Summary
Этот протокол описывает метод нанести истирания поверхности глаза мыши и следовать за процесс заживления ран после этого. Протокол использует глазной Берр частично удалить поверхности эпителия глаза анестезированные мышей.
Abstract
Мышиных роговицы обеспечивает отличную модель для изучения заживление ран. Роговицы верхний слой глаза и таким образом первой обороны, травмы. В самом деле наиболее распространенный тип травмы глаз, в клинике является роговицы ссадины. Здесь мы используем глазной Берр побудить износа, что приводит к удалению эпителия роговицы в естественных условиях на наркотизированных мышей. Этот метод позволяет для целевых и воспроизводимые эпителиальных потрясений, оставляя нетронутыми других областях. Кроме того мы описывают визуализации прошлифовать эпителия с окрашивание флюоресцеином и представить конкретные рекомендации о том, как визуализировать прошлифовать роговицы. Затем мы следуем сроки заживления 0, 18 и 72 ч после истирания, пока рана является повторное грануломах. Эпителиальный истиранию модель повреждение роговицы идеально подходит для исследования пролиферации эпителиальных клеток, миграции и эпителизация слоев роговицы. Однако этот метод не является оптимальным для изучения стромальные активации во время заживления ран, потому что глазной заусенцев не проникают в слои стромальных клеток. Этот метод также подходит для клинического применения, например, Доклинические испытания эффективности препарата.
Introduction
Эпителиального слоя многочисленных органов подвержены травм. Однако они также содержат способность компенсировать потери ткани через заживление ран. Роговицы предлагает отличную модель для изучения заживление ран. Он образует внешней поверхности глаза и обеспечивает защитный слой для чувствительных глазной техники. Таким образом роговица функционирует как физический барьер патогенов и потери воды. Он состоит из трех слоев; эпителий, строма и эндотелия. Эпителий роговицы делает верхний слой роговицы. Эпителиальные клетки поддерживают функцию барьера роговицы, строго придерживаясь друг друга через плотные соединения1,2,3. Бесклеточной роговицы в базальной мембраны, Боумена, отделяет эпителия от обширной стромы, которая содержит тугоплавкие кератиноцитах. В строме эндотелиальные клетки канал питательных веществ, воды и кислорода в верхний слой.
Роговицы ссадины являются очень распространенными в клинике4. Травмы роговицы разнообразны, но во многом вызваны мелких частиц, таких как пыль или песок, царапин или других посторонних предметов. Протокол описано здесь направлена на воспроизведение клинически значимых тип эпителия роговицы ссадины. Поступая таким образом, этот протокол обеспечивает контролируемый и семенных метод для клиницистов и роговицы ученых для реализации своих собственных исследований. Мы выступали в vivo пробирного ремонт повреждений на мышиных роговицы абразивной ткани с притупилась глазной Берр, Algerbrush II. Здесь, мы нацелены на истирание только к центральной эпителия роговицы и оставить другие части органа без повреждений. Таким образом протокол является идеальным для изучения динамики роговицы эпителиальных клеток или базальной мембраны во время эпителизация, ячейка миграции, пролиферации и дифференцировки в vivo5. Недавно эта модель была использована для анализа прогениторных клеток динамика в мышиных роговицы, а также раскрыть потенциал дифференцированной роговицы эпителиальных клеток в восстановлении ниши стволовых клеток роговицы после травмы6,7. После истирания роговицы возвращается в его нормальное прозрачности и прочности. Интересно, что в vitro исследование показало, что эпителизация происходит без увеличения клеток распространения8. Этот протокол описывает шкале времени непрерывного исцеления в мышиных роговицы. Таким образом, метод применим проверить влияние наркотиков на исцеление шаблоны и скорость.
Роговицы был широко используется для заживления ран исследований. Однако многие исследования опирались на других моделях травмы. Устоявшиеся модели повреждение роговицы является щелочной ожога, который производится путем применения гидроокиси натрия (NaOH) с или без фильтровальной бумаги на поверхности роговицы9. Щелочные воздействия результатов в больших и рассеянных травмы, которая затрагивает не только эпителия роговицы, но и конъюнктивы и стромы9,10. Было показано, что сильное щелочных растворов вызывают язвы роговицы, помутнение и неоваскуляризации9. Воспалительные клетки вторгнуться стромы обычно в течение 6 ч и остаются там до 24 h11. Таким образом щелочные травмы является целесообразным методом в исследованиях, связанных с стромальные активации. Другой тип химической травмы может быть нанесен, применяя диметилсульфоксида (ДМСО) на роговице9,10. Другие часто используемые травмы модели включают инцизионная раны, которые проникают через стромы и кератэктомия раны, которые ограничены к верхней части стромы14,15. Эти методы полезны также ответить на вопросы относительно стромальных заживление ран. Различные травмы модели имеют свои преимущества и недостатки. Ссадина или хирургическая, эпителия роговицы был впервые разработан с использованием притупилась скальпели или лопастей ex vivo роговицы16. Этот метод был позднее используется в естественных условиях на мыши, крысы и кролик17,18,19,20,21,22. Используя глазной Бёрр (рис. 1), мы удаляем только выбранной области эпителия, затрагивая остальной эпителия. Таким образом, это возможно для более точного эпителиальных удаления в различные части роговицы. Кроме того можно оценить размер износа с окрашивание флюоресцеином. Кроме того здесь мы следуем истиранию закрытия во время периода заживления.
Этот метод создает ряд преимуществ, i) включая точное местоположение сайта истиранию, который не возможен с химической травмы, ii истирания быстро выполнять, и iii) это неинвазивные. Здесь мы описываем метод, с помощью беспородных ВММНИИ мыши как модель, однако это может применяться широкий спектр генетической модели мыши, а также крыс и кроликов, которые являются общей модели, используемые для изучения антропогенного роговицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты утверждаются Советом Национального животных эксперимент.
1. Подготовка
- Подготовить все решения и держать при комнатной температуре, если не указано иное. Соблюдайте правила утилизации отходов dispose используемых материалов и решений.
- Использование ВММНИИ и МГП Беспородные запасов, в возрасте 4-12 недель и обоих полов. При использовании штамм C57BL/6, выполните метод подготовки кетамин medetomidine на шаге 1.3.2. Для других шагов следуйте инструкциям, описанным в 1.3.3.-1.3.5.
- Подготовьте ветеринарной медицины, свежими и в время перед началом операции. Carprofen будет использоваться позднее, таким образом нет необходимости на данном этапе его подготовки.
- Подготовить раствор кетамин medetomidine для анестезии, микс 0,375 мл (фондовый концентрации 50 мг/мл) кетамина (Ketaminol Vet) с 0,25 мл (stock концентрации 1 мг/мл) из medetomidine (Cepetor Vet) и добавить 1,25 мл стерильного 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (7,5 мг/кг, кетамином и 1 мг/кг, medetomidine).
- Подготовить более разбавленного раствора кетамина medetomidine для анестезии на мышей C57BL/6, микс 0,375 мл (stock концентрации 50 мг/мл) кетамина с 0,25 мл (stock концентрации 1 мг/мл) из medetomidine и добавить 2,5 мл стерильного 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (3,75 мг/кг, кетамином и 0,5 мг/кг, medetomidine).
Примечание: Это альтернативный шаг, только для взрослых мышей C57BL/6. - Для подготовки buprenorfin анальгезию, добавить 0,1 мл (stock концентрации 0,3 мг/мл) от buprenorfin до 1,9 мл стерильного 0,9% NaCl. Управление мышью вес 0,2 мл/20 g (0,15 мг/кг).
- Подготовить Атипамезола для прекращения анестезии, добавить 0,1 мл (фондовый концентрацией 5 мг/мл) из Атипамезола до 4,9 мл 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (0,75 мг/кг).
- Для обезболивания во время после анестезии используют carprofen. Добавить 0,1 мл (stock концентрации 50 мг/мл) от carprofen до 4,9 мл 0,9% NaCl. Администрировать 0,15 мл/20 g вес мыши (7,5 мг/кг).
- Приготовления флуоресцентных окрашивание раствора
- Для визуализации истирания под Кобальт синий свет (рис. 1), используйте флуоресцентный решение. Приготовляют раствор 0,1% флуоресцеин первого измерения 10 мг флуоресцеин соли с тонкой масштаба и затем добавить его в 10 мл в фосфат буфер солевой раствор (PBS).
- Защищать от света флуоресцеин решение и трясти за 5 минут на шейкер.
Примечание: Решение флуоресцеин светочувствительные; Держите решение охватывает от света. Это решение может храниться в + 4 ° C на 2-3 дней. Для использования это полезно на место флуоресцеин решение в капельницы, который используется для глазных капель. Используйте стерильные фильтр-при перемещении решение для капельницы.
- Прочистите наконечник глазной Берр, до и после использования; сначала с PBS и затем с 70% EtOH. Если сделать несколько мышей истирания в ходе той же операции, сделайте очистки шагов между каждой мыши.
- Наденьте пластину с подогревом (+ 37 ° C) и место бумажным полотенцем на нем.
2. роговицы ссадины
Предупреждение: Используйте защитная одежда (перчатки, лабораторный халат) при обработке мышей. Вес мыши, чтобы оценить объем лекарств для администрирования.
- Используйте метод Одноручные scruffing справляться с мыши23. Администрировать кетамин medetomidine смесь внутрибрюшинно (и.п.) в левой нижней части живота. Поместите курсор мыши на отдельные клетки и ждать его заснуть. Обычно это занимает менее 5 минут. Затем Администрирование, первый buprenorfin, а затем Атипамезола инъекционным и.п. Используйте тот же метод обработки.
Примечание: После анестезии, протокол должен не быть приостановлена в любой момент. - Прежде чем продолжить, проверьте, что пластину с подогревом теплой. Место наркотизированных мыши на пластину с подогревом. Уровень анестезии это хорошо, если хвост рефлекс отсутствует, но присутствует мыс рефлекс. Проверьте эти рефлексы, щипать хвост и любой палец с пальцами или щипцами. Не прилагайте излишних усилий. Анестезия будет последние 20-25 минут.
- Чтобы сделать истиранию, используйте уборка глазной заусенцев. Поверните основание Берр включите вибрации, что необходимо сделать к истиранию. Почувствовать вибрации в руке, когда зауец функционирует правильно.
- Откройте один глаз одновременно держа веки отдельно с пальцами. Затем прочно сенсорных Берр роговицы и двигаться взад и вперед а инструмент как боком на поверхности глаза. Вибрации зауец будет выполнять нуля; не нажимайте, встряхнуть или разрыв роговицы. В центре роговицы 20, абразивные движения на поверхности достаточно, чтобы вызвать раны. Не поднять заусенцев и попытаться остаться в регионе роговицы быть скрепляемые. Несколько раундов практике потребует приобретения стандартного размера истиранию.
Примечание: Роговицы Асептика может быть достиган до истиранию используя Бетадин офтальмологический раствор.
3. изображений к истиранию
- Осветить прошлифовать региона с помощью Кобальт синий перо света (рис. 1) и решение флюоресцеином. Глазной поверхности появляется бесцветный в освещенности. После применения флуоресцеин прошлифовать региона флуоресцирует зеленым, когда светящиеся глаза с перо света.
- При необходимости, откройте прошлифовать глаз точно так же как и 2.3 и администрировать одну каплю раствора флуоресцеин от капельницы. Мыть глаз один раз с PBS или 0,9% NaCl для уменьшения фона флюоресцеином. Для мытья используйте капельницы или пипетки. Аспирационная жидкости мягкой салфеткой и Почистите ресницы, при необходимости. Избыток жидкости обычно собирает носовой границы глаза, недалеко от открытия канала слезоточивый.
Предостережение: Не прикасайтесь роговицы при энзимный, как незначительные ссадины могут быть наведено.
- При необходимости, откройте прошлифовать глаз точно так же как и 2.3 и администрировать одну каплю раствора флуоресцеин от капельницы. Мыть глаз один раз с PBS или 0,9% NaCl для уменьшения фона флюоресцеином. Для мытья используйте капельницы или пипетки. Аспирационная жидкости мягкой салфеткой и Почистите ресницы, при необходимости. Избыток жидкости обычно собирает носовой границы глаза, недалеко от открытия канала слезоточивый.
- Возьмите фотографии роговицы ссадины.
- Для получения похожих изображений в ходе каждой сессии изображений, используйте инструменты устойчивый вложение Кобальт синий свет перо и Зеркальные камеры (рис. 2). Этот протокол обеспечивает установку, который легко повторить (рис. 2).
- Чтобы прикрепить света пера и камеры, используйте настольную лампу с гибкие руки и зажим и регулируемый камеры руку с зажимом, соответственно. Кабель галстук перо света лампа и позицию чуть выше глаз мыши. Позиционирование свет по-разному может изменить визуализацию истиранию. Предложение для позиционирования этих инструментов описана на рисунке 2.
- Используйте SLR камеру для фотографирования глаза. Поместите животное в нужном расстоянии и позиции и фокус камеры (1:12) в свете комната. После этого закройте все другие огни, за исключением Кобальт синий свет перо.
Примечание: Ленты перо света ручку вниз или использовать резинкой, чтобы держать свет на все время во время визуализации. Это может помочь, если изображение становится размытым. Это простой для выполнения визуализации шаг с коллегой.
- Для получения похожих изображений в ходе каждой сессии изображений, используйте инструменты устойчивый вложение Кобальт синий свет перо и Зеркальные камеры (рис. 2). Этот протокол обеспечивает установку, который легко повторить (рис. 2).
4. проснувшись после роговицы ссадины
- Администрирование, первый buprenorfin, а затем Атипамезола инъекционным и.п. Используйте тот же метод обработки как 2.1.
- Поместите каплю антибактериальные, fucidin кислоты глазную мазь (Isathal) и прошлифовать-скрепляемые глаза увлажняют и держать глазной поверхности очистить от бактерий после анестезии.
- Как мыши будут просыпаться в 5-20 минут на пластину с подогревом, наблюдать мыши в период пробуждения после анестезии. Когда она становится мобильным, поместите его в индивидуальной клетке.
Примечание: Если просыпаться занимает больше времени, поместите указатель мыши в клетке с подогревом pad или разместить всю клетку на пластину с подогревом и регулярно контролировать мышь. В то время как анестезия носит off, мыши обычно качает и достигает вверх с передней телом. Это поведение должно вернуться к нормальной жизни в 3-4 часа и затем поместите курсор мыши обратно в общий каркас. - Администрирование carprofen и.п. для обезболивания и глаз мазь на два дня подряд после истирания, подобно как шаги 2.2. и 4.2.
5. изображения во время заживления ран
- В этом протоколе использовать время очка 18 h и 72 ч после истирания наблюдать закрытие раны.
- Для последовательных изображений, анестезировать мышей, как описано в 2.2.
- Сфотографируйте, как описано в 3.
- Wake up животных с Атипамезола и.п. и следить за период пробуждения, как описано в разделе 4.3.
Примечание: если не продолжения последующей деятельности, усыпить мыши сразу после 5.1.2. Эвтаназия описан в 6.1.
6. роговица коллекции и встраивание парафина
- После точки последнего времени приносят в жертву животное. Поместите курсор мыши в камере, которые могут быть заполнены с CO2. Заполнить воздуха камеры с CO2. Когда животное неподвижной, вывихнуть шейных позвонков, твердо потянув от основания хвоста и нажав области шеи вниз в то же время.
Предупреждение: Всегда следуйте рекомендациям органа местных животных. - Собирайте весь глазного яблока, резка проема в коже в сторону глаза Рассечение ножницами. Поместите ножницы под глазного яблока и вырезать глазной нерв поп глазного яблока из орбиты. Используйте щипцы, если глаз легко не вышли.
- Сделайте отверстие на задней части глаза, на стороне сетчатки, с иглой 26G разрешить свободный проникновения решений внутри глаза.
Примечание: Не позволяйте глаза становятся сухими, вместо этого, поместите его в PBS до продолжения с протоколом.
- Сделайте отверстие на задней части глаза, на стороне сетчатки, с иглой 26G разрешить свободный проникновения решений внутри глаза.
- Соберите глазного яблока в 2-мл пробирку с PBS. На данный момент не прерывалось эксперимент.
- Удаление PBS и исправить глазного яблока в параформальдегида 4% (PFA) в + 4 ° C для 4-5 часов.
- Переместите фиксированный глазного яблока в ткани кассету для обработки тканей. Используйте ткани, обработка машины и следующую программу:
- Промойте с PBS.
- Проинкубируйте 2 x 45 минут в 70% этанола при комнатной температуре.
- Проинкубируйте 2 x 1 h в 94% этанола при комнатной температуре.
- Инкубируйте 3 x 45 минут в абсолютного этанола при комнатной температуре.
- Инкубируйте 3 x 1 h в ксилоле, при комнатной температуре и последний ксилола при 37 ° C.
- Инкубируйте 3 x 1 h в парафин при температуре 60 ° C.
- После обработки ткани встройте в парафин жидкий (+ 60 ° C), используя блок внедрения тканей глазного яблока. Место глаз внутри блока, так что он смотрит в сторону и периферийных пограничных вверх. Пусть блок затвердеть на прохладный пластину для 5-10 минут.
7. парафиновых срезах роговицы
- Подготовьте микротом для разрезания согласно инструкциям учреждения или производителя.
Предупреждение: Будьте внимательны при обработке лезвия острыми микротома. - Место один водяной бане с сверхчистого водой комнатной температуры около микротома и другой с ультрачистая вода нагревается до + 50 ° C.
- Сделайте 5 мкм толщиной секций глазного яблока.
Примечание: Объектив легко перерывы при резании. Чтобы избежать этого, протирают режущие поверхности влажной салфеткой, каждый раз, когда запускается новый ряд разделов. Использование водопроводной воды для увлажнения ткани. - Место разделы рядом друг с другом в ванну водой комнатной температуры, а затем переместите их в ванну с горячей водой с помощью на стеклянное скольжение. Растяните разделы в ванну с горячей водой до тех пор, пока все морщин расслабиться и секции становится матовой.
- Сухие стекла слайды с разделами на ночь в котором + 37 ° C.
- Прикрепить разделы к слайдам, сохраняя слайд за 1 минуту на подогревом тарелку в + 60 ° C. После этого секции может быть непосредственно обработаны для окрашивания, иммуногистохимического методы или хранящиеся в + 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает модель причинять ущерб истиранию к мыши роговицы и предлагает как следовать и визуализировать процесс заживления после истирания. Недавно мы использовали этот метод для изучения роли эпителия роговицы прогениторных клеток во время заживления6. Использование установленных инструментов является ключом к успешной истиранию эксперимент. Мы и другие, использовали Algerbrush II глазной Бёрр (рис. 1) для выполнения ссадины6,7,24. Этот инструмент имеет притупилась Берр наконечник 0,5 мм размер кисти вместо дрели или ножницы эпителия роговицы прочь. Таким образом этот инструмент является рекомендуемым выбором для стирания травмы на роговице.
Центральной частью этой модели является, что желаемого интервалы могут быть легко визуализированы пострадавшего региона. В рисунке 3Aмы представляем использование флуоресцеин, пятнать в сочетании с Кобальт синий источник света (рис. 1) для отображения на сайте истиранию. В этом эксперименте мы провели большой раной в центре роговицы и покинул периферийных нетронутой роговицы (Рисунок 3А). Кроме того мы скрепляемые только левый глаз каждой мыши и правой, двусторонние следит как элемент скрепляемые. Образцы двусторонних глаз остается отрицательным для флуоресцеин сигнал, который свидетельствует о том, что они не проходят любые потери клеток во время эксперимента и таким образом функционировать, а также контрольных образцов. Однако зеленый сигнал в границах глаза отображаются флуоресцеин решение, которое накапливается в стыке между глаз и век. Истиранию был крупнейшим в 0 ч, сразу же после травмы (рис. 3A). Это было заметно меньше после 18 ч. и в этом случае, расположенная вблизи верхней границы глаза. Однако эпителий закрывает подвергаются региона с равной скоростью со всех сторон истиранию. В частности на 72 ч после ранения, зеленый сигнал не был виден. Это означает, что эпителия роговицы был полностью заново грануломах 72 ч после истирания.
С помощью этого метода мы нацелены на упором истиранию только на эпителии роговицы, так что более глубокие слои роговицы остались нетронутыми. Удаление эпителия роговицы было очевидно из Гистологические срезы на рисунке 3B. В 0 ч край истиранию показано как узкие, бесклеточной выступ непрерывный от регулярно, 4-5 клеток слои толщиной эпителия роговицы. Лимба, периферийных пограничных эпителия роговицы, представляет пример региона, который не пострадал от износа во время всей экспериментальной timeline (72 ч.). Кроме того Гистологические срезы указал, что глубокие слои роговицы, стромы и эндотелия, не пострадали от глазной заусенцев. Эти две ткани появились аналогичные в образцах прошлифовать и двусторонние глаз. В 18 ч после травмы процесс заживления активен и эпителизация продолжается. Это было предложено на внешний вид передней кромки. Передний край содержит только 1-2 слоя эпителиальных клеток и охватывает подвергаются региона до повторного стратификации может произойти25. С учетом результатов на рисунке 3Aповерхность был полностью повторно грануломах, 72 h, когда перенос фронтов были охвачены рану и снова присутствовали все эпителиального слоя. Гистологические срезы из двусторонних глаза подтвердил, что глаза элемента управления остается неизменным в течение периода наблюдения (рис. 3A).
И наконец мы предоставляем доказательства того, что модель истиранию ограничивается эпителия роговицы и не ссылаться стромальные ответ на травмы, такие как неоваскуляризации. Рисунок 4 показывает мышиных роговицы в 18 ч после истирания. На основании макроскопической вид, этот момент не показало стромальные ответ, показывая тем самым, что наш протокол не нарушить глубокие слои роговицы. В сравнении щелочной травмы с 0,75 моль/Л NaOH немедленно индуцированной неоваскуляризации в стромы. Учитывая быстрое неоваскуляризация в щелочной травмы, время точки в нашем методе предоставляют доказательства исключает возможность реагирования в стромы.
Рисунок 1: основные инструменты для эпителия роговицы ссадины. Слева — вибрирующие глазной заусенцев. Кобальт синий свет перо в право используется для приведения флуоресцеин пятна видны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Imaging роговицы ссадины. (A) инструменты для визуализации регулируемый камеры руку с зажимом (слева), Зеркальные камеры (в центре) и настольная лампа с гибкие руки и зажим (справа). Кобальт синий светлый пера привязан к купол лампа с двумя стяжек. (B) общий вид изображений установки; Расстояние от каждого инструмента вложения помечен в изображении в см. Обоих зажимов 6 см от калильная пластина и мыши помещается 10 см от края плиты тепло. (C) пристальный взгляд на абразивную стойкость изображений с предлагаемой расстояния и позиции мыши глаз см. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: обнаружение и локализация роговицы ссадины. (A) мыши глаза на 0, 18 и 72 ч после истирания. Флуоресцеин сигнала знаменует прошлифовать региона в ярко-зеленый, тогда как все другие регионы в эпителии остаются темные. Двусторонние глаза служат элементы управления. Пунктирная линия отмечает границы раны и белое пятно в каждый глаз является отражением от камеры. (B) гистологически секционного и гематоксилином и эозином витражи образцы мышь глаз на 0, 18 и 72 ч после истирания. Лимба является границы, которая окружает эпителия роговицы, со всех сторон. Астерикс знаменует край истиранию. Шкалы бар-100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: роговицы ссадины не активировать ответ стромы. Щелочные воздействия с 0,75 моль/Л NaOH, следуют ирригационные с 0,9% NaCl производит неоваскуляризации роговицы (глаз, собранные сразу после лечения). Истиранию с глазной Берр показывает нет неоваскуляризации даже после того, как 18 ч истиранию сайт отмечен пунктирной линией. Масштаб бар 1 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ранение методы являются популярные инструменты для изучения различных аспектов роговицы гомеостаза и патологий. Истиранию модель предлагает хорошо контролируемых метод для решения соответствующих проблем в офтальмологии. Однако некоторые критические точки в протоколе, следует подчеркнуть. В частности детали, говорится о ветеринарной медицины, рана исцеления сроки и результаты оптимизированы для использования с беспородных ВММНИИ и МГП запасов, но может варьироваться среди штаммов мышей26. Этот протокол экспериментальных животных останется с наркотизированных приблизительно 20 минут. Это дает окно короткий, но достаточно времени для выполнения к истиранию. Однако при использовании глазных Берр, истиранию, сам это очень быстрая операция и должна быть возможность выполнять в этот период времени.
Простой и доступный визуализация является одним из главных преимуществ модели истиранию. В сочетании с методами молекулярной биологии, это открывает возможности для изучения эпителиальных клеток в деталях. Прошлифовать роговицы может быть обработан для гистологического или иммунологических окрашивание и белки и нуклеиновые кислоты могут быть собраны и дальнейшего изучения. Pajoohesh-Ганджи et al. показал что ген выражение шаблоны в изменении роговицы эпителиальных клеток после роговицы оскорбление с притупилась клинка27. Для обеспечения контролируемого выборки, мы рекомендуем изображения ссадины будут приняты сразу же после операции и коллекции образцов следуйте точно запланированные сроки.
Этот протокол имеет использует помимо экспертизы эпителизации роговицы. Например износу роговицы лимба, ниши стволовых клеток роговицы, может использоваться для изучения динамики стволовых клеток7. Мы показали, что регион не скрепляемые эпителия оставалась нормальной во время процесса заживления, однако некоторые авторы утверждают, что базальной мембраны и базовые стромы кератиноцитах страдают от окуляра burr24,28. Удаление базальной мембраны могут быть оценены с конкретными базальной мембраны пятнать. Кроме того неоднократные ссадины на длительный временной шкале могут выявить интересные закономерности исцеления. В этом протоколе мы не наблюдали архитектура эпителия над долгосрочной Чейз. Оба притупляется скальпель и травмы глазной Берр показали увеличение случаев к эрозии роговицы после одного до нескольких недель после травмы24,29,30. Это следует иметь в виду при использовании модели истиранию для долгосрочных исследований. Однако, исследования, посвященные эрозии роговицы может быть полезен этот протокол.
Другие ранения модели описаны в длину Stepp et al. в отзыв5. Вместе этот протокол и существующие подходы обеспечивают гибких вариантов для изучения фундаментальных биологических вопросов, а также практических клинических проблем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Кайса Ikkala за ее неоценимую техническую помощь и проницательный помощь при актуализации этого метода, а также позднее в ходе осуществления на наши вопросы, Центральный научно-исследовательский. Мы хотели бы также поблагодарить за ее помощь в планировании руководящими принципами работы ветеринарных лабораторных животных центр и Анны Меллер.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
