Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب لتلحق التآكل على سطح العين للماوس، ومتابعة الجرح شفاء العملية بعد ذلك. البروتوكول يستفيد من لدغ العين جزئيا إزالة ظهارة سطح العين في الفئران فظاعتها.
Abstract
القرنية مورين يوفر نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح. القرنية هي الطبقة الخارجية للعين، وبالتالي هو الدفاع الأولى للإصابة. في الواقع، النوع الأكثر شيوعاً من إصابة العين وجدت في عيادة كشط القرنية. هنا، فنحن نستخدم لدغ العين للحث كشط أسفر عن إزالة ظهارة القرنية في فيفو على تخديره من الفئران. يسمح هذا الأسلوب لتعطيل الظهارية المستهدفة واستنساخه، ترك مناطق أخرى سليمة. وبالإضافة إلى ذلك، وصف تصور ظهارة الحبيبات مع تلطيخ fluorescein، وتقديم المشورة ملموسة بشأن كيفية تصور القرنية الحبيبات. ثم، نحن نتبع الجدول الزمني للجرح شفاء 0, 18 و 72 ح بعد الكشط، حتى الجرح هو إعادة متظهرنه. نموذج إصابة القرنية الظهارية كشط مثالي للدراسات المتعلقة بانتشار الخلايا الظهارية، والهجرة، وإعادة epithelialization من طبقات القرنية. ومع ذلك، هذا الأسلوب ليس الأمثل لدراسة تفعيل stromal أثناء التئام الجروح، نظراً لعدم اختراق لدغ العين إلى طبقات الخلايا اللحمية. هذا الأسلوب أيضا مناسبة للتطبيقات السريرية، على سبيل المثال، قبل الإكلينيكية اختبار فعالية العقاقير.
Introduction
طبقات طلائي أجهزة عديدة يتعرضون لإصابات. بيد أنها تحتوي أيضا على القدرة على التعويض عن فقدان الأنسجة من خلال التئام الجروح. القرنية يقدم نموذجا ممتازا لدراسة التئام الجروح. أشكال السطح الخارجي للعين، ويوفر طبقة واقية لآلية العين الحساسة. وهكذا، القرنية تعمل كحاجز مادي لمسببات الأمراض وفقدان المياه. وهو يتألف من ثلاث طبقات؛ ظهارة وسدى والبطانة. ظهارة القرنية تشكل الطبقة الخارجية للقرنية. الخلايا الظهارية الحفاظ على وظيفة الحاجز القرنية بالتقيد بدقة ببعضها البعض عن طريق تقاطعات ضيق1،،من23. غشاء القرنية اللاخلوي الطابق السفلي، غشاء بومان، يفصل في الظهارة ستروما واسعة النطاق، التي تحتوي على كيراتوسيتيس المقاوم للحرارة. تحت ستروما، القناة خلايا بطانية بالمواد الغذائية والمياه والأوكسجين إلى الطبقة العليا.
سحجات القرنية شائعة جداً في عيادة4. إصابات القرنية متنوعة، ولكن إلى حد كبير تسببها جزيئات صغيرة مثل الغبار أو الرمل أو الخدوش أو كائنات أخرى أجنبية. ووصف البروتوكول هنا تهدف إلى استنساخ نوع ذات صلة سريرياً كشط القرنية الظهارية. عند القيام بذلك، يوفر هذا البروتوكول طريقة يمكن السيطرة عليها والاصيلة للأطباء والعلماء القرنية لتنفيذ الدراسات الخاصة بهم. ونحن قد يؤديها في فيفو إصابة إصلاح مقايسة على القرنية مورين كاشط الأنسجة مع لدغ العين المتبلدة، ثانيا الجيربروش. هنا، نحن نستهدف الكشط فقط ظهارة القرنية المركزية وترك أجزاء أخرى من الجهاز دون أضرار. وهكذا، البروتوكول المثالي لدراسة ديناميات الخلايا الظهارية القرنية أو الأغشية الطابق السفلي أثناء إعادة ابيثيلياليزيشن، خلية الهجرة والانتشار والتمايز في فيفو5. مؤخرا، تم استخدام هذا النموذج لتحليل ديناميات الخلايا السلف في القرنية مورين، وكذلك فيما يتعلق بكشف النقاب عن قدرة الخلايا الظهارية القرنية المتباينة في إعادة تأسيس مكانة الخلايا الجذعية القرنية بعد إصابة6،7. عقب الكشط، ترجع القرنية بشفافيته المعتادة والشد. من المثير للاهتمام، أوضحت دراسة في المختبر أن epithelialization إعادة يحدث دون انتشار الخلايا زيادة8. ويصف هذا البروتوكول الجدول الزمني للشفاء دون انقطاع في القرنية مورين. وبالتالي ينطبق الأسلوب لاختبار أثر المخدرات على شفاء أنماط والسرعة.
وقد استخدمت على نطاق واسع القرنية للجرح شفاء الدراسات. ومع ذلك، قد اعتمدت العديد من الدراسات على نماذج أخرى للإصابة. نموذج راسخة لإصابة القرنية هو حرق القلوية التي يتم تنفيذها بواسطة تطبيق هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) مع أو بدون تصفية الورق على سطح القرنية9. التعرض القلوية ينتج ضرر كبير ومنتشر يؤثر على ظهارة القرنية، ليس فقط، بل أيضا الملتحمة وسدى9،10. حلول قلوية قوية تبين أن حمل قرحة القرنية، عتامة ونيوفاسكولاريزيشن9. الخلايا التحريضية تغزو ستروما عادة ضمن ح 6 والبقاء هناك حتى 24 ح11. هكذا، إصابة القلوية أسلوب المستحسن في الدراسات المتعلقة بالتنشيط stromal. نوع آخر من الإصابات الكيميائية يمكن إنزالها بتطبيق ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في9،القرنية10. وتشمل نماذج الإصابة شائعة أخرى عن الجروح التي تخترق عن طريق الجروح ستروما وكيراتيكتومي، التي تقتصر على الجزء العلوي من ال14،ستروما15. هذه الأساليب أيضا مفيدة للإجابة على الأسئلة بخصوص اللحمية التئام الجروح. نماذج مختلفة من الإصابة لها مزاياها وعيوبها. تم تطوير الكشط، أو ديبريديمينت، من ظهارة القرنية أولاً باستخدام المشارط المتبلدة أو شفرات على السابقين فيفو القرنيات16. وكان هذا الأسلوب في وقت لاحق المستخدمة في فيفو على الماوس وفار وارنب17،،من1819،20،،من2122. استخدام لدغ العين (الشكل 1)، نزيل فقط منطقة مختارة من الظهارة، تاركاً بقية الظهارة لم تتأثر. وبهذه الطريقة، فمن الممكن التحديد تستهدف إزالة الظهارية إلى أجزاء مختلفة من القرنية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم حجم الاحتكاك مع صبغة فلوريسسين. وعلاوة على ذلك، هنا ونحن نتابع الإغلاق كشط خلال فترة الشفاء.
يشكل هذا الأسلوب العديد من المزايا، ط) بما في ذلك الموقع الدقيق لموقع الكشط، وغير ممكن مع الإصابات الكيميائية، الثاني) التآكل السريع لأداء، والثالث) غير الغازية. هنا، نحن تصف طريقة استخدام الماوس الرنين أووتبريد كنموذج، ولكن هذا يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من النماذج الوراثية الماوس، وكذلك للفئران والأرانب، وهي النماذج الشائعة المستخدمة لدراسة اضطراب القرنية البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أقرها المجلس التجربة الحيوانية الوطنية.
1-الأعمال التحضيرية
- إعداد جميع الحلول وتبقى في درجة حرارة الغرفة، ما لم يبين خلاف ذلك. اتبع أنظمة التخلص من النفايات للتصرف في استخدام المواد وإيجاد الحلول.
- استخدام الرنين والممثل المدني الدولي أووتبريد الأرصدة، تتراوح أعمارهم بين 4-12 أسابيع واي من الجنسين. إذا كان استخدام سلالة C57BL/6، اتبع أسلوب إعداد ميديتوميديني الكيتامين في الخطوة 1-3-2. لاتخاذ خطوات أخرى، اتبع الإرشادات المذكورة في 1.3.3.-1.3.5.
- إعداد الطب البيطري طازجة وفي الوقت المناسب قبل بدء العملية. والايبوبروفين سوف تستخدم في وقت لاحق، وبالتالي ليس من الضروري إعداد أنه عند هذه النقطة.
- إعداد حلاً من الكيتامين ميديتوميديني للتخدير، مزيج 0.375 مل (الأسهم تركيز 50 ملغ/مل) الكيتامين (التعليم والتدريب المهني كيتامينول) مع 0.25 مل (الأسهم تركيز 1 ملغ/مل) من ميديتوميديني (التعليم والتدريب المهني سيبيتور) وإضافة 1.25 مل العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم. إدارة 0.15 مل/20 غرام وزن الماوس (7.5 مغ/كغ، والكيتامين و 1 مغ/كغ، ميديتوميديني).
- إعداد حلاً أكثر مخفف من الكيتامين ميديتوميديني للتخدير في الفئران C57BL/6، مزيج 0.375 مل (الأسهم تركيز 50 ملغ/مل) الكيتامين مع 0.25 مل (الأسهم تركيز 1 ملغ/مل) من ميديتوميديني وإضافة 2.5 مل العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم. إدارة 0.15 مل/20 غرام وزن الماوس (3.75 مغ/كغ، والكيتامين و 0.5 ملغ/كغ، ميديتوميديني).
ملاحظة: هذا خطوة بديلة، فقط للكبار C57BL/6 الفئران. - إعداد بوبرينورفين للتسكين، إضافة 0.1 مل (الأسهم تركيز 0.3 مغ/مل) من بوبرينورفين إلى 1.9 مل العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم. إدارة 0.2 مل/20 غرام من وزن الماوس (0.15 مغ/كغ).
- لإعداد أتيباميزولي لوقف التخدير، إضافة 0.1 مل (الأسهم تركيز 5 ملغ/مل) من أتيباميزولي لمل 4.9 من 0.9% كلوريد الصوديوم. إدارة 0.15 مل/20 غرام وزن الماوس (0.75 مغ/كغ).
- للتسكين أثناء التخدير بعد انتهاء استخدام والايبوبروفين. إضافة 0.1 مل (الأسهم تركيز 50 ملغ/مل) من والايبوبروفين لمل 4.9 من 0.9% كلوريد الصوديوم. إدارة 0.15 مل/20 غرام وزن الماوس (7.5 مغ/كغ).
- إعداد الحل المصبوغة نيون
- لتصور سحجه تحت الضوء الأزرق الكوبالت (الشكل 1)، استخدم حلاً فلورسنت. إعداد حل فلوريسسين 0.1% من الأولى قياس 10 مغ من الملح فلوريسسين مع مقياس جيد وثم إضافته إلى 10 مل في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
- حماية الحل فلوريسسين من الضوء ويهز لمدة 5 دقائق على شاكر.
ملاحظة: الحل فلوريسسين حساسة للضوء؛ يبقى الحل تغطيتها من الضوء. ويمكن تخزين هذا الحل في + 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. للاستخدام، يكون من المفيد وضع الحل فلوريسسين في زجاجة قطارة الذي يتم استخدامه لقطرات العين. استخدام عامل تصفية عقيمة عند نقل الحل إلى زجاجة القطارة.
- تنظيف تلميح لدغ العين قبل وبعد الاستخدام؛ مع برنامج تلفزيوني أولاً ثم مع 70% EtOH. إذا جعل التآكل للفئران عدة خلال العملية نفسها، القيام بخطوات التنظيف بين كل الماوس.
- وضع لوحة ساخنة على (+37 درجة مئوية) ووضع منشفة ورقية على ذلك.
2-القرنية الكشط
تحذير: استخدام ملابس واقية (قفازات، معطف مختبر) عند التعامل مع الفئران. وزن الماوس لتقدير حجم الدواء لإدارة.
- استخدم الأسلوب سكروفينج بيد واحدة للتعامل مع الماوس23. إدارة خليط الكيتامين-ميديتوميديني إينترابيريتونيلي (القائمة) إلى اليسار أسفل البطن. ضع الماوس على أقفاص فردية وانتظر حتى تغفو. وهذا يستغرق عادة أقل من 5 دقائق. ثم، بإدارة بوبرينورفين الأولى ومن ثم أتيباميزولي عن طريق الحقن القائمة. استخدام نفس الأسلوب المناولة.
ملاحظة: عندما يتم إعطاء التخدير، البروتوكول ينبغي أن لا يكون مؤقتاً في أي لحظة. - قبل المتابعة، تحقق من أن لوحة ساخنة دافئة. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على لوحة ساخنة. مستوى التخدير جيد إذا منعكس ذيل غائب، ولكن إصبع القدم المعاكسة الحالية. التحقق من ردود الفعل هذه معسر الذيل وأي أخمص القدمين مع الأصابع أو الملقط. لا تستخدم القوة المفرطة. وسوف تخدير آخر 20-25 دقيقة.
- لجعل كشط، استخدم لدغ العين تنظيفها. قم بتدوير القاعدة للدغ لتشغيل الاهتزاز التي أمر أساسي لجعل الكشط. يشعر الاهتزاز في متناول اليد، عندما يعمل لدغ بشكل صحيح.
- فتح عين واحدة في وقت واحد بعقد الجفون بشكل منفصل مع الأصابع. ثم إيمانا راسخا اللمس لدغ للقرنية ونقل الصك ذهابا وإيابا، وكذلك جانبية على سطح العين. سوف تؤدي إلى اهتزاز لدغ الصفر؛ ضغط، ويهز أو تمزق القرنية. في القرنية الوسطى، تكفي 20 كاشط الحركات على السطح للحث على الجرح. لا رفع لدغ ومحاولة للبقاء في منطقة القرنية أن تآكل. اكتساب الاحتكاك الحجم العادي سيتطلب عدة جولات من الممارسة.
ملاحظة: يمكن تحقيق أسيبسيس القرنية قبل الاحتكاك باستخدام حل تدين العيون.
3-التصوير الكشط
- تضيء المنطقة الحبيبات باستخدام حل fluorescein والأزرق الكوبالت القلم الضوء (الشكل 1). سطح العين يظهر عديم اللون في الضوء المحيط. بعد تطبيق فلوريسسين، فلوريسسيس منطقة الحبيبات باللون الأخضر عند إلقاء الضوء العين بالقلم الخفيفة.
- إذا لزم الأمر، بفتح العين الحبيبات وبالمثل كما هو الحال في 2.3 وإدارتها قطره واحدة لحل فلوريسسين من زجاجة القطارة. أغسل العين مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني أو 0.9% كلوريد الصوديوم للحد من خلفية فلوريسسين. استخدام زجاجة قطارة أو ماصة للغسيل. نضح السائل بعيداً مع مسح لينة وتنظيف الرموش، إذا لزم الأمر. عادة ما يجمع السائل الفائض إلى الحدود الآنف العين، والقرب من افتتاح القناة المسيل للدموع.
تحذير: تجنب لمس القرنية أثناء كليينينج كما يمكن أن يتسبب وسحجات طفيفة.
- إذا لزم الأمر، بفتح العين الحبيبات وبالمثل كما هو الحال في 2.3 وإدارتها قطره واحدة لحل فلوريسسين من زجاجة القطارة. أغسل العين مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني أو 0.9% كلوريد الصوديوم للحد من خلفية فلوريسسين. استخدام زجاجة قطارة أو ماصة للغسيل. نضح السائل بعيداً مع مسح لينة وتنظيف الرموش، إذا لزم الأمر. عادة ما يجمع السائل الفائض إلى الحدود الآنف العين، والقرب من افتتاح القناة المسيل للدموع.
- التقاط صور كشط القرنية.
- للحصول على صور مماثلة خلال كل دورة التصوير، استخدام أدوات مرفق ثابت للضوء القلم الأزرق الكوبالت وكاميرا SLR (الشكل 2). يوفر هذا البروتوكول إعداد التي من السهل أن تكرار (الشكل 2).
- لإرفاق على ضوء القلم والكاميرا، استخدام مصباح طاولة مع ذراع مرنة والمشبك وذراع كاميرا قابل لتعديل مع المشبك، على التوالي. القلم الخفيفة إلى الجدول مصباح والموقف فقط فوق العين الماوس ربط الكابل. الموضع الضوء بشكل مختلف قد يغير التصور من التآكل. ويرد في الشكل 2اقتراحا لوضع هذه الأدوات.
- استخدام كاميرا SLR لالتقاط صور للعين. وضع الحيوان في المسافة المطلوبة والموقف وتركيز الكاميرا (01:12) في ضوء الغرفة. وبعد ذلك، قم بإغلاق كافة أضواء أخرى إلا على ضوء القلم الأزرق الكوبالت.
ملاحظة: الشريط مؤشر القلم الخفيفة إلى أسفل أو استخدام شريط المطاطي للحفاظ على ضوء طوال الوقت أثناء التصوير. وهذا قد يساعد إذا تصبح الصورة ضبابية. فمن الأسهل لتنفيذ الخطوة التصوير مع زميل له.
- للحصول على صور مماثلة خلال كل دورة التصوير، استخدام أدوات مرفق ثابت للضوء القلم الأزرق الكوبالت وكاميرا SLR (الشكل 2). يوفر هذا البروتوكول إعداد التي من السهل أن تكرار (الشكل 2).
4-الاستيقاظ بعد "كشط القرنية"
- إدارة بوبرينورفين الأولى ومن ثم أتيباميزولي عن طريق الحقن القائمة. استخدام نفس الأسلوب معالجة كما هو الحال في 2.1.
- ضع قطره الفوسيدين المضادة للبكتيريا، العين حمض مرهم (إيساثال) لعيون الحبيبات وغير متآكل لترطيب والحفاظ سطح العين نظيفة من البكتيريا بعد التخدير.
- كما سوف تستيقظ الماوس في 5-20 دقيقة على لوحة ساخنة، مراقبة الماوس أثناء فترة الاستيقاظ بعد التخدير. عندما يصبح الجوال، وضعه في قفص حدة.
ملاحظة: إذا كان الاستيقاظ وقتاً أطول، ضع الماوس في القفص مع وسادة ساخنة أو مكان القفص كامل على صفيحة ساخنة ورصد الماوس بشكل منتظم. حين يلبس التخدير، الماوس عادة ما يهز وتصل إلى أعلى مع الجسم الأمامي. هذا السلوك ينبغي أن تعود إلى طبيعتها في 3-4 ساعات وبعد ذلك يمكنك وضع الماوس مرة أخرى إلى قفص مشتركة. - إدارة القائمة والايبوبروفين مرهم العين والتسكين في يومين متتاليين بعد الكشط، وبالمثل كما هو الحال في الخطوات 2.2. و 4-2.
5-التصوير أثناء التئام
- في هذا البروتوكول، يشير استخدام الوقت 18 ح وح 72 بعد كشط لمراقبة إغلاق الجرح.
- لتصوير متتالية، تخدير الفئران كما هو موضح في 2.2.
- التقاط الصور كما هو موضح في 3.
- استيقظ الحيوانات مع القائمة أتيباميزولي ورصد فترة التنبيه كما هو موضح في 4.3.
ملاحظة: إذا لم يكن استمرار المتابعة، euthanize الفأرة اليمين بعد 5.1.2. ويرد وصف القتل الرحيم في 6-1.
6-القرنية جمع ودمج البارافين
- بعد النقطة الزمنية الأخيرة، التضحية بالحيوان. ضع الماوس في دائرة التي يمكن أن تملأ بأول أكسيد الكربون2. ملء الهواء الدائرة مع شركة2- عندما يكون الحيوان غير متحرك، انخﻻع فقرات عنق الرحم بسحب بشدة من قاعدة الذيل والضغط على منطقة الرقبة لأسفل في نفس الوقت.
تنبيه: دائماً اتبع المبادئ التوجيهية للهيئة المحلية الرفق بالحيوان. - جمع مقلة العين كلها بقطع فتحه في الجلد إلى جانب العين مع مقص التشريح. وضع المقص تحت مقلة العين وقطع العصب العين لموسيقى البوب مقلة العين الخروج من المدار. استخدام الملقط إذا العين لا يخرج بسهولة.
- جعل ثقب في الجزء الخلفي العين، ومن ناحية الشبكية، مع إبرة ز 26 للسماح بتغلغل خالية من الحلول داخل العين.
ملاحظة: لا تدع العين تصبح جافة، وبدلاً من ذلك، ووضعه في برنامج تلفزيوني حتى تواصل مع البروتوكول.
- جعل ثقب في الجزء الخلفي العين، ومن ناحية الشبكية، مع إبرة ز 26 للسماح بتغلغل خالية من الحلول داخل العين.
- جمع مقلة العين في أنبوب 2 مل مع برنامج تلفزيوني. عدم إيقاف التجربة في هذه المرحلة.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح مقل العيون في 4% بارافورمالدهيد (PFA) في + 4 درجة مئوية لمدة 4-5 ساعات.
- تحريك مقلة العين الثابتة لكاسيت أنسجة لمعالجة الأنسجة. استخدام أنسجة تجهيز الجهاز والبرنامج التالي:
- شطف مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان 2 × 45 دقيقة في الإيثانول 70% في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان ح 2 × 1 في الإيثانول 94% عند درجة حرارة الغرفة.
- احتضان 3 × 45 دقيقة في الإيثانول المطلقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان ح 3 × 1 في زيلين نفط، في درجة حرارة الغرفة وزيلين نفط آخر في 37 درجة مئوية.
- احتضان ح 3 × 1 في شمع البارافين في 60 درجة مئوية.
- وبعد تجهيز الأنسجة، تضمين مقلة العين في البارافين السائل (+ 60 درجة مئوية) باستخدام كتلة أنسجة تضمين. ضع العين داخل الكتلة بحيث أنها تبحث جانبياً ويواجه الحدود المحيطية صعودا. واسمحوا كتلة يصلب على طبق بارد لمدة 5-10 دقائق.
7-البارافين المقاطع القرنية
- إعداد مبضع لتقطيع وفقا لتعليمات المؤسسة أو الشركة المصنعة.
تنبيه: كن حذراً عند التعامل مع بليد مبضع حادة. - مكان واحد للمياه حمام مع درجة حرارة الغرفة الماء عالي النقاوة بجوار مبضع وآخر مع الماء عالي النقاوة تسخينها إلى + 50 درجة مئوية.
- إجراء 5 ميكرومتر أبواب سميكة من مقلة العين.
ملاحظة: العدسة يكسر بسهولة خلال تمزيقها. لتجنب هذا، مسح سطح القطع مع أنسجة رطبة في كل مرة يتم بدء تشغيل صف جديد من المقاطع. استخدام مياه الحنفية إلى ترطيب الأنسجة. - وضع المقاطع بجانب بعضها البعض في حوض ماء في درجة حرارة الغرفة وقم بنقلها إلى حمام الماء الساخن مع المساعدة من شريحة زجاجية. تمتد المقاطع في حمام الماء الساخن حتى الاسترخاء جميع التجاعيد ومأتى الأقسام تصبح.
- الجاف للشرائح الزجاجية مع المقاطع بين عشية وضحاها في +37 درجة مئوية.
- إرفاق المقاطع إلى الشرائح بحفظ الشريحة لمدة 1 دقيقة على صفيحة ساخنة في + 60 درجة مئوية. وبعد ذلك، المقاطع يمكن مباشرة المجهزة لتلطيخ، أساليب إيمونوهيستولوجيكال أو تخزينها في + 4 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف نموذج إلحاق ضرر كشط القرنية الماوس هذا البروتوكول وتشير إلى كيفية متابعة ووضع تصور لعملية الشفاء بعد الكشط. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذا الأسلوب لدراسة دور الخلايا القرنية الظهارية السلف خلال الجرح الشفاء6. استخدام أدوات المنشأة هو المفتاح لتجربة التآكل ناجحة. ونحن وآخرون، استخدمت لدغ العين الجيربروش الثاني (الشكل 1) لأداء7،،من6وسحجات24. هذه الأداة قد تلميح لدغ المتبلدة من 0.5 مم في الحجم الذي فرش بدلاً من التدريبات أو مقصات ظهارة القرنية بعيداً. وهكذا، هذه الأداة هو الخيار الموصى به لإصابة التآكل على القرنية.
جزءا أساسيا من هذا النموذج أن المنطقة المتضررة يمكن تصور دون عناء في الفواصل الزمنية المطلوبة. في الشكل 3 ألف، نقدم استخدام fluorescein تلطيخ في تركيبة مع مصدر ضوء أزرق الكوبالت (الشكل 1) لعرض الموقع التآكل. في هذه التجربة، أجرينا كبير الجرح في القرنية المركزية وتركت لم يمسها القرنية الطرفية (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، نحن فقط العين اليسرى فأرة الحاسوب كل متآكل وإبقاء العين اليمنى، والثنائية كعنصر تحكم غير متآكل. عينات العين الثنائية ظلت سلبية بالنسبة لإشارة فلوريسسين، مما يوحي بعدم الخضوع لأي خسارة في الخلية أثناء التجربة وهكذا تعمل أيضا كعينات مراقبة. ومع ذلك، عرض إشارة خضراء في حدود العين الحل fluorescein التي تراكمت في مفترق الطرق بين العين والجفن. التآكل كان أكبر في ح 0، مباشرة بعد الإصابة (الشكل 3A). وكان ملحوظ أصغر بعد 18 ساعة، وفي هذه الحالة، يقع بالقرب من الحد العلوي للعين. ومع ذلك، يغلق الظهارة المنطقة المكشوفة بسرعة متساوية من جميع الأطراف للتآكل. جدير بالذكر، في مرحلة ما بعد إصابة ح 72، كانت لا إشارة خضراء مرئية. يشير هذا إلى أن ظهارة القرنية كان تماما إعادة متظهرنه من ح 72 بعد التآكل.
مع هذا الأسلوب، ونحن تهدف إلى تركيز الكشط فقط في ظهارة القرنية، حيث أن طبقات أعمق من القرنية لا تزال سليمة. إزالة ظهارة القرنية كان واضحا من أقسام نسيجية في الشكل 3B. في ح 0، يتم إظهار حافة الكشط افريز اللاخلوي الضيقة، وهو مستمر من عادية، 4-5 خلية طبقات سميكة ظهارة القرنية. ليمبوس، الحدود المحيطية ظهارة القرنية، يعرض منطقة مثال الذي لم يتأثر بالتآكل خلال كامل الفترة الزمنية التجريبية (ح 72). وباﻹضافة إلى ذلك، أوضحت مقاطع نسيجية أن طبقات أعمق من القرنية وفي سدى والبطانة، كانوا لا يتضرر لدغ العين. هذه الأنسجة اثنين تبدو مشابهة في عينات العين الحبيبات والثنائية. في ح 18 ما بعد الإصابة، تنشط عملية الشفاء وإعادة ابيثيلياليزيشن مستمرة. واقترح هذا بظهور على حافة الرائدة. الرائدة يحتوي على فقط 1-2 الخلايا الظهارية طبقات وتغطي المنطقة المكشوفة قبل أن يمكن أن تحدث إعادة التقسيم الطبقي25. تمشيا مع النتائج في الشكل 3 ألف، على السطح كان تماما إعادة متظهرنه قبل 72 ساعة، عند ترحيل الجبهات قد غطى الجرح وجميع الطبقات الظهارية، مرة أخرى، هذا. وأكد مقاطع نسيجية من العين ثنائية (الشكل 3A) أن عيون الرقابة ظلت سليمة أثناء فترة المراقبة.
وأخيراً، نحن نقدم الأدلة أن نموذج كشط يقتصر على ظهارة القرنية وعدم التذرع باستجابة stromal للإصابة، مثل نيوفاسكولاريزيشن. ويبين الشكل 4 بعد كشط القرنية مورين في ح 18. استناداً إلى رأي العيانية، لم يتم عرض هذه النقطة وقت استجابة stromal، مما يدل على أن لدينا البروتوكول يخل بطبقات القرنية أعمق. في المقارنة، فعل إصابة قلوية مع 0.75 مول/لتر هيدروكسيد الصوديوم فورا neovascularization في سدى. نظراً نيوفاسكولاريزيشن السريع في إصابة القلوية، النقاط الزمنية في الطريقة تقديم أدلة ليستبعد إمكانية الاستجابة في ستروما.
رقم 1: أدوات أساسية كشط القرنية الظهارية. على اليسار لدغ العين تهتز. ويستخدم الضوء الأزرق الكوبالت القلم في الحق لجلب وصمة عار واضحة fluorescein. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التصوير كشط القرنية. (أ) أدوات للتصوير هي ذراع كاميرا قابل لتعديل مع المشبك (يسار) وكاميرا SLR (في الوسط) ومصباح طاولة مع ذراع مرنة والمشبك (يمين). مرتبطة قبة المصباح الضوء القلم الأزرق الكوبالت مع العلاقات الكابل اثنين. (ب) نظرة عامة لبرنامج الإعداد التصوير؛ يتم وضع علامة المسافة من كل أداة مرفق في الصورة في سم. كلا المشابك 6 سم بعيداً عن لوحة الحرارة ويتم وضع الماوس 10 سم بعيداً عن حافة لوحة الحرارة. (ج) نظرة متفحصة على تصوير الاحتكاك مع المسافة المقترحة وموقف للعين الماوس في سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الكشف والترجمة كشط القرنية. (أ) عيون الماوس في 0، 18 و 72 ح بعد الكشط. إشارة fluorescein علامات منطقة الحبيبات الأخضر الساطع، في حين تظل جميع المناطق الأخرى في ظهارة الظلام. عيون الثنائية بمثابة عناصر التحكم. خط متقطع يمثل حدود الجرح، وبقعة بيضاء في كل عين هو الانعكاس من الكاميرا. (ب) الأشيع مقطوع وتوضع وويوزين الملون عينات عيون الماوس في 0, 18 و 72 ح بعد الكشط. ليمبوس هي الحدود التي تحيط ظهارة القرنية من جميع الجوانب. استريكس علامات حافة التآكل. شريط الحجم هو 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: كشط القرنية لا تنشيط استجابة stromal. التعرض القلوية مع 0.75 مول/لتر هيدروكسيد الصوديوم متبوعاً بالري مع 0.9% كلوريد الصوديوم تنتج neovascularization القرنية (العين جمعها مباشرة بعد المعالجة). يظهر الاحتكاك مع لدغ العين لا نيوفاسكولاريزيشن حتى بعد حاء 18 كشط موقع يتميز بخط متقطع. تغيير حجم شريط 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أساليب إصابة أدوات شعبية لدراسة مختلف جوانب التوازن القرنية والأمراض. يوفر الطراز كشط أسلوب التحكم جيدا لمعالجة المشاكل ذات الصلة في طب العيون. ومع ذلك، بعض النقاط الحرجة في البروتوكول يجدر التشديد. جدير بالذكر أن التفاصيل المحددة فيما يتعلق بالطب البيطري، والجرح الشفاء الجدول الزمني، والنتيجة هي الأمثل للاستخدام مع الأرصدة الرنين والممثل المدني الدولي أووتبريد، ولكن قد تختلف بين سلالات من الفئران26. مع هذا البروتوكول، سوف تظل الحيوانات التجريبية أنيسثيتيزيد لمدة 20 دقيقة تقريبا. وهذا يعطي نافذة قصيرة لكنها كافية من الوقت للقيام التآكل. ومع ذلك، عند استخدام لدغ العين، مما يجعل الجرح نفسه هو عملية سريعة جداً وينبغي أن يكون من الممكن إجراء في هذا الإطار الزمني.
التصور سهلة ويمكن الوصول إليها واحدة من المزايا الرئيسية لنموذج التآكل. جنبا إلى جنب مع طرق البيولوجيا الجزيئية، وهذا يفتح إمكانيات لدراسة الخلايا الظهارية في قدر كبير من التفصيل. يمكن معالجة القرنيات الحبيبات لغذائها أو المناعية تلطيخ والبروتينات أو الأحماض النووية يمكن جمعها والمزيد من الدراسة. بيوش-غانجي et al. وأظهر ذلك الجين أنماط التعبير في تغيير الخلايا الظهارية القرنية عند إهانة القرنية مع بليد المتبلدة27. للتأكد من أخذ العينات الخاضعة للرقابة، نوصي بأن يتم أخذ صور للجروح بعد العملية مباشرة ومجموعات عينة اتباع الجداول الزمنية المخططة بالضبط.
هذا البروتوكول قد يستخدم بعد دراسة ابيثيلياليزيشن القرنية. على سبيل المثال، قد تستخدم كشط القرنية ليمبوس، مكانة الخلايا الجذعية القرنية، لدراسة ديناميات الخلايا الجذعية7. لقد أظهرنا أن المنطقة غير متآكل الظهارة ظلت طبيعية خلال عملية الشفاء، ومع ذلك يدعى بعض المؤلفين أن الغشاء الطابق السفلي والكامنة وراء كيراتوسيتيس stromal تتأثر العين لدغ24،28. ويمكن تقدير إزالة الغشاء الطابق السفلي مع تلطيخ الغشاء محددة. وعلاوة على ذلك، وسحجات المتكررة على مدى زمني أطول يمكن أن تكشف عن أنماط الشفاء مثيرة للاهتمام. في هذا البروتوكول، ونحن لم يلاحظ بنية الظهارة خلال عملية مطاردة طويلة الأجل. كل مبلد مشرط وإصابات العين لدغ أظهرت زيادة في حدوث تقرحات القرنية على بعد واحد لعدة أسابيع بعد إصابة24،،من2930. وينبغي أن يوضع ذلك في الاعتبار عند استخدام نموذج الكشط للدراسات الطويلة الأجل. غير أن الدراسات التي تركز على تقرحات القرنية قد تجد هذا البروتوكول مفيدة.
وترد نماذج أخرى مما أسفر عن إصابة مطولاً في ستيب et al. ، في استعراض5. معا، هذا البروتوكول والنهج القائمة التي توفر خيارات متعددة لدراسة كل المسائل البيولوجية الأساسية، فضلا عن المشاكل السريرية العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر عكلة كيسه لها المساعدة التقنية لا تقدر بثمن ومساعدة الثاقبة عند تفعيل هذا الأسلوب كذلك في وقت لاحق أثناء التنفيذ على أسئلتنا البحوث المركزية. ونود أيضا أن أشكر مركز الحيوانات المختبرية وأنا ميلر لمساعدة لها مع تخطيط المبادئ التوجيهية لعمل الطب البيطري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
