schudden op minimaal 750 rpm in orde voor de culturen groeien goed. Bij gebrek aan een gespecialiseerde shaker is het mogelijk om te groeien van elke cultuur in een individuele buis. Culturen kunnen worden overgezet in de 24-well plaat voor centrifugeren daarna, indien gewenst.
  6. Het verzamelen van bacteriën door gedurende 5 minuten bij 2.000 x g centrifugeren.
  7. Decanteren supernatans dat door de plaat omkeren en schudden. Resuspendeer RNAi bacteriën in 100 µL van basale S (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 opgelost in 1 L ultrazuiver water en gesteriliseerd met autoclaaf).
  8. Pipetteer geresuspendeerde bacteriën in een passend aantal putjes van een multiwell plaat NGM (Nematode groei Media, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL fosfaatbuffer (bedrag per liter: 132 milliliters K2HPO4 (1 M) en 868 mL KH2PO4 (1 M)), en de agar 18 g per liter water) aangevuld met IPTG (1 mM eindconcentratie) en carbenicillin (eindconcentratie is 100 μg/mL).
    1. Gebruik van NGM media 3,5 mL per putje van 6-well plaat, 1 mL per putje van de plaat van een 24-well of 150 µL per putje van 96-wells-plaat.
    2. Gebruik 100 μl per putje van bacteriën voor 6-well plaat; 50 μl per putje voor 24-well; of 20 μL per putje van 96-wells-plaat. Laten drogen.
      Opmerking: Drogen normaal wordt uitgevoerd in een steriele stroom kap ter bevordering van snelle, uniforme drogen. Uniforme drogen is heel belangrijk. Vermijd te veel drogen, als scheuren in de agar bevorderen gravende van wormen. Dit leidt tot het verliezen en de potentiële verstoppingen van vloeistof-handlingsystemen worm.
  9. De bereide platen onmiddellijk of bewaar ze bij 4 ° C voor maximaal twee weken voor later gebruik.
    Opmerking: Als u wilt voorkomen dat platen worden tegen het uitdrogen, zij kunnen worden verzegeld met kunststof paraffine film of geplaatst in een strak verzegelde container met vochtig keukenpapier.

3. onderhoud en voorbereiding van C. elegans

Opmerking: Voordat de experimenten, genereren een gesynchroniseerde bevolking van gravid, volwassen hermafrodiete wormen als volgt.

  1. Wassen gravid volwassenen (dat wil zeggen, met meerdere embryo's zichtbaar binnen de gonaden) van 4-6 10-cm NGM platen in een conische tube van 15 mL door toevoeging van 4 mL S basale plaat, wervelende zachtjes en vervolgens gieten in een conische tube van 15 mL.
  2. Pellet wormen via centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 30 seconden.
  3. Gecombineerd supernatant, het verzorgen niet te verstoren de worm-pellet.
  4. Voeg 3,5 mL worm bleekwater oplossing (eindconcentratie 0,5 M NaOH, 1% natriumhypochloriet, in steriel water) naar de worm pellet, en meng door het omkeren van 1 minuut.
  5. Kort vortex en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 30 seconden.
  6. Gecombineerd of decanteren van de bovendrijvende substantie, niet te verstoren de worm pellet verzorgen.
  7. Voeg 3,5 mL verse worm bleekwater oplossing naar de worm pellet.
  8. Krachtig mengen wormen in bleekwater oplossing. Periodiek (ongeveer elke tien seconden) visueel inspecteren wormen onder een Microscoop ontleden. Kijk voor worm nagelriemen te breken, het vrijgeven van eieren. Zodra de meeste van de volwassen wormen zijn opgeloste (~ 95%), verdund bleekmiddel tot 15 mL met basale S om te stoppen met spijsvertering.
    Opmerking: Eierschalen meer resistent zijn tegen dan volwassen weefsel bleekmiddel, maar ze kunnen worden ontbonden tijdens langdurige blootstelling. Ei ontbinding, niet bloot eieren om worm bleekwater oplossing voor langer dan 7 minuten. Als eierschalen overdreven zijn beschadigd, worden de embryo's zullen sterven.
  9. Pellet embryo's bij 1.000 x g gedurende 30 seconden en gecombineerd of decanteren in de bovendrijvende vloeistof zonder het verwijderen van de pellet van embryo's.
  10. Resuspendeer wormen in S basale tot een eindvolume van 15 mL tot Verdun resterende bleekwater oplossing.
  11. De stappen wassen (3.9-3.10) drie keer voor een totaal van 4 opeenvolgende wast.
  12. Na de vierde wash, gecombineerd supernatant en optellen tot 5 of 6 mL steriele S basale in de conische tube van 15 mL. Het doel is om embryo's tot een concentratie van ~ 50 wormen per µL resuspendeer.
    Opmerking: Het bedrag van de basale S hangt af van de grootte van de ei-pellet; Hoe groter de pellet, de meer basale S is noodzakelijk.
  13. Incubeer de conische buis 's nachts op een tafelblad rotator bij kamertemperatuur of 48 h bij 15 ° C. Larven zal uitkomen, maar larvale ontwikkeling zal in de L1-stadium (L1 diapauze) toe te schrijven aan de voedende ontbering arresteren.
  14. Onderzoeken van de embryo's onder een ontleden Microscoop om te verifiëren dat de meeste van hen hebben uitgekomen en gearresteerd in de L1-stadium van ontwikkeling.
  15. Bepaal de worm telling door 20 µL van worm prep en verdunnen het met 80 µL van basale S. Pipetteer 10 µL van verdunde worm oplossing direct op een lege NGM plaat. Herhaal 2 vaker.
    1. Tellen van de larven in elke vlek en bepalen van het gemiddelde aantal. Verdeel dit gemiddelde door 2 te verkrijgen van een geschatte aantal wormen per µL in de worm prep. Worm preps kunnen vervolgens worden gebruikt voor voortplanting platen of voor experimenten.
      Opmerking: Na 4-5 dagen, uitgehongerd larven zal beginnen te sterven; Gooi de prep op dit punt.
  16. Voor teeltmateriaal van de stam, Pipetteer een passend aantal L1 wormen (5.000-6.000) op 3-4 10-cm NGM platen met gespot geconcentreerd OP50 E. coli – "superfood" (E. coli OP50 gespot op 25 X concentratie (dat wil zeggen, 1 L van nachtelijke OP50 cultuur geteeld in LB opbrengsten 40 mL 25 X OP50 superfood); 2 mL deze geconcentreerde bacteriële suspensie zijn bevlekt op elke 10 cm NGM plaat).
  17. Platen om voor te bereiden experimenten, voert u een van de volgende handelingen (voor "Basisprotocol" gebruik 3.17.1 setup, voor de "RNAi scherm instellen" gebruik stappen 3.17.2 - 3.17.4 voorkomend):
    1. Pipetteer ~ 5.000 wormen/10 cm plaat met RNAi of OP50 superfood agarvoedingsbodem.
    2. Pipetteer ~ 500 wormen/putje in een 6-well plaat met RNAi agarvoedingsbodem.
    3. Pipetteer ~ 300 wormen/putje in een 24-well-plate bezaaid met RNAi.
    4. Pipetteer ~ 100 wormen/putje in een 96-wells-plaat met RNAi agarvoedingsbodem.
      Opmerking: Voor instructies over hoe RNAi was uitgezaaid Raadpleeg stappen 2,7-2,9 in voorbereiding van RNAi bacteriën.
  18. Als een vruchtbare stam van wormen wordt gebruikt, incubeer wormen bij 25 ° C gedurende ~ 44-48 h. Gebruik deze wormen zo spoedig mogelijk nadat de bevolking de juiste leeftijd heeft bereikt. Dit minimaliseert het effect van ei broedeieren binnen de wormen tijdens de test.
  19. Als de spanning wordt gebruikt is temperatuur-steriele (b.v., fer-15(b26); FEM-1(hc17) of glp-4(bn2)), incubeer wormen bij 15 ° C gedurende ~ 16 h en vervolgens overbrengen naar de 25 ° C voor 44 h ontwikkeling en embryogenese voorkomen.

4. de vloeistof doden Assay Setup (basisprotocol)

Opmerking: Dit is een protocol voor een bacteriële stam en een bron van wormen.

  1. Met behulp van een cel schraper, verwijder de P. aeruginosa uit een plaat van SK en resuspendeer ~ 5 mL S basale. Opschalen indien nodig. Meet de extinctie van de bacteriële suspensie met een spectrofotometer (OD600)
  2. Bereiden 24 mL verdunde voorraad van P. aeruginosa in basale S bij OD600 ≈ 0.09 (eindconcentratie is 3 X). 4.6.2 voor de uiteindelijke inhoud per putje zien, en schaal volume van bacteriële verdunning dienovereenkomstig.
  3. Voeg 21 mL vloeibare langzaam doden media (3 g NaCl, 3.5 g pepton/l aangevuld met CaCl2 en MgSO4 tot en met een eindconcentratie van 1 mM). Met behulp van een meerkanaalspipet, breng 45 µL van bacteriën en media aan elk putje van de plaat van een 384-well.
  4. Wassen van wormen uit hun bron (dat wil zeggen, stap 3.17.1) in een conische buis van 50 mL en toestaan van wormen te regelen onder zwaartekracht. Gecombineerd supernatant tot 5 mL. Resuspendeer in een totaal van 50 mL S basale.
  5. Herhaal stap 4.4 tweemaal.
  6. Met behulp van een worm sorter, sorteren ongeveer 22 wormen in elk putje van de plaat 384-well.
    Opmerking: De setup drops elke worm van ~1.1 µL van vloeistof. 22 wormen zal oplopen tot 25 µL, totale assay volume om 70 µL per putje.
    1. De uiteindelijke samenstelling van elk putje bestaat uit 70 µL. 45 µL van dit volume wordt toegevoegd als bacteriële medium (0.03 OD600 bacteriën in 24 µL S basale en 21 µL SK aangevuld met CaCl2 en MgSO4). De andere 25 µL is toegevoegd met de 22 wormen.
    2. Als de sorter gebruikt hier (Zie Tabel of Materials) is niet beschikbaar, wormen kunnen worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van 1 worm/µL in basale S en afgepipetteerde 25 µL per putje met behulp van een meerkanaalspipet. Resultaten kunnen echter toegenomen variabiliteit vertonen. Anderzijds is het mogelijk gebruik een peristaltische vloeistof dispenser, zoals beschreven door Leung en collega's19.
  7. Nadat de wormen zijn gesorteerd in de 384-well plaat, afdichting van de plaat met een gas-permeabele film en Incubeer de platen bij 25 ° C gedurende 24-48 uur.
  8. Gebruik op het gewenste tijdstip, een microplate wasmachine te wassen de 384-well plaat met S basale totaal 5 keer.
    1. Na de tweede wash, gecombineerd allermeest naar de media, platen met behulp van een microplate vortexer gedurende ten minste 30 seconden los van eventuele puin vanaf de onderkant van de putten te verlaten ~ 20 µL. krachtig schudden).
  9. Nadat de laatste wash, aspirate supernatant tot 20 µL. toevoegen 50 µL van 0.98 µM nucleïnezuur vlek (Zie Tabel van materialen) / goed van de plaat 384-well voor een eindconcentratie van 0,7 µM.
  10. Incubeer bij kamertemperatuur voor 12-16 h. Deze kleurstof zal alleen dode wormen vlekken. Na de gewenste incubatieperiode vlek wassen platen met de microplate-wasmachine te verwijderen van de eventuele overschrijding (minimaal 3 wasbeurten).
  11. Voor data-acquisitie, kunt een spectrofotometer of een geautomatiseerde microscope beeld doorvallend licht zowel fluorescentie (531 nm excitatie en 593 emissie).
    1. Gebruik een lage vergroting doelstelling om een afbeelding van de hele put worden vastgelegd.
    2. Anderzijds gebruiken stroom vermimetry. Deze techniek maakt gebruik van een groot object stroom cytometer als een worm fluorimeter, de grootte en de fluorescentie van hele organisme (dat wil zeggen, C. elegans) op een wijze die sterk gelijkt op cytometry van de stroom te meten.
  12. Gebruik van de software van de analyse van de geautomatiseerde beeld (zoals CellProfiler, een gratis image analyse studio op basis van MatLab http://cellprofiler.org/) voor het berekenen van de TL en totale worm gebieden per putje op onpartijdige wijze.
    Opmerking: Het quotiënt van deze getallen geeft de Fractie dood voor elk putje. Als men goed had 7 gekleurd wormen uit van 20 totaal, dan de dood van de Fractie bestaat uit 0.35 of 35%.
    1. Voorafgaand aan het eerste gebruik, moet de geautomatiseerde beeldverwerking pijpleiding worden gevalideerd door handmatige scoren. Dit wordt gedaan door het vergelijken van de resultaten van de geautomatiseerde pijpleiding aan scores verkregen door visueel inspecteren van beelden en breuken van dode wormen opnemen voor elk van hen. Het validatieproces zorgt ervoor dat de parameters voor de voorbewerking met imaging kloppen en de gegevens correct vertegenwoordigen.

5. aanpassing voor meerdere Screening C. elegans stammen of Knockdowns (RNAi scherm Setup)

Opmerking: Dit is een scherm van de RNAi beschreven voor de installatie van een 24-well plaat.

  1. Voeg 1 mL S basale per putje van de plaat van een 24-well (zie stap 3.17.3). Zachtjes doorroeren wormen door schudden van de plaat, dan wormen naar een leeg, steriel 24 diep-well-plate. Het toestaan van wormen te regelen zwaartekracht (~ 5 minuten).
  2. Gecombineerd supernatant, verlaten ongeveer 1 mL. Voeg 7 mL S basale aan elk putje.
  3. Herhaal stap 5.1-5.2 een minimum van 2 vaker. Na de laatste wasbeurt, gecombineerd supernatant, ongeveer 400 µL verlaten.
  4. Met behulp van de functie van de Resampler van de worm sorter, sorteren 22 wormen uit de 24-well plaat worm suspensie in elk putje van de plaat van een 384-well (elk putje van een 24-well plaat opbrengsten 8-12 putjes van de plaat van een 384-well).
    1. Om te voorkomen dat de hongerdood, Pipetteer bacteriën in 384-Wells-platen (een spanning die dient uitsluitend als voedsel, zoals OP50, of een pathogene stam) vóór sortering.
      Opmerking: Pathogenen kunnen worden toegevoegd door volgende stappen 2.3-2.5 of 6.4-6.5 en voedselbron bacteriën kunnen worden verdund en toegevoegd door dezelfde regeling als voor P. aeruginosate volgen.
  5. Nadat de wormen zijn gesorteerd in de 384-well plaat, kleine moleculen of andere experiment-specifieke materialen toevoegen.

6. aanpassing voor E. faecalis

Opmerking: Alleen de verschillen ten opzichte van P. aeruginosa assay worden beschreven.

  1. Voorbereiden van een nieuwe bron van E. faecalis door bacteriën uit een bevroren voorraad op een bord van de agar BHI (hersenen hart infusie) strepen en incubatie gedurende 16 tot 24 uur bij 37 ° C.
    Opmerking: Voer E. faecalis experimenten binnenkant van een BSL-2 biologische veiligheidskast zodat steriliteit. Gebruiken passende veiligheidsmaatregelen om te minimaliseren van de kans van pathogene besmetting of verontreiniging.
  2. Platen kunnen bij 4 ° C gedurende maximaal één week worden opgeslagen. Na deze periode wordt vervangen door een nieuwe plaat.
  3. De nacht voordat u sorteert wormen, beënten 3-5 mL steriele BHI met een één kolonie van E. faecalis. Incubeer 12-16 uur bij 37 ° C met agitatie.
  4. Breng bacteriën in de putjes wat P. aeruginosa (3 x bacteriën in basale S, OD600≈0.09).
    Opmerking: Voor E. faecalis, de uiteindelijke goed samenstelling is: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, met het resterende volume bestaat uit S basale. Vergeet niet dat 25 µL van S basale zal worden geleverd met wormen.
    Opmerking: E. faecalis produceert dikke biofilms die absorberen de fluorescerende vlek veroorzaakt onscherpe beelden. Uitgebreide wassen kan onvoldoende zijn om deze biofilm te verwijderen. In dit geval kunnen de wormen worden overgedragen aan een lege plaat met behulp van een meerkanaalspipet. Om te vergemakkelijken de overdracht, kan tween-20 worden toegevoegd aan basale S bij een eindconcentratie van 0,1% (v/v) Tween-20 in basale S. Dit helpt bij het verwijderen van de wormen uit de biofilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Belangrijke parameters voor assay prestaties

Een goed begrip van de biologie die ten grondslag liggen aan deze bepaling is noodzakelijk voor het oplossen van problemen en het optimaliseren van de bepaling. Te dien einde verwijzen we eerst naar verscheidene belangrijke papers ophelderen van de mechanismen van de pathogenese van P. aeruginosa-gemedieerde doden in vloeibare7,20. Voorwaarde dat de bovenstaande stappen worden gevolgd (Zie Figuur 1 voor een schematische voorstelling van het protocol assay) zal een tijd-afhankelijke doden van C. elegans alleen in aanwezigheid van het pathogene agens (figuur 2A) worden waargenomen. In tegenstelling, in de afwezigheid van belangrijke voedingssupplementen (bijvoorbeeld als de pepton is weggelaten uit de media, en alleen S basale is toegevoegd), zal weinig tot geen moord worden waargenomen (figuur 2B). Interessant is dat is de twee stappen incubatie van P. aeruginosa (gedurende 24 uur bij 37 ° C, dan 24 h bij 25 ° C) die is van cruciaal belang voor conventionele langzaam doden testen, en was oorspronkelijk uitgevoerd in vloeibare doden21, overbodig in deze test ( Figuur 2C). Hoewel het mogelijk is om toe te voegen P. aeruginosa rechtstreeks uit overnachting LB cultuur, doen aanzienlijk verandert letaliteit kinetiek en wordt niet aanbevolen.

Begrip assay biologie maakt ook een vereenvoudiging van de bepaling, als passend en wenselijk. Bijvoorbeeld, de belangrijkste bestuurder van host doden in deze test is de siderofoor pyoverdine, en host toxiciteit veroorzaakt door pyoverdine is afhankelijk van haar vermogen om te binden ijzer7. Als zodanig, kan de bepaling worden vereenvoudigd door te vervangen door pyoverdine-rijke filtraat, gezuiverde pyoverdine of zelfs een aantal synthetische ijzer-chelaat chemische stoffen (bijvoorbeeld 1,10-phenanthroline) voor levende bacteriën, als de transcriptionele reactie van C. elegans deze behandelingen is zeer vergelijkbaar (Figuur 3)22.

Verscheidene verschillende lijnen van bewijsmateriaal spreken tot de robuustheid van de experimentele opstelling. Ten eerste, de setup verdraagt een breed scala aan eerste bacteriële concentraties. Concentraties zo laag als OD600 = 0.0025 (ongeveer 10-fold lager dan aanbevolen) nog steeds vertonen en concentratie-tijdafhankelijke doden, hoewel de timing (figuur 4A verschuiven). Ten tweede, de reproduceerbaarheid van de test is zodanig dat zo weinig als 4 putten is vaak voldoende om het verkrijgen van statistisch significante gegevens (figuur 4B).

Er zijn verschillende wijzigingen niet aangeraden. Bijvoorbeeld met behulp van oorspronkelijke bacteriën entmateriaal met veel hogere concentraties dan die welke zijn vermeld in het protocol; doen dus resulteert in dikke, biofilm-achtig materiaal dat is moeilijk of onmogelijk effectief weg te wassen, die scoren letaliteit compliceert. Bovendien, hoge-concentratie bacteriële entmateriaal ook kunnen concurreren voor zuurstof en leiden tot niet-specifieke host doden7.

Een andere belangrijke opmerking is het beperken van de periode tussen het stoppen van de test en imaging de dode wormen. Merk op dat dit tijdsbestek kleuring omvatten moet, dus het is van cruciaal belang voor het efficiënt. Na de dood begint het biologisch materiaal binnen wormen te extruderen en/of worden verteerd door bacteriën. Binnen een kwestie van 24-32 h blijft alleen de epidermis. De schubbenlaag vlekken zeer slecht en is zeer licht, waardoor het gemakkelijk is om te verliezen tijdens wasbeurten. Het is belangrijk op te merken dat de stammen of voorwaarden van de stam/RNAi met zeer verschillende kinetiek van doden kunnen worden bemoeilijkt door dit verschijnsel (dat wil zeggen, sommige wormen nog steeds levend worden kunnen terwijl anderen al hebben verloren hun inhoud en onmogelijk zijn te beeld). Figuur 4A toont dit fenomeen, als wormen aan de linker kant van de plaat, geënt met zeer lage initiële bacteriële concentraties, zijn nog steeds grotendeels leven terwijl wormen aan de rechterkant van de plaat, die werden blootgesteld aan veel hogere concentraties van bacteriën, heb weggewassen.

Een zeer belangrijke determinant van assay succes is de methode gebruikt voor het verzamelen en analyseren van de gegevens. We hebben in ons lab, ten minste drie methoden gebruikt voor het verzamelen van gegevens uit deze onderzoeken: spectrofotometrie, geautomatiseerde microscopie en stroom vermimetry (dat wil zeggen, de aanpassing van stroom cytometry technieken om C. elegans; letterlijk, de meting van wormen in een vloeiende oplossing). De eerste van deze methoden gebruikt een spectophotometer om te lezen van de fluorescentie van de kleurstof of het stempel verslaggever van de wormen in kwestie. Deze methode heeft het voordeel van het gebruik van een tamelijk alomtegenwoordige stuk van apparatuur (een standaard spectrofotometer met een microplate-reader) en is de snelste methode om gegevens te vergaren. Het mist echter de informatieve inhoud beschikbaar via geautomatiseerde microscopie en de statistische macht van stroom vermimetry.

Geautomatiseerde microscopie is een andere haalbare optie. Een aantal microplate imaging systemen momenteel op de markt, variërend in prijzen die betaalbaar is voor een enkele Detective (bijvoorbeeld een Cytation5 van de Bio-Tek) om groter, duurder en hogere kwaliteit machines die meer gewoonlijk worden aangetroffen in de kern voorzieningen (bijvoorbeeld een moleculaire apparaten ImageXpress Microscoop). In de praktijk zijn de meeste van deze oplossingen vatbaar voor het scoren van de meeste schermen en testen. Meest geautomatiseerde imaging platformen kunnen ook worden gekoppeld aan downstream software voor beeldverwerking (bijvoorbeeld MetaMorph, ImageJ, Gene5 of cel Profiler) ter bevordering van het rendement van informatie. Voorbeelden van het nut van de verwerking zijn weergegeven in Figuur 5 en Figuur 6. Wanneer de signal-to-noise verhouding hoog is (zoals in afbeelding 5), analyse is eenvoudig en onderscheid tussen positieve en negatieve voorwaarden is triviaal. In deze gevallen kunnen zelfs zwak hits gemakkelijk worden geïdentificeerd. Vele tests, hebben echter een zwakkere signal-to-noise verhouding. Bijvoorbeeld, verhoogt behandeling van roze-1::GFP22 wormen (met het expressie van de constitutieve mCherry in hun pharynges) met 1,10-phenathroline het niveau van roze-1::GFP. Voor data-analyse, is de afleidbare GFP-verslaggever genormaliseerd naar het constituerende mCherry signaal (Figuur 6). In dit geval de verslaggever heeft expressie van de zwakkere en/of niet geactiveerd in de meerderheid van de wormen. Tenuitvoerlegging van extra beeldverwerking hulpmiddelen, zoals cel Profiler, die kunnen verminderen achtergrond en signaal versterken kan dus voordelig.

Ten slotte, als een COPAS-FlowPilot beschikbaar is, kan het worden gebruikt om gegevens via stroom vermimetry te vergaren. Veel zoals de meer vertrouwde concept van cytometry van de stroom, kan dit instrument worden gebruikt voor het meten van de fluorescentie van C. elegans in ten minste twee of drie kanalen tegelijk. Deze methode is zeer vatbaar voor de overname van gegevens met hoge statistische significantie, maar de doorvoer is zeer minder in vergelijking met geautomatiseerde microscopie. Het belangrijkste voordeel van stroom vermimetry is in de mogelijkheid om het analyseren van hele worm populaties als één groep voor een repliceren, in plaats van hen te splitsen in meerdere wells en analyseren van het gemiddelde van de putten. Analyseren van grote groepen op deze manier drastisch verbetert de statistisch onderscheidingsvermogen en laat de opsporing van zelfs kleine effecten.

Wijzigingen van de vloeibare doden Assay

Recente ontwikkelingen van de bepaling hebben zijn nut uitgebreid door activering van fluorescerende verslaggevers (Figuur 6), met behulp van de middellange - tot high-throughput RNAi technieken (Figuur 3), en zelfs de vervanging van de oorspronkelijke keuring pathogeen.

De meest voor de hand liggende reden om te gebruiken van RNAi ingesteld is om te testen voor host defense trajecten tegen P. aeruginosa (of andere ziekteverwekkers). Voorbeelden van RNAi knockdown van genen die relevant is voor de overleving in de test worden weergegeven in Figuur 3. In overeenstemming met eerdere opmerkingen20,23,24,25, daf-2(RNAi) verbeterd C. elegans overleven tijdens blootstelling aan P. aeruginosa, terwijl daf-16) RNAi), zip-2(RNAi) en cebp-1(RNAi) het verkort. Zoals opgemerkt, is RNAi meest gewoon opgenomen in de bepaling groeiende wormen op multiwell platen waar elk goed een verschillende RNAi kloon bevat. Vanwege de hoge viscositeit van de agar en kleine volumes betrokken is het moeilijk te bereiken van uniforme, bubble-free vullen van 96-wells-platen zonder gespecialiseerde apparatuur. Daarnaast drogen de bacteriestammen uitvoering de RNAi, kan dit ook worden voor een probleem, zoals de buitenste wells sneller dan innerlijke wells drogen, wat leidt tot niet-uniformiteit en aanzienlijke potentieel voor agar kraken. Zoals hierboven vermeld, bevordert dit het wormen aan ingraven, vermindering van het aantal dieren beschikbaar voor screening en risico's verstopping vloeistof aangestuurde machines. Voor beide van deze redenen zijn 24-Wells-platen makkelijker te werken dan 96-wells-platen. Hoewel hierdoor assay doorvoer, het verbetert de betrouwbaarheid, en wordt voorgesteld, met name voor eerste schermen.

De bepaling heeft tot slot de bepaling ter vervanging van P. aeruginosa met E. faecalisgewijzigd. (In principe, substitutie met andere bacteriesoorten niet dient onnodige problemen, mits passende kweken en blootstellingsomstandigheden geïdentificeerd zijn.) De belangrijkste factor die meespeelt is de eisen van de media van het pathogene agens oplevert, zowel voor de groei en ontwikkeling en voor de inductie van virulentie. Bijvoorbeeld, vereist de Gram positieve, opportunistische pathogenen E. faecalis voedselrijke media (zoals BHI) en incubatie bij hogere temperaturen in vergelijking met P. aeruginosa14,26. Door deze factoren rekening houdend met, aanpassing van de de test gebruik van E. faecalis was eenvoudig. Zoals bekend door P. aeruginosa, zagen we tijdafhankelijke doden (Figuur 7). Interessant is dat was de timing van de dood vergelijkbaar met de eerder gepubliceerde testen waarmee pre infectie op agar platen26, ondanks het ontbreken van deze stap, die suggereert dat de mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese variëren.

Figure 1
Figuur 1: schema voor vloeistof gebaseerde C. elegans - P. aeruginosa infectie assay. Stappen waarbij nematode propagatie en voorbereiding zijn aan linkerzijde, bacteriële voorbereiding aan de rechterkant. Stappen waarbij beide zijn gecentreerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Moord op het C. elegans door P. aeruginosa is specifiek en juiste bacteriële voeding vereist. (A) C. elegans dood in aanwezigheid van E. coli en P. aeruginosa. (B) C. elegans dood in aanwezigheid van P. aeruginosa met (rechts) en zonder (links) langzaam doden media aan de mix toegevoegd (dat wil zeggen, S basale alleen). Basale S is een minimale media en bevat de voedingsstoffen die nodig zijn voor de groei van bacteriën niet en verzet zich tegen de productie van pyoverdine. (C) C. elegans dood in aanwezigheid van anders bereid P. aeruginosa. p < 0,01, op basis van de Student t-test. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. 10 wells per biologische repliceren per voorwaarde werden gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: C. elegans weerstand tegen P. aeruginosa hangt host immuun trajecten. Een panel van geselecteerde RNAi knockdowns werd behandeld met P. aeruginosa (A) of 1,10-phenanthroline (een chemische complexvormer dat blootstelling aan P. aeruginosa in vloeistof nabootst) (B). p < 0,01, #p < 0,05, op basis van de Student t-test. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. 10 wells per biologische repliceren per voorwaarde werden gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: C. elegans doden door P. aeruginosa is robuust en hangt af van bacteriële concentratie. (A-B) representatieve beelden (A) en (B) kwantificering van C. elegans dood na blootstelling aan uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van P. aeruginosa voor 72 h. p-waarden werden berekend op basis van Student t -test. Schaal bar in (A) is 1 mm. 16 wells per biologische repliceren per voorwaarde werden gebruikt. BF: Helder veld, FL: fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: gegevensverwerking voor verwerving en afbeelding van een bepaling met een sterk signaal. (A) representatieve beelden van levende (negatieve controle) en doden (positieve controle) C. elegans. (B) statistische analyse van negatieve en positieve controles op basis van de methode voor het verkrijgen van gegevens, verwerkingsmodus en aantal wells geanalyseerd. (C) fluorescentie werd geanalyseerd voor wormen uit vier afzonderlijke wells van een 96-wells-plaat (twee positieve en twee negatieve controle putten). Elk bevatte goed ~ 100 wormen. Elke stip op de grafiek vertegenwoordigt een enkele worm, tonen de time-of-flight (die correleert met, maar ten dele te wijten aan de coiling van levende wormen, grootte vertegenwoordigt) en de gemeten fluorescentie voor wormen die zijn gekleurd met Sytox Orange. Positieve controle wormen werden vooraf gedood door hitte blootstelling. Als gevolg van veranderingen in spanning en de vorm van dode wormen (zoals kan worden gezien in(), dode wormen lijken meer staaf-achtige en paar lichaam knikken hebben) in vergelijking met hun tegenhangers van de levende, dode wormen hebben een langere TOF. p-waarden werden berekend op basis van de Student t-test. Schaal bar in()is 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Data acquisitie en beeld verwerking van een bepaling met een matige signaal. (A) representatieve beelden van C. elegans uitvoering een afleidbare roze-1::GFP-verslaggever en een constitutief marker van mCherry (om te normaliseren expressie van genen uit de extrachromosomal array). C. elegans blootgesteld aan DMSO (negatieve controle) of 1,10-phenanthroline (positieve controle). (B) statistische analyse van negatieve en positieve controles op basis van de methode voor het verkrijgen van gegevens, verwerkingsmodus en aantal wells geanalyseerd. (C) vier afzonderlijke wells van een 96-wells-plaat (twee positieve en twee negatieve controle putten) werden geanalyseerd met behulp van stroom vermimetry. p-waarden werden berekend op basis van de Student t-test. Schaal bar in()is 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: C. elegans doden door E. faecalis is afhankelijk van robuuste en tijd. (A-B) representatieve beelden (A) en (B) kwantificering van C. elegans dood na blootstelling aan E. faecalis. p < 0,01, op basis van de Student t-test. 10 putten dienden per biologische repliceren per voorwaarde. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. schaal bar in (A) is 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze bepaling (of soortgelijke testen waar andere ziekteverwekkers worden vervangen door P. aeruginosa of E. faecalis) is handig voor allerlei doeleinden, met inbegrip van Geneesmiddelenontwikkeling. Het is ook nuttig voor het aanpakken van fundamentele biologische kwesties, zoals de identificatie van virulentiefactoren, het ontrafelen van host defense trajecten, en het bepalen van de regelgevende machine die betrokken zijn bij de host-pathogen interactions.

Hoewel de bepaling P. aeruginosa vloeibare doden robuust is, zijn er verschillende punten waar aandacht moet worden besteed aan het minimaliseren van de kans op mislukking. Ten eerste, zoals opgemerkt, moet de bacteriële bron plaat voor P. aeruginosa inentingen blijven vers, opdat de bacteriën virulentie, ondanks de groei van de overnachting in LB verliezen. Het is ten tweede sleutel om ervoor te zorgen dat calcium en magnesium worden toegevoegd aan P. aeruginosa doden testen. Zonder het, zullen virulentie aanzienlijk worden aangetast. Tot slot, het is vermeldenswaard dat wormen gefokt op HT115 (voor RNAi gebaseerde testen) aanzienlijk later dan wormen op OP50 gefokt zullen sterven (N. Kiev, persoonlijke mededeling). Om deze reden, als overschakelen naar RNAi gebaseerde studies, is het belangrijk om het beste tijdstip voor de assay empirisch.

Voor het doden van testen met P. aeruginosa of E. faecalis, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er voldoende voedsel voor de ontwikkeling van de wormen van het L1-podium totdat ze klaar om te worden gebruikt in de test. Honger, zelfs op de korte termijn, is bekend dat een aantal host defense pathways, zoals de DAF-2/DAF-16 insuline/IGF netwerk27signalering activeren. Onze gegevens suggereren dat de DAF-16/FOXO wordt al enigszins geactiveerd door wordt gekweekt in vloeibare20, en verdere activering ten zeerste ongewenst, is omdat DAF-16/FOXO23weerstand breedspectrum pathogeen bevordert.

Tot slot is het cruciaal om te gebruiken volledig steriel wormen in elke bepaling die afhankelijk van sterfte als een uitlezing is. Als wormen vruchtbare zijn, wordt in vloeistof veroorzaakt problemen in het leggen van eieren. Dientengevolge, uitkomen sommige van de embryo's binnen de ouder, waardoor uiteindelijk de dood. Om deze reden gebruiken wij in het algemeen een genetische laesie, zoals glp-4(bn2)28, dat een volledig penetrant steriele fenotype voor deze tests toont. Het gebruik van chemische stoffen die voorkomen dat embryonale ontwikkeling, maar nog steeds toestaan leggen van eieren, zoals 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), moet worden vermeden als zij ook met bacteriële groei en ontwikkeling interfereren kunnen.

In het algemeen, hebben we vond het heel nuttig zijn voor het plannen van verschillende tijdstippen voor analyse. Hoewel de bepaling robuust is en de timing in het algemeen strookt, kunnen stochastische en onzichtbare veranderingen verschuiven de timing van de dood in de bepaling binnen 2-4 uur. Wanneer noodzakelijk is het oplossen van problemen, is het vaak nuttig om eerst de eenvoudigste antwoorden; dat wil zeggen, bereiden van verse media, negeren van de meest recente bacteriele en opnieuw strijk bacteriestammen van bevroren voorraden, etc. alleen zeer zelden deze maatregelen niet zet de bepaling op functionaliteit.

Als gevolg van de relatieve eenvoud van de methode, kan een breed scala aan wijzigingen gemakkelijk worden uitgevoerd. Veranderen de wormen van de achtergrond van een uniforme glp-4(bn2) voor high-throughput RNAi schermen, zoals die beschrijven we hierin, is nuttig voor de identificatie van de host reactie trajecten voor een breed scala van xenobiotica en giftige chemicaliën. Bijvoorbeeld, door toe te voegen dezelfde chemische of toxine in elk putje van RNAi platen (b.v., Cry5B toxine, phenanthroline, enz.), kunnen trajecten die veranderen van de gevoeligheid voor deze toxines gemakkelijk worden geïdentificeerd. Dit soort schermen kunnen ook worden gebruikt ter identificatie van netwerken van de verdediging tegen om het even welk van het arsenaal van ziekteverwekkers die C. elegans infecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij hebben geen conflicten van interesse bekend te maken.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de preventie van kanker en de Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Stichting Onderzoek Grant C-1930, en door de nationale instituten van gezondheid K22 AI110552 toegekend aan NVK. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).

Tags

Immunologie en infecties probleem 137 Caenorhabditis elegans high-throughput screening hoge-content screening Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis gastheer-pathogeen interacties
Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde <em>C. elegans</em> Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V.,… More

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter