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Medicine

कॉर्निया घाव भरने के लिए एक मॉडल के रूप में आंख गड़गड़ाहट के साथ Corneal उपकला घर्षण

doi: 10.3791/58071 Published: July 10, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए माउस की आंख की सतह को एक घर्षण दण्ड, और उसके बाद घाव भरने की प्रक्रिया का पालन करें । प्रोटोकॉल एक आंख गड़गड़ाहट का लाभ लेता है के लिए आंशिक रूप से anaesthetized चूहों में आंख की सतह उपकला हटा दें ।

Abstract

murine कॉर्निया घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । कॉर्निया आंख की सबसे बाहरी परत है, और इस तरह चोट करने के लिए पहली रक्षा है । वास्तव में, आंख की चोट क्लिनिक में पाया का सबसे आम प्रकार एक corneal घर्षण है । यहां, हम एक आंख गड़गड़ाहट का उपयोग करने के लिए एक anesthetized चूहों पर vivo में corneal उपकला को हटाने में जिसके परिणामस्वरूप घर्षण प्रेरित । इस विधि लक्षित और reproducible उपकला व्यवधान के लिए अनुमति देता है, अन्य क्षेत्रों को बरकरार छोड़. इसके अलावा, हम fluorescein धुंधला के साथ abraded उपकला के दृश्य का वर्णन और कैसे abraded कॉर्निया कल्पना करने के लिए पर ठोस सलाह प्रदान करते हैं । फिर, हम घाव भरने की समय रेखा का पालन करें 0, 18, और ७२ एच घर्षण के बाद, जब तक घाव re-epithelialized है । corneal चोट की उपकला घर्षण मॉडल उपकला कोशिका प्रसार, प्रवास और corneal परतों के पुनः epithelialization पर अध्ययन के लिए आदर्श है. हालांकि, इस विधि घाव भरने के दौरान stromal सक्रियण का अध्ययन करने के लिए इष्टतम नहीं है, क्योंकि नेत्र गड़गड़ाहट stromal कोशिका परतों में घुसना नहीं है । इस विधि भी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, उदाहरण के लिए, दवा प्रभावशीलता के पूर्व नैदानिक परीक्षण.

Introduction

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कई अंगों की उपकला परतों चोटों को उजागर कर रहे हैं. हालांकि, वे भी घाव भरने के माध्यम से ऊतक नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति करने की क्षमता होते हैं । कॉर्निया घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । यह आंख की बाहरी सतह रूपों और संवेदनशील नेत्र मशीनरी के लिए एक सुरक्षात्मक परत प्रदान करता है । इस प्रकार, कॉर्निया रोगजनकों और पानी के नुकसान के लिए एक शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है । यह तीन परतों से बना है; उपकला, स्ट्रोमा और endothelium. कॉर्निया की उपकला कॉर्निया की सबसे बाहरी परत बनाता है । उपकला कोशिकाओं तंग जंक्शनों के माध्यम से एक दूसरे के लिए कड़ाई से पालन करके कॉर्निया के बैरियर समारोह बनाए रखने1,2,3. एक acellular corneal तहखाने झिल्ली, बोमन की झिल्ली, व्यापक स्ट्रोमा है, जो दुर्दम्य keratocytes शामिल से उपकला अलग । स्ट्रोमा के तहत, endothelial कोशिकाओं के पोषक तत्वों, पानी और ऊपरी परत को ऑक्सीजन चैनल ।

Corneal घर्षण क्लिनिक4में बहुत आम हैं । कॉर्निया के लिए चोटों विविध रहे हैं, लेकिन मोटे तौर पर ऐसे धूल या रेत, खरोंच, या अंय विदेशी वस्तुओं के रूप में छोटे कणों की वजह से कर रहे हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित corneal उपकला घर्षण के एक नैदानिक प्रासंगिक प्रकार reproducing करना है । ऐसा करने में, इस प्रोटोकॉल चिकित्सकों और corneal वैज्ञानिकों के लिए एक नियंत्रणीय और लाभदायक विधि प्रदान करता है अपने अध्ययन में लागू । हम एक सुस्त नेत्र गड़गड़ाहट के साथ ऊतक abrading द्वारा vivo murine कॉर्निया पर चोट की मरंमत परख में एक प्रदर्शन किया है, Algerbrush द्वितीय । यहाँ, हम केवल केंद्रीय corneal उपकला के लिए घर्षण लक्ष्य और नुकसान के बिना अंग के अन्य भागों छोड़. इस प्रकार, प्रोटोकॉल corneal उपकला कोशिका गतिशीलता या फिर से epithelialization के दौरान तहखाने झिल्ली का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, सेल प्रवास, प्रसार और vivo5में भेदभाव. हाल ही में, इस मॉडल के लिए murine कॉर्निया में जनक सेल गतिशीलता का विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुनः में विभेदित corneal उपकला कोशिकाओं की क्षमता का अनावरण करने के लिए उपयोग किया गया corneal6,7चोट के बाद स्टेम सेल आला स्थापना । घर्षण के बाद, कॉर्निया अपने सामांय पारदर्शिता और तंयता ताकत के लिए देता है । दिलचस्प है, इन विट्रो में एक अध्ययन संकेत दिया कि फिर से epithelialization वृद्धि हुई सेल प्रसार8के बिना होता है । इस प्रोटोकॉल murine कॉर्निया में निर्बाध चिकित्सा की समयरेखा का वर्णन । विधि इस प्रकार चिकित्सा पैटर्न और गति पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू है ।

कॉर्निया बड़े पैमाने पर घाव भरने के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, कई अध्ययनों ने चोट के दूसरे मॉडलों पर भरोसा जताया है । corneal चोट का एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल alkaline जला है कि सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के साथ या बिना फ़िल्टर कागज corneal सतह9पर लागू करने के द्वारा किया जाता है । एक बड़े और फैलाना चोट है कि न केवल corneal उपकला को प्रभावित करता है, लेकिन यह भी कंजाक्तिवा और स्ट्रोमा9,10में alkaline जोखिम परिणाम । मजबूत alkaline समाधान corneal अल्सर, opacification, और neovascularization9प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । भड़काऊ कोशिकाओं स्ट्रोमा आमतौर पर 6 घंटे के भीतर आक्रमण और 24 ज11तक वहां रहते हैं । इस प्रकार, alkaline चोट stromal सक्रियण से संबंधित अध्ययन में एक उचित तरीका है । रासायनिक चोट का एक अंय प्रकार के कॉर्निया9,10पर dimethyl sulfoxide (DMSO) लागू करने से दण्डित किया जा सकता है । अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया चोट मॉडल चीरा घाव है कि स्ट्रोमा और keratectomy घावों, जो स्ट्रोमा14,15के ऊपरी हिस्से तक ही सीमित है के माध्यम से घुसना शामिल हैं । इन तरीकों को भी stromal घाव भरने के बारे में सवालों के जवाब उपयोगी हैं । अलग चोट मॉडल अपने स्वयं के फायदे और नुकसान है । घर्षण, या corneal उपकला की दुल्हन, पहले पूर्व vivo कॉर्निया16पर सुस्त नश्तर या ब्लेड का उपयोग कर विकसित किया गया था । इस विधि में बाद में माउस, चूहा, और खरगोश17,18,19,20,21,22पर vivo में उपयोग किया गया है । आंख गड़गड़ाहट का प्रयोग (1 चित्रा), हम उपकला की केवल एक चयनित क्षेत्र को हटाने, अप्रभावित उपकला के बाकी छोड़. इस तरह, यह ठीक कॉर्निया के विभिन्न भागों के लिए उपकला हटाने को लक्षित करने के लिए संभव है. इसके अलावा, घर्षण आकार fluorescein धुंधला के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, यहां हम चिकित्सा अवधि के दौरान घर्षण बंद का पालन करें ।

इस विधि कई फायदे बन गया, मैं) घर्षण साइट है, जो रासायनिक चोट, द्वितीय के साथ संभव नहीं है की सटीक स्थान सहित) घर्षण प्रदर्शन करने के लिए जल्दी है, और iii) यह गैर इनवेसिव है । इस के साथ साथ, हम एक मॉडल के रूप में नस्ल NMRI माउस का उपयोग कर विधि का वर्णन है, लेकिन यह माउस आनुवंशिक मॉडल के विशाल सरणी के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही साथ चूहे और खरगोश, जो आम मानव corneal व्यवधान का अध्ययन करते थे मॉडल हैं ।

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Protocol

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सभी प्रयोगों को राष्ट्रीय पशु प्रयोग बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया जाता है.

1. तैयारी

  1. सभी समाधान तैयार है और कमरे के तापमान में रखने के लिए, जब तक अंयथा संकेत दिया । उपयोग की गई सामग्रियों और समाधानों को निपटाने के लिए अपशिष्ट निपटान विनियमों का पालन करें ।
  2. NMRI और ICR का उपयोग शेयर, उंर के बीच 4-12 सप्ताह और या तो लिंग । C57BL/6 दबाव का उपयोग करते हैं, तो चरण 1.3.2 में ketamine-medetomidine तैयारी विधि का पालन करें । अंय चरणों के लिए, 1.3.3.-1.3.5 में वर्णित निर्देशों का पालन करें ।
  3. आपरेशन शुरू करने से पहले पशु चिकित्सा ताजा और समय में तैयार करते हैं । Carprofen का उपयोग बाद में किया जाएगा, इस प्रकार यह आवश्यक नहीं है कि यह इस बिंदु पर तैयार हो.
    1. संज्ञाहरण के लिए ketamine-medetomidine का एक समाधान तैयार करने के लिए, ०.३७५ मिलीलीटर (शेयर एकाग्रता ५० mg/ketamine (Ketaminol पशु चिकित्सक) की ०.२५ मिलीलीटर (स्टॉक एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल) के साथ medetomidine (Cepetor पशु चिकित्सक) का मिश्रण है और १.२५ मिलीलीटर बाँझ ०.९% NaCl जोड़ें । प्रशासन ०.१५ एमएल/माउस वजन के 20 जी (७.५ मिलीग्राम/किग्रा, ketamine और 1 मिलीग्राम/kg, medetomidine) ।
    2. C57BL/6 चूहों पर संज्ञाहरण के लिए ketamine-medetomidine का एक और अधिक पतला समाधान तैयार करने के लिए, ०.३७५ मिलीलीटर (शेयर एकाग्रता ५० मिलीग्राम/एमएल) के साथ ketamine के ०.२५ मिलीलीटर (स्टॉक एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल) के medetomidine और जोड़ने के २.५ मिलीलीटर बाँझ की ०.९% NaCl । प्रशासन ०.१५ एमएल/20 माउस वजन के जी (३.७५ मिलीग्राम/किग्रा, ketamine और ०.५ मिलीग्राम/kg, medetomidine) ।
      नोट: यह केवल वयस्क C57BL/6 चूहों के लिए एक वैकल्पिक कदम है ।
    3. analgesia के लिए buprenorfin तैयार करने के लिए, ०.१ मिलीलीटर (शेयर एकाग्रता ०.३ मिलीग्राम/एमएल) buprenorfin के १.९ मिलीलीटर बाँझ ०.९% NaCl जोड़ें । प्रशासन ०.२ एमएल/20 जी माउस वजन (०.१५ मिलीग्राम/
    4. atipamezole संज्ञाहरण के लिए तैयार करने के लिए, जोड़ें ०.१ मिलीलीटर (शेयर एकाग्रता 5 मिलीग्राम/एमएल) atipamezole के ४.९ मिलीलीटर ०.९% NaCl । प्रशासन ०.१५ एमएल/20 जी माउस वजन (०.७५ मिलीग्राम/
    5. बाद संज्ञाहरण उपयोग carprofen के दौरान analgesia के लिए । ०.१ मिलीलीटर (शेयर एकाग्रता ५० मिलीग्राम/carprofen के ४.९ मिलीलीटर के लिए ०.९% NaCl जोड़ें । प्रशासन ०.१५ एमएल/20 माउस वजन के जी (७.५ मिलीग्राम/
  4. फ्लोरोसेंट धुंधला समाधान तैयार
    1. कोबाल्ट नीले प्रकाश (चित्रा 1) के तहत घर्षण visualizing के लिए, एक फ्लोरोसेंट समाधान का उपयोग करें । पहले 10 मिलीग्राम fluorescein नमक को मापने के द्वारा एक ०.१% fluorescein समाधान तैयार एक ठीक पैमाने के साथ और फिर यह फॉस्फेट बफर खारा समाधान (पंजाब) में 10 मिलीलीटर में जोड़ें ।
    2. प्रकाश से fluorescein समाधान की रक्षा और एक शेखर पर 5 मिनट के लिए हिला ।
      नोट: fluorescein समाधान प्रकाश-संवेदी है; प्रकाश से आच्छादित समाधान रखें । यह समाधान 2-3 दिनों के लिए + 4 ° c में संग्रहित किया जा सकता है । उपयोग के लिए, यह एक ड्रॉपर बोतल है कि नेत्र बूंदों के लिए प्रयोग किया जाता है में fluorescein समाधान जगह मददगार है । एक बाँझ फिल्टर का प्रयोग करें जब ड्रॉपर बोतल के लिए समाधान चलती है ।
  5. साफ आंख गड़गड़ाहट टिप से पहले और उपयोग के बाद; पहले पंजाबियों के साथ और फिर ७०% ेतोः के साथ । यदि एक ही कार्रवाई के दौरान कई चूहों को एक घर्षण बनाने, प्रत्येक माउस के बीच सफाई कदम है ।
  6. पर गरम प्लेट रखो (+ ३७ डिग्री सेल्सियस) और उस पर एक कागज तौलिया जगह है ।

2. Corneal घर्षण

चेतावनी: चूहों को संभालने जब सुरक्षात्मक पहनते हैं (दस्ताने, लैब कोट) का उपयोग करें. प्रशासन के लिए दवा की मात्रा का अनुमान करने के लिए माउस तौलना.

  1. 23माउस को हैंडल करने के लिए एक-हाथ scruffing विधि का उपयोग करें । प्रशासन ketamine-medetomidine मिश्रण intraperitoneally (आईएफसआई) बाएं निचले पेट के लिए । एक व्यक्ति के पिंजरे में माउस प्लेस और यह सो गिरने के लिए रुको । यह आमतौर पर 5 मिनट से कम लेता है । फिर, प्रशासन पहले buprenorfin और फिर आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से atipamezole । एक ही हैंडलिंग तकनीक का प्रयोग करें ।
    नोट: एक बार संज्ञाहरण दिया जाता है, प्रोटोकॉल किसी भी क्षण में रोका नहीं जाना चाहिए ।
  2. जारी रखने से पहले, जांच लें कि गर्म थाली गर्म है । anesthetized माउस को गरम प्लेट पर रखें । संज्ञाहरण का स्तर अच्छा है अगर पूंछ पलटा अनुपस्थित है, लेकिन पैर की अंगुली पलटा मौजूद है । पूंछ और उंगलियों या संदंश के साथ किसी भी पैर की अंगुली चुटकी द्वारा इन सजगता की जाँच करें । अत्यधिक बल प्रयोग न करें । संज्ञाहरण 20-25 मिनट पिछले जाएगा ।
  3. एक घर्षण बनाने के लिए, साफ नेत्र गड़गड़ाहट का उपयोग करें । घर्षण बनाने के लिए आवश्यक है कि कंपन पर बारी करने के लिए गड़गड़ाहट का आधार घुमाएँ । हाथ में कंपन महसूस, जब गड़गड़ाहट ठीक से काम कर रहा है ।
    1. उंगलियों के साथ अलग से पलकों को पकड़ कर एक बार में एक आंख खोलें । फिर दृढ़ता से कॉर्निया के लिए गड़गड़ाहट को छूने और साधन आगे और पीछे के रूप में अच्छी तरह से आंख की सतह पर बग़ल में कदम । गड़गड़ाहट कंपन खरोंच प्रदर्शन करेंगे; प्रेस मत करो, हिला या कॉर्निया आंसू । केंद्रीय कॉर्निया में, 20 abrading आंदोलनों सतह पर घाव पैदा करने के लिए पर्याप्त हैं । गड़गड़ाहट नहीं उठा और कॉर्निया के क्षेत्र में रहने के लिए abraded होने की कोशिश करो । एक मानक आकार घर्षण प्राप्त अभ्यास के कई दौर की आवश्यकता होगी ।

    नोट: Corneal asepsis betadine नेत्र समाधान का उपयोग करके घर्षण से पहले प्राप्त किया जा सकता है ।

3. इमेजिंग घर्षण

  1. कोबाल्ट ब्लू पेन लाइट (चित्रा 1) और fluorescein समाधान का उपयोग कर abraded क्षेत्र को रोशन करें । आंख की सतह परिवेश प्रकाश में बेरंग दिखाई देता है । fluorescein आवेदन के बाद abraded क्षेत्र को ग्रीन में fluoresces जब पेन लाइट के साथ आंखों को रोशन करते हैं ।
    1. यदि आवश्यक हो, abraded आंख इसी तरह के रूप में २.३ में खोलें और ड्रॉपर बोतल से fluorescein समाधान की एक बूंद प्रशासन । पंजाबियों या ०.९% NaCl के साथ एक बार आंख धो fluorescein की पृष्ठभूमि को कम करने के लिए । एक ड्रॉपर बोतल या धोने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें । महाप्राण तरल दूर एक नरम पोंछे के साथ और बरौनी साफ, अगर जरूरत है । अतिरिक्त तरल आमतौर पर आंख की नाक सीमा को इकट्ठा, बंद आंसू नहर के उद्घाटन के लिए ।
      चेतावनी: कॉर्निया को छूने से बचें जबकि मामूली खरोंच के रूप में cleaining प्रेरित किया जा सकता है ।
  2. corneal घर्षण की तस्वीरें ले लो ।
    1. प्रत्येक इमेजिंग सत्र के दौरान इसी तरह की छवियों को प्राप्त करने के लिए, कोबाल्ट नीले पेन प्रकाश और एसएलआर कैमरा (चित्रा 2) के लिए स्थिर लगाव उपकरण का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल को दोहराने के लिए आसान है कि एक सेटअप प्रदान करता है (चित्रा 2) ।
      1. कलम प्रकाश और कैमरा संलग्न करने के लिए, एक लचीला हाथ और दबाना और एक क्लैंप के साथ एक समायोज्य कैमरा हाथ, क्रमशः के साथ एक टेबल लैंप का उपयोग करें । केबल-टेबल लैंप और माउस आंख के ऊपर की स्थिति के लिए कलम प्रकाश टाई । प्रकाश स्थिति अलग ढंग से घर्षण के दृश्य को बदल सकता है । स्थिति के लिए एक सुझाव इन उपकरणों चित्रा 2में वर्णित है ।
    2. आंखों की तस्वीरें लेने के लिए एसएलआर कैमरे का उपयोग करें । एक वांछित दूरी और स्थिति में पशु प्लेस और कमरे प्रकाश में कैमरा (1:12) ध्यान केंद्रित । उसके बाद कोबाल्ट ब्लू पेन लाइट को छोड़कर अन्य सभी लाइट्स बंद कर दीजिये ।
      नोट: टेप पेन लाइट हैंडल नीचे या इमेजिंग के दौरान सभी समय पर प्रकाश रखने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें । छवि मंदता हो जाती है, तो यह मदद हो सकती है । किसी सहकर्मी के साथ इमेजिंग चरण निष्पादित करना सबसे आसान है ।

4. जागने के बाद Corneal घर्षण

  1. प्रशासन पहले buprenorfin और फिर आईएफसआई इंजेक्शन के जरिए atipamezole. २.१ में के रूप में ही हैंडलिंग तकनीक का प्रयोग करें ।
  2. जीवाणुरोधी की एक बूंद प्लेस, fucidin एसिड नेत्र मरहम (Isathal) दोनों abraded और गैर abraded आँखों के लिए moisturize और संज्ञाहरण के बाद आंख की सतह बैक्टीरिया से साफ रखने के लिए.
  3. के रूप में माउस को गरम प्लेट पर 5-20 मिनट में जाग जाएगा, पोस्ट संवेदनाहारी जगा अवधि के दौरान माउस का निरीक्षण । जब यह मोबाइल हो जाता है, यह एक व्यक्ति के पिंजरे में जगह है ।
    नोट: यदि जागते समय लगता है, एक गर्म पैड के साथ पिंजरे में माउस जगह या गर्म प्लेट पर पूरे पिंजरे जगह है और नियमित रूप से माउस की निगरानी । जबकि संज्ञाहरण बंद पहनता है, माउस आम तौर पर हिलाता है और पूर्वकाल शरीर के साथ ऊपर की ओर पहुंचता है । यह व्यवहार 3-4 घंटे में सामांय करने के लिए वापस जाना चाहिए और फिर आप माउस को एक साझा पिंजरे में वापस रख सकते हैं ।
  4. carprofen आईएफसआई analgesia और आंख मरहम के लिए लगातार दो दिनों के बाद घर्षण, इसी तरह के रूप में २.२ चरणों में । और ४.२.

5. घाव भरने के दौरान इमेजिंग

  1. इस प्रोटोकॉल में, घाव बंद का पालन करने के लिए घर्षण के बाद समय अंक 18 एच और ७२ एच का उपयोग करें ।
    1. लगातार इमेजिंग के लिए, anesthetize चूहों के रूप में समझाया २.२ में ।
    2. 3 में समझाया के रूप में तस्वीरें ले लो ।
    3. atipamezole आईएफसआई के साथ जानवरों को जगा और ४.३ में समझाया के रूप में जगा अवधि की निगरानी ।
      नोट: यदि पालन जारी नहीं है, 5.1.2 के बाद माउस सही euthanize । इच्छामृत्यु ६.१ में बताई गई है ।

6. कॉर्निया संग्रह और आयल embedding

  1. अंतिम समय बिंदु के बाद, पशु बलिदान । एक चैंबर है कि2सह के साथ भरा जा सकता है में माउस प्लेस । 2 सह के साथ चैंबर हवा भरें जब पशु unmobile है, गर्भाशय ग्रीवा कशेरुकाओं पूंछ के आधार से मजबूती से खींच और गर्दन एक ही समय में नीचे क्षेत्र दबाने से पता लगाएँ ।
    सावधानी: हमेशा स्थानीय पशु कल्याण निकाय के दिशानिर्देशों का पालन करें ।
  2. त्वचा में एक खोलने के लिए लकीर कैंची के साथ आंख के पक्ष को काटने से पूरी गोलक इकट्ठा । गोलक के नीचे कैंची रखें और नेत्र तंत्रिका काट करने के लिए कक्षा के बाहर आंखों पॉप । यदि आँख आसानी से बाहर न आ जाए तो संदंश का प्रयोग करें.
    1. आंख के पीछे एक छेद बनाओ, रेटिना की ओर, एक 26G सुई के साथ आंख के अंदर समाधान के मुक्त प्रवेश की अनुमति के लिए ।
      नोट: चलो आंख सूखी नहीं हो, बजाय, यह पंजाब में जगह प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने तक ।
  3. पंजाबियों के साथ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में गोलक ले लीजिए । प्रयोग को इस बिंदु पर न रोकें ।
  4. पंजाबियों को हटाएं और 4% paraformaldehyde (पीएफए) में गोलक को 4 ° c में 4-5 घंटे के लिए ठीक करें ।
  5. ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक ऊतक कैसेट के लिए तय गोलक हटो । एक ऊतक प्रसंस्करण मशीन और निंनलिखित कार्यक्रम का प्रयोग करें:
    1. पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
    2. कमरे के तापमान पर ७०% इथेनॉल में 2 x ४५ मिनट की मशीन ।
    3. कमरे के तापमान पर ९४% इथेनॉल में 2 एक्स 1 एच मशीन ।
    4. कमरे के तापमान पर निरपेक्ष इथेनॉल में 3 एक्स ४५ मिनट की मशीन ।
    5. xylene में 3 एक्स 1 एच, कमरे के तापमान और ३७ डिग्री सेल्सियस पर पिछले xylene में गर्मी ।
    6. ६० डिग्री सेल्सियस पर आयल मोम में 3 एक्स 1 एच मशीन ।
  6. ऊतक प्रसंस्करण के बाद, एक ऊतक embedding ब्लॉक का उपयोग तरल तेल (+ ६० डिग्री सेल्सियस) में गोलक एंबेड । ब्लॉक के अंदर आंख जगह है कि यह बग़ल में लग रही है और परिधीय सीमा ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है । चलो ब्लॉक 5-10 मिनट के लिए एक ठंडी थाली पर जमना ।

7. कॉर्निया के आयल वर्गों

  1. संस्था के या निर्माता के निर्देश के अनुसार सेक्शनिंग के लिए microtome तैयार करें ।
    चेतावनी: तेज microtome ब्लेड से निपटने में सावधान रहें ।
  2. प्लेस microtome के बगल में कमरे के तापमान ultrapure पानी के साथ एक पानी स्नान और ultrapure के लिए गरम पानी के साथ एक और ५० ° c ।
  3. गोलक के 5 µm मोटी धाराएं बना लें ।
    नोट: लेंस अनुभाग के दौरान आसानी से टूट जाता है । इससे बचने के लिए, एक नम ऊतक के साथ काटने की सतह पोंछ हर बार वर्गों की एक नई पंक्ति शुरू की है । उपयोग नल का पानी ऊतक गीला करने के लिए ।
  4. कमरे के तापमान पानी स्नान में एक दूसरे के बगल में वर्गों प्लेस और फिर एक गिलास स्लाइड की मदद से गर्म पानी के स्नान के लिए उन्हें ले जाएँ । गर्म पानी स्नान में वर्गों खिंचाव जब तक सभी झुर्रियां आराम और वर्गों मैट हो जाते हैं ।
  5. + ३७ ° c में रातोंरात अनुभागों के साथ काँच की स्लाइड्स को सुखाएं.
  6. + ६० ° c में एक गरम प्लेट पर 1 मिनट के लिए स्लाइड रखते हुए अनुभागों को स्लाइड में अनुलग्न करें । इस के बाद, वर्गों सीधे धुंधला, immunohistological तरीकों या 4 ° c में संग्रहीत करने के लिए संसाधित किया जा सकता है ।

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल एक मॉडल का वर्णन करने के लिए माउस कॉर्निया के लिए एक घर्षण चोट दण्ड और पता चलता है कि कैसे का पालन करें और घर्षण के बाद उपचार प्रक्रिया कल्पना । हाल ही में, हम घाव भरने6के दौरान corneal उपकला जनक कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस विधि कार्यरत हैं. स्थापित उपकरणों का उपयोग एक सफल घर्षण प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम, और दूसरों, Algerbrush द्वितीय नेत्र गड़गड़ाहट का इस्तेमाल किया है (1 चित्रा) के लिए घर्षण6,7,24प्रदर्शन । इस उपकरण के आकार में ०.५ mm की एक मंद गड़गड़ाहट टिप है कि ब्रश के बजाय अभ्यास या कैंची corneal उपकला दूर । इस प्रकार, इस उपकरण कॉर्निया पर एक घर्षण चोट के लिए सिफारिश की पसंद है ।

इस मॉडल का एक केंद्रीय हिस्सा है कि प्रभावित क्षेत्र अनायास वांछित अंतराल पर visualized किया जा सकता है । चित्रा 3में, हम एक कोबाल्ट नीले प्रकाश स्रोत (चित्रा 1) के साथ संयोजन में धुंधला fluorescein का उपयोग करने के लिए घर्षण साइट प्रदर्शित प्रस्तुत करते हैं । इस प्रयोग में, हम केंद्रीय कॉर्निया में एक बड़े घाव प्रदर्शन किया और परिधीय कॉर्निया अछूता छोड़ (3 ए आंकड़ा) । इसके अलावा, हम प्रत्येक माउस के केवल बाईं आंख abraded और एक गैर abraded नियंत्रण के रूप में सही, द्विपक्षीय नजर रखा । द्विपक्षीय नेत्र नमूने fluorescein संकेत है, जो पता चलता है कि वे प्रयोग के दौरान किसी भी कोशिका हानि से गुजरना नहीं है और इस तरह अच्छी तरह से नियंत्रण के नमूने के रूप में कार्य के लिए नकारात्मक बने रहे । हालांकि, आंखों की सीमाओं में ग्रीन सिग्नल fluorescein समाधान है कि आंख और पलक के बीच जंक्शन में जमा दिखायी । घर्षण 0 एच में सबसे बड़ा था, तुरंत चोट (3ए) के बाद । यह 18 घंटे के बाद स्पष्ट रूप से छोटा था और, इस मामले में, आंख की ऊपरी सीमा के पास स्थित है । हालांकि, उपकला घर्षण के सभी पक्षों से एक समान गति से उजागर क्षेत्र बंद कर देता है । विशेष रूप से, पर ७२ एच के बाद घायल, कोई हरी संकेत दिखाई दे रहा था । यह इंगित करता है कि corneal उपकला पूरी तरह से पुनः epithelialized के बाद ७२ ज द्वारा घर्षण था ।

इस विधि के साथ, हम केवल corneal उपकला पर घर्षण ध्यान केंद्रित करने के उद्देश्य से, ताकि कॉर्निया की गहरी परतों बरकरार रहे । corneal उपकला को हटाने का आंकड़ा बीमें ऊतकवैज्ञानिक वर्गों से स्पष्ट था. 0 एच में, घर्षण के किनारे एक संकीर्ण, acellular कगार है कि एक नियमित रूप से, 4-5 कोशिका परतों मोटी corneal उपकला से लगातार है के रूप में दिखाया गया है । limbus, corneal उपकला के परिधीय सीमा, पूरे प्रयोगात्मक समयरेखा (७२ ज) के दौरान घर्षण से प्रभावित नहीं किया गया था कि एक उदाहरण क्षेत्र प्रस्तुत करता है. इसके अलावा, ऊतकवैज्ञानिक वर्गों संकेत दिया कि कॉर्निया की गहरी परतों, स्ट्रोमा और endothelium, आंख गड़गड़ाहट से नुकसान नहीं किया गया । इन दो ऊतकों abraded और द्विपक्षीय आंख के नमूनों में इसी तरह दिखाई दिया । पर 18 घंटे के बाद चोट, उपचार प्रक्रिया सक्रिय है और फिर से epithelialization चल रहा है । यह एक अग्रणी धार के रूप से सुझाव दिया गया था । अग्रणी बढ़त केवल 1-2 उपकला कोशिका परतों में शामिल हैं और यह पुन: स्तरीकरण25हो सकता से पहले उजागर क्षेत्र को शामिल किया गया. आंकड़ा 3ए पर परिणामों के साथ लाइन में, सतह पूरी तरह से पुनः था epithelialized द्वारा ७२ ज, जब पलायन मोर्चों घाव कवर किया था और सभी उपकला परतों फिर से मौजूद थे । द्विपक्षीय आंख से ऊतकवैज्ञानिक वर्गों (आंकड़ा 3ए) है कि नियंत्रण आंखें अवलोकन अवधि के दौरान बरकरार रह पुष्टि की ।

अंत में, हम घर्षण मॉडल corneal उपकला के लिए प्रतिबंधित है और इस तरह के neovascularization के रूप में चोट करने के लिए एक stromal प्रतिक्रिया आह्वान नहीं करता है कि सबूत प्रदान करते हैं. चित्रा 4 घर्षण के बाद 18 एच में murine कॉर्निया से पता चलता है । macroscopic दृश्य के आधार पर, इस समय बिंदु एक stromal प्रतिक्रिया प्रदर्शित नहीं किया था, इस प्रकार का संकेत है कि हमारे प्रोटोकॉल गहरी corneal परतों को बाधित नहीं करता है । इसकी तुलना में, ०.७५ मॉल के साथ एक alkaline चोट/L NaOH तुरंत स्ट्रोमा में neovascularization प्रेरित । क्षारीय चोट में तेजी से neovascularization को देखते हुए, हमारे विधि में समय अंक स्ट्रोमा में प्रतिक्रिया की संभावना बाहर शासन करने के लिए सबूत प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: corneal उपकला घर्षण के लिए आवश्यक उपकरण । बाईं तरफ एक हिल आंख गड़गड़ाहट है । सही में कोबाल्ट ब्लू पेन लाइट fluorescein दाग को दिखने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: corneal घर्षण इमेजिंग । (A) इमेजिंग के लिए उपकरण क्लैंप के साथ एक समायोज्य कैमरा हाथ (बाएँ), एसएलआर कैमरा (केंद्र) और लचीला हाथ और क्लैंप (दाएँ) के साथ एक टेबल लैंप हैं. इस कोबाल्ट ब्लू पेन लाइट को दो केबल संबंधों के साथ दीपक के गुंबद से बांधा गया है । (B) इमेजिंग सेटअप का एक सामांय दृश्य; प्रत्येक अनुलग्नक उपकरण की दूरी सेमी में छवि में चिह्नित है । दोनों क्लैंप हीट प्लेट से 6 सेमी दूर होते हैं और माउस को हीट प्लेट एज से 10 सेमी दूर रखा जाता है । (ग) सेमी में प्रस्तावित दूरी और माउस आंख की स्थिति के साथ घर्षण इमेजिंग पर एक करीब देखो । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3: पता लगाने और corneal घर्षण के स्थानीयकरण । (क) 0, 18 पर माउस आंखें, और घर्षण के बाद ७२ ज । उपकला में अन्य सभी क्षेत्रों अंधेरे रहते हैं, जबकि Fluorescein संकेत, चमकीले हरे रंग में abraded क्षेत्र के निशान. द्विपक्षीय आंखें नियंत्रण के रूप में कार्य करती हैं । डैश्ड रेखा घाव की सीमाओं के निशान और प्रत्येक आंख में सफेद स्थान कैमरे से प्रतिबिंब है । (ख) Histologically खोदी गई और hematoxylin और eosin के दाग के नमूने माउस की आँखों पर 0, 18 और ७२ एच में घर्षण के बाद । Limbus सीमा है कि सभी पक्षों से corneal उपकला चारों ओर है । Asterix घर्षण के किनारे निशान । स्केल बार १०० µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

Figure 4
चित्रा 4: Corneal घर्षण एक stromal प्रतिक्रिया को सक्रिय नहीं करता है । ०.७५ मॉल के साथ क्षारीय एक्सपोजर/L NaOH के साथ सिंचाई के बाद ०.९% NaCl उत्पादन corneal neovascularization (आंख तुरंत उपचार के बाद एकत्र) । आंख गड़गड़ाहट के साथ घर्षण कोई neovascularization के बाद भी 18 h. घर्षण साइट एक डैश्ड लाइन के साथ चिह्नित है दिखाता है । स्केल बार 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

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घायल तरीके corneal homeostasis और विकृतियों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लोकप्रिय उपकरण हैं । घर्षण मॉडल नेत्र विज्ञान में प्रासंगिक समस्याओं का पता करने के लिए एक अच्छी तरह से नियंत्रित विधि प्रदान करता है । हालांकि, प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर बल देने लायक हैं । विशेष रूप से, पशु चिकित्सा के बारे में उल्लिखित विवरण, घाव भरने की समय रेखा, और परिणाम NMRI और ICR शेयरों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन26चूहों के उपभेदों के बीच भिंन हो सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के साथ, प्रायोगिक जानवरों लगभग 20 मिनट के लिए anesthetized रहेगा । यह घर्षण प्रदर्शन करने के लिए समय की एक छोटी लेकिन पर्याप्त खिड़की देता है । हालांकि, जब नेत्र गड़गड़ाहट का उपयोग कर, घर्षण ही एक बहुत ही त्वरित आपरेशन है और इस समय सीमा में प्रदर्शन करने के लिए संभव होना चाहिए ।

आसान और सुलभ दृश्य घर्षण मॉडल का मुख्य लाभ में से एक है । आणविक जीवविज्ञान विधियों के साथ संयुक्त, इस महान विस्तार में उपकला कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं को खोलता है. Abraded कॉर्निया ऊतकवैज्ञानिक या प्रतिरक्षा धुंधला है और प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड एकत्र किया जा सकता है और आगे की जांच के लिए संसाधित किया जा सकता है । Pajoohesh-गंजी एट अल । corneal उपकला कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न एक मंद ब्लेड27के साथ corneal अपमान पर परिवर्तन दिखाया. नियंत्रित नमूना सुनिश्चित करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि घर्षण की छवियाँ तुरंत कार्रवाई के बाद लिया जाता है और नमूना संग्रह बिल्कुल योजनाबद्ध समयसीमा का पालन करें.

इस प्रोटोकॉल corneal epithelialization की परीक्षा से परे का उपयोग करता है । उदाहरण के लिए, corneal limbus, कॉर्निया के स्टेम सेल आला के घर्षण, स्टेम सेल गतिशीलता7का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमें पता चला है कि गैर उपकला के abraded क्षेत्र चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान सामान्य रहे, लेकिन कुछ लेखकों का दावा है कि तहखाने झिल्ली और अंतर्निहित stromal keratocytes नेत्र गड़गड़ाहट24,28से प्रभावित कर रहे हैं. तहखाने झिल्ली को हटाने के विशिष्ट तहखाने झिल्ली धुंधला के साथ अनुमान लगाया जा सकता है । इसके अलावा, एक लंबी समयरेखा पर दोहराया खरोंच दिलचस्प उपचार पैटर्न प्रकट कर सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक लंबी अवधि के पीछा पर उपकला की वास्तुकला का पालन नहीं किया । दोनों सुस्त स्केलपेल और आंख गड़गड़ाहट चोटों corneal कटाव के लिए एक के बाद कई हफ्तों के लिए एक वृद्धि की घटनाओं को दिखाया है चोट24,29,30के बाद । लंबी अवधि के अध्ययन के लिए घर्षण मॉडल का उपयोग करते समय इस बात को ध्यान में रखना चाहिए । हालांकि, corneal कटाव पर ध्यान केंद्रित अध्ययन इस प्रोटोकॉल उपयोगी मिल सकता है ।

अंय घायल मॉडल एक समीक्षा5में कदम एट अल द्वारा लंबाई में वर्णित हैं । साथ में, इस प्रोटोकॉल और मौजूदा दृष्टिकोण बहुमुखी दोनों मौलिक जैविक प्रश्नों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यावहारिक नैदानिक समस्याओं की जांच विकल्प प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उसे अमूल्य तकनीकी सहायता और व्यावहारिक मदद के लिए Kaisa Ikkala शुक्रिया अदा करना चाहूंगा जब इस विधि actualizing के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हमारे केंद्रीय अनुसंधान के सवालों के कार्यांवयन के दौरान पर बाद में । हम यह भी पशु चिकित्सा के काम के दिशा निर्देशों की योजना के साथ उसकी मदद के लिए प्रयोगशाला पशु केंद्र और अंना Meller शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMRI mouse Envigo 275
0.9% NaCl use sterile
Medetomidine Vetmedic Vnr087896 Market name: Cepetor Vet
Ketamine Intervet Vnr511485 Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin Invidior 3015248 Market name: Temgesic
Atipamezol Orion Pharma Vnr471953 Market name: Antisedan Vet
Carprofen Norbrook Vnr027579 Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment Dechra Vnr080899 Market name: Isathal
Fluorescein salt Sigma-Aldrich F6377
Phosphate-buffered saline solution PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) Algerbrush 6.39768E+11
Cobalt Blue pen light SP Services DE/003
Hot plate Kunz Instruments 2007-0217
Digital SLR camera Nikon D80
Adjustable camera arm and clamp Neewer 10086132 Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp Prisma
Soft wipe KimtechScience 7552
CO2 chamber
Dissection toolset Fine Science Tools
Syringes Beckton Dickinson 303172
26G needles Beckton Dickinson 303800
2 mL Eppendorf tube Sarstedt 689
Tissue casette Sakura Finetech 4118F
Tissue processing machine ASP200S Leica
Xylene VWR UN1307
Paraffin wax Millipore K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm Sakura Finetech 4123
Microtome Microm HM355
Water bath for sectioning Orthex 60591
Water bath for sectioning Leica HI1210
Microtome blade Feather S35
Glass slide Th.Geyer GmbH & Co. 7,695,019
Ultrapure water Millipore MPGP04001 MilliQ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 PFA

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References

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कॉर्निया घाव भरने के लिए एक मॉडल के रूप में आंख गड़गड़ाहट के साथ Corneal उपकला घर्षण
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Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing. J. Vis. Exp. (137), e58071, doi:10.3791/58071 (2018).More

Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing. J. Vis. Exp. (137), e58071, doi:10.3791/58071 (2018).

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