Summary
Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.
Abstract
A córnea murino fornece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. A córnea é a camada mais externa do olho e, portanto, é a primeira defesa de lesão. Na verdade, o tipo mais comum de lesão ocular encontrado na clínica é uma abrasão da córnea. Aqui, nós utilizamos uma rebarba ocular para induzir uma abrasão, resultando na remoção do epitélio corneano na vivo em ratos anestesiados. Este método permite a interrupção epitelial visada e reprodutível, deixando outras áreas intactas. Além disso, descrevemos a visualização do epitélio com fluoresceína mancha abradado e fornecer aconselhamento concreto sobre como visualizar a abrasão da córnea. Então, seguimos a linha do tempo da ferida cura 0, 18 e 72 h após a abrasão, até que a ferida é re-epithelialized. O modelo de abrasão epitelial de lesão corneana é ideal para estudos sobre a proliferação de células epiteliais, migração e re-epitelização das camadas da córnea. No entanto, esse método não é ideal para estudar a ativação do estroma durante a cicatrização de feridas, porque a rebarba ocular não penetra nas camadas de células do estroma. Esse método também é apropriado para aplicações clínicas, por exemplo, pré-clínicos teste de eficácia de drogas.
Introduction
Epitelial de inúmeros órgãos está expostos a lesões. No entanto, eles também contêm a capacidade de compensar a perda de tecido através da cicatrização da ferida. A córnea oferece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. Forma a superfície externa do olho e fornece uma camada protetora para a maquinaria ocular sensível. Assim, a córnea funciona como uma barreira física para patógenos e perda de água. É composto de três camadas; epitélio, estroma e endotélio. O epitélio da córnea torna-se a camada mais externa da córnea. Células epiteliais mantêm a função de barreira da córnea aderindo estritamente ao outro através de junções apertadas1,2,3. Uma membrana basal acelular da córnea, membrana de Bowman, separa o epitélio do estroma extensivo, que contém keratocytes refratário. Sob o estroma, células endoteliais canal nutrientes, água e oxigênio para a camada superior.
Abrasões da córnea são muito comuns na clínica4. Lesões de córnea são diversos, mas em grande parte são causados por pequenas partículas, como poeira ou areia, arranhões ou outros objectos estranhos. O protocolo descrito aqui visa reproduzir um tipo clinicamente relevante de abrasão epitelial da córnea. Ao fazê-lo, este protocolo fornece um método controlável e seminal para clínicos e cientistas da córnea implementar em seus próprios estudos. Efetuamos um ensaio de reparo de lesões no vivo na córnea murino por abrasão o tecido com uma rebarba ocular entorpecida, o II Algerbrush. Aqui, temos como alvo a abrasão para o epitélio corneano central e deixar as outras partes do órgão sem danos. Assim, o protocolo é ideal para estudo célula epitelial da córnea dinâmica ou a membrana basal durante a re-epitelização, célula de migração, proliferação e diferenciação em vivo5. Recentemente, este modelo foi usado para analisar a dinâmica de células progenitoras na córnea murino, bem como para desvendar a capacidade das células epiteliais da córnea diferenciadas em re-estabelecer o nicho de células-tronco da córnea após lesão6,7. Após abrasão, a córnea retorna ao seu normal transparência e resistência à tração. Curiosamente, um estudo em vitro indicou que re-epitelização ocorre sem célula maior proliferação8. Este protocolo descreve a linha do tempo de cicatrização ininterrupta na córnea murino. O método é, portanto, aplicável para testar o efeito das drogas sobre a cura de padrões e velocidade.
A córnea tem sido extensivamente usada para estudos de cicatrização de feridas. No entanto, muitos estudos têm contado com outros modelos de lesão. Um modelo bem estabelecido de lesão da córnea é a queimadura alcalina é executada através da aplicação de hidróxido de sódio (NaOH) com ou sem papel de filtro sobre a superfície da córnea9. Alcalina exposição resulta em uma lesão grande e difusa que afeta não só o epitélio corneano, mas também a conjuntiva e estroma9,10. Soluções alcalinas fortes foram mostradas para induzir úlceras da córnea, opacificação e neovascularização9. Células inflamatórias invadem o estroma geralmente dentro de 6 h e permanecem lá até 24 h11. Assim, a lesão alcalina é um método aconselhável em estudos relacionados à ativação do estroma. Um outro tipo de lesão química pode ser infligido aplicando dimetilsulfóxido (DMSO) na córnea9,10. Outros modelos de lesões comumente usados incluem feridas incisional que penetram através do estroma e fotorrefrativa feridas, que são limitadas a porção superior do estroma14,15. Esses métodos também são úteis para responder perguntas sobre a cicatrização de feridas do estroma. Lesão de diferentes modelos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Abrasão, ou desbridamento, do epitélio corneano foi desenvolvida usando bisturis entorpecidas ou lâminas em ex vivo córneas16. Este método foi mais tarde usado na vivo no rato, rato e coelho17,18,19,20,21,22. Usando a rebarba ocular (Figura 1), removemos apenas uma região selecionada do epitélio, deixando o resto do epitélio afetado. Desta forma, é possível segmentar com precisão a remoção epitelial para diferentes partes do cornea. Além disso, o tamanho de abrasão pode ser avaliado com coloração de fluoresceína. Além disso, aqui seguimos encerramento abrasão durante o período de cicatrização.
Esse método apresenta diversas vantagens, i) incluindo a localização precisa do local de abrasão, que não é possível com lesão química, ii) a abrasão é rápida a executar e iii) é não-invasivo. Aqui, descrevemos o método usando o mouse NMRI outbred como modelo, no entanto, isso poderia ser aplicado para a vasta gama de modelos genéticos de rato, bem como para o rato e o coelho, que são modelos comuns usados para estudar a ruptura da córnea humana.
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Protocol
Todas as experiências são aprovadas pelo Conselho Nacional de experimento animal.
1. preparações
- Preparar todas as soluções e manter em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Siga os regulamentos de eliminação de resíduos para dispose utilizado materiais e soluções.
- Uso NMRI e ICR consanguíneo ações, entre as idades de 4 a 12 semanas e ambos os sexos. Se usando a linhagem C57BL/6, siga o método de preparação de cetamina-medetomidina na etapa 1.3.2. Para outras etapas, siga as instruções descritas em 1.3.3.-1.3.5.
- Prepare o medicamento veterinário fresco e no tempo, antes de iniciar a operação. Carprofeno será usado mais tarde, assim não é necessário para prepará-lo neste momento.
- Para preparar uma solução de cetamina-medetomidina para anestesia, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina (Ketaminol Vet) com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor Vet) e adicione 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).
- Para preparar uma solução mais diluída de cetamina-medetomidina anestesia em camundongos C57BL/6, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina e adicionar 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (3,75 mg/kg, cetamina e 0,5 mg/kg, medetomidina).
Nota: Este é um passo alternativo, apenas para adultos camundongos C57BL/6. - Para preparar o buprenorfin para analgesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,2 mL/20 g de massa de rato (0,15 mg/kg).
- Para preparar o atipamezole para interromper a anestesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 5 mg/mL) de atipamezole para 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de massa de rato (0,75 mg/kg).
- Para analgesia durante pós-anestesia use carprofeno. Adicionar 0,1 mL (concentração de ações 50mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg).
- Preparar a solução de coloração fluorescente
- Para visualizar a abrasão sob a luz azul cobalto (Figura 1), use uma solução fluorescente. Preparar uma solução de fluoresceína 0,1% primeira medição 10 mg de sal de fluoresceína com uma escala bem e em seguida, adicioná-lo a 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS).
- Proteger a solução de fluoresceína de luz e agitar durante 5 minutos em uma coqueteleira.
Nota: A solução de fluoresceína é sensível à luz; manter a solução coberta de luz. Esta solução pode ser armazenada em + 4 ° C durante 2-3 dias. Para uso, é útil colocar a solução de fluoresceína em um frasco conta-gotas que é usado para colírio. Use um filtro estéril quando se deslocam a solução para o frasco conta-gotas.
- Limpe a ponta da rebarba ocular antes e após o uso; primeiro com PBS e, em seguida, com 70% EtOH. Se tornando uma abrasão para vários ratos durante a mesma operação, fazer as limpeza etapas entre cada rato.
- Ponha a placa aquecida (37 ° C) e coloque uma toalha de papel nele.
2. corneal abrasão
Atenção: Utilize protectores (luvas, jaleco) quando lidar com ratos. Pese o mouse para estimar o volume de medicação a administrar.
- Use o método agarrando com uma mão para manipular o rato23. Administrar a mistura de cetamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) no abdômen inferior esquerdo. Coloque o mouse para uma gaiola individual e esperar que caia no sono. Isso geralmente leva menos de 5 minutos. Em seguida, administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação.
Nota: Uma vez que a anestesia é dada, o protocolo deve não ser pausado a qualquer momento. - Antes de continuar, verifique se a placa aquecida é quente. Coloque o mouse anestesiado na chapa aquecida. O nível da anestesia é bom se o reflexo de cauda está ausente, mas o reflexo do dedo do pé está presente. Estes reflexos por beliscar a cauda e qualquer dedo do pé com os dedos ou uma pinça. Não use força excessiva. Anestesia vai durar 20-25 minutos.
- Para tornar uma abrasão, use a rebarba ocular limpa. Gire a base das rebarbas para ativar a vibração que é essencial para fazer a abrasão. Senti a vibração na mão, quando a rebarba está funcionando corretamente.
- Abra um olho de cada vez, mantendo as pálpebras separadamente com os dedos. Então firmemente tocar as rebarbas para a córnea e deslocar o instrumento e para trás, bem como para os lados da superfície ocular. A vibração de rebarba executará o zero; Não pressione, agitar ou rasgar a córnea. A córnea central, 20 movimentos na superfície de abrasão são suficientes para induzir a ferida. Não levante a rebarba e tentar ficar na região da córnea para ser desgastados. Adquirir uma abrasão tamanho padrão exigirá várias rodadas de prática.
Nota: Assepsia da córnea pode ser conseguida antes de abrasão usando betadine solução oftálmica.
3. imagem latente a abrasão
- Ilumine a região abradada usando solução de fluoresceína e luz de caneta azul cobalto (Figura 1). A superfície ocular parece incolor em luz ambiente. Após a aplicação de fluoresceína, região abradada fluoresce a verde quando iluminando o olho com a caneta de luz.
- Se necessário, abra o olho abradado da mesma forma como no 2.3 e administrar uma gota de solução de fluoresceína do frasco conta-gotas. Lavar o olho uma vez com PBS ou 0,9% NaCl para reduzir fundo da fluoresceína. Use um frasco conta-gotas ou uma pipeta para lavagem. Aspirar o líquido fora com uma limpeza suave e limpar os cílios, se necessário. O excesso de líquido geralmente coleta à fronteira nasal do olho, perto da abertura do canal lacrimal.
Atenção: Evite tocar a córnea enquanto cleaining como escoriações menores podem ser induzidas.
- Se necessário, abra o olho abradado da mesma forma como no 2.3 e administrar uma gota de solução de fluoresceína do frasco conta-gotas. Lavar o olho uma vez com PBS ou 0,9% NaCl para reduzir fundo da fluoresceína. Use um frasco conta-gotas ou uma pipeta para lavagem. Aspirar o líquido fora com uma limpeza suave e limpar os cílios, se necessário. O excesso de líquido geralmente coleta à fronteira nasal do olho, perto da abertura do canal lacrimal.
- Fotografa a abrasão da córnea.
- Para obter imagens semelhantes durante cada sessão de imagens, use ferramentas de fixação constante para a luz de caneta azul cobalto e a câmera de SLR (Figura 2). Este protocolo fornece uma configuração fácil de repetir (Figura 2).
- Para anexar a luz caneta e a câmera, use um candeeiro de mesa com um braço flexível e braçadeira e um braço de câmera ajustável com uma pinça, respectivamente. Cabo-tie a caneta de luz ao candeeiro de mesa e posição logo acima do olho do rato. A luz de posicionamento diferente pode alterar a visualização da abrasão. Uma sugestão para o posicionamento dessas ferramentas é descrita na Figura 2.
- Use a câmera SLR para tirar fotos do olho. Coloque o animal em uma distância desejada e a posição e o foco da câmera (01:12) na luz do quarto. Depois disso, feche todas as outras luzes, exceto a luz de caneta azul cobalto.
Nota: O manípulo de luz caneta de fita para baixo ou use um elástico para manter a luz acesa o tempo todo durante a imagem latente. Isto pode ajudar se a imagem se torna embaçada. É mais fácil de executar a etapa de imagem com um colega.
- Para obter imagens semelhantes durante cada sessão de imagens, use ferramentas de fixação constante para a luz de caneta azul cobalto e a câmera de SLR (Figura 2). Este protocolo fornece uma configuração fácil de repetir (Figura 2).
4. acordar após abrasão Corneal
- Administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação, como em 2.1.
- Coloque uma gota de antibacteriano, fucidin ácido pomada (Isathal) para olhos desgastados e não-desgastada para hidratar e manter a superfície ocular limpo de bactérias após a anestesia.
- Como o mouse vai acordar em 5-20 minutos na placa aquecida, observe o mouse durante o período pós-anestésico do despertar. Quando torna-se móvel, coloque-o em uma gaiola individual.
Nota: Se acordar leva mais tempo, coloque o rato na gaiola com uma almofada aquecida ou coloque a gaiola inteira sobre a chapa aquecida e monitorar o mouse regularmente. Enquanto o efeito da anestesia, o mouse normalmente sacode e atinge para cima com o corpo anterior. Esse comportamento deve retornar ao normal em 3-4 horas e então você pode colocar o mouse volta para uma jaula compartilhada. - Administre o carprofeno i.p. para analgesia e olho pomada em dois dias consecutivos após a abrasão, da mesma forma como em passos 2.2. e 4.2.
5. imagem latente durante a cicatrização de feridas
- Neste protocolo, tempo de uso aponta 18 h e 72 h após a abrasão para observar o fechamento da ferida.
- Para tratamento de imagens consecutivo, anestesia os ratos como explicado no ponto 2.2.
- Tire fotos como explicado em 3.
- Acorde os animais com atipamezole i.p. e monitorar o período de despertar, conforme explicado no ponto 4.3.
Nota: se não continuar o acompanhamento, eutanásia o mouse logo após 5.1.2. Eutanásia é descrita em 6.1.
6. córnea coleção e incorporação de parafina
- Após o último ponto de tempo, sacrifica o animal. Coloque o mouse em uma câmara que pode ser preenchida com CO2. Encher o ar da câmara com CO2. Quando o animal fica imóvel, deslocar as vértebras cervicais puxando firmemente da base da cauda e pressionando a região do pescoço para baixo, ao mesmo tempo.
Cuidado: Siga sempre as orientações do órgão local de bem-estar animal. - Recolha o globo ocular inteiro cortando uma abertura na pele para o lado do olho com uma tesoura de dissecação. Coloque a tesoura sob o globo ocular e cortar o nervo ocular para estalar o globo ocular fora da órbita. Use a pinça se o olho não sai facilmente.
- Faça um buraco na parte de trás do olho, do lado da retina, com uma agulha 26G para permitir a livre penetração das soluções dentro do olho.
Nota: Não deixe o olho tornar-se seca, em vez disso, colocá-lo em PBS até continuando com o protocolo.
- Faça um buraco na parte de trás do olho, do lado da retina, com uma agulha 26G para permitir a livre penetração das soluções dentro do olho.
- Recolha o globo ocular em um tubo de 2 mL com PBS. Não pausa o experimento neste ponto.
- Remover o PBS e corrigir olhos em paraformaldeído 4% (PFA) em + 4 ° C por 4-5 horas.
- Mova o olho fixo para uma fita de tecido para processamento do tecido. Use um tecido de processamento da máquina e o programa a seguir:
- Enxaguar com PBS.
- Incube 2 x 45 min em etanol a 70% à temperatura ambiente.
- Incube 2 x 1 h em 94% de etanol na temperatura de quarto.
- Incube 3 x 45 min em etanol absoluto à temperatura ambiente.
- Incubar 3 x 1 h em xilol, a temperatura e a último xileno a 37 ° C.
- Incubar 3 x 1 h em cera de parafina a 60 ° C.
- Após processamento de tecido, incorpore o globo ocular em parafina líquida (+ 60 ° C), usando um bloco de incorporação de tecido. Coloque o olho dentro do bloco é olhar para os lados e a borda periférica é virada para cima. Deixe o bloco solidificar em um prato legal por 5-10 minutos.
7. parafina seções da córnea
- Prepare o micrótomo para corte de acordo com as instruções da instituição ou do fabricante.
Cuidado: Tenha cuidado ao manusear a lâmina afiada do micrótomo. - Banho de água de um lugar com temperatura de água ultrapura ao lado do micrótomo e outro com água ultrapura aquecido a + 50 ° C.
- Fazer 5 µm de espessura seções do globo ocular.
Nota: A lente rompe facilmente durante o corte. Para evitar isso, limpe a superfície do corte com um tecido úmido, cada vez que uma nova linha de seções é iniciada. Use água da torneira para umedecer o tecido. - Colocar as seções ao lado do outro em banho de água a temperatura ambiente e em seguida, movê-los para o banho de água quente com a ajuda de uma lâmina de vidro. Estica o banho de água quente, até que todas as rugas relaxar e o fosco seções tornam-se as seções.
- Secar as lâminas de vidro com seções pernoite em 37 ° C.
- Anexar as seções para os slides, mantendo o slide por 1 minuto em uma placa aquecida em + 60 ° C. Depois disso, as seções podem ser diretamente processadas para coloração, métodos reagidos ou armazenadas em + 4 ° C.
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Representative Results
Este protocolo descreve um modelo para infligir um dano de abrasão ao cornea de rato e sugere como seguir e visualizar o processo de cicatrização após a abrasão. Recentemente, utilizamos este método para estudar o papel das células progenitoras epiteliais da córnea durante6de cicatrização de feridas. O uso de ferramentas estabelecidas é a chave para uma experiência bem sucedida de abrasão. Nós e outros, têm usado as rebarbas ocular Algerbrush II (Figura 1) para executar a abrasões6,7,24. Esta ferramenta tem uma ponta de rebarba entorpecida de 0,5 mm de tamanho que escovas fora ao invés de brocas ou tesouras do epitélio corneano. Assim, esta ferramenta é a opção recomendada para uma lesão de abrasão na córnea.
Uma parte central deste modelo é que a região afetada pode ser facilmente visualizada em intervalos desejados. Na Figura 3A, apresentamos o uso da fluoresceína mancha em combinação com uma fonte de luz azul cobalto (Figura 1) para exibir o site da abrasão. Neste experimento, realizamos um grande ferimento na córnea central e deixado intocada córnea periférica (Figura 3A). Além disso, estamos desgastados apenas o olho esquerdo de cada rato e manteve o olho bilateral, bem como um controle de não-desgastada. As amostras de olho bilateral manteve-se negativa para o sinal de fluoresceína, que sugere que eles não passam por qualquer perda de célula durante o experimento e assim funcionar bem como amostras de controlo. No entanto, sinal verde nas fronteiras do olho exibido a solução de fluoresceína que acumulou na junção entre o olho e a pálpebra. A abrasão foi maior às 0h, imediatamente após a lesão (Figura 3A). Foi marcadamente menor após 18 h e, neste caso, sua proximidade com a borda superior do olho. No entanto, o epitélio fecha a região exposta a uma velocidade igual de todos os lados da abrasão. Notavelmente, em 72 h após ferimento, nenhum sinal verde era visível. Isso indica que o epitélio corneano foi totalmente re-epithelialized por 72 h após a abrasão.
Com este método, que visa focar a abrasão apenas sobre o epitélio corneano, para que as camadas mais profundas da córnea permaneceram intactas. A remoção do epitélio corneano era evidente de cortes histológicos na Figura 3B. Às 0h, a borda da abrasão é mostrada como uma saliência estreita, acelular que é contínua, desde um regular, epitélio corneano grosso célula 4-5 de camadas. Limbo, borda periférica do epitélio corneano, apresenta uma região de exemplo que não foi afetado pela abrasão durante todo cronograma experimental (72 h). Além disso, cortes histológicos indicaram que as camadas mais profundas da córnea, o estroma e o endotélio, não foram prejudicados por burr a ocular. Estes dois tecidos apareceram semelhantes em amostras de olho desgastados e bilateral. No pós-lesão 18 h, o processo de cicatrização é ativo e re-epitelização está em curso. Isto foi sugerido pelo surgimento de uma vanguarda. A extremidade contém apenas 1-2 camadas de células epiteliais e abrange a região exposta antes de re-estratificação pode ocorrer25. Em consonância com os resultados na Figura 3A, a superfície foi totalmente re-epithelialized por 72 h, quando as frentes migratórias tinham coberto a ferida e todas as camadas epiteliais novamente estavam presentes. Cortes histológicos do olho bilateral confirmaram (Figura 3A), que os olhos de controle permaneceram intactos durante o período de observação.
Por último, nós fornecemos a evidência de que o modelo de abrasão é restrito para o epitélio corneano e não invoca uma resposta estromal de lesão, tais como neovascularização. A Figura 4 mostra a córnea murino às 18 h após a abrasão. Com base na visão macroscópica, neste ponto do tempo não exibir uma resposta estromal, indicando assim que nosso protocolo não interrompa as camadas mais profundas da córnea. Em comparação, uma lesão alcalina com 0,75 mol/L do NaOH induzida imediatamente neovascularização no estroma. Dada a rápida neovascularização na lesão alcalina, os pontos de tempo em nosso método fornecem provas para descartar a possibilidade de resposta no estroma.
Figura 1: ferramentas essenciais para abrasão epitelial corneana. À esquerda está uma rebarba ocular vibratória. A luz de caneta azul cobalto no canto direito é usada para trazer a mancha de fluoresceína visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem da abrasão da córnea. (A) ferramentas para geração de imagens são um braço de câmera ajustável com grampo (à esquerda), a câmera de SLR (centro) e um candeeiro de mesa com braço flexível e braçadeira (à direita). A luz de caneta azul cobalto está ligada à cúpula da lâmpada com duas abraçadeiras. (B) uma visão geral da configuração de imagem; a distância de cada ferramenta de fixação está marcada na imagem em cm. Ambos os grampos são 6 cm longe da placa calor e o mouse é colocado a 10 cm de distância da borda de placa de calor. (C) um olhar mais de perto a imagem de abrasão com distância proposta e posição para o olho do rato em cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: deteção e localização de abrasão corneal. (A) olhos de rato em 0, 18 e 72 h após a abrasão. Sinal de fluoresceína marca região abradada em verde-claro, Considerando que todas as outras regiões no epitélio permanecem escuras. Olhos bilaterais servem como controles. Linha tracejada marca as bordas da ferida e a mancha branca em cada olho é o reflexo da câmera. (B) histologicamente seccionado e hematoxilina e eosina manchado amostras dos olhos do mouse em 0, 18 e 72 h após a abrasão. Limbo é a fronteira que rodeia o epitélio corneano de todos os lados. Asterix marca a borda da abrasão. Barra de escala é 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: abrasão Corneal não ativa uma resposta estromal. Exposição alcalina com 0,75 mol/L do NaOH, seguido de irrigação com 0,9% NaCl produz neovascularização da córnea (olho recolhido imediatamente após o tratamento). Abrasão com a rebarba ocular mostra sem neovascularização mesmo após 18 h. abrasão site é marcado com uma linha tracejada. Escala da barra 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ferindo métodos são ferramentas populares para estudar diferentes aspectos da homeostase da córnea e patologias. O modelo de abrasão oferece um método bem controlado para resolver problemas relevantes em oftalmologia. No entanto, determinados pontos críticos no protocolo são vale a pena enfatizar. Notavelmente, os detalhes descritos em matéria de medicina veterinária, ferida cura cronograma e resultado são otimizados para uso com estoques NMRI e ICR outbreds, mas podem variar entre cepas de ratos26. Com este protocolo, os animais experimentais permanecerá anestesiados por aproximadamente 20 minutos. Isto dá uma janela curta mas suficiente de tempo para realizar a abrasão. No entanto, ao usar a rebarba ocular, tornando a abrasão em si é uma operação muito rápida e deve ser possível realizar neste período de tempo.
Visualização fácil e acessível é uma das principais vantagens do modelo de abrasão. Isto combinado com métodos de biologia molecular, abre possibilidades para estudar as células epiteliais em grande detalhe. Abradados córneas podem ser processadas para imunológica ou histológica coloração e proteínas ou ácidos nucleicos podem ser coletados e examinados ainda mais. Pajoohesh-Ganji et al mostrou esse gene padrões de expressão da mudança de células epiteliais da córnea após insulto da córnea com uma lâmina entorpecida27. Para garantir a amostragem controlada, recomendamos que imagens das abrasões são tomadas imediatamente após a operação e coleções de amostra seguem exatamente as cronogramas planejadas.
Este protocolo tem usos além do exame de epitelização corneal. Por exemplo, abrasão de limbo corneal, o nicho de células-tronco da córnea, pode ser usada para estudar a dinâmica de células-tronco7. Nós mostramos que a região não-desgastada do epitélio permaneceu normal durante o processo de cura, no entanto, alguns autores afirmam que a membrana basal e à base do estroma keratocytes são afetados pela ocular burr24,28. A remoção da membrana porão pode ser estimada com coloração específica da membrana basal. Além disso, abrasões repetidas ao longo de uma linha de tempo mais longa poderiam revelar padrões interessantes de curativas. Neste protocolo, não observamos a arquitetura do epitélio durante uma perseguição a longo prazo. Ambos entorpecidos bisturi e lesões oculares rebarba mostraram um aumento da incidência de erosões da córnea após uma a várias semanas após a lesão de29,24,30. Isto deve ser mantido em mente ao usar o modelo de abrasão para estudos de longo prazo. No entanto, estudos enfocando erosões da córnea podem achar este protocolo útil.
Outros modelos ferindo são descritos detalhadamente por Stepp et al , em uma revisão de5. Juntos, o presente protocolo e as abordagens existentes fornecem opções versáteis para examinar questões biológicas fundamentais bem como problemas clínicos práticos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Kaisa Ikkala por sua inestimável assistência técnica e perspicaz ajuda quando atualizando este método, bem como mais tarde durante a implementação às nossas perguntas de pesquisa central. Também gostaríamos de agradecer sua ajuda com planejamento as orientações do veterinário trabalho o centro de animais de laboratório e Anna Meller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
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