Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

doi: 10.3791/58071 Published: July 10, 2018

Summary

Dit protocol beschrijft een methode om een slijtage aan de oculaire oppervlakte van de muis toebrengen, en volgen de wond genezingsproces daarna. Het protocol maakt gebruik van een oogbeschadigingen en/of burr gedeeltelijk verwijderen van de oppervlakte-epitheel van het oog bij verdoofde muizen.

Abstract

Het lymfkliertest hoornvlies biedt een uitstekend model om te studeren wondgenezing. Het hoornvlies is de buitenste laag van het oog, en is dus de eerste verdediging aan verwonding. In feite, is het meest voorkomende type oogletsel gevonden in kliniek een hoornvlies schuren. Hier, gebruiken wij een oogbeschadigingen en/of burr om te induceren een schuren wat resulteert in de verwijdering van de cornea epitheel in vivo narcose muizen. Deze methode zorgt voor gerichte en reproduceerbare epitheliale ontwrichting, en andere gebieden intact. Bovendien, we beschrijven de visualisatie van het vrijkomen epithelium met fluoresceïne kleuring en concreet advies geven over hoe het vrijkomen hoornvlies visualiseren. Dan, we volgen de tijdlijn voor wond genezing van 0, 18, en 72 uur na schuren, totdat de wond is opnieuw epithelialized. Het model van de epitheliale schuren van hoornvlies letsel is ideaal voor studies betreffende epitheliale celproliferatie, migratie en opnieuw epithelialization van het hoornvlies lagen. Deze methode is echter niet optimaal te bestuderen stromale activering tijdens de wondgenezing, omdat de oogbeschadigingen en/of burr niet tot de stromale cel lagen doordringen doet. Deze methode is ook geschikt voor klinische toepassingen, bijvoorbeeld, pre-klinische test voor drug effectiviteit.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Epitheelweefsel lagen van talrijke organen worden blootgesteld aan verwondingen. Ze bevatten echter ook de mogelijkheid om te compenseren voor het verlies van weefsel door de wondgenezing. Het hoornvlies biedt een uitstekend model om te studeren wondgenezing. Het vormt het buitenoppervlak van het oog en vormt een beschermende laag voor de gevoelige oogbeschadigingen en/of machines. Hoornvlies fungeert dus als een fysieke barrière voor ziekteverwekkers en waterverlies. Het bestaat uit drie lagen; epitheel, stroma en endotheel. Het epitheel van het hoornvlies maakt de buitenste laag van het hoornvlies. Epitheliale cellen behouden de barrièrefunctie van het hoornvlies door het strikt vasthouden aan elkaar tot en met strakke kruispunten1,2,3. Een Acellulair hoornvlies membraan van de kelder, de Bowman membraan, scheidt het epitheel van de uitgebreide stroma, waarin vuurvaste keratocytes. Onder de stroma kanaal endotheliale cellen voedingsstoffen, water en zuurstof naar de bovenste laag.

Hoornvlies schaafwonden zijn heel gebruikelijk in de kliniek4. Verwondingen aan het hoornvlies zijn divers, maar grotendeels worden veroorzaakt door kleine deeltjes zoals stof of zand, krassen of andere vreemde voorwerpen. Het protocol beschreven hier beoogt een klinisch relevante soort hoornvlies epitheliale schuren te reproduceren. Dit protocol biedt daarbij een controleerbaar en baanbrekende methode voor clinici en wetenschappers van de cornea te implementeren in hun eigen studies. We hebben een in vivo -bepaling van het schade-reparatie uitgevoerd op het lymfkliertest hoornvlies door wordt het weefsel met een dulled oogbeschadigingen en/of burr, de Algerbrush II bekrast. Hier, wij de doelstelling van de schuren alleen aan de centrale hoornvlies epitheel en laat de andere delen van het orgel zonder schade. Dus, het protocol is ideaal om studie hoornvlies epitheliale cel dynamics of het membraan van de kelder tijdens Re epithelialization, cel migratie, de proliferatie en differentiatie in vivo5. Onlangs, dit model werd gebruikt voor het analyseren van progenitor cel dynamiek in het lymfkliertest hoornvlies eveneens over het onthullen van de capaciteit van de gedifferentieerde hoornvlies epitheliale cellen in het herstel van de niche van de cel van de stam van het hoornvlies na letsel6,7. Na het schuren, het hoornvlies keert terug naar haar normale transparantie en treksterkte. Interessant, een in vitro studie aangegeven dat opnieuw epithelialization gebeurt zonder verhoogde cel proliferatie8. Dit protocol beschrijft de tijdlijn van ononderbroken genezing in het lymfkliertest hoornvlies. De methode is dus die van toepassing zijn voor het testen van het effect van drugs op genezing patronen en snelheid.

Het hoornvlies is uitgebreid gebruikt voor wond genezing studies. Vele studies hebben echter vertrouwd op andere modellen van letsel. Een reeds lang gevestigde model van hoornvlies letsel is het alkalische branden die wordt uitgevoerd door het toepassen van natriumhydroxide (NaOH) met of zonder filtreerpapier op het hoornvlies oppervlakte9. Alkalische blootstelling resulteert in een grote en diffuse schade raakt niet alleen het hoornvlies epitheel, maar ook het bindvlies en stroma9,10. Sterke basische oplossingen is gebleken voor het opwekken van de cornea ulcera, troebelingen, en neovascularization9. Ontstekingscellen binnenvallen het stroma meestal binnen 6 uur en blijft er tot 24 h11. Alkalische letsel is dus een raadzaam methode in studies met betrekking tot stromale activering. Een ander soort chemische letsel kan worden toegebracht door dimethylsulfoxide (DMSO) toe te passen op het hoornvlies9,10. Andere veelgebruikte letsel-modellen zijn incisional wonden die dringen door de stroma en keratectomy wonden, die beperkt tot het bovenste deel van het stroma14,15 zijn. Deze methoden zijn ook handig voor het beantwoorden van vragen over stromale wondgenezing. Verschillende letsel modellen hebben hun eigen voor- en nadelen. Schuren, of debridement, van het hoornvlies epithelium werd eerst ontwikkeld met behulp van afgestompt scalpels of messen op ex vivo hoornvlies16. Deze methode is later gebruikt in vivo op muis, rat en konijn17,18,19,20,21,22. Gebruik de oogbeschadigingen en/of burr (Figuur 1), verwijderen we alleen een geselecteerde regio van het epitheel, en de rest van het epithelium onaangetast. Deze manier, is het mogelijk om precies de epitheliale verhuizing naar verschillende delen van het hoornvlies. Daarnaast kan de grootte van de schuur met fluoresceïne kleuring worden beoordeeld. Bovendien, hier volgen wij schuren sluiting de helende periode.

Deze methode brengt verschillende voordelen, i) met inbegrip van de precieze locatie van schuren site, die niet mogelijk met chemische schade is, ii) de schuren is snel uit te voeren, en iii) het is niet-invasief. Hierin beschrijven we de methode met behulp van de outbred NMRI-muis als een model, maar dit kan worden toegepast voor de enorme hoeveelheid genetische muismodellen, alsmede voor de rat en het konijn, die gemeenschappelijke modellen gebruikt bij het bestuderen van de menselijke verstoring van het hoornvlies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle experimenten zijn goedgekeurd door de board van het nationale dierlijke experiment.

1. voorbereiding

  1. Alle oplossingen voor te bereiden en bewaar op kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Volg afvalverwijdering verordeningen Gooi gebruikte materialen en oplossingen.
  2. Gebruik NMRI en ICR outbred voorraden, leeftijd tussen 4-12 weken en beide geslachten. Als de stam van de C57BL/6, volgt u de ketamine-medetomidine-voorbereiding methode in stap 1.3.2. Voor andere stappen, volgt u de instructies beschreven in 1.3.3.-1.3.5.
  3. Bereiden de diergeneeskunde fris en in de tijd voordat u de bewerking start. Carprofen zal later gebruikt worden, dus het is niet noodzakelijk voor te bereiden het op dit punt.
    1. Ter voorbereiding van een oplossing van ketamine-medetomidine voor anesthesie, meng 0.375 mL (concentratie 50 mg/mL) van ketamine (Ketaminol dierenarts) met 0,25 mL (concentratie 1 mg/mL) van medetomidine (Cepetor dierenarts) en voeg 1,25 mL steriele 0.9% NaCl. Beheren van 0,15 mL/20 g van muis gewicht (7,5 mg/kg, ketamine en 1 mg/kg, medetomidine).
    2. Ter voorbereiding van een meer verdunde oplossing van ketamine-medetomidine voor anesthesie bij C57BL/6 muizen, meng 0.375 mL (concentratie 50 mg/mL) van ketamine met 0,25 mL (concentratie 1 mg/mL) van medetomidine en voeg 2,5 mL steriele 0.9% NaCl. Beheren van 0,15 mL/20 g van muis gewicht (3,75 mg/kg, ketamine en 0,5 mg/kg, medetomidine).
      Opmerking: Dit is een alternatieve stap, alleen voor volwassen C57BL/6 muizen.
    3. Buprenorfin om voor te bereiden Analgesie, Voeg 0,1 mL (concentratie 0,3 mg/mL) van buprenorfin tot 1.9 mL steriele 0.9% NaCl. Beheren van 0,2 mL/20 g muis gewicht (0,15 mg/kg).
    4. Ter voorbereiding van atipamezole van stopzetting van de verdoving, Voeg 0,1 mL (concentratie 5 mg/mL) van atipamezole tot 4.9 mL van 0.9% NaCl. Beheren van 0,15 mL/20 g muis gewicht (0,75 mg/kg).
    5. Gebruik carprofen voor analgesie tijdens na narcose. Voeg 0,1 mL (concentratie 50 mg/mL) van carprofen 4.9 ml 0.9% NaCl. Beheren van 0,15 mL/20 g van muis gewicht (7,5 mg/kg).
  4. Fluorescerende kleurstofoplossing bereiden
    1. Gebruik voor het visualiseren van de schuur onder de Cobalt blauw licht (Figuur 1), een fluorescerende oplossing. Bereid een fluoresceïne-oplossing van 0,1% door eerste meet 10 mg fluoresceïne zout met een mooie schaal en voeg deze vervolgens toe tot 10 mL in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. De fluoresceïne oplossing beschermen tegen licht en schud gedurende 5 minuten op een shaker.
      Opmerking: De fluoresceïne-oplossing is lichtgevoelig; Bewaar deze oplossing gedekt door licht. Deze oplossing kan worden opgeslagen in + 4 ° C voor 2-3 dagen. Voor gebruik is het handig om te plaatsen het fluoresceïne-oplossing in een fles van de druppelaar die wordt gebruikt voor oogdruppels. Een steriele-filter gebruiken bij het verplaatsen van de oplossing aan de druppelaar fles.
  5. Reinig de oogbeschadigingen en/of burr tip vóór en na gebruik; eerst met PBS en vervolgens met 70% EtOH. Als u een schuur in verschillende muizen tijdens dezelfde bewerking, doen de schoonmaak stappen tussen elke muis.
  6. De verwarmde plaat zetten (+37 ° C) en plaats een papieren handdoek op het.

2. hoornvlies schuren

Let op: Gebruik bij beschermende slijtage (handschoenen, laboratoriumjas) behandeling van muizen. Weeg de muis voor het inschatten van de hoeveelheid medicatie om te beheren.

  1. De hand scruffing-methode gebruiken om de muis23. Ketamine-medetomidine mengsel intraperitoneally beheren (i.p.) naar de linker onderbuik. Plaatst u de muisaanwijzer naar een individuele kooi en wachten tot het in slaap te vallen. Dit duurt meestal minder dan 5 minuten. Vervolgens eerste buprenorfin en vervolgens atipamezole via i.p. injecties te beheren. De zelfde behandeling techniek gebruiken.
    Opmerking: Zodra de verdoving gegeven is, het protocol moet niet worden onderbroken op elk moment.
  2. Voordat u verdergaat, Controleer of de verwarmde plaat warm. Plaats de narcose muis op de verwarmde plaat. Het niveau van de verdoving is goed als de staart reflex afwezig is, maar de teen reflex aanwezig is. Controleer deze reflexen door knijpen de staart en elke teen met vingers of pincet. Gebruik geen buitensporig geweld. Verdoving zal laatste 20-25 minuten.
  3. Om te maken een schuren, gebruikt u de schoongemaakte oogbeschadigingen en/of burr. De basis van de burr inschakelen de trillingen die essentieel is om de slijtage te draaien. Voel de trillingen in de hand, wanneer de burr naar behoren functioneert.
    1. Één oog tegelijkertijd openen door het ingedrukt houden van de oogleden afzonderlijk met vingers. Vervolgens stevig raak de burr aan het hoornvlies en het instrument heen en weer zo goed als zijwaarts bewegen op het oogbeschadigingen en/of oppervlak. De burr trillingen zal het uitvoeren van de kras; niet druk, schud of scheuren van het hoornvlies. In het centrale hoornvlies zijn 20 wordt bekrast van bewegingen op het oppervlak voldoende voor het opwekken van de wond. Til de burr niet en probeer te blijven in de regio van het hoornvlies te worden abraded. Het verwerven van een standaardformaat schuren zal vereisen verschillende rondes van praktijk.

    Opmerking: Hoornvlies asepsis kan worden bereikt vóór schuren met behulp van oogheelkundige betadine-oplossing.

3. beeldvorming van de schuren

  1. Verlicht de vrijkomen regio met kobalt blauw pen licht (Figuur 1) en fluoresceïne oplossing. De oculaire oppervlakte verschijnt kleurloze in omgevingslicht. Na toepassing van de fluoresceïne fluoresceert de vrijkomen regio in groen wanneer de verlichting van het oog met de lichte pen.
    1. Indien nodig, het vrijkomen oog op dezelfde manier zoals in 2.3 openen en beheren een druppel van fluoresceïne oplossing uit de druppelaar fles. Wassen van het oog een keer met PBS of 0.9% NaCl om de achtergrond van de fluoresceïne. Gebruik een druppelaar fles of een pipet voor het wassen. Gecombineerd de vloeistof weg met een zacht doekje en reinig de wimpers, indien nodig. Het overtollige vocht verzamelt meestal de nasale grens van het oog, dicht bij de opening van het kanaal van de scheur.
      Let op: Raak het hoornvlies terwijl cleaining zoals kleine schaafwonden kunnen worden opgewekt.
  2. Maak afbeeldingen van de cornea schuren.
    1. Voor het verkrijgen van vergelijkbare beelden tijdens elke imaging sessie, door de gestage bijlage hulpmiddelen te gebruiken voor de Cobalt Blauw pen licht en de SLR camera (Figuur 2). Dit protocol voorziet een setup die gemakkelijk te herhalen (Figuur 2).
      1. Het licht van de pen en de camera gebruikt om een tafellamp met klem, een flexibele arm en een verstelbare camera-arm met een klem, respectievelijk. Kabelbinder de pen licht de tafellamp en positie net boven het oog van de muis. Positionering van het licht anders kan de visualisatie van de schuren worden gewijzigd. Een suggestie voor het plaatsen van deze tools is beschreven in Figuur 2.
    2. De SLR camera gebruiken om foto's van het oog. Plaats het dier in een gewenste afstand en positie en focus de camera (1:12) in de kamer licht. Daarna sluit u alle andere lichten behalve het licht kobalt blauw pen.
      Opmerking: Tape de pen lichte greep naar beneden of gebruik van een rubberen band om te houden van het licht op de hele tijd tijdens imaging. Dit zou kunnen helpen als het beeld wazig wordt. Het is gemakkelijkste de imaging stap met een collega te voeren.

4. wakker na hoornvlies schuren

  1. Eerste buprenorfin en vervolgens atipamezole via i.p. injecties beheren. Gebruik dezelfde behandeling techniek zoals in 2.1.
  2. Breng een druppel van antibacteriële, fucidin zure oog zalf (Isathal) voor zowel vrijkomen en niet-abraded ogen te hydrateren en houden de oculaire oppervlakte zindelijk vanuit bacteriën na narcose.
  3. Als de muis wordt wakker in 5-20 minuten op de verhitte plaat, observeren de muis na verdoving wakker periode. Wanneer wordt het mobiele, plaatst u deze in een afzonderlijke kooi.
    Opmerking: Als wakker langer duurt, plaatst u de muisaanwijzer in de kooi met een verwarmde zeem of plaats de hele kooi op de verwarmde plaat en regelmatig toezicht op de muis. Terwijl de narcose slijt af, de muis meestal schudt en naar boven met de voorste lichaam bereikt. Dit probleem moet terug naar normaal in 3-4 uur en vervolgens kunt u de muis naar een gedeelde kooi plaatsen.
  4. Carprofen i.p. voor analgesie en oog zalf op twee opeenvolgende dagen na het schuren, op dezelfde manier zoals in stappen 2.2 beheren. en 4.2.

5. beeldvorming tijdens de wondgenezing

  1. In dit protocol wijst tijd gebruiken 18 uur en 72 uur na schuren te observeren van de sluiting van de wond.
    1. Anesthetize voor opeenvolgende beeldvorming, de muizen zoals uiteengezet in punt 2.2.
    2. Neem foto's zoals uitgelegd in 3.
    3. De dieren met atipamezole i.p. wakker en controleren van de wakker periode zoals in 4.3.
      Opmerking: als niet voortzetting van de follow-up, de muis direct na 5.1.2 euthanaseren. Euthanasie is beschreven in 6.1.

6. hoornvlies collectie en paraffine insluiten

  1. Na het laatste punt van de tijd, het dier te offeren. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een kamer die gevuld kan worden met CO2. De kamer lucht vullen met CO2. Wanneer het dier onbeweeglijk is, ontwrichten de cervicale wervels door stevig te trekken van de basis van de staart en te drukken op de nek regio down op hetzelfde moment.
    Let op: Volg altijd de richtlijnen van het lichaam lokale dierenwelzijn.
  2. Verzamel de hele oogbol door het snijden van een opening in de huid aan de zijkant van het oog met een dissectie schaar. Plaats de schaar onder de oogbol en snijd de oogbeschadigingen en/of zenuw om pop de oogbol uit de baan. Pincet gebruiken als het oog niet gemakkelijk uit komt.
    1. Maak een gat aan de achterkant van het oog, aan de retinale kant, met een 26G naald om gratis penetratie van oplossingen in het oog.
      Opmerking: Laat niet het oog geworden droog, in plaats daarvan, plaats het in PBS tot voortzetting van het protocol.
  3. Het verzamelen van de oogbol in een tube 2 mL met PBS. Worden niet onderbroken het experiment op dit punt.
  4. PBS verwijderen en monteren van oogballen in 4% paraformaldehyde (PFA) in + 4 ° C voor 4-5 uur.
  5. Verplaats de vaste oogbol op een cassette weefsel voor verwerking van het weefsel. Gebruik een weefsel verwerking machine en het volgende programma:
    1. Spoel met PBS.
    2. 2 x 45 min in 70% ethanol bij kamertemperatuur incuberen.
    3. 2 x 1 h in 94% ethanol bij kamertemperatuur incuberen.
    4. 3 x 45 min in absolute ethanol bij kamertemperatuur incuberen.
    5. Incubeer 3 x 1 h in xyleen, bij kamertemperatuur en laatste xyleen bij 37 ° C.
    6. Incubeer 3 x 1 h in paraffine bij 60 ° C.
  6. Na weefsel verwerking, in vloeibare paraffine (+ 60 ° C) met behulp van een weefsel inbedden blok met insluiten van de oogbol. Plaats het oog binnen het blok zodat het kijkt opzij en de perifere grens naar boven zijn gericht. Laat het blok 5-10 minuten op een koele plaat stollen.

7. paraffine secties van het hoornvlies

  1. Bereiden de microtoom voor afdelen volgens de instructies van de instelling of van de fabrikant.
    Let op: Wees voorzichtig met het hanteren van het mes scherpe microtoom.
  2. Plaats een waterbad met kamertemperatuur ultrazuiver water naast de microtoom en andere met ultrazuiver water verwarmd tot + 50 ° C.
  3. Maak 5 µm dik secties van de oogbol.
    Opmerking: De lens breekt gemakkelijk tijdens het segmenteren. Om dit te vermijden, veeg het snijvlak met een vochtig tissue telkens een nieuwe rij van secties wordt gestart. Gebruik leidingwater te bevochtigen van het weefsel.
  4. Plaats van de secties naast elkaar in het waterbad kamertemperatuur en verplaats deze naar de waterbad met behulp van een glasplaatje. Rekken van de secties in het waterbad totdat alle rimpels ontspannen en de secties worden matte.
  5. Droog de glas dia's met secties overnachting in +37 ° C.
  6. De secties aan de dia's koppelen door het bijhouden van de dia 1 minuut op een verwarmde plaat in + 60 ° C. Na dit, kunnen de secties worden direct verwerkt voor de kleuring, immunohistological methoden of opgeslagen in + 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft een model om te berokkenen slijtage schade aan het hoornvlies muis en stelt voor het visualiseren van het genezingsproces na schuren te volgen. Onlangs, we gebruikt deze methode om te studeren van de rol van hoornvlies epitheliale voorlopercellen tijdens wond genezing van6. Het gebruik van gevestigde tools is de sleutel tot een succesvolle schuren-experiment. Wij, en anderen, hebben de Algerbrush II oogbeschadigingen en/of burr (Figuur 1) gebruikt om de schaafwonden6,7,24. Dit hulpmiddel heeft een afgestompt burr tip van 0,5 mm in grootte die borstels in plaats van boren of schaar het hoornvlies epithelium weg. Deze tool is dus de aanbevolen keuze voor een slijtage letsel op het hoornvlies.

Een centraal onderdeel van dit model is dat de getroffen regio moeiteloos kan worden gevisualiseerd op gewenste tijdstippen. In figuur 3Apresenteren wij het gebruik van fluoresceïne kleuring in combinatie met een lichtbron Cobalt Blauw (Figuur 1) de schuren-site wilt weergeven. In dit experiment trad we een grote wond in het centrale hoornvlies en verliet het perifere hoornvlies onaangeroerd (figuur 3A). Bovendien, we abraded alleen het linkeroog van elke muis en hield de juiste, bilaterale oog als een besturingselement niet-abraded. De bilaterale oog monsters bleef negatief voor fluoresceïne signaal, die suggereert dat ze niet elke cel verlies ondergaan tijdens het experiment en dus evenals controlemonsters functioneren. Echter weergegeven groene signaal in de grenzen van het oog de fluoresceïne-oplossing die verzameld in de kruising tussen het oog en het ooglid. De schuren was grootste bij 0 h, onmiddellijk na de schade (figuur 3A). Het was aanzienlijk kleiner na 18 h en, in dit geval ligt dicht bij de bovenste rand van het oog. Het epithelium sluit echter de blootgestelde regio met een gelijke snelheid van alle kanten van het schuren. Met name bij 72 h na verwonding, werd geen groen signaal zichtbaar. Dit geeft aan dat het hoornvlies epithelium werd volledig opnieuw epithelialized door 72 uur na het schuren.

Met deze methode gericht we gericht de schuren alleen op het hoornvlies epitheel, zodat de diepere lagen van het hoornvlies intact gebleven. De verwijdering van het hoornvlies epithelium bleek uit de histologische gedeelten in figuur 3B. Bij 0 h, wordt de rand van de slijtage weergegeven als een smalle, Acellulair richel die continu van een regelmatige, 4-5 cel lagen dik hoornvlies epitheel. De limbus, perifere rand van het hoornvlies epitheel, presenteert een voorbeeld-regio die niet werd beïnvloed door de slijtage tijdens de volledige experimentele tijdlijn (72 uur). Daarnaast histologische secties aangegeven dat de diepere lagen van het hoornvlies, het stroma en het endotheel, niet werden geschaad door de oogbeschadigingen en/of burr. Deze twee weefsels verscheen qua vrijkomen en bilaterale oog monsters. Op 18 h na letsel, het genezingsproces is actief en opnieuw epithelialization loopt. Dit werd voorgesteld door de verschijning van een voorkant motorkap. De voorrand bevat alleen de lagen van 1-2-epitheliale cellen en omvat de blootgestelde regio voordat opnieuw stratificatie25kan plaatsvinden. In lijn met de resultaten op figuur 3A, werd het oppervlak volledig opnieuw epithelialized door 72 h, wanneer de migratie fronten hadden bedekt de wond en alle epitheliale lagen weer aanwezig waren. Histologische secties van het bilaterale oog bevestigd (figuur 3A) dat de ogen van de controle tijdens de observatieperiode intact gebleven.

Tot slot, we aantonen dat het model schuren is beperkt tot het hoornvlies epithelium en geen beroep op een stromale reactie op schade, zoals neovascularization doen. Figuur 4 toont de lymfkliertest hoornvlies om 18 h na schuren. Op basis van macroscopische weergave, deed dit tijdstip niet een stromale reactie, dus die aangeeft dat ons protocol niet de diepere hoornvlies lagen verstoort weergegeven. Ter vergelijking: een alkalische blessure met 0,75 mol/L NaOH onmiddellijk geïnduceerde neovascularization in het stroma. Gezien de snelle neovascularization in alkalische letsel, bewijzen de punten van de tijd in onze methode uitsluiten van de mogelijkheid van antwoord in het stroma.

Figure 1
Figuur 1: essentiële gereedschappen voor hoornvlies epitheliale schuren. Aan de linkerkant is een trillende oogbeschadigingen en/of burr. De Cobalt Blauw pen licht in het recht wordt gebruikt om de fluoresceïne vlek zichtbaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: het hoornvlies schuren Imaging. (A) Tools voor imaging een verstelbare camera-arm met klem (links), de SLR camera (midden) en een tafellamp met flexibele arm zijn en klem (rechts). De Cobalt Blauw pen licht is gebonden aan de koepel van de lamp met twee kabelbandjes. (B) een algemeen beeld van de imaging-instellingen; de afstand van elke bijlage tool is gemarkeerd in de afbeelding in cm. Beide klemmen zijn 6 cm afstand van de warmte-plaat en de muis is geplaatst 10 cm van de rand van de plaat warmte vandaan. (C) een dichtere blik bij de beeldvorming van de schuren met voorgestelde afstand en positie aan het oog van de muis in cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: opsporing en lokalisatie van de cornea schuren. (A) de ogen van de muis bij 0, 18, en 72 uur na schuren. Fluoresceïne signaal markeert de vrijkomen regio in helder groen, terwijl alle andere regio's in het epithelium donker blijven. Bilaterale ogen dienen als besturingselementen. Onderbroken lijn markeert de grenzen van de wond en de witte vlek in elk oog is de reflectie van de camera. (B) histologisch gesegmenteerd en haematoxyline en eosine bevlekt monsters van de ogen van de muis bij 0, 18, en 72 uur na het schuren. Limbus is de rand die het hoornvlies epithelium van alle kanten omringt. Asterix markeert de rand van het schuren. De bar van de schaal is 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: hoornvlies schuren niet activeert een stromale reactie. Alkalische blootstelling met 0,75 mol/L NaOH gevolgd door irrigatie met 0,9% NaCl produceert hoornvlies neovascularization (oog verzameld onmiddellijk na de behandeling). Schuren met de oogbeschadigingen en/of burr geeft geen neovascularization ook na 18 h. slijtage plaats is gemarkeerd met een onderbroken lijn. Schaal bar 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Verwonden methoden zijn populaire tools om te bestuderen van de verschillende aspecten van het hoornvlies homeostase en pathologieën. Het schuren-model biedt een goed gecontroleerde methode om aan te pakken problemen in de oogheelkunde. Er zijn echter bepaalde kritische punten in het protocol waard het benadrukken. Met name de details beschreven met betrekking tot de uitoefening van de diergeneeskunde, wond genezing tijdlijn en resultaat zijn geoptimaliseerd voor gebruik met outbred NMRI en ICR voorraden, maar kunnen variëren tussen stammen van muizen26. Met dit protocol blijft de proefdieren narcose gedurende ongeveer 20 minuten. Dit geeft een korte maar voldoende venster van tijd om uit te voeren van het schuren. Wanneer u de oogbeschadigingen en/of burr, waardoor de slijtage zelf is echter een zeer snelle werking en moet het mogelijk zijn om uit te voeren in dit tijdsbestek.

Makkelijk en toegankelijk visualisatie is een van de belangrijkste voordelen van het model schuren. In combinatie met moleculaire biologiemethodes, opent dit mogelijkheden om te studeren de epitheliale cellen in groot detail. Vrijkomen hoornvlies kunnen worden verwerkt voor de histologische of immunologische kleuring van en proteïnen of nucleic zuren kunnen worden verzameld en nader bestudeerd. Pajoohesh-Ganji et al. toonde dat gen expressiepatronen in de verandering van de cornea epitheliale cellen op hoornvlies belediging met een mes afgestompt27. Gecontroleerde bemonstering raadzaam, dat beelden van de schuren worden genomen onmiddellijk na de operatie en monstercollecties Volg precies de geplande tijdlijnen.

Dit protocol heeft gebruik dan onderzoek van hoornvlies epithelialization. Slijtage van het hoornvlies limbus, de niche van de cel van de stam van het hoornvlies, kan bijvoorbeeld worden gebruikt te bestuderen van de stamcel dynamics7. We hebben laten zien dat de niet-abraded regio van het epithelium normale bleef tijdens het genezingsproces, maar sommige auteurs beweren dat het membraan van de kelder en de onderliggende stromale keratocytes worden beïnvloed door het oculair burr24,28. De verwijdering van het membraan van de kelder kan worden geschat met specifieke kelder membraan kleuring. Bovendien kunnen herhaalde schaafwonden over een langere tijdlijn onthullen interessante helende patronen. In dit protocol hebben niet zien we de architectuur van het epithelium over een lange achtervolging. Beide afgestompt scalpel en oogbeschadigingen en/of burr verwondingen hebben aangetoond een verhoogde incidentie aan cornea-erosies na één tot enkele weken na verwonding24,29,30. Dit moet in gedachten worden gehouden bij het gebruik van het model schuren voor lange termijn studies. Echter kunnen studies gericht op cornea-erosies nuttig vinden dit protocol.

Andere kwetsende modellen zijn uitvoerig beschreven door Stepp et al. in een review-5. Dit protocol en de bestaande benaderingen bieden samen veelzijdig opties te onderzoeken van zowel fundamentele biologische vragen evenals praktische klinische problemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Kaisa Ikkala voor haar onschatbare hulp van de technische en inzichtelijke hulp bij het actualiseren van deze methode en later tijdens de uitvoering op onze centrale onderzoeksvragen. Wij wil ook het laboratorium dier Center en Anna Meller bedanken voor haar hulp bij het plannen van de richtsnoeren van het veterinaire werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMRI mouse Envigo 275
0.9% NaCl use sterile
Medetomidine Vetmedic Vnr087896 Market name: Cepetor Vet
Ketamine Intervet Vnr511485 Market name: Ketaminol Vet
Buprenorfin Invidior 3015248 Market name: Temgesic
Atipamezol Orion Pharma Vnr471953 Market name: Antisedan Vet
Carprofen Norbrook Vnr027579 Market name: Norocarp Vet
1% fucidin acid eye ointment Dechra Vnr080899 Market name: Isathal
Fluorescein salt Sigma-Aldrich F6377
Phosphate-buffered saline solution PBS
Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) Algerbrush 6.39768E+11
Cobalt Blue pen light SP Services DE/003
Hot plate Kunz Instruments 2007-0217
Digital SLR camera Nikon D80
Adjustable camera arm and clamp Neewer 10086132 Height 28 cm
Table lamp with a flexible arm and a clamp Prisma
Soft wipe KimtechScience 7552
CO2 chamber
Dissection toolset Fine Science Tools
Syringes Beckton Dickinson 303172
26G needles Beckton Dickinson 303800
2 mL Eppendorf tube Sarstedt 689
Tissue casette Sakura Finetech 4118F
Tissue processing machine ASP200S Leica
Xylene VWR UN1307
Paraffin wax Millipore K95523361
Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm Sakura Finetech 4123
Microtome Microm HM355
Water bath for sectioning Orthex 60591
Water bath for sectioning Leica HI1210
Microtome blade Feather S35
Glass slide Th.Geyer GmbH & Co. 7,695,019
Ultrapure water Millipore MPGP04001 MilliQ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 PFA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (13), 4093-4100 (2000).
  2. Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57, (3), 283-292 (1993).
  3. Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64, (1), 11-20 (1997).
  4. Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2, (5200), 713 (1960).
  5. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  6. Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. (2018).
  7. Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22, (2), 323-331 (2018).
  8. Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (2), 936 (2012).
  9. Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9, (4), 487-490 (2016).
  10. Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
  11. Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175, (2), 571-579 (2009).
  12. Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  13. Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33, (1), 230-239 (2015).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, (11), 8505 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (9), 6262 (2013).
  16. Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92, (1), 259-262 (1982).
  17. Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
  18. Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280, (22), 21653-21660 (2005).
  19. Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
  20. Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37, (8), 1593-1601 (1996).
  21. Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45, (2), 189-201 (1997).
  22. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87, (5), 478-486 (2008).
  23. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  24. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93, (6), 927-936 (2011).
  25. Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22, (2), 113-133 (2003).
  26. Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50, (5), 553-556 (2006).
  27. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245, (2), 132-143 (2016).
  28. Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (6), 2786 (2012).
  29. Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124, (Pt 15), 2666-2675 (2011).
  30. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1775-1788 (2004).
Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing. J. Vis. Exp. (137), e58071, doi:10.3791/58071 (2018).More

Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing. J. Vis. Exp. (137), e58071, doi:10.3791/58071 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter