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Immunology and Infection

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/58068
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biosciences, Rice University

Summary

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Abstract

El número de medicamentos nuevos identificados por tradicionales, pantallas en vitro ha disminuido, reducir el éxito de este enfoque en la búsqueda de nuevas armas combatir la resistencia a múltiples drogas. Esto ha llevado a la conclusión de que los investigadores no sólo la necesidad de encontrar nuevos medicamentos, pero también es necesario desarrollar nuevas formas de encontrarlos. Entre los candidatos más prometedores métodos todo organismo, en vivo ensayos lecturas de alto rendimiento, fenotípica de uso y acoge esa gama de elegans de Caenorhabditis a Danio rerio. Estos hosts tienen varias ventajas de gran alcance, incluyendo reducciones dramáticas en hits positivos falsos, como compuestos que son tóxicos para el huésped o biounavailable se colocan típicamente en la pantalla inicial, antes de seguir costoso para arriba.

Aquí mostramos cómo nuestro análisis se ha utilizado para interrogar variación de host en el bien documentado C. elegans—Pseudomonas aeruginosa matanza líquido patosistema. También demostramos varias extensiones de esta técnica bien elaborada. Por ejemplo, somos capaces de llevar a cabo pantallas genéticas de alto rendimiento utilizando RNAi en 24 o 96 pocillos formatos de placa factores de host consulta en esta interacción huésped-patógeno. Usando este análisis, pantallas de todo el genoma se pueden completar en sólo unos meses, que dramáticamente pueden simplificar la tarea de identificar dianas farmacológicas, potencialmente sin la necesidad de enfoques laboriosa purificación bioquímica.

También Divulgamos aquí una variación de nuestro método que sustituye a la bacteria gram-positiva Enterococcus faecalis para el patógeno gramnegativo p. aeruginosa. Mucho como es el caso de p. aeruginosa, muerte por E. faecalis es dependiente del tiempo. A diferencia de los anteriores C. elegans, ensayos deE. faecalis , nuestro análisis de E. faecalis no exigen Preinfección, mejorando su perfil de seguridad y reducir las posibilidades de contaminación de equipos de manipulación de líquidos. El ensayo es altamente robusto, mostrando ~ 95% mortalidad 96 h post infección.

Introduction

La identificación y desarrollo de antibióticos de amplio espectro, eficaces, ahora hace ya casi un siglo, condujeron a un momento clave en la salud pública donde había una creencia extensa que infecciosa enfermedad sería una lacra del pasado. Dentro de unas pocas décadas, este optimismo empezó a decaer, como patógeno después de patógeno desarrollado mecanismos de resistencia que estos tratamientos una vez milagrosos. Durante algún tiempo, la carrera de armamentos entre los esfuerzos de descubrimiento de drogas y los patógenos parecía equilibrada. Sin embargo, el mal uso de antimicrobianos ha culminado recientemente con la aparición de cepas resistentes a los fármacos pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensy p. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa es un oportunista, gram negativos, múltiples hosts patógeno que es una grave amenaza a los pacientes con quemaduras graves, aquellos que son inmunodeprimidos, o fibrosis quística. Es también cada vez más identificado como un agente causal en las infecciones nosocomiales severas, particularmente debido a la continua adquisición de resistencia a los antimicrobianos. Para comenzar a abordar esta amenaza, hemos utilizado el bien documentado C. elegans-p. aeruginosa infección sistema5. Nuestro laboratorio ha aprovechado este sistema para el desarrollo de una plataforma de base líquida, alto rendimiento, alto contenido de investigación para identificar nuevos compuestos que limitan la capacidad del patógeno para matar el host6. Curiosamente, estos compuestos parecen pertenecer a por lo menos tres categorías generales, incluyendo antimicrobianos7 y virulencia de los inhibidores de la8. Otros ensayos de descubrimiento de drogas de alto contenido en C. elegans se han divulgado para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis de Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, y Enterococcus faecalis, entre otros9,10,11,12,13,14,15,16. Estos tipos de ensayos tienen varias ventajas bien reconocidos, tales como limitar falsos éxitos positivos que pueden ser tóxicos para el anfitrión y el patógeno, aumento de la probabilidad de biodisponibilidad en comparación con una pantalla química y la capacidad para identificar éxitos más allá de simplemente limitando el crecimiento microbiano, como anti-antiguamente, las moléculas estimulantes inmunes o compuestos que lo contrario inclinación el equilibrio de la interacción huésped-patógeno en favor de la ex. Además, los compuestos descubiertos en estas pantallas son a menudo eficaces en huéspedes mamíferos.

Cabe señalar que por lo menos dos otros ensayos17,18 están disponibles para llevar a cabo pantallas de alto rendimiento en C. elegans en líquido. Sin embargo, cada uno de estos ensayos es una modificación que permite el análisis prototípico de colonización intestinal, conocido como muerte lenta, a realizarse en líquido, aumentar el rendimiento y permitiendo a los compuestos que más fácilmente se proyectarán. Caracterización cuidadosa ha demostrado concluyentemente que los mecanismos de virulencia bacteriana son diferentes entre estos ensayos y nuestra pantalla basado en el líquido7. Puesto que ambos tipos de virulencia se observan en sistemas mamíferos, es importante considerar que determinante de virulencia es más relevante para los intereses del experimentador antes selección de ensayo.

Aquí se demuestra una versión optimizada de la líquido-ensayo de C. elegans-P. aeruginosa . También divulgamos la adaptación de nuestro método de análisis de base líquida para acomodar el patógeno bacteriano grampositivo Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis se identifica cada vez más como una amenaza grave nosocomial con un armamento cada vez mayor de resistencia a los antimicrobianos vías1. Aunque existe un método anterior para la detección de alto rendimiento de E. faecalis 14, requiere Preinfección con el patógeno, lo que complica el procedimiento y aumenta la probabilidad de contaminación de equipos como el FlowSort COPAS. Nuestro protocolo elimina la necesidad de la infección, mejorar el perfil de seguridad. Por último, se reporta un medio por el cual cualquiera de estos ensayos se puede combinar con alimentación de RNAi, lo que permite al usuario buscar factores de huésped que desempeñan un papel en el establecimiento, o resistencia a la infección.

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Protocol

PRECAUCIÓN: P. aeruginosa y E. faecalis son patógenos de nivel 2 de bioseguridad, y deben tomarse precauciones de seguridad adecuado para evitar el contagio accidental y para minimizar la contaminación de las superficies. Todos los medios y materiales que entran en contacto con agentes patógenos deben ser esterilizados o descarta. Nuevas directrices están disponibles desde la publicación del CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5ª edición.

1. preparación y mantenimiento de p. aeruginosa

  1. Racha de p. aeruginosa de un stock congelado en una placa de agar LB (caldo de lisogenia). Incubar de 16 a 24 h a 37 ° C
    Nota: Realizar experimentos de p. aeruginosa dentro de un gabinete para garantizar la esterilidad biológica de seguridad BSL-2. Utilizar las precauciones de seguridad apropiadas para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación o infección de patógena.
  2. Transferir esta placa a 4 ° C. Esta placa puede conservada a 4 ° C y utilizada para inocular cultivos de hasta una semana. Después de una semana, descontaminar y deseche la placa y hacer una nueva placa de racha LB.
    Nota: Disminuye la virulencia de p. aeruginosa después de almacenamiento prolongado.
  3. Dos días antes de la creación de las placas de ensayo, inocular 3-5 mL de caldo LB estéril con una sola Colonia de p. aeruginosa de la placa hecha en 1.1. Incubar a 37 ° C por 12 a 16 h.
    Nota: No incubar más de 16 h. En ricas culturas líquidas, p. aeruginosa PA14 comienza a lisar.
  4. Preparar platos para 10 cm estéril con medios matar lenta (3 g NaCl, peptona de 3.5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mL de tampón fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) y 868 mL de KH2PO4 (1 M)) y agar 18 g/L).
    Nota: Preparar las placas antes de tiempo. Puede almacenarse hasta por 3 semanas en un recipiente hermético a 4 º C.
  5. De semillas cada 10 cm matar lenta placa (SK) con 350 μL de p. aeruginosa de cultivo LB fresco durante la noche. Utilizando un esparcidor bacteriano estéril, esparcir bacterias uniformemente en toda la superficie de los medios de comunicación y deje que se seque en el gabinete de seguridad biológico un BSL-2.
  6. Incube las placas a 37 ° C durante 24 h.

2. preparación de las bacterias de ARNi

  1. Raya hacia fuera o pin-transferencia deseadas cepas de bacterias que contiene el ARNi en placas con agar LB con antibióticos apropiados (carbenicilina 100 μg/ml) y la tetraciclina en 15 μg/mL para las bibliotecas Ahringer y Vidal de un stock congelado.
    Nota: Cuando se trabaja con bacterias no patógenas, utilice cualquiera de los dos un BSL-2 / gabinete de seguridad biológico B o un flujo laminar de BSL-1 campana para asegurar la esterilidad de las culturas y minimizar la posibilidad de contaminación cruzada de la biblioteca.
  2. Incubar las placas durante 24 h a 37 ° C.
  3. Almacenar las placas a 4 ° C hasta por dos semanas.
    1. Después de dos semanas, deseche las placas y reemplácelos con platos recién hechos.
  4. Prueba de múltiples cepas de ARNi en paralelo inoculando individualmente una sola Colonia de cada clon en 4 mL de LB carbenicilina complementado en un único pozo de una placa de 24 pozos pozos profundos o en un tubo de ensayo estéril.
    Nota: Tetraciclina se ha divulgado para reducir la eficacia de RNAi. No utilice en este medio.
  5. Coloque las placas de 24 pozos profundos en un incubador de agitación optimizado para placas de pocillos e incubar a 37 ° C por 16 h agitando a 950 rpm.
    Nota: Es difícil de obtener crecimiento bacteriano uniforme en placas de pocillos con un incubador de agitación convencional. La incubadora de agitación debe ser capaz de estremecer a un mínimo de 750 rpm a fin de las culturas crecer correctamente. En la ausencia de una coctelera especializada, es posible crecer cada cultura en un tubo individual. Culturas se pueden transferir en la placa de 24 pocillos para la centrifugación después, si lo desea.
  6. Recoger las bacterias por centrifugación durante 5 minutos a 2.000 x g.
  7. Decantar el sobrenadante invirtiendo la placa y agitándolo vigorosamente. Resuspender las bacterias ARNi en 100 μl de S Basal (5,85 g NaCl, 1 g de K2HPO4, 6 g KH2PO4 disuelto en 1 L de agua ultrapura y esterilizado por autoclave).
  8. Pipetear las bacterias resuspendidas en un número adecuado de pozos de una placa NGM pocillos (nematodo de medios del crecimiento, 3 g NaCl, peptona 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mL de tampón fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) y 868 mL de KH2PO4 (1 M)) y 18 g agar por litro de agua) suplementado con IPTG (concentración final de 1 mM) y carbenicilina (concentración final de 100 μg/mL).
    1. Uso de 3,5 mL de medio de NGM por pozo de placa de 6 pozos, 1 mL por pocillo de una placa de 24 pocillos o 150 μL por pozo de placa de 96 pocillos.
    2. Uso 100 μL/pocillo de bacterias de la placa de 6 pozos; 50 μL/pocillo de 24 pocillos; o 20 μL/pocillo de la placa de 96 pocillos. Deje que se seque.
      Nota: De secado se realiza normalmente en una campana de flujo estéril para promover el secado rápido y uniforme. Es muy importante el secado uniforme. Evitar que se sequen demasiado, como grietas en el agar promoción madriguera de gusanos. Esto lleva a pérdidas y obstrucciones potenciales de sistemas de manejo de líquido del gusano.
  9. Utilice las placas preparadas inmediatamente o almacenarlos a 4 ° C hasta por dos semanas para su uso posterior.
    Nota: Para evitar que las placas de secado, pueden ser selladas con film plástico de parafina o coloca en un recipiente herméticamente sellado con toallas de papel húmedo.

3. mantenimiento y preparación de C. elegans

Nota: Antes de iniciar los experimentos, generan una población sincronizada de grávida, adulto gusanos hermafroditas como sigue.

  1. Lave grávidos adultos (es decir, con múltiples embriones visibles dentro de la gónada) 4-6 placas de NGM de 10 cm en un tubo cónico de 15 mL añadir 4 mL de S Basal placa, girando suavemente, y luego verter en un tubo cónico de 15 mL.
  2. Pelotilla de gusanos mediante centrifugación a 1.000 x g durante 30 segundos.
  3. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de gusano.
  4. Añadir 3,5 mL de solución de lejía al gusano (concentración final de 0.5M de NaOH, 1% hipoclorito de sodio, en agua estéril) y el pellets de lombriz, mezclar por inversión del tubo durante 1 minuto.
  5. Brevemente vortex y centrifugar a 1.000 x g durante 30 segundos.
  6. Aspirar o decantar el sobrenadante, teniendo cuidado de no para perturbar el pellet de gusano.
  7. Añadir 3,5 mL de solución de lejía al gusano fresco a la pelotilla de gusano.
  8. Mezcle vigorosamente gusanos en solución de lejía. Periódicamente (aproximadamente cada diez segundos) Inspeccione visualmente los gusanos debajo de un microscopio de disección. Reloj para que cutículas de gusano para romperse, liberando huevos. La mayoría de los gusanos adultos que se han disuelto (~ 95%), Diluya el blanqueador 15 ml con S Basal para detener la digestión.
    Nota: Cáscaras de huevo son más resistentes al cloro que los tejidos adultos, pero puede ser disuelto durante una exposición prolongada. Para evitar la disolución de huevo, no exponga los huevos para gusano solución de blanqueador por más de 7 minutos. Si las cáscaras de huevo están excesivamente dañados, los embriones morirán.
  9. Pelotilla de embriones a 1.000 x g durante 30 segundos y aspirar o decantar el sobrenadante sin remover el sedimento de los embriones.
  10. Resuspender gusanos en S basal hasta un volumen final de 15 mL para diluir la solución de lejía al resto.
  11. Repita los pasos de lavado (3.9-3.10) tres veces más para un total de 4 lavados consecutivos.
  12. Después del cuarto lavado, aspirar el sobrenadante y se suman a los 5 o 6 mL de S estériles basales en el tubo cónico de 15 mL. El objetivo es suspender los embriones a una concentración de ~ 50 lombrices por μl.
    Nota: La cantidad de S Basal depende del tamaño de la pelotilla de huevo; cuanto mayor sea el pellet, el más básico de S es necesario.
  13. Incubar el tubo cónico la noche en un agitador de la mesa a temperatura ambiente o 48 h a 15 ° C. Las larvas eclosionan, pero arrestará a desarrollo larval en la fase L1 (L1 diapausa) debido a la privación de nutrientes.
  14. Examinar los embriones con un microscopio de disección para verificar que la mayoría de ellos ha tramado y detenido en la fase L1 del desarrollo.
  15. Determinar el número de gusano por tomar 20 μl de la preparación de gusano y diluir con 80 μl de S Basal. Pipetear 10 μl de solución de gusano diluido directamente en un plato blanco de NGM. Repetir 2 veces más.
    1. Contar las larvas en cada lugar y determinar el promedio. Este promedio se dividen por 2 para obtener un conteo aproximado de lombrices por μL en la preparación de gusano. Preparaciones de gusano pueden utilizarse para las placas de propagación o para experimentos.
      Nota: Después de 4-5 días, las larvas hambrientos comenzará a morir; desechar la preparación en este momento.
  16. Para la propagación de la cepa, pipeta salpicado de un número adecuado de gusanos L1 (5.000-6.000) en placas de 3-4 cm 10 NGM concentrado OP50 e. coli – "superfood" (e. coli OP50 vistos en concentración de 25 X (es decir, 1 L de noche OP50 cultura en LB rinde 40 mL de 25 X OP50 súper); 2 mL de esta suspensión bacteriana concentrada son vistos en cada placa NGM de 10 cm).
  17. Para preparar las placas para los experimentos, hacer uno de los siguientes (para configuración de uso 3.17.1 "Protocolo básico", para los pasos de uso "ARNi pantalla configurar" 3.17.2 - 3.17.4 según corresponda):
    1. Pipeta ~ 5.000 lombrices/10 placa de cm sembrado con ARNi o OP50 superfood.
    2. Pipeta de ~ 500 gusanos/pozo de una placa de 6 pozos sembrados con ARNi.
    3. Pipeta de ~ 300 gusanos/pozo de una placa de 24 pocillos sembrados con ARNi.
    4. Pipeta de ~ 100 gusanos/pozo de una placa de 96 pocillos sembrados con ARNi.
      Nota: Para obtener instrucciones sobre cómo fue sembrada ARNi consulte pasos 2.7-2.9 en preparación de bacterias ARNi.
  18. Si se utiliza una cepa fértil de gusanos, incubar gusanos a 25 ° C ~ 44-48 h. uso estos gusanos tan rápidamente como sea posible después de que la población ha llegado a la edad apropiada. Esto minimiza el impacto del huevo para incubar dentro de los gusanos durante el ensayo.
  19. Si se utiliza la cepa es estéril a la temperatura (por ejemplo, fer-15(b26); FEM-1(hc17) o glp-4(bn2)), incubar gusanos a 15 ° C para h ~ 16 y luego se transfieren a 25 ° C durante 44 h para completar el desarrollo y prevenir la embriogénesis.

4. líquido matando a configuración de análisis (protocolo básico)

Nota: Este es un protocolo para una cepa bacteriana y una fuente de gusanos.

  1. Con un raspador celular, quitar la p. aeruginosa de una placa de SK y resuspender en ~ 5 mL de S Basal. Aumentar si es necesario. Medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana mediante un espectrofotómetro (OD600)
  2. Preparar 24 mL de caldo diluido de p. aeruginosa en el Basal de S en OD600 ≈ 0,09 (concentración final de 3 X). Ver 4.6.2 para contenido final por pozo y escala por consiguiente volumen de dilución bacteriana.
  3. Agregar 21 mL de medio líquido para matar lenta (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L con CaCl2 y MgSO4 a una concentración final de 1 mM). Usando una pipeta multicanal, traslado 45 μl de bacterias y de los medios de comunicación en cada pocillo de una placa de 384 pozos.
  4. Lavar gusanos de su fuente (es decir, paso 3.17.1) en un tubo cónico de 50 mL y permitir gusanos para instalarse bajo fuerza de la gravedad. Aspirar sobrenadante hasta 5 mL. Resuspender en un total de 50 mL S basal.
  5. Repita el paso 4.4 dos veces.
  6. Utilizando un clasificador de gusano, ordenar aproximadamente 22 gusanos en cada pocillo de la placa de 384 pozos.
    Nota: La configuración de gotas cada gusano ~1.1 μl de líquido. 22 gusanos ascenderá a 25 μl, volumen total de la prueba a 70 μL/pocillo.
    1. La composición final de cada pozo se compone de 70 μl. 45 μl de este volumen se añade como medio bacteriano (0,03 bacterias OD600 μl 24 S μl basales y 21 SK complementado con CaCl2 y MgSO4). Los otros 25 μl se agrega con los 22 gusanos.
    2. Si el clasificador utilizado aquí (véase Tabla de materiales) está disponible, gusanos pueden ser diluidos a una concentración final de 1 μl de gusano en S Basal y pipeteado 25 μL/pocillo con una pipeta multicanal. Sin embargo, los resultados pueden presentar aumento de la variabilidad. Alternativamente, es posible utilizar un dispensador líquido peristáltico, descrito por Leung y colaboradores19.
  7. Después de gusanos han sido ordenados en la placa de 384 pozos, sellar la placa con una película permeable al gas e Incube las placas a 25 ° C durante 24-48 h.
  8. En el tiempo deseado, usar una lavadora de microplacas para lavar la placa de 384 pozos con S Basal un total de 5 veces.
    1. Después del segundo lavado, aspirar la mayoría de los medios de comunicación, dejando unos 20 μl. vigorosamente sacude placas mediante un Vortex de microplacas durante al menos 30 segundos para aflojar cualquier suciedad desde el fondo de los pozos).
  9. Después del último lavado, aspirar sobrenadante hasta 20 μl. Añadir 50 μl de 0.98 μm de ácido nucleico de la mancha (véase Tabla de materiales) o bien la placa de 384 pocillos, para una concentración final de 0,7 μm.
  10. Incubar a temperatura ambiente durante 12-16 h. Este colorante solo mancha gusanos muertos. Después de la incubación deseada, lavado de placas utilizando la lavadora de microplacas para quitar cualquier exceso manchan (un mínimo de 3 lavados).
  11. Para adquisición de datos, utilice un espectrofotómetro o un microscopio automatizado luz transmitida y fluorescencia (531 de nm de excitación y emisión 593).
    1. Utilice un objetivo de bajo aumento para permitir una imagen del todo bien para ser capturado.
    2. Como alternativa, utilice vermimetry de flujo. Esta técnica utiliza un citómetro de flujo de objeto grande como un Fluorímetro de gusano, miden el tamaño y la fluorescencia del organismo entero (es decir, C. elegans) de manera que es muy similar a la citometría de flujo.
  12. Utilizar software de análisis de imagen automatizado (como CellProfiler, un estudio de análisis de imágenes basado en MatLab http://cellprofiler.org/) para calcular las áreas de gusano fluorescente y total por pozo de una manera imparcial.
    Nota: El cociente de estos números representa la muerte de fracción para cada pozo. Si bien había 7 había manchado hacia fuera 20 total, entonces la muerte de fracción compone de 0.35 o 35%.
    1. Antes del primer uso, la canalización de procesamiento de imagen automatizado debe ser validada por puntuación manual. Esto se hace comparando resultados de la tubería automatizada en los puntajes obtenidos por visualmente inspeccionar imágenes y grabación de fracciones de gusanos muertos para cada uno de ellos. El proceso de validación asegura que los parámetros para el procesamiento automatizado de la proyección de imagen son precisos y representan los datos correctamente.

5. adaptación de cepas múltiples de detección de C. elegans o caídas (ARNi Screen Setup)

Nota: Esta es una pantalla de RNAi para una configuración de placa de 24 pozos.

  1. Añadir 1 mL de S Basal por pozo de una placa de 24 pocillos (ver paso 3.17.3). Suavemente agite gusanos agitando la placa, luego transferencia de gusanos a una placa de pozo profundo 24 vacía y estéril. Permiten gusanos a gravitacionalmente (~ 5 minutos).
  2. Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 mL. Agregar 7 mL de S Basal a cada pocillo.
  3. Repita los pasos 5.1-5.2 un mínimo de 2 veces más. Después del último lavado, aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 400 μl.
  4. Utilizando la función remuestreador de la clasificadora de gusano, tipo 22 gusanos de la suspensión de gusano de la placa de 24 pozos en cada pocillo de una placa de 384 pozos (cada pocillo de una placa de 24 pozos rendimientos de 8-12 pocillos de una placa de 384 pocillos).
    1. Para evitar la inanición, pipetear las bacterias en placas de 384 pocillos (una cepa que sirve únicamente como alimento, como OP50, o una cepa patógena) antes de la clasificación.
      Nota: Pueden añadirse agentes patógenos por pasos 2.3-2.5 o 6.4-6.5 y fuente de alimentación las bacterias pueden ser diluidas y ha añadido siguiendo el mismo esquema en cuanto a p. aeruginosa.
  5. Después de gusanos han sido ordenados en la placa de 384 pocillos, agregar pequeñas moléculas u otros materiales específicos del experimento.

6. adaptación de E. faecalis

Nota: Sólo las diferencias de p. aeruginosa ensayo se describen.

  1. Preparar una fuente fresca de E. faecalis rayas bacterias de un stock congelado en un plato de agar BHI (infusión de cerebro corazón) y la incubación por 16 a 24 h a 37 ° C.
    Nota: Realizar experimentos de E. faecalis dentro de un gabinete para garantizar la esterilidad biológica de seguridad BSL-2. Utilizar las precauciones de seguridad apropiadas para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación o infección de patógena.
  2. Las placas pueden almacenarse a 4 ° C hasta una semana. Después de este período, reemplace con una nueva placa.
  3. La noche antes de la clasificación de gusanos, inocular 3-5 mL BHI estéril con una sola Colonia de E. faecalis. Incubar 12-16 h a 37 ° C con agitación.
  4. Añadir las bacterias a los pozos en cuanto a p. aeruginosa (3 bacterias x en S Basal, OD600≈0.09).
    Nota: Para E. faecalis, el final bien la composición es: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, con el volumen restante de S basal. Recuerda que se entregarán 25 μl de S basal con gusanos.
    Nota: E. faecalis produce biopelículas gruesas que absorben la mancha fluorescente, causar imágenes borrosas. Lavado extenso puede ser insuficiente para eliminar este biofilm. En este caso, los gusanos se pueden transferir a un plato vacío con una pipeta multicanal. Para facilitar la transferencia, puede se agregó Tween 20 a S Basal a una concentración final de 0,1% (v/v) Tween 20 en S Basal. Esto ayuda en la eliminación de los gusanos de la biopelícula.

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Representative Results

Parámetros importantes para el funcionamiento de ensayo

Una correcta comprensión de la biología que subyace a este análisis es necesaria para optimizar el análisis y solución de problemas. Para ello, nos referimos primero a varios papeles claves dilucidar los mecanismos de patogenia de p. aeruginosa-mediada en líquido7,20. Siempre que se siguen los pasos mencionados anteriormente (ver figura 1 para un esquema del Protocolo de ensayo) una matanza dependiente del tiempo de C. elegans se observará sólo en presencia del patógeno (figura 2A). En cambio, en la ausencia de suplementos nutricionales claves (por ejemplo, si la peptona se deja fuera de los medios de comunicación, y se agrega sólo S Basal), poco a ninguna matanza será observada (figura 2B). Curiosamente, la incubación de dos pasos de p. aeruginosa (durante 24 h a 37 ° C, entonces 24 h a 25 ° C) que es fundamental para los ensayos convencionales de muerte lenta y fue originalmente implementado en matar a liquido21, es prescindible en este ensayo ( Figura 2). Mientras que es posible añadir p. aeruginosa de noche cultura LB, significativamente al hacerlo cambia la cinética de mortalidad y no se recomienda.

Entender biología ensayo también permite simplificación del análisis, si apropiada y deseable. Por ejemplo, el conductor más importante del anfitrión en este ensayo es el pyoverdine pseudobactina y host la toxicidad causada por pyoverdine es condicionada a su capacidad para enlazar hierro7. Así, el ensayo puede simplificarse sustituyendo pyoverdine-ricos filtrado, purificado pyoverdine o incluso algunos productos químicos quelantes del hierro (p. ej., 1, 10-fenantrolina) bacterias vivas, como la respuesta transcripcional de C. elegans a estos tratamientos es muy similar (figura 3)22.

Varias líneas de evidencia hablan de la robustez de la instalación experimental. En primer lugar, la configuración tolera una amplia gama de concentraciones bacterianas iniciales. Concentraciones tan bajas como OD600 = 0.0025 (aproximadamente 10 veces más bajo que el recomendado) todavía matanza de tiempo-concentración-dependientes y exposición, aunque el tiempo cambie de puesto (Figura 4A). En segundo lugar, la reproducibilidad del ensayo es tal que como pocos como 4 pozos es con frecuencia suficiente para obtener datos estadísticamente significativos (Figura 4B).

Hay varios cambios que no se recomienda. Por ejemplo, utilizando inóculos de bacterias inicial con concentraciones muy superiores a los mencionados en el protocolo; hacerlo así resulta en grueso, biofilm-como material que es difícil o imposible lavar con eficacia, que complica la puntuación mortalidad. Además, alta concentración inóculo bacteriano también puede competir por oxígeno y activar host no específico homicidio7.

Otra nota importante es limitar el período de tiempo entre detener el análisis y proyección de imagen los gusanos muertos. Tenga en cuenta que este período de tiempo debe incluir tinción, por lo que es fundamental para ser eficiente. Después de la muerte, el material biológico en gusanos comienza a sacar o ser consumido por las bacterias. En cuestión de 24-32 h, solamente la cutícula permanece. La cutícula se tiñe muy poco y es muy ligera, lo que es fácil perder durante el lavado. Es importante tener en cuenta que las cepas o condiciones de tensión/ARNi con cinéticas muy diferentes de la matanza se pueden complicar por este fenómeno (es decir, algunos gusanos todavía pueden estar vivos mientras que otros ya han perdido su contenido y son imposibles de la imagen). Figura 4A muestra este fenómeno, como gusanos en el lado izquierdo de la placa, inoculado con una concentración bacteriana inicial muy baja, son todavía en gran parte vivo mientras gusanos en el lado derecho de la placa, que fueron expuestos a mucho mayores concentraciones de las bacterias, han sido arrastrados.

Un determinante muy importante del éxito de análisis es el método utilizado para recopilar y analizar los datos. En nuestro laboratorio hemos utilizado por lo menos tres métodos de recogida de datos de estos ensayos: espectrofotometría, microscopía automatizada y vermimetry de flujo (es decir, la adaptación de técnicas de citometría de flujo para C. elegans; literalmente, la medición de gusanos en una solución de flujo). El primero de estos métodos utiliza un spectophotometer para leer la fluorescencia del tinte o reportero de los gusanos en cuestión. Este método tiene la ventaja de utilizar una pieza bastante ubicua de equipo (un espectrofotómetro estándar con un lector de microplacas) y es el método más rápido para adquirir datos. Sin embargo, carece del contenido informativo de microscopía automatizada y la potencia estadística de flujo vermimetry.

Microscopía automatizada es otra opción viable. Un número de sistemas de imagen de microplacas son actualmente en el mercado, que van en precios que son asequibles a un único investigador (p. ej., un Cytation5 Bio-Tek) más grande, más caro y máquinas de mayor calidad que se encuentran más comúnmente en base instalaciones (por ejemplo, un microscopio de ImageXpress de dispositivos moleculares). En la práctica, la mayoría de estas soluciones es susceptible de recuento de la mayoría de pantallas y análisis. Más plataformas de proyección de imagen automatizadas pueden acoplarse también a software aguas abajo para tratamiento (por ejemplo, MetaMorph, ImageJ, Gene5 o célula Profiler) para aumentar el rendimiento de la información de la imagen. En la figura 5 y figura 6se muestran ejemplos de la utilidad del proceso. Cuando la relación señal a ruido es alta (como en la figura 5), el análisis es simple y discriminar entre condiciones positivas y negativas es trivial. En estos casos, incluso débiles golpes pueden ser fácilmente identificados. Muchos ensayos, sin embargo, tienen una relación de señal a ruido más débil. Por ejemplo, tratamiento de color de rosa-1::GFP22 gusanos (con expresión constitutiva mCherry en su musculo) con 1, 10-phenathroline aumenta el nivel de color de rosa-1::GFP. Para el análisis de datos, el reportero inducible de GFP se normaliza a la señal constitutiva mCherry (figura 6). En este caso, el reportero tiene expresión más débil o no está activado en la mayoría de los gusanos. Por lo tanto, puede ser ventajoso implementar procesamiento de imágenes herramientas adicionales, como analizador de la célula, que pueden reducir el fondo y amplifican la señal.

Por último, si un FlowPilot COPAS está disponible, puede utilizarse para adquirir datos a través de vermimetry de flujo. Mucho como el concepto más familiar de citometría de flujo, este instrumento puede utilizarse para medir la fluorescencia de C. elegans en al menos dos o tres canales a la vez. Este método es muy susceptible a la adquisición de datos con alta significación estadística, pero el rendimiento es muy disminuido comparado con microscopía automatizada. La ventaja más significativa de flujo vermimetry es en la capacidad para analizar las poblaciones de gusano entero como un solo grupo para una repetición, en lugar de dividir en varios pozos y analizando la media de los pozos. Analizar grandes grupos de esta manera dramáticamente mejora la potencia estadística y permite la detección de efectos incluso pequeños.

Modificaciones de la prueba de líquido de la matanza

Novedades del ensayo han extendido su utilidad incluyendo análisis de activación de reporteros fluorescentes (figura 6), utilizando técnicas de RNAi de mediano a alto rendimiento (figura 3) e incluso la sustitución de la original patógeno.

La razón más evidente con ARNi configurar es para probar vías de defensa del anfitrión contra p. aeruginosa (u otros agentes patógenos). En la figura 3se muestran ejemplos de ARNi knockdown de genes relevantes para la supervivencia en el análisis. Consonancia con anteriores observaciones20,23,24,25, daf-2(RNAi) mejorado supervivencia de C. elegans durante la exposición a p. aeruginosa, mientras que () daf-16 ARNi), zip-2(RNAi) y cebp-1(RNAi) lo acortaron. Como se señaló, ARNi más simplemente está incluido en el ensayo de cultivo de lombrices en las placas de pocillos donde cada una contiene también un clon de ARNi diferentes. Debido a la alta viscosidad del agar y pequeños volúmenes involucrados, es difícil lograr un relleno uniforme, sin burbujas de placas de 96 pozos sin equipo especializado. Además, las cepas bacterianas transportar el iARN de secado también puede ser un problema, como los pozos externos secan más rápido que el internos pozos, conduciendo a la falta de uniformidad y significativo potencial de agrietamiento de agar. Como se señaló anteriormente, esto anima a gusanos de madriguera, reduciendo el número de animales disponibles para la proyección y los riesgos que maquinaria de manejo de líquido. Por ambas razones, placas de 24 pocillos son más fáciles de trabajar con que placas de 96 pocillos. Aunque esto reduce el rendimiento del análisis, mejora la confiabilidad y se sugiere, especialmente para las pantallas iniciales.

Por último, el ensayo se ha modificado el ensayo para reemplazar a p. aeruginosa con E. faecalis. (En principio, sustitución con otras especies bacterianas no debe proporcionar excesivas dificultades, siempre que el cultivo apropiado y las condiciones de exposición son identificadas.) El factor más importante a considerar es los requisitos medios del patógeno, para el crecimiento y desarrollo y para la inducción de la virulencia. Por ejemplo, el Gram positivo, oportunista patógeno E. faecalis requiere medios ricos en nutrientes (como BHI) e incubación a temperaturas más altas en comparación a p. aeruginosa14,26. Teniendo estos factores en cuenta, adaptación de la el ensayo con E. faecalis fue sencillo. Como se ha señalado para p. aeruginosa, vimos matar dependiente del tiempo (figura 7). Curiosamente, el momento de la muerte fue similar a ensayos previamente publicados que infección previa en agar placas26, pese a la ausencia de este paso, que puede sugerir que los mecanismos implicados en patogenesia varían.

Figure 1
Figura 1: esquema para la base líquida de C. elegans – ensayo de infección de p. aeruginosa . Pasos que implican la preparación y propagación de nematodos en el lado izquierdo, preparación bacteriana están a la derecha. Pasos que implican ambos estén centradas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Asesinato de C. elegans por p. aeruginosa es específico y requiere una nutrición bacteriana. (A) C. elegans muerte en presencia de e. coli y p. aeruginosa. (B) muerte de C. elegans en presencia de p. aeruginosa (derecho) y sin medios de matar lenta (izquierdos) añadidos a la mezcla (es decir, S sólo basal). S es un mínimo de medios y no contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano y excluye la producción del pyoverdine. (C) muerte de C. elegans en presencia diferentemente preparados p. aeruginosa. p < 0.01, basado en el de Student t-test. Barras de error representan SEM 10 pozos fueron utilizados por repetición biológica por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resistencia de C. elegans a p. aeruginosa depende de caminos inmunes del anfitrión. Un panel de las caídas de RNAi fue tratado con 1, 10-fenantrolina (un quelante química que imita a la exposición a p. aeruginosa en líquido) o p. aeruginosa (A) (B). p < 0.01, #p < 0.05, basado en el de Student t-test. Barras de error representan SEM 10 pozos fueron utilizados por repetición biológica por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Asesinato de C. elegans por p. aeruginosa es robusta y depende de la concentración bacteriana. Imágenes representativas (A-B) (A) y (B) cuantificación de C. elegans muerte después de la exposición a diversas concentraciones de p. aeruginosa por 72 h. p-valores se calculan en base a estudiante t -prueba. Barra de escala (A) es 1 mm. 16 pozos fueron utilizados por repetición biológica por condición. BF: Campo luminoso, FL: fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: procesamiento imagen y adquisición de datos de un ensayo con una señal fuerte. Imágenes representativas (A) vivo (control negativo) y muertos (control positivo) C. elegans. (B) análisis estadístico de controles positivos y negativos basados en el método de adquisición de datos, el modo de procesamiento y número de pozos analizados. (C) la fluorescencia fue analizada para gusanos de cuatro pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (dos positivos y dos pozos de control negativo). Cada uno contenía bien ~ 100 gusanos. Cada punto del gráfico representa un solo gusano, mostrando el tiempo de vuelo (que se relaciona con pero, debido al bobinado de gusanos vivos, imperfectamente representa tamaño) y la fluorescencia medida para gusanos que se tiñen con Sytox Orange. Exposición de calor mataron los gusanos control positivo. Debido a los cambios en la tensión y la forma de gusanos muertos (como puede verse en (A), gusanos muertos aparecen más barra-como y tienen pocas curvas de cuerpo) en comparación con sus contrapartes de la vida, gusanos muertos tienen un TOF más. p-valores se calcularon a partir de Student t-test. Barra de escala en (A) es 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: procesamiento de imagen y adquisición de datos de un ensayo con una señal moderada. (A) imágenes representativas de C. elegans con un reportero inducible de 1::GFP rosa y un marcador constitutiva mCherry (para normalizar la expresión de los genes de la matriz Extracromosómica). C. elegans expuesto a DMSO (control negativo) o 1, 10-fenantrolina (control positivo). (B) análisis estadístico de controles positivos y negativos basados en el método de adquisición de datos, el modo de procesamiento y número de pozos analizados. (C) cuatro pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (dos positivos y dos pozos de control negativo) se analizaron mediante flujo vermimetry. p-valores se calcularon a partir de Student t-test. Barra de escala en (A) es 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Matanza de C. elegans por E. faecalis depende del sólido y el tiempo. Imágenes representativas (A-B) (A) y (B) cuantificación de C. elegans la muerte después de la exposición a E. faecalis. p < 0.01, basado en el de Student t-test. se utilizaron 10 pozos por repetición biológica por condición. Barras de error representan la barra de escala de SEM (A) es de 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este ensayo (o ensayos similares donde otros patógenos se sustituyen por p. aeruginosa o E. faecalis) es útiles para una variedad de propósitos, incluyendo el descubrimiento de la droga. También es útil para abordar cuestiones biológicas fundamentales, como la identificación de factores de virulencia, la aclaración de las vías de defensa del anfitrión y determinar la maquinaria regulatoria involucrados en la interacción huésped-patógeno.

Aunque el ensayo asesinato líquido de p. aeruginosa es sólido, hay varios puntos donde debe prestarse atención cuidadosa para minimizar las posibilidades de fracaso. En primer lugar, como se señaló, la placa bacteriana fuente para inoculaciones de p. aeruginosa debe permanecer fresca, para que las bacterias pierden virulencia, a pesar del crecimiento durante la noche en LB. En segundo lugar, es clave para asegurarse de que calcio y magnesio se añaden a p. aeruginosa matando a ensayos. Sin él, virulencia se verá significativamente afectada. Por último, cabe destacar que gusanos criados en HT115 (para ensayos de RNAi) morirá considerablemente más adelante que gusanos criaban en OP50 (N. Kirienko, comunicación personal). Por esta razón, si cambio a estudios basados en el RNAi, es importante determinar empíricamente el mejor momento para el análisis.

Respecto a los ensayos con p. aeruginosa o E. faecalis, es crucial para asegurar que haya una alimentación adecuada para el desarrollo de los gusanos de la fase L1 hasta que estén listos para ser usados en el ensayo. Hambre, incluso en el corto plazo, es conocido por activar un número de vías de defensa anfitrión, tales como la insulina/IGF de DAF-2/DAF-1627de la red de señalización. Nuestros datos sugieren que el DAF-16/FOXO ligeramente ya es activado por ser cultivados en líquido20, y más activación es fuertemente indeseable, ya que promueve el DAF-16/FOXO amplio espectro patógeno resistencia23.

Por último, es fundamental utilizar gusanos totalmente estériles en cualquier análisis que se basa en la mortalidad como una lectura. Si los gusanos son fértiles, en líquido causa dificultades en la puesta de huevos. Como resultado, algunos de los embriones eclosionan dentro de la matriz, causando eventualmente su muerte. Por esta razón, generalmente utilizamos una lesión genética, como la glp-4(bn2)28, que muestra un fenotipo completamente penetrante estéril para estos ensayos. Debe evitarse el uso de productos químicos que impiden desarrollo embrionario pero todavía permite la puesta de huevos, tales como 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), como también puede interferir con el desarrollo y crecimiento bacteriano.

En general, nos hemos encontrado muy útil para planificar varios puntos del tiempo para el análisis. Aunque el ensayo es robusto y la sincronización es generalmente constante, estocástico e imperceptibles cambios pueden cambiar el momento de la muerte en el análisis dentro de 2-4 horas. Solución de problemas es necesario, a menudo es útil considerar primero los más simples de respuestas; es decir, preparar medios frescos, descartar las últimas culturas bacterianas y volver a la raya de cepas bacterianas de acciones congeladas, etc. sólo muy rara vez no estas medidas restauración el ensayo a la funcionalidad.

Debido a la relativa simplicidad del método, se puede realizar fácilmente una gran variedad de modificaciones. Cambiar los gusanos de un fondo uniforme glp-4(bn2) para pantallas de ARNi de alto rendimiento, tales como los describimos en este documento, es útil para la identificación de las vías de respuesta de host para una amplia gama de productos químicos tóxicos y xenobióticos. Por ejemplo, al añadir el mismo producto químico o toxina en cada pocillo de las placas de RNAi (p. ej., Cry5B toxina, fenantrolina, etc.), vías que alteran la sensibilidad a estas toxinas pueden ser identificadas fácilmente. Este tipo de pantallas puede utilizarse también para identificar redes de defensa contra cualquiera de la panoplia de agentes patógenos que infectan a C. elegans.

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Disclosures

Los autores declaran que tienen no hay conflictos de interés que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la prevención del cáncer y el Research Institute of Texas (CPRIT) Premio RR150044, Welch Fundación investigación beca C-1930 y por el nacional institutos de salud K22 AI110552 otorgado a NVK. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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