Summary
Det här protokollet beskriver en metod att tillfoga ett skrapsår på den okulära ytan av musen och följa sårläkningsprocessen därefter. Protokollet tar fördel av en okulär burr delvis bort ytan epitelet i ögat i bedövat möss.
Abstract
Murina hornhinnan ger en utmärkt modell för att studera sårläkning. Hornhinnan är det yttersta lagret av ögat, och således är det första försvaret att skada. I själva verket är den vanligaste typen av ögonskador Funna i kliniken en korneal nötning. Här använder vi en okulär burr för att inducera ett skrapsår som resulterar i borttagning av hornhinnans epitel i vivo på sövda möss. Denna metod möjliggör riktade och reproducerbara epitelial störningar, medan andra områden intakt. Dessutom vi beskriva visualisering av skadad epitel med fluorescein färgning och ge konkreta råd om hur att visualisera skadad kornea. Sedan följer vi tidslinjen för sårläkning 0, 18 och 72 h efter nötning, tills såret är åter epithelialized. Epitelial nötning modellen korneal skada är idealisk för studier på epitelial cell spridning, migration och återepitelisation hornhinnans lager. Denna metod är dock inte optimal att studera stromal aktivering under sårläkning, eftersom den okulära burr inte tränger till de stromal cell-lagrarna. Denna metod är också lämplig för kliniska tillämpningar, till exempel prekliniska test av drogen effektivitet.
Introduction
Epitelial skikt av talrika organ utsätts för skador. Men innehåller de också förmågan att kompensera vävnad genom sårläkning. Hornhinnan erbjuder en utmärkt modell för att studera sårläkning. Det bildar den yttre ytan av ögat och ger ett skyddande lager för den känsliga okulär maskinen. Hornhinnan fungerar således som en fysisk barriär till patogener och vattenförlust. Den består av tre lager; epitel, stroma och endotel. Epitelet i hornhinnan gör upp det yttersta lagret av hornhinnan. Epitelceller upprätthålla barriärfunktionen av hornhinnan genom att följa strikt varandra genom åtsittande föreningspunkter1,2,3. Ett acellulärt korneal basalmembranet, den Bowmans membran, avgränsar epitelet från omfattande stroma, som innehåller eldfasta keratocyter. Endotelceller kanal under stroma, näringsämnen, vatten och syre till det övre lagret.
Hornhinnan skrubbsår är mycket vanliga i kliniken4. Skador på hornhinnan är olika, men till stor del orsakade av små partiklar såsom damm eller sand, repor eller andra främmande föremål. Protokollet beskrivs här syftar till att reproducera en kliniskt relevant typ av hornhinnans epitel nötning. Så ger det här protokollet en kontrollerbar och banbrytande metod för kliniker och korneal forskare för att genomföra egna studier. Vi har utfört en reparation i vivo skada analys på murina hornhinnan av slipning vävnaden med en avtrubbade okulär burr, den Algerbrush II. Här, vi riktar nötning endast till det centrala hornhinnans epitelet och lämna de andra delarna av orgeln utan skador. Således, protokollet är idealisk för studien korneal epitelial cell dynamics eller basalmembranet under återepitelisation, cell migration, proliferation och differentiering i vivo5. Nyligen har användes denna modell för att analysera progenitor cell dynamics i murina hornhinnan samt att avslöja kapaciteten av differentierade korneal epitelceller återupprätta korneal stamcellsnischen efter skada6,7. Efter nötning, hornhinnan återgår till sin normala öppenhet och draghållfasthet. Intressant, anges en in vitro- studie att återepitelisation sker utan ökad cell spridning8. Det här protokollet beskriver tidslinjen av oavbruten healing i murina hornhinnan. Metoden gäller således att testa effekten av läkemedel på healing mönster och hastighet.
Hornhinnan har använts i stor utsträckning för sårläkning studier. Men många studier har förlitat sig på andra modeller av skada. En väletablerad modell av korneal skada är alkaliska brännskadan som utförs genom att tillämpa natriumhydroxid (NaOH) med eller utan filterpapper på hornhinnans yta9. Alkaliska exponering resulterar i en stor och diffus skada som påverkar inte bara hornhinneepitelet, men också de bindhinna och stroma9,10. Starka alkaliska lösningar har visats inducera kärlnybildning9korneal sår och kontrastverkan. Inflammatoriska celler invaderar stroma vanligtvis inom 6 h och stanna kvar där tills 24 h11. Alkaliska skada är alltså en lämpligt metod i studier relaterade till stromal aktivering. En annan typ av kemisk skada kan åsamkas genom tillämpning av dimetyl sulfoxid (DMSO) på hornhinnan9,10. Andra vanliga skador modeller inkluderar incisional sår som tränger igenom stroma och keratectomy såren, som är begränsade till den övre delen av stroma14,15. Dessa metoder är också användbart för att besvara frågor angående stromal sårläkning. Annan skada modeller har sina egna fördelar och nackdelar. Nötning eller debridering, av hornhinnans epitel utvecklades först med slöa skalpeller eller blad på ex vivo hornhinnor16. Denna metod har senare varit används i vivo på mus, råtta och kanin17,18,19,20,21,22. Använder den okulära burr (figur 1), vi tar bort endast en vald region av epitel, lämnar resten av epitelet opåverkad. Detta sätt, är det möjligt att exakt rikta epitelial borttagningen till olika delar av hornhinnan. Dessutom kan nötning storlek bedömas med fluorescein färgning. Dessutom följa här vi nötning stängning under läkningsperioden.
Denna metod medför flera fördelar, i) inklusive exakt lokalisering av nötning webbplats, som inte är möjligt med kemisk skada, ii) nötning går snabbt att utföra, och iii) det är icke-invasiv. Häri, beskriver vi metoden med outbred NMRI musen som modell, men detta kan tillämpas till det stora utbud av mus genetiska modeller, samt till råtta och kanin, som är gemensamma modeller som används för att studera mänskliga korneala störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment är godkända av nationella djurförsök styrelsen.
1. förberedelser
- Förbereda alla lösningar och förvara i rumstemperatur, om inte annat anges. Följ avfallsbestämmelser till kasta använt material och lösningar.
- Användning NMRI och ICR utkonkurrerat dö ut lager, åldrarna 4-12 veckor och endera könet. Om du använder C57BL/6 stammen, följ metoden ketamin-Medetomidin förberedelse i steg 1.3.2. För andra steg, följ instruktionerna i 1.3.3.-1.3.5.
- Förbereda den veterinär-medicinen färska och i tid före operation startas. Karprofen kommer att användas senare, det är således inte nödvändigt att förbereda den på denna punkt.
- För att förbereda en lösning av ketamin-Medetomidin anestesi, blanda 0,375 mL (lagerför koncentrationen 50 mg/mL) av ketamin (Ketaminol Vet) med 0,25 mL (lagerför koncentrationen 1 mg/mL) av Medetomidin (Cepetor Vet) och tillsätt 1,25 mL steril 0,9% NaCl. Administrera 0,15 mL/20 g Musens vikt (7,5 mg/kg, ketamin och 1 mg/kg, Medetomidin).
- För att förbereda en mer utspädd lösning av ketamin-Medetomidin anestesi på C57BL/6 möss, blanda 0,375 mL (lagerför koncentrationen 50 mg/mL) av ketamin med 0,25 mL (lagerför koncentrationen 1 mg/mL) av Medetomidin och tillsätt 2,5 mL steril 0,9% NaCl. Administrera 0,15 mL/20 g Musens vikt (3,75 mg/kg, ketamin och 0,5 mg/kg, Medetomidin).
Obs: Detta är ett alternativt steg, endast för vuxna C57BL/6 möss. - För att förbereda buprenorfin för analgesi, tillsätt 0,1 mL (lagerför koncentration 0,3 mg/mL) av buprenorfin till 1,9 mL steril 0,9% NaCl. Administrera 0,2 mL/20 g Musens vikt (0,15 mg/kg).
- För att förbereda atipamezol avbruten anestesi, Lägg 0,1 mL (lagerför koncentration 5 mg/mL) av atipamezol till 4,9 mL 0,9% NaCl. Administrera 0,15 mL/20 g Musens vikt (0,75 mg/kg).
- För analgesi under efter anestesi använda karprofen. Tillsätt 0,1 mL (lagerför koncentrationen 50 mg/mL) av karprofen till 4,9 mL 0,9% NaCl. Administrera 0,15 mL/20 g Musens vikt (7,5 mg/kg).
- Förbereda fluorescerande färglösningen
- För att visualisera nötning i Cobalt Blå ljuset (figur 1), Använd en fluorescerande lösning. Förbered en 0,1% fluorescein lösning genom att första mäta 10 mg av fluorescein salt med en finskalig och sedan lägga till 10 mL i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Ljuskänsligt fluorescein lösningen och skaka i 5 minuter på en shaker.
Obs: Fluorescein lösningen är ljuskänsliga; Förvara lösningen omfattas från ljus. Denna lösning kan förvaras i + 4 ° C i 2-3 dagar. För användning är det bra att placera fluorescein lösningen i en droppflaska som används för ögondroppar. Använd en steril-filter när du flyttar lösningen i droppflaska.
- Ren den okulära burr spetsen före och efter användning; först med PBS och sedan med 70% EtOH. Om att göra ett skrapsår till flera möss under samma operation, göra rengöring steg mellan varje mus.
- Sätta den uppvärmda plattan på (+ 37 ° C) och placera en pappershandduk på den.
2. korneal nötning
FÖRSIKTIGHET: Använd skyddskläder (handskar, labbrock) vid hantering av möss. Väg med musen för att uppskatta volymen av medicinering för att administrera.
- Använd metoden en hand scruffing för att hantera musen23. Administrera ketamin-Medetomidin blandning intraperitonealt (i.p.) till vänstra nedre delen av buken. Placera musen till en enskild bur och vänta på att somna. Det tar vanligtvis mindre än 5 minuter. Sedan administrera första buprenorfin och sedan atipamezol via i.p. injektioner. Använda samma hantering teknik.
Obs: När anestesi ges, protokollet bör inte pausas när som helst. - Innan du fortsätter, kontrollera att den uppvärmda plattan är varm. Placera sövda musen på den uppvärmda plattan. Anestesi är bra om svans reflex är frånvarande, men tå reflexen är närvarande. Kontrollera dessa reflexer genom att nypa svansen och någon tå med fingrar eller pincett. Använd inte överdriven kraft. Anestesi kommer senaste 20-25 minuter.
- Gör ett skrapsår och Använd den rengjorda okulär burr. Rotera basen av burr att slå på den vibration som är mycket viktigt att slitningen. Känn en vibration i hand, när burr fungerar.
- Öppna ett öga i taget genom att hålla ögonlocken separat med fingrar. Sedan stadigt tryck råeggen på hornhinnan och flytta instrumentet fram och tillbaka samt som i sidled på den okulära ytan. Burr vibrationer kommer att utföra scratch; Tryck, skaka eller inte riva hornhinnan. I centrala hornhinnan är 20 slipning rörelser på ytan tillräckliga för att framkalla såret. Inte lyfta burr och försöka bo i regionen i hornhinnan att vara skadad. Förvärva en standardstorlek nötning kommer att kräva flera omgångar av praxis.
Obs: Hornhinnan asepsis kan uppnås innan nötning med betadine ophthalmic lösning.
3. imaging slitningen
- Belysa regionen skadad med fluorescein lösning och kobolt blå penna ljus (figur 1). Den okulära ytan verkar färglöst i omgivande ljus. Efter fluorescein ansökan fluorescerar regionen skadad i grönt när lysande ögat med pennan ljus.
- Om det behövs, öppna skadad ögat på samma sätt som i 2.3 och administrera en droppe av fluorescein lösning från den dropper flaskan. Tvätta ögat en gång med PBS eller 0,9% NaCl att minska bakgrunden av fluorescein. Använd en droppflaska eller en pipett för tvätt. Aspirera vätskan bort med en mjuk torka och rengör ögonfransarna, om det behövs. Den överflödig vätskan samlar oftast till ögat, nära öppnandet av kanalen tår nasal kantlinje.
FÖRSIKTIGHET: Undvik att vidröra hornhinnan medan cleaining som mindre skrubbsår kan induceras.
- Om det behövs, öppna skadad ögat på samma sätt som i 2.3 och administrera en droppe av fluorescein lösning från den dropper flaskan. Tvätta ögat en gång med PBS eller 0,9% NaCl att minska bakgrunden av fluorescein. Använd en droppflaska eller en pipett för tvätt. Aspirera vätskan bort med en mjuk torka och rengör ögonfransarna, om det behövs. Den överflödig vätskan samlar oftast till ögat, nära öppnandet av kanalen tår nasal kantlinje.
- Ta bilder av den hornhinna nötning.
- För att få liknande bilder under varje bildsession, använda stadig fastsättning verktyg för Cobalt Blå penna ljuset och den SLR kameran (figur 2). Detta protokoll ger en setup som är lätt att upprepa (figur 2).
- För att fästa lampan pennan och kameran, använda en bordslampa med en flexibel arm och klämma och en justerbar kameran arm med en klämma, respektive. Kabel-tie pennan ljus till bordslampa och position strax ovanför musen ögat. Positionering ljuset annorlunda kan påverka visualisering av slitningen. Ett förslag för positionering dessa verktyg beskrivs i figur 2.
- Använd den SLR kameran för att ta bilder av ögat. Placera djuret i en önskad avstånd och position och fokus kameran (1:12) i rumsbelysning. Efter det, Stäng alla andra lampor utom det koboltblå penna ljuset.
Obs: Tejpa pennan ljus handtaget ner eller använda ett gummiband för att hålla ljuset på hela tiden under imaging. Detta kan hjälpa om bilden blir suddig. Det är lättast att utföra steget imaging med en kollega.
- För att få liknande bilder under varje bildsession, använda stadig fastsättning verktyg för Cobalt Blå penna ljuset och den SLR kameran (figur 2). Detta protokoll ger en setup som är lätt att upprepa (figur 2).
4. vakna upp efter korneal nötning
- Administrera första buprenorfin och sedan atipamezol via i.p. injektioner. Använda samma hantering teknik som i 2.1.
- Placera en droppe av antibakteriella, fucidin syra ögonsalva (Isathal) till både skadad och icke-skadad ögon att återfukta och hålla den okulära ytan ren från bakterier efter anestesi.
- När musen kommer att vakna upp i 5-20 minuter på den uppvärmda plattan, Observera musen under perioden efter narkos vakna. När det blir mobil, placera det i en enskild bur.
Obs: Om det tar längre tid att vakna upp, Placera musen i buren med en uppvärmd pad eller placera hela buren på den uppvärmda plattan och regelbundet övervaka musen. Medan anestesi avtar, skakar musen normalt och når uppåt med främre kroppen. Detta beteende bör återgå till det normala i 3-4 timmar och sedan kan du Placera musen tillbaka till en delad bur. - Administrera karprofen i.p. för analgesi och ögat salva två dagar efter nötning, på samma sätt som i steg 2.2. och 4.2.
5. imaging under sårläkning
- Använd tid pekar i detta protokoll, 18 h och 72 h efter nötning att iaktta sårslutning.
- För på varandra följande imaging, söva mössen som förklaras i 2.2.
- Ta bilder som förklaras i 3.
- Vakna upp djuren med atipamezol i.p. och övervaka den vakna perioden som förklaras i 4.3.
Obs: om inte fortsatt uppföljning, avliva musen direkt efter 5.1.2. Dödshjälp är beskrivs i 6.1.
6. hornhinnan insamling och Paraffin inbäddning
- Efter den sista tidpunkten, offra djur. Placera musen i en kammare som kan fyllas med CO2. Fylla kammaren luften med CO2. När djuret är orörliga, rubba halskotor genom att dra fast från basen av svansen och trycka på regionen hals ner samtidigt.
Varning: Följ alltid riktlinjerna i lokala djurskydd kroppen. - Samla hela ögongloben genom att skära en öppning i huden vid sidan av ögat med dissektion sax. Placera saxen under ögongloben och skär den okulära nerven för att pop ögongloben ur omloppsbana. Använd tången om ögat inte kommer ut enkelt.
- Gör ett hål på baksidan av ögat, på retinal sida, med en 26G nål att tillåta fri penetration av lösningar inuti ögat.
Obs: Låt inte ögat blir torrt, istället, placera den i PBS tills fortsätter med protokollet.
- Gör ett hål på baksidan av ögat, på retinal sida, med en 26G nål att tillåta fri penetration av lösningar inuti ögat.
- Samla ögongloben i en 2 mL tub med PBS. Pausa inte experimentet på denna punkt.
- Ta bort PBS och fixa ögonglober i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i + 4 ° C i 4-5 timmar.
- Flytta fasta ögongloben till en vävnad kassett för vävnad bearbetning. Använd en vävnad bearbetning maskin och följande program:
- Skölj med PBS.
- Inkubera 2 x 45 min i 70% etanol i rumstemperatur.
- Inkubera 2 x 1 h i 94% etanol i rumstemperatur.
- Inkubera 3 x 45 min i absolut etanol vid rumstemperatur.
- Inkubera 3 x 1 h i xylen, vid rumstemperatur och sista xylen vid 37 ° C.
- Inkubera 3 x 1 h i paraffin vax på 60 ° C.
- Efter vävnad bearbetning, bädda in ögongloben i flytande paraffin (+ 60 ° C) med en vävnad inbäddning block. Placera ögat inuti blocket så att det ser ut i sidled och perifera gränsen är vänd uppåt. Låt blocket stelna på en cool platta för 5-10 minuter.
7. paraffin avsnitt av hornhinnan
- Förbereda mikrotomen för snittning enligt den institutionens eller tillverkarens instruktioner.
Varning: Var försiktig vid hantering av vassa mikrotomen bladet. - Plats ett vattenbad med rumstemperatur ultrarent vatten bredvid mikrotomen och en annan med ultrarent vatten värms upp till + 50 ° C.
- Göra 5 µm tjocka sektioner av ögongloben.
Obs: Linsen bryter lätt vid snittning. För att undvika detta, torka skärning med en fuktig vävnad som varje gång en ny rad av sektioner är igång. Använda kranvatten för att fukta vävnaden. - Placera i avsnitt bredvid varandra i rumstemperatur vattenbad och sedan flytta dem till hett vattenbad med hjälp av en glasskiva. Sträcka i avsnitt i det varma vattenbadet tills alla rynkor koppla av och sektioner blir Matt.
- Torka glas glasen med sektioner övernattning i + 37 ° C.
- Bifoga i avsnitt till bilder genom att hålla bilden i 1 minut på en uppvärmd platta i + 60 ° C. Efter detta, kan avsnitten vara direkt bearbetas för färgning, immunohistological metoder eller lagras i + 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver en modell för att orsaka en nötning skada mus hornhinnan och föreslår hur följ och visualisera läkningsprocessen efter nötning. Nyligen har anställt vi denna metod att studera rollen av hornhinnans epitel stamceller under sårläkning6. Användning av etablerade verktyg är nyckeln till en framgångsrik nötning experiment. Vi, och andra, har använt Algerbrush II okulär burr (figur 1) för att utföra den skrubbsår6,7,24. Detta verktyg har en avtrubbade burr spets 0,5 mm i storlek som borstar snarare än borrar eller klipper hornhinneepitelet bort. Sålunda, detta verktyg är det rekommendera valet för en nötning skada på hornhinnan.
En central del av denna modell är att den drabbade regionen utan ansträngning kan visualiseras på önskad intervall. I figur 3Apresenterar vi användningen av fluorescein färgning i kombination med en koboltblå ljuskälla (figur 1) för att visa webbplatsen nötning. I detta experiment utfört vi ett stort sår i hornhinnans och lämnade perifera kornea orörd (figur 3A). Dessutom vi skadad bara vänster öga varje mus och höll den rätt, bilaterala öga som en icke-skadad kontroll. De bilaterala öga proverna var fortsatt negativ för fluorescein signal, vilket tyder på att de inte genomgår någon cellförlust under experimentet och därmed fungera samt kontrollprover. Grön signal vid gränserna till ögat visas dock fluorescein lösningen som ackumulerats i korsningen mellan ögat och ögonlocket. Nötning var störst vid 0 h, omedelbart efter skadan (figur 3A). Det var markant mindre efter 18 h och, i detta fall ligger nära den övre gränsen av ögat. Dock stänger epitel exponerade regionen lika hastighet från alla sidor av nötning. Noterbart på 72 h efter såra, var ingen grön signal synlig. Detta indikerar att hornhinneepitelet var helt nytt epithelialized av 72 h efter nötning.
Med den här metoden syftar vi fokuserar nötning endast på hornhinnans epitel, så att djupare lager av hornhinnan förblivit intakt. Avlägsnandet av hornhinnans epitel var uppenbart från histologiska sektioner i figur 3B. Vid 0 h visas i utkanten av nötning som en smal, acellulärt avsats som är fortlöpande från en vanlig, 4-5 cell lager tjock hornhinneepitelet. Limbus, perifer gränsen av hornhinnans epitel, presenterar ett exempel region som inte påverkades av nötning under hela experimentella tidslinjen (72 h). Histologiska sektioner anges dessutom att de djupare skikten av hornhinnan, stroma och endotel, inte var skadas av okulär burr. Dessa två vävnader verkade liknande i skadad och bilaterala ögat prover. Vid 18 h efter skada, läkningsprocessen är aktiv och återepitelisation pågår. Detta föreslogs av uppkomsten av en framkant. Framkant innehåller bara 1-2 epitelceller lager och omfattar regionen utsatt innan re stratifiering kan ske25. I linje med resultaten på figur 3A, var ytan helt nytt epithelialized av 72 h, när de migrerar fronterna hade täckt såret och alla epitelial lager fanns igen. Histologiska sektioner från bilaterala ögat bekräftade (figur 3A) att kontroll ögon förblev intakt under observationsperioden.
Slutligen kan vi styrka att nötning modellen är begränsad till hornhinneepitelet och anropar inte en stromal reaktion på skada, såsom kärlnybildning. Figur 4 visar murina hornhinnan på 18 h efter nötning. Baserat på makroskopiska Visa, framvisade denna tidpunkt inte en stromal reaktion, vilket indikerar att våra protokoll inte stör de djupare hornhinnans lager. I jämförelse inducerade en alkalisk skada med 0,75 mol/L NaOH omedelbart kärlnybildning i stroma. Med tanke på den snabba kärlnybildning i alkaliska skador, bevisa punkter i vår metod att utesluta möjligheten att svar i stroma.
Figur 1: viktiga verktyg för hornhinnans epitel nötning. Till vänster är en vibrerande okulär burr. Kobolt blå penna ljus till höger används för att föra fluorescein fläcken syns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Imaging den hornhinna nötning. (A) verktyg för bildbehandling är en justerbar kameran arm med klämma (vänster), SLR kameran (mitten) och en bordslampa med flexibel arm och klämma (höger). Kobolt blå penna ljus är knuten till kupolen på lampan med två buntband. (B) en allmän uppfattning av imaging installationen; distansera av varje bifogad fil verktyg markeras i bilden i cm. Båda klämmorna är 6 cm från värme plattan och musen placeras 10 cm från värmen plattan kanten. (C) en närmare titt på nötning bildtagning med föreslagna avstånd och position för mus ögat i cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: identifiering och lokalisering av den hornhinna nötning. (A) mus ögon på 0, 18 och 72 h efter nötning. Fluorescein signal markerar regionen skadad i ljust gröna, medan alla andra regioner i epitelet fortfarande är mörkt. Bilaterala ögon fungerar som kontroller. Streckad linje markerar gränsar av såret och den vita fläcken i varje öga är reflektion från kameran. (B) sektioneras histologiskt och hematoxylin och eosin målat prover av mus synar på 0, 18 och 72 h efter nötning. Limbus är på kanten som omger hornhinneepitelet från alla sidor. Asterix markerar kanten av slitningen. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: korneal nötning aktiveras inte en stromal reaktion. Alkaliska exponering med 0,75 mol/L NaOH följt av bevattning med 0,9% NaCl producerar korneal kärlnybildning (ögat samlas in omedelbart efter behandling). Nötning med okulär råeggen visar ingen kärlnybildning även efter 18 h. nötning webbplats markeras med en streckad linje. Skala bar 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skadade metoder är populära verktyg att studera olika aspekter av hornhinnans homeostas och patologier. Nötning modellen erbjuder en väl kontrollerad metod för att ta itu med relevanta problem i oftalmologi. Vissa kritiska punkter i protokollet är dock värt att poängtera. Särskilt, Detaljer beskrivs avseende veterinärmedicin, sår läkning tidslinje och resultatet är optimerade för användning med utkonkurrerat dö ut NMRI och ICR bestånd, men kan variera bland stammar av möss26. Med detta protokoll förblir försöksdjuren sövda i ca 20 minuter. Detta ger ett kort men tillräckligt tidsfönster att utföra slitningen. Dock när du använder den okulära burr, gör nötning själv är en mycket snabb operation och bör vara möjligt att utföra inom denna tidsram.
Enkelt och tillgängligt visualisering är en av de främsta fördelarna med nötning modellen. Kombinerat med molekylärbiologiska metoder, öppnar detta möjligheter för att studera epitelceller i detalj. Skadad hornhinnor kan behandlas för histologisk eller immunologiska färgning och proteiner och nukleinsyror kan samlas och undersökas ytterligare. Pajoohesh-Ganji et al. visade att gen uttrycksmönster i hornhinnan epitelceller ändringen på hornhinnan förolämpning med en avtrubbade bladet27. För att säkerställa kontrollerade provtagning, rekommenderar vi att bilderna av skrubbsår tas genast efter operationen och provsamlingar följa exakt planerade tidslinjerna.
Detta protokoll har användningsområden utöver granskning av hornhinnan epithelialization. Nötning av hornhinnans limbus, stamcellsnischen i hornhinnan, kan exempelvis användas för att studera stamceller dynamics7. Vi visade att epitelet icke-skadad regionen förblev normal under läkningsprocessen, men vissa författare hävdar att basalmembranet och den underliggande stromal keratocyter påverkas av okulära skorra24,28. Avlägsnande av basalmembranet kan uppskattas med specifika basalmembranet färgning. Dessutom kunde upprepade skrubbsår över en längre tidslinje avslöja intressanta helande mönster. I detta protokoll iakttog vi inte arkitekturen av epitel över en långsiktig jakt. Båda avtrubbade skalpell och okulär burr skador har visat en ökad incidens till hornhinnan erosioner efter en till flera veckor efter skada24,29,30. Detta bör hållas i åtanke när du använder den nötning modellen för långsiktiga studier. Studier med fokus på hornhinnan erosioner kanske hittar emellertid detta protokoll användbar.
Andra skadade modeller beskrivs utförligt av Stepp et al. i en granskning5. Tillsammans ger detta protokoll och befintliga metoder mångsidiga alternativ för att undersöka grundläggande biologiska frågor såväl som praktiska kliniska problem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Kaisa Ikkala för hennes ovärderliga tekniskt bistånd och insiktsfulla hjälp när aktualerande denna metod liksom senare under genomförandet till vår centrala forskningsfrågor. Vi vill också tacka Laboratory Animal Center och Anna Meller för hennes hjälp med att planera riktlinjerna i veterinära arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
