Summary
Denne protokol beskriver en metode til at påføre en slid okulær overflade af musen og følge den sårheling proces derefter. Protokollen tager fordel af en okulær burr delvist fjerne overflade epitel af øjet i bedøvet mus.
Abstract
Murine hornhinden giver en fremragende model for at studere sårheling. Hornhinden er det yderste lag af øjet, og dermed er det første forsvar mod skade. Faktisk er den mest almindelige form for øjenskader fundet i klinikken en hornhinde slid. Her, udnytte vi en okulær burr for at fremkalde en slid resulterer i fjernelse af hornhindens epitel i vivo på bedøvede mus. Denne metode giver mulighed for målrettet og reproducerbare epitelial forstyrrelser, forlader andre områder intakt. Derudover vi beskrive visualisering af slidt epitel med fluorescein farvning og yde konkret rådgivning om, hvordan man visualisere slidt hornhinden. Vi Følg tidslinjen af sårheling 0, 18 og 72 h efter slid, indtil såret er igen epithelialized. Modellens epitelial slid af cornea skade er ideel til undersøgelser om epitelcelle spredning, migration og fornyet epithelialization af hornhinde lag. Men, denne metode er ikke optimal at studere stromale aktivering i løbet af sårheling, fordi okulær burr ikke trænge ind til de stromale cellelag. Denne metode er også velegnet til kliniske applikationer, for eksempel, præ-klinisk test af narkotika effektivitet.
Introduction
Epitel lag af mange organer er udsat for skader. De indeholder imidlertid også mulighed for at kompensere for væv tab gennem sårheling. Hornhinden tilbyder en fremragende model for at studere sårheling. Det danner øjets ydre overflade og giver et beskyttende lag for den følsomme okulær maskiner. Hornhinden fungerer således, som en fysisk barriere for patogener og vandtab. Det består af tre lag. epitel, stroma og endotelet. Epitel af hornhinden udgør det yderste lag af hornhinden. Epitelceller opretholde den barriere funktion af hornhinden ved strengt at overholde hinanden gennem stramme kryds1,2,3. En acellulær hornhinde basalmembranen, den Bowman membran, adskiller epitel fra den omfattende stroma, som indeholder ildfaste keratocytes. Under stroma kanal endotelceller næringsstoffer, vand og ilt til det øverste lag.
Corneal hudafskrabninger er meget almindelige i klinikken4. Skader på hornhinden er mangfoldige, men er i høj grad forårsaget af små partikler såsom støv, sand, ridser eller andre fremmedlegemer. Protokollen beskrevet her sigter mod at gengive et klinisk relevante type af hornhindens epitel slid. Dermed giver denne protokol en kontrollerbar og skelsættende metode til klinikere og cornea forskere til at gennemføre deres egne undersøgelser. Vi har udført en i vivo skade reparation assay på murine hornhinden ved slibning væv med en sløvet okulær burr, Algerbrush II. Her, vi målrette slid kun til den centrale hornhindens epitel og lade de andre dele af orglet uden skader. Således protokollen er ideel til undersøgelse hornhinde epitelcelle dynamics eller basalmembranen under fornyet epithelialization, celle migration, spredning og differentiering i vivo5. For nylig blev denne model brugt til at analysere stamfader celle dynamics i murine hornhinden samt at afsløre kapacitet af de differentierede hornhinde epitelceller i genetablere hornhinde stamcelle niche efter skade6,7. Efter slid, hornhinden vender tilbage til sin normale gennemsigtighed og brudstyrke. Interessant, viste en in vitro- undersøgelse, at fornyet epithelialization sker uden øget celle spredning8. Denne protokol beskriver tidslinjen af uafbrudt healing i murine hornhinden. Metoden er således relevant at teste effekten af lægemidler på healing mønstre og hastighed.
Hornhinden har været flittigt brugt for sårheling undersøgelser. Dog har mange undersøgelser påberåbt sig andre modeller af skade. En veletableret model af cornea skade er basisk brænde, der er udført ved at anvende natriumhydroxid (NaOH) med eller uden filter papir på hornhindens overflade9. Alkalisk eksponering resulterer i et stort og diffus skade, der påvirker ikke blot hornhindens epitel, men også conjunctiva og stroma9,10. Stærkt alkalisk løsninger har vist sig at fremkalde hornhinde sår, mattering og neovascularization9. Inflammatoriske celler invadere stroma typisk inden for 6 h og forblive der indtil 24 h11. Alkalisk skade er således en tilrådeligt metode i undersøgelser vedrørende stromale aktivering. En anden type af kemiske skade kan være påført ved at anvende dimethylsulfoxid (DMSO) på hornhinden9,10. Andre almindeligt anvendte skade modeller omfatter incisional sår, der trænger igennem de stroma og keratectomy sår, som er begrænset til den øverste del af stroma14,15. Disse metoder er også nyttige til at besvare spørgsmål vedrørende stromale sårheling. Forskellige skade modeller har deres egne fordele og ulemper. Slid, eller debridering af hornhindens epitel blev først udviklet ved hjælp af sløvet skalpeller eller vinger på ex vivo hornhinder16. Denne metode har senere været brugt i vivo på mus, rotte og kanin17,18,19,20,21,22. Ved hjælp af okulær burr (figur 1), fjerner vi kun en valgte område af epitel, upåvirket resten af epitel. Denne måde, det er muligt at præcist målrettede epitelial fjernelse til forskellige dele af hornhinden. Derudover kan slid størrelse vurderes med fluorescein farvning. Desuden, her følger vi slid lukning den helbredende periode.
Denne metode indebærer flere fordele, i) herunder præcise placering af slid websted, som ikke er muligt med kemisk skade, ii) slid er hurtig til at udføre, og iii) det er non-invasiv. Heri, beskrive vi metoden ved hjælp af outbred NMRI musen som model, men dette kan anvendes til det enorme opbud af musen genetiske modeller samt til rotte og kanin, som er fælles modeller, der anvendes til at studere menneskets hornhinde forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter er godkendt af national animal eksperiment board.
1. præparater
- Forberede alle løsninger og holde ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Følg affaldsregler Bortskaf anvendte materialer og løsninger.
- Brug NMRI og ICR outbred bestande, alderen 4-12 uger og begge køn. Hvis du bruger C57BL/6 stamme, følge metoden ketamin-medetomidine forberedelse i trin 1.3.2. Andre skridt, Følg instruktionerne beskrevet i 1.3.3.-1.3.5.
- Forberede veterinærmedicin, frisk og i tiden før du starter operationen. Carprofen skal bruges senere, det er således ikke nødvendigt at forberede det på dette tidspunkt.
- For at forberede en opløsning af ketamin-medetomidine for anæstesi, mix 0.375 mL (stock koncentration 50 mg/mL) af ketamin (Ketaminol Vet) med 0,25 mL (stock koncentration 1 mg/mL) af medetomidine (Cepetor Vet) og tilføje 1,25 mL steril 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g af musen vægt (7,5 mg/kg, ketamin og 1 mg/kg, medetomidine).
- For at forberede en mere fortyndet opløsning af ketamin-medetomidine for anæstesi på C57BL/6 mus, mix 0.375 mL (stock koncentration 50 mg/mL) af ketamin med 0,25 mL (stock koncentration 1 mg/mL) af medetomidine og tilsættes 2,5 mL af steril 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g af musen vægt (3,75 mg/kg, ketamin og 0,5 mg/kg, medetomidine).
Bemærk: Dette er et alternativt trin, kun for voksne C57BL/6 mus. - For at forberede analgesi buprenorfin bør der tilsættes 0,1 mL (stock koncentration 0,3 mg/mL) af buprenorfin 1,9 ml steril 0,9% NaCl. Administrere 0,2 mL/20 g musen vægt (0,15 mg/kg).
- For at forberede Atipamezol for ophørende anæstesi, tilsættes 0,1 mL (stock koncentration 5 mg/mL) af Atipamezol til 4,9 mL 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g musen vægt (0,75 mg/kg).
- Bruge carprofen for analgesi under post anæstesi. Der tilsættes 0,1 mL (stock koncentration 50 mg/mL) af carprofen 4,9 ml 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g af musen vægt (7,5 mg/kg).
- Forberede fluorescerende Farvningsopløsningen
- Visualisere slid under kobolt blå lys (figur 1), bruge en fluorescerende løsning. Fremstilles en 0,1% opløsning af fluorescein ved første måling 10 mg fluorescein salt med et finskala og derefter føje den til 10 mL i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Beskytte fluorescein løsning fra lys og ryste i 5 minutter på en shaker.
Bemærk: Fluorescein løsning er lysfølsomme; holde den løsning, der er omfattet af lys. Denne opløsning kan opbevares i + 4 ° C i 2-3 dage. Til brug er det nyttigt at placere fluorescein løsning i en dråbetæller flaske, der bruges til øjendråber. Bruge en steril-filter, når du flytter løsningen til dropper flasken.
- Ren okulær burr spidsen før og efter brug; først med PBS og derefter med 70% EtOH. Hvis gør en slid til flere mus under den samme operation, gør rensningsetaper mellem hver mus.
- Sætte den opvarmet plade på (+37 ° C) og placere en køkkenrulle på det.
2. hornhinde slid
Forsigtig: Brug beskyttende slid (handsker, laboratoriekittel) Hvornår håndtering mus. Veje med musen for at vurdere omfanget af medicin til at administrere.
- Brug én hånd scruffing metode til at håndtere musen23. Administrere ketamin-medetomidine blanding intraperitoneal (i.p.) til den venstre nedre abdomen. Placer musen til en individuel bur og vente på at falde i søvn. Det tager typisk mindre end 5 minutter. Derefter administrere første buprenorfin og derefter Atipamezol via i.p. injektioner. Brug den samme håndtering teknik.
Bemærk: Når der gives anæstesi, protokollen bør ikke sættes på pause på ethvert tidspunkt. - Før du fortsætter, Kontroller, opvarmet pladen er varm. Sted bedøvede musen på den opvarmet plade. Anæstesi er god hvis halen reflex er fraværende, men tå refleks er til stede. Tjek disse reflekser ved at klemme halen og enhver tå med fingre eller pincet. Brug ikke overdreven kraft. Anæstesi vil sidste 20-25 minutter.
- Gøre en slid, bruge den rensede okulær burr. Rotere base af burr at tænde de vibrationer, der er afgørende for at skabe slitage. Føle vibrationer i hånd, når burr fungerer korrekt.
- Åbne et øje ad gangen ved at holde øjenlågene separat med fingrene. Derefter fast touch burr til hornhinden og flytte instrument frem og tilbage så godt som sidelæns på okulær overflade. Burr vibration vil udføre bunden; Tryk på, ryste eller ikke rive hornhinden. I den centrale hornhinden er 20 slibning bevægelser på overfladen tilstrækkelig til at fremkalde såret. Ikke løfte burr og prøve at bo i regionen i hornhinden at være slibes. Erhverve en standard-størrelse slid vil kræve flere runder for praksis.
Bemærk: Hornhinde aseptik kan opnås før slid ved hjælp af betadine oftalmologiske løsning.
3. imaging slibning
- Belyse slidt regionen ved hjælp af kobolt blå pen lys (figur 1) og fluorescein løsning. Okulær overflade vises farveløs i omgivende lys. Efter fluorescein ansøgning fluorescerer regionen slidt i grøn når lysende øjet med pen lys.
- Hvis det er nødvendigt, åbne slidt øjet på samme måde som i 2,3 og administrere en dråbe af fluorescein løsning fra dropper flaske. Vaske øjet engang med PBS eller 0,9% NaCl at reducere baggrund af fluorescein. Bruge en dråbetæller flaske eller en pipette til vask. Opsug væsken væk med en blød tør og ren øjenvipper, hvis nødvendigt. Den overskydende væske indsamler normalt til den nasale grænse af øjet tæt på åbning af tåre kanalen.
Forsigtig: Undgå at berøre hornhinde mens cleaining som mindre hudafskrabninger kan være fremkaldt.
- Hvis det er nødvendigt, åbne slidt øjet på samme måde som i 2,3 og administrere en dråbe af fluorescein løsning fra dropper flaske. Vaske øjet engang med PBS eller 0,9% NaCl at reducere baggrund af fluorescein. Bruge en dråbetæller flaske eller en pipette til vask. Opsug væsken væk med en blød tør og ren øjenvipper, hvis nødvendigt. Den overskydende væske indsamler normalt til den nasale grænse af øjet tæt på åbning af tåre kanalen.
- Tage billeder af den hornhinde slid.
- For at få lignende billeder under hver tænkelig session, brug stabil vedhæftet fil værktøjer til kobolt blå pen lys og SLR kamera (figur 2). Denne protokol giver en opsætning, der er let at gentage (figur 2).
- Dukanvedhæfte pen lys og kameraet brug en bordlampe med en fleksibel arm og klemme og en justerbar kamera arm med en klemme, henholdsvis. Kabel-tie pen lys bordlampe og position lige over musen øjet. Positionering lyset forskelligt kan ændre visualisering af slid. Et forslag til placering af disse værktøjer er beskrevet i figur 2.
- Brug SLR kamera til at tage billeder af øjet. Placere dyret i en ønsket afstand og position og fokus kamera (1:12) i værelse lys. Efter at lukke alle andre lys undtagen kobolt blå pen lys.
Bemærk: Tape pen lys håndtaget ned eller brug en elastik til at holde lyset på hele tiden under imaging. Dette kan hjælpe hvis billedet bliver sløret. Det er nemmest at udføre trinnet billedbehandling med en kollega.
- For at få lignende billeder under hver tænkelig session, brug stabil vedhæftet fil værktøjer til kobolt blå pen lys og SLR kamera (figur 2). Denne protokol giver en opsætning, der er let at gentage (figur 2).
4. vågne op efter hornhinde slid
- Administrere første buprenorfin og derefter Atipamezol via i.p. injektioner. Brug den samme håndtering teknik som 2.1.
- Anbring en dråbe af antibakterielle, fucidin syre øjet salve (Isathal) til både slidt og ikke slibes øjne til at fugte og holde okulær overfladen ren for bakterier efter anæstesi.
- Som musen vil vågne op i 5-20 minutter på den opvarmet plade, observere musen wake-up-periode efter narkose. Når det bliver mobil, skal du placere det i en individuel bur.
Bemærk: Hvis det tager længere tid at vågne op, placere musen i bur med en opvarmet pad eller placere hele buret på den opvarmet plade og overvåge musen regelmæssigt. Mens anæstesi aftager, musen typisk ryster og når opad med den forreste krop. Denne adfærd bør vende tilbage til normal i 3-4 timer og derefter kan du placere musen tilbage til et delt bur. - Administrere carprofen i.p. for analgesi og øjet salve på to på hinanden følgende dage efter slid, på samme måde som i trin 2.2. og 4.2.
5. imaging i løbet af sårheling
- I denne protokol point brug tid 18 og 72 timer efter slid at observere sår lukning.
- For på hinanden følgende imaging, bedøver mus som forklaret i punkt 2.2.
- Tage billeder, som forklaret i 3.
- Vågn op dyr med Atipamezol i.p. og overvåge wake-up periode, som forklaret i 4.3.
Bemærk: Hvis ikke fortsætte opfølgningen, aflive mus lige efter 5.1.2. Aktiv dødshjælp er beskrevet i 6.1.
6. hornhinden samling og Paraffin indlejring
- Efter det sidste tidspunkt, ofre dyret. Placere musen i et kammer, der kan fyldes med CO2. Fyld salen luften med CO2. Når dyret er immobile, splitte halshvirvel ved trække fast fra bunden af halen og trykke på halsregionen ned på samme tid.
Forsigtig: Altid følge retningslinjerne i den lokale dyrevelfærd krop. - Samle hele øjeæblet ved at skære en åbning i huden ved siden af øjet med dissektion saks. Placer saks under øjeæblet og skære den okulære nerve for at pop øjeæblet ud af kredsløb. Bruge pincet, hvis øjet ikke kommer ud nemt.
- Lav et hul på bagsiden af øjet på den retinale side, med en 26G kanyle tillade frie penetration af løsninger inde i øjet.
Bemærk: Lad ikke øjet bliver tørt, i stedet, skal du placere det i PBS indtil fortsætter med protokollen.
- Lav et hul på bagsiden af øjet på den retinale side, med en 26G kanyle tillade frie penetration af løsninger inde i øjet.
- Indsamle øjeæblet i et 2 mL rør med PBS. Ikke pause forsøget på dette punkt.
- Fjerne PBS og lave øjne i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i + 4 ° C for 4-5 timer.
- Flytte faste øjeæblet på en væv kassette til væv forarbejdning. Bruge en væv forarbejdning maskine og følgende program:
- Skyl med PBS.
- Inkuber 2 x 45 min. i 70% ethanol ved stuetemperatur.
- Inkuber 2 x 1 h i 94% ethanol ved stuetemperatur.
- Inkuber 3 x 45 min. i absolut ethanol ved stuetemperatur.
- Inkuber 3 x 1 h i xylen, ved stuetemperatur og sidste xylen ved 37 ° C.
- Inkuber 3 x 1 h i paraffin voks ved 60 ° C.
- Efter væv forarbejdning, integrere øjeæblet i flydende paraffin (+ 60 ° C) ved hjælp af en væv indlejring blok. Placere øje inde i blokken, så det ser sidelæns og det perifere grænser opad. Lad blokken størkne på en cool plade i 5-10 minutter.
7. paraffinsnit af hornhinden
- Forberede mikrotom til skæring i overensstemmelse med instituttets eller producentens instruktioner.
FORSIGTIGHED: Vær forsigtig ved håndtering af skarpe mikrotomen blade. - Sted et vandbad med stuetemperatur ultrarent vand ved siden af mikrotomen og en anden med ultrarent vand opvarmes til + 50 ° C.
- Gøre 5 µm tykt sektioner af øjeæblet.
Bemærk: Linsen knækker let ved skæring. For at undgå dette, tør skære overfladen med en fugtig serviet, hver gang en ny række af sektioner er startet. Brug vand fra hanen til at fugte væv. - Placer sektioner ved siden af hinanden i stuetemperatur vandbad og derefter flytte dem til vandbad ved hjælp af et glas dias. Strække sektioner i vandbad indtil alle rynker slappe af og sektioner bliver mat.
- Tørre glas dias med sektioner overnatning i +37 ° C.
- Vedhæfte sektionerne til dias ved at holde diasset i 1 minut på et opvarmet fad i + 60 ° C. Efter dette, kan afsnittene direkte forarbejdes til farvning, immunohistological metoder eller oplagres i + 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en model til at påføre en slid skade mus hornhinden og tyder på, hvordan man følge og visualisere helingsprocessen efter slid. For nylig har ansat vi denne metode til at studere rollen af hornhindens epitel stamceller under sårheling6. Anvendelse af etablerede værktøjer er nøglen til en vellykket slid eksperiment. Vi og andre har brugt Algerbrush II okulær burr (figur 1) til at udføre hudafskrabninger6,7,24. Dette værktøj har en sløvet burr spidsen af 0,5 mm i størrelse, pensler i stedet for Boremaskiner eller sakse hornhindens epitel væk. Således, dette værktøj er det anbefalede valg for en slid skade på hornhinden.
En central del af denne model er, at den berørte region ubesværet kan visualiseres på det ønskede mellemrum. I figur 3Apræsenterer vi brugen af fluorescein farvning i kombination med en kobolt blå lyskilde (figur 1) for at få vist webstedet slid. I dette eksperiment udføres vi et stort sår i central hornhinden og forlod den perifere hornhinden uberørt (figur 3A). Desuden vi slibes kun det venstre øje af hver mus og holdt den rigtige, bilaterale øje som en ikke-slibes kontrol. De bilaterale øje prøver forblev negativ for fluorescein signal, som tyder på at de ikke underkastes nogen celletab under eksperimentet og dermed fungere godt som kontrolprøver. Grønne signal i øjet grænser vises dog fluorescein løsningen, der opsamlet i krydset mellem øjet og på øjenlåget. Slidstyrke var største på 0 h, umiddelbart efter skade (figur 3A). Det var markant mindre efter 18 h, og i dette tilfælde ligger tæt på den øvre grænse for øjet. Dog lukker epitel regionen udsatte lige hastighed fra alle sider af slibning. Navnlig på 72 h post såret, var ingen grønne signal synlige. Dette indikerer, at hornhindens epitel var fuldt re epithelialized af 72 h efter slibning.
Med denne metode sigter vi mod at fokusere slid kun på hornhindens epitel, således at dybere lag af hornhinden forblev intakt. Fjernelse af hornhindens epitel var tydeligt fra histologiske snit i figur 3B. Ved 0 h, er kanten af slibning vist som en smal, acellulær afsats, der er løbende fra en regelmæssig, 4-5 celle lag tyk hornhindens epitel. Limbus, perifere kanten af hornhindens epitel, præsenterer et eksempel region, der ikke var påvirket af slid under hele eksperimentelle tidslinjen (72 h). Derudover anført histologiske sektioner, at de dybere lag af hornhinden, stroma og endotel, ikke blev skadet af okulær burr. Disse to væv syntes lignende i slidt og bilaterale øje prøver. På 18 h efter skade, den helbredende proces er aktive og re epithelialization er igangværende. Det blev foreslået af udseendet af en forkant. Forkant indeholder kun 1-2 epitelcelle lag og det dækker det udsatte område før re stratificering kan forekomme25. I overensstemmelse med resultaterne på figur 3A, var overfladen fuldt re epithelialized af 72 h, når de overfører fronter havde dækket såret og alle epitel lag var igen til stede. Histologiske sektioner fra bilaterale øjet bekræftet (figur 3A), kontrol øjne forblev intakt i observationsperioden.
Endelig, vi leverer beviser for, at modellens slid er begrænset til hornhindens epitel og ikke påberåbe sig en stromale reaktion på skade, såsom neovascularization. Figur 4 viser murine hornhinden på 18 h efter slid. Baseret på makroskopisk se, dette tidspunkt ikke vise en stromale svar, der således angiver at vores protokol ikke forstyrrer de dybere hornhinde lag. I sammenligning induceret en basisk skade med 0,75 mol/L NaOH straks neovascularization i stroma. Givet den hurtige neovascularization i basisk skade, give tidspunkter i vores metode beviser for at udelukke muligheden for svar i stroma.
Figur 1: uundværlige redskaber til hornhindens epitel slidstyrke. Til venstre er en vibrerende okulær burr. Kobolt blå pen lys til højre er brugt til at bringe fluorescein pletten synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Imaging den hornhinde slid. (A) værktøjer til billedbehandling er en justerbar kamera arm med klemme (til venstre), Spejlrefleks (center) og en bordlampe med fleksibel arm og klemme (til højre). Kobolt blå pen lys er bundet til kuplen af lampen med to kabelbindere. (B) en generel gennemgang af opsætningen af imaging; afstanden mellem hver vedhæftet fil værktøj er markeret i billedet i cm. Begge klemmer er 6 cm fra den varme plade og musen placeres 10 cm væk fra den varme plade kant. (C) nærmere på slid imaging med foreslåede afstand og position til musen øjet i cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: påvisning og lokalisering af den hornhinde afslidning. (A) mus øjne 0, 18 og 72 timer efter slid. Fluorescein signal markerer regionen slidt i lysegrønt, mens alle andre regioner i epitel forbliver mørk. Bilaterale øjne tjener som kontrol. Stiplet linje markerer grænserne af såret og den hvide plet i hvert øje er refleksion fra kameraet. (B) i histologisk snit og hæmatoxylin og eosin farves prøver af mus øjne 0, 18 og 72 timer efter slid. Limbus er den grænse, der omgiver hornhindens epitel fra alle sider. Asterix markerer kanten af slibning. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: hornhinde slid ikke aktivere en stromale svar. Alkalisk eksponering med 0,75 mol/L NaOH efterfulgt af kunstvanding med 0,9% NaCl producerer hornhinde neovascularization (øjet indsamlet umiddelbart efter behandling). Slid med okulær burr viser ingen neovascularization selv efter 18 h. slid websted er markeret med en stiplet linje. Skalere bar 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Såret metoder er populære værktøjer til at studere forskellige aspekter af cornea homøostase og patologier. Den slidstyrke model tilbyder en velkontrollerede metode for at tage fat på relevante problemer i oftalmologi. Visse kritiske punkter i protokollen er dog værd at understrege. Især detaljerne skitseret vedrørende veterinærmedicin, sår healing tidslinje og resultatet er optimeret til brug med outbred NMRI og ICR bestande, men kan variere blandt stammer af mus26. Med denne protokol, vil de eksperimentelle dyr forblive bedøvede i ca 20 minutter. Dette giver et kort men tilstrækkelige vindue af tid til at udføre slibning. Men når du bruger okulær burr, gør slitage, selv er en meget hurtig betjening og bør være muligt at udføre inden for denne tidsramme.
Let og tilgængelig visualisering er en af de vigtigste fordele ved slid model. Kombineret med molekylærbiologiske metoder, åbner det muligheder for at studere epitelceller i stor detalje. Slidt hornhinder kan behandles for histologiske eller immunologiske farvning og proteiner eller nukleinsyrer kan indsamles og undersøges yderligere. Pajoohesh-Ganji et al. viste at gen expression mønstre i cornea epitelceller ændringen på cornea fornærmelse med en sløvet klinge27. For at sikre kontrolleret prøveudtagning, anbefaler vi at billeder af hudafskrabninger er taget umiddelbart efter operationen og prøve samlinger følger præcis den planlagte tidslinjer.
Denne protokol har anvendelser ud over undersøgelse af hornhinde epithelialization. Afslidning af cornea limbus, stamcelle niche af hornhinden, kan for eksempel bruges til at studere stamcelle dynamics7. Vi viste, at regionen ikke slibes af epitel forblev normale under helingsprocessen, men nogle forfattere hævder, at basalmembranen og de underliggende stromale keratocytes påvirkes af okulære burr24,28. Fjernelse af basalmembranen kan estimeres med specifikke basalmembranen farvning. Desuden kan gentagne hudafskrabninger over en længere tidslinje afsløre interessant helbredende mønstre. I denne protokol, vi ikke observere arkitekturen af epitel over en langsigtet chase. Begge sløvet skalpel og okulær burr skader har vist en øget forekomst til hornhinde erosioner efter en til flere uger efter skade24,29,30. Dette bør holdes for øje, når du bruger slid model for langtidsstudier. Men, undersøgelser fokuserer på cornea erosioner kan finde denne protokol nyttige.
Andre såret modeller er beskrevet udførligt af Stepp et al. i et review5. Denne protokol og de eksisterende tilgange giver tilsammen, alsidige muligheder for at undersøge både grundlæggende biologiske spørgsmål såvel som praktiske kliniske problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Kaisa Ikkala for hendes uvurderlig faglig bistand og indsigtsfulde hjælp når aktualiserende denne metode og senere under gennemførelsen på vores centrale forskningsspørgsmål. Vi vil også gerne takke Laboratory Animal Center og Anna Meller for hendes hjælp med planlægning retningslinjer af den veterinærmedicinske arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
