Summary
Bu iletişim kuralı oküler yüzey için bir aşınma fare indirebilmek için ve yara iyileşme süreci bundan sonra izlenecek yöntemi açıklanır. Protokol kısmen göz yüzey epitel anaesthetized farelerde kaldırmak için oküler bir burr yararlanır.
Abstract
Fare kornea yara iyileşmesi eğitim için mükemmel bir model sağlar. Kornea gözün en dış tabakası ve böylece ilk savunma sakatlığı. Aslında, klinikte buldum göz yaralanma en yaygın türü bir kornea aşınma var. Burada, biz bir oküler burr imzalat fareler üzerinde kornea epitel vivo kaldırılması sonuçlanan bir aşınma ikna etmek için kullanmaktadır. Bu yöntem diğer alanlarda dokunmadan hedeflenen ve tekrarlanabilir epitel bozulma için izin verir. Buna ek olarak, floresein boyama ile aşınır epitel görselleştirme açıklar ve nasıl aşınır kornea görselleştirmek için somut tavsiyeler sağlar. Sonra yara yara yeniden epithelialized kadar aşınma sonra 0, 18 ve 72 h şifa kronolojisi izleyin. Kornea yaralanma epitel aşınma modeli epitel hücre çoğalması, geçiş ve kornea katmanların yeniden epithelialization çalışmalar için idealdir. Oküler burr stromal hücre katmanlarına nüfuz etmez çünkü ancak, bu yöntem stromal etkinleştirme sırasında yara iyileşmesi, eğitim için en uygun değildir. Bu yöntem ayrıca örneğin, önceden klinik test ilaç etkinliğinin klinik uygulamalar için uygundur.
Introduction
Çok sayıda organları epitel tabakalarının yaralanmalara maruz kalır. Ancak, onlar da yara iyileşmesi ile doku kaybı telafi etmek için yeteneğini içerir. Kornea yara iyileşmesi eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Gözün dış yüzey oluşturur ve hassas oküler makine için bir koruyucu tabaka sağlar. Böylece, kornea patojenler ve su kaybı için fiziksel bir bariyer görevi görür. Üç katmandan oluşur; epitel, stroma ve endotel. Kornea epitel kornea dıştaki katman yapar. Epitel hücreleri kesinlikle birbirine sıkı kavşak1,2,3ile bağlı kalarak tarafından kornea bariyer fonksiyonunu korumak. Bir acellular kornea membran, Bowman'ın membran, ateşe dayanıklı keratocytes içeren kapsamlı stroma epitel ayırır. Stroma altında besin, su ve oksijen üst katmana endotel hücreleri kanal.
Kornea aşınmalar klinik4' te çok yaygındır. Kornea yaralanmaları çeşitlidir, ama büyük ölçüde toz veya kum, çizilme veya diğer yabancı nesneler gibi küçük parçacıklar tarafından kaynaklanır. Protokol tanımlamak burada kornea epitel aşınma klinik bir tür üreyen amaçlamaktadır. Bunu yaparken, bu iletişim kuralı klinisyenler ve kornea bilim adamları kendi çalışmaları uygulamak için bir kontrol edilebilir ve seminal yöntemi sağlar. Biz fare kornea üzerinde doku dulled oküler burr, Algerbrush II ile aşındırma tarafından bir vivo içinde hasar onarım tahlil gerçekleştirdiniz. Burada, biz sadece merkezi kornea epitel için aşınma hedef ve organ zarar vermeden diğer bölgelerinde bırakın. Böylece, iletişim kuralını yeniden epithelialization sırasında çalışma kornea epitel hücre dinamiği veya membran için idealdir geçiş, yayılmasını önleme ve farklılaşma vivo içinde5hücre. Son zamanlarda, bu model fare kornea de kapasite kornea kök hücre niş yaralanma6,7' den sonra yeniden kurulmasında farklılaştırılmış kornea epitel hücresi açıklayacak olarak progenitör hücre dinamiklerini analiz etmek için kullanıldı. Aşınma, korneanın normal şeffaflık ve çekme dayanımı için döndürür. İlginçtir, bir vitro çalışma artan hücre proliferasyonu8yeniden o epithelialization oluşur göstermiştir. Bu iletişim kuralı kesintisiz fare kornea iyileşme zaman çizelgesi açıklar. Yöntem böylece şifa desenleri ve hız üzerindeki etkisi ilaç test etmek için geçerlidir.
Kornea kapsamlı çalışmalar şifa yara için kullanılmıştır. Ancak, birçok çalışma yaralanma diğer modellerde yararlanmıştır. Bir iyi kurulmuş kornea yaralanma sodyum hidroksit (NaOH) uygulayarak gerçekleştirilir alkalin yanık veya filtre kağıdı kornea yüzey9olmadan modeldir. Alkali pozlama sadece kornea epitel, aynı zamanda konjonktiva ve stroma9,10etkiler büyük ve diffüz yaralanma içinde sonuçlanır. Güçlü alkalin çözümleri kornea ülseri, opaklaşmasına ve neovaskülarizasyon9ikna etmek için gösterilmiştir. İnflamatuar hücre genellikle içinde 6 h stroma istila ve 24 saat11' e kadar orada kalır. Böylece, alkali yaralanması stromal harekete geçirmek ile ilgili çalışmalarda tavsiye bir yöntemdir. Başka bir tür kimyasal yaralanma dimetil sülfoksit (DMSO) uygulayarak üstünde kornea9,10uyguluyor. Diğer sık kullanılan yaralanma modelleri stroma14,15üst bölümü sınırlıdır stroma ve keratectomy yaralar üzerinden nüfuz umblikal yaralar içerir. Bu yöntemleri de stromal yara iyileşmesi ile ilgili soruları cevaplamak yararlıdır. Farklı yaralanma modelleri kendi avantaj ve dezavantajları vardır. Aşınma veya debridman, kornea epitel, ilk neşter dulled veya bıçaklar ex vivo kornealar16tarihinde kullanarak geliştirilmiştir. Bu yöntem daha sonra kullanılan vivo içinde fare, fare ve tavşan17,18,19,20,21,22üzerinde olmuştur. Oküler burr (Şekil 1) kullanarak, epitel kalan etkilenmez bırakarak epitel, yalnızca seçili bir bölge kaldırın. Bu şekilde, tam olarak farklı bölgelerine kornea epitel kaldırma hedeflemek mümkündür. Buna ek olarak, aşınma boyutu floresein boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, burada aşınma kapatma sırasında iyileşme dönemi takip ediyoruz.
Bu yöntem birçok avantaj teşkil etmektedir, i) dahil olmak üzere tam yerini kimyasal yaralanma ile mümkün değildir, aşınma sitesinin II) aşınma gerçekleştirmek hızlı, ve III) Bu non-invaziv. Burada, bu fare genetik modellerini geniş dizi yanı sıra sıçan ve insan kornea bozulma eğitim için kullanılan ortak modellerdir tavşan uygulanan olabilir ancak bir model olarak outbred NMRI fareyi kullanarak yöntemi açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ulusal hayvan deney Kurulu tarafından onaylanır.
1. hazırlıkları
- Tüm çözümler hazırlamak ve aksi belirtilmediği takdirde oda sıcaklığında tutmak. Atık bertaraf düzenlemelere dispose kullanılan malzemeler ve çözümler için.
- Kullanım NMRI ve ICR outbred hisse senetleri, ya cinsiyet ve yaş 4-12 hafta arasında. C57BL/6 zorlanma kullanıyorsanız, adım 1.3.2 ketamin-medetomidine hazırlık yönteminde izleyin. Diğer adımlar için 1.3.3.-1.3.5 içinde açıklanan yönergeleri izleyin.
- Veteriner ilaçları taze ve zamanında işlemi başlatmadan önce hazırlayın. Carprofen daha sonra kullanılacak olan, bu nedenle bu noktada hazırlamak gerekli değildir.
- Anestezi için ketamin-medetomidine çözeltisi hazırlamak için 0.375 mL karışımı (stok konsantrasyonu 50 mg/mL) ketamin bas (Ketaminol veteriner) ile 0.25 mL (stok konsantrasyonu 1 mg/mL) medetomidine (Cepetor veteriner) in ve steril %0,9 1,25 mL ekleyin NaCl. Fare ağırlık (7.5 mg/kg, ketamin ve 1 mg/kg, medetomidine) 0,15 mL/20 g yönetmek.
- Anestezi C57BL/6 fareler üzerinde ketamin-medetomidine daha sulu çözeltisi hazırlamak için 0.375 mL karışımı (stok konsantrasyon 50 mg/mL) ketamin bas 0.25 mL ile (stok konsantrasyonu 1 mg/mL), medetomidine ve steril %0,9 2.5 mL ekleyin NaCl. Fare ağırlık (3,75 mg/kg, ketamin ve 0.5 mg/kg, medetomidine) 0,15 mL/20 g yönetmek.
Not: Bu sadece yetişkin C57BL/6 fareler için alternatif bir adım olduğunu. - Buprenorfin analjezi için hazırlamak, 0.1 mL ekleyin (stok konsantrasyon 0.3 mg/mL), buprenorfin steril %0,9 1,9 ml NaCl. 0.2 mL/20 g fare ağırlık (0.15 mg/kg) yönetmek için.
- Atipamezole anestezi durdurulması için hazırlamak, 0.1 mL ekleyin (stok konsantrasyonu 5 mg/mL), atipamezole %0,9 4.9 ml NaCl. 0,15 mL/20 g fare ağırlık (0.75 mg/kg) yönetmek için.
- Sonrası anestezi sırasında analjezi için carprofen kullanın. 0.1 mL ekleyin (stok konsantrasyonu 50 mg/mL), carprofen %0,9 4.9 ml NaCl. Fare ağırlık (7.5 mg/kg) 0,15 mL/20 g yönetmek.
- Floresan boyama çözüm hazırlamak
- Kobalt mavi ışık (Şekil 1) altında aşınma görüntülenmesi için floresan bir çözüm kullanın. İlk ölçüm 10 mg floresein tuz iyi ölçekli tarafından bir % 0,1 floresein çözüm hazırlamak ve çözümde fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL ekleyin.
- Fluoresein çözüm ışıktan korumak ve 5 dakika boyunca bir sallayıcı.
Not: Işığa duyarlı floresein çözümdür; çözüm ışık kapalı tutun. Bu çözüm 4 ° C'de 2-3 gün süreyle saklanabilir. Kullanım için göz damlası için kullanılan bir damlalık şişe floresein çözüm yerleştirmek yararlıdır. Steril bir filtre çözümü için damlalık şişe taşırken kullanın.
- Oküler burr ipucu önce ve sonra kullanım temizlik; ilk PBS ve daha sonra ile % 70 alkol. Bir aşınma birkaç fareler için aynı işlemi sırasında yapma, her fare arasında temizleme adımları yapın.
- (37 derece ° C) ısıtmalı plaka koymak ve kağıt havlu üzerine yerleştirin.
2. kornea aşınma
Dikkat: koruyucu giyim (eldiven, önlük) kullandığınızda fare işleme. Yönetmek için ilaç hacmi tahmin etmek için fareyi tartın.
- Fare23işlemek için tek elle scruffing yöntemini kullanın. Ketamin-medetomidine karışımı intraperitoneally yönetmek (IP) sol alt karın için. Bireysel bir kafes için fareyi getirin ve uykuya dalmak bekleyin. Bu genellikle 5 dakikadan daha az sürer. O zaman, ilk buprenorfin ve sonra atipamezole ı.p. enjeksiyonları ile yönetirsiniz. Aynı işleme tekniği kullanın.
Not: anestezi verildikten sonra protokol her an duraklatılmış değil. - Devam etmeden önce ateşli tabağı sıcak olup olmadığını kontrol edin. İmzalat fare ısıtmalı tabağa yerleştirin. Anestezi düzeyini iyi ise kuyruk refleks yoktur ama ayak refleks mevcuttur. Bu refleksleri kuyruk ve herhangi bir ayak parmakları veya forseps ile pinching tarafından kontrol edin. Aşırı güç kullanmayın. Anestezi son 20-25 dakika olacak.
- Bir aşınma yapmak için temizlenmiş oküler burr kullanın. Aşınma yapmak esastır titreşim açmak için burr Bankası döndürün. Burr düzgün elinde, titreşim hissediyorum.
- Bir gözü bir anda göz kapakları parmak ile ayrı ayrı tutarak açın. Sonra sıkıca burr kornea için touch ve enstrüman de ileri geri hareket ettirmek gibi yan oküler yüzeyde. Burr titreşim çizik gerçekleştirir; tuşuna basın, sallamak veya kornea gözyaşı. Merkez kornea yüzeyi hareketleri aşındırma 20 yara ikna etmek yeterlidir. Burr kaldırın ve çizikler için kornea bölgede kalmaya çalışın. Standart boyutlu aşınma edinme uygulama birkaç tur gerektirir.
Not: Betadin oftalmik çözüm kullanarak aşınma önce kornea asepsis elde edilebilir.
3. aşınma görüntüleme
- Kobalt Mavisi kalem ışık (Şekil 1) ve floresein çözüm kullanarak aşınır bölgenin aydınlatmak. Oküler yüzeyi ortam ışığı renksiz görünür. Fluoresein uygulamadan sonra aşınır bölge yeşil göz kalemi ile ışık aydınlatıcı zaman fluoresces.
- Gerekirse, aşınır göz 2.3 olduğu gibi aynı şekilde açın ve bir damla floresein çözüm damlalık şişe yönetmek. PBS veya % 0,9 ile bir kez göz yıkama NaCl floresein arka plan azaltmak için. Bir damlalık şişe veya bir pipet yıkama için kullanın. Yumuşak bir bezle uzakta sıvı Aspire edin ve gerekirse kirpik, temiz. Aşırı sıvı genellikle göz gözyaşı kanalı'nın açılması yakın burun kenarlık için toplar.
Dikkat: küçük sıyrıklar indüklenen gibi temizleme sırasında kornea dokunmaktan kaçının.
- Gerekirse, aşınır göz 2.3 olduğu gibi aynı şekilde açın ve bir damla floresein çözüm damlalık şişe yönetmek. PBS veya % 0,9 ile bir kez göz yıkama NaCl floresein arka plan azaltmak için. Bir damlalık şişe veya bir pipet yıkama için kullanın. Yumuşak bir bezle uzakta sıvı Aspire edin ve gerekirse kirpik, temiz. Aşırı sıvı genellikle göz gözyaşı kanalı'nın açılması yakın burun kenarlık için toplar.
- Kornea aşınma fotoğraf çekmek.
- Benzer görüntü görüntüleme her oturum sırasında elde etmek, kobalt mavisi kalem ışık ve SLR kamera (Şekil 2) için sabit ek araçları kullanın. Bu iletişim kuralı (Şekil 2) yinelemek kolay bir kurulum sağlar.
- Kalem ışık ve kamera takmak için bir masa lambası esnek bir kol ve kelepçe ve ayarlanabilir kamera kolunu bir kelepçe ile sırasıyla kullanın. Kablo bağı ışık masa lambası ve konum hemen üstünde fare göz kalemi. Işığı farklı konumlandırma aşınma görselleştirme değiştirebilir. Bu araçlar konumlandırma için bir öneri Şekil 2' de anlatılan.
- SLR fotoğraf makinesi göz fotoğraf çekmek için kullanın. İstenilen mesafe ve pozisyon ve odak fotoğraf makinesi (1:12) hayvan oda ışığında yerleştirin. Bundan sonra kobalt mavisi kalem ışık hariç diğer bütün ışıklar kapatın.
Not: kalem ışık kolu aşağı bant veya görüntüleme sırasında her zaman ışık tutmak için bir lastik bant kullanın. Görüntü bulanık hale gelirse bu yardımcı olabilir. Bir meslektaşım ile görüntüleme adımı gerçekleştirmek en kolay yoldur.
- Benzer görüntü görüntüleme her oturum sırasında elde etmek, kobalt mavisi kalem ışık ve SLR kamera (Şekil 2) için sabit ek araçları kullanın. Bu iletişim kuralı (Şekil 2) yinelemek kolay bir kurulum sağlar.
4. sonra kornea aşınma uyanma
- İlk buprenorfin ve sonra atipamezole ı.p. enjeksiyonları ile yönetirsiniz. 2.1 olduğu gibi aynı işleme tekniği kullanın.
- Bir damla nemlendirmek ve oküler yüzey temiz bakterilerden anestezi sonra tutun aşınır ve sigara çizikler gözler için antibakteriyel, fucidin asit göz merhem (Isathal) koyun.
- Fare ısıtmalı plaka üzerinde 5-20 dakika içinde uyanacak gibi fare sonrası anestezik uyandırma döneminde gözlemlemek. Mobil hale geldiğinde, bireysel bir kafese koyun.
Not: uyanma daha uzun sürerse, ısıtmalı bir yastık ile kafeste fareyi getirin veya bütün kafesi ısıtmalı tabağa yerleştirin ve fare düzenli olarak izlemek. Anestezinin etkisi geçiyor, fare genellikle sallıyor ve yukarı doğru anterior vücut ile ulaşır. Bu davranış 3-4 saat içinde normale dönmesi gerekir ve sonra paylaşılan kafese fareyi getirin. - Carprofen ı.p. analjezi ve göz merhem için iki gün üst üste aynı şekilde olduğu gibi adımları 2.2 aşınma sonra bilgisayarları yönetmek. ve 4.2.
5. yara iyileşmesi sırasında görüntüleme
- Bu protokol için 18 h ve 72 h aşınma sonra yara kapatma gözlemlemek için puan kullanım zaman.
- Ardışık görüntüleme için fareler 2.2 içinde açıklandığı gibi anestezi.
- 3'te açıklandığı gibi fotoğraf çekmek.
- Atipamezole ı.p. hayvanlarla uyan ve uyandırma döneminin 4,3 açıklandığı gibi izlemek.
Not: Eğer değilse takip devam ediyor, şu 5.1.2 sonra fare ötenazi. Ötenazi 6.1 açıklanmıştır.
6. kornea koleksiyonu ve parafin katıştırma
- Son zaman noktadan sonra hayvan kurban. Fare ile CO2dolu bir odaya koyun. Oda hava CO ile doldurmak2. Hayvan hareketsiz olduğunda, servikal vertebra kuyruk tabanından sıkıca çekerek ve boyun bölgesi aşağı aynı anda basarak yerinden çıkar.
Dikkat: Her zaman yerel hayvan refahı vücut yönergeleri izleyin. - Tüm göz küresi deri bir açılış göz tarafına diseksiyon makasla keserek toplamak. Göz küresi altında makas yerleştirin ve göz küresi yörüngeden pop için oküler sinir kesti. Göz kolayca dışarı gelmez forseps kullanın.
- Ücretsiz penetrasyon çözümleri göz içinde izin vermek için 26 G iğne ile retina tarafında göz arkasında bir delik açın.
Not: bunun yerine kuru, haline, iletişim kuralı ile devam kadar PBS içinde yer göz izin vermeyin.
- Ücretsiz penetrasyon çözümleri göz içinde izin vermek için 26 G iğne ile retina tarafında göz arkasında bir delik açın.
- Göz küresi PBS ile 2 mL tüp içinde toplamak. Deneme bu noktada durmaz.
- PBS kaldırmak ve gözbebekleri %4 paraformaldehyde (PFA) içinde 4-5 saat 4 ° C'de düzeltin.
- Sabit göz küresi doku işleme için bir doku kaset gider. İşleme makine ve aşağıdaki programı bir doku kullanın:
- Durulama PBS ile.
- % 70 etanol oda sıcaklığında 2 x 45 dk kuluçkaya.
- % 94'ü etanol oda sıcaklığında 2 x 1 h kuluçkaya.
- 3 x 45 dk içinde oda sıcaklığında mutlak etanol kuluçkaya.
- 3 x 1 h ksilen, oda sıcaklığında ve 37 ° C'de son ksilen içinde kuluçkaya
- 3 x 1 h Parafin balmumu 60 ° C'de kuluçkaya
- İşleme doku sonra göz küresi Sıvı parafin (+ 60 ° C) bir doku gömme blok kullanarak gömün. Bloğun içine göz yana doğru bakıyor ve periferik kenarlığı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 5-10 dakika için serin bir tabağa kuvvetlendirmek blok izin.
7. parafin kesitler kornea
- Kurumun veya üreticinin yönergelerine göre kesit için microtome hazırlamak.
Dikkat: keskin microtome bıçak ele alırken dikkatli olun. - Yer bir su banyosu oda sıcaklığında Ultrasaf Su microtome yanında ile ve başka Ultrasaf Su ile + 50 ° C'ye ısıtılmış
- Göz küresi 5 µm kalınlığında bölümleri olun.
Not: Lens kolayca kesit sırasında tatili. Bunu önlemek için her zaman yeni bir satır bölümlerinin başladı nemli mendil ile kesme yüzeyi silin. Musluk suyu doku nemlendirmek için kullanın. - Oda sıcaklığında su banyosu içinde birbirlerine yanında bölümleri yerleştirin ve ardından bir cam slayt yardımıyla sıcak su banyosu için taşıyın. Tüm kırışıklıkların rahatla kadar sıcak su banyosu ve bölümler haline mat bölümlerde germek.
- 37 derece ° C. gecede bölümünde cam slaytlarla Kuru
- 1 dakika + 60 ° c ısıtılmış bir plaka üzerinde slayt tutarak slaytlara bölümleri ekleyin Bundan sonra bölümler olabilir doğrudan boyama için immunohistological yöntemleri işlenen veya 4 ° c'depolanan
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı fare kornea bir aşınma yaralanma indirebilmek için bir modeli açıklar ve nasıl izleyin ve aşınma sonra iyileşme süreci görselleştirmek için önerir. Son zamanlarda, bu yöntem6şifa yara sırasında kornea epitel progenitör hücre rol çalışmaya çalıştırmaya başladık. Kurulan araçların kullanılması başarılı aşınma deneyi anahtarıdır. Biz ve diğerleri, Algerbrush II oküler burr (Şekil 1) aşınmalar6,7,24gerçekleştirmek için kullandık. Bu araç 0,5 mm dulled burr ucu yerine matkaplar ya da makası kornea epitel uzakta fırça boyutu vardır. Bu nedenle, bu aracı bir aşınma yaralanma kornea üzerinde için önerilen seçimdir.
Bir merkezi bu model etkilenen bölge zahmetsizce istediğiniz aralıklarla görüntülenmeyecektir parçasıdır. Şekil 3Aiçinde biz bir Kobalt mavi ışık kaynağı (aşınma sitesini görüntülemek için,resim 1) ile birlikte boyama floresein kullanımı mevcut. Bu deneyde, biz büyük bir merkez kornea yara ve periferik kornea bakir (Şekil 3A) yaptı uygulandı. Ayrıca, her fare sadece sol gözünde çizikler ve çizikler sigara denetimi olarak değil, ikili göz kulak. İkili göz örnekleri onlar değil herhangi bir hücre kaybı deneme sırasında geçmesi ve bu nedenle de kontrol örnekleri işlev öneriyor floresein sinyal için negatif kaldı. Bununla birlikte, göz sınırları içinde yeşil sinyal Junction göz ve göz kapağının arasında birikmiş floresein çözüm görüntülenir. Aşınma 0 h yaralanma (Şekil 3A) hemen ardından, büyük oldu. 18 h sonra belirgin daha küçük ve bu durumda, göz üst sınır yakın yer. Ancak, epitel aşınma her taraftan eşit bir hızda maruz kalan bölge kapatır. Özellikle, 72 h sonrası yaralama, yeşil sinyal görünür oldu. Bu kornea epitel tam 72 h aşınma sonra yeniden epithelialized olduğunu gösterir.
Böylece kornea derin katmanları değişmeden kaldı bu yöntemle, biz sadece kornea epitel üzerinde aşınma odaklanman nişan almıştım. Kornea epitel kaldırılması Şekil 3Bhistolojik bölümlerden açıktı. 0 h aşınma kenarına bir düzenli, 4-5 hücre katmanları kalın kornea epitel sürekli bir dar, acellular çıkıntı olarak gösterilir. Limbus, kornea epitel periferik kenarlığını aşınma tüm deneysel zaman çizelgesi (72 h) sırasında etkilenen değil bir örnek bölge sunar. Buna ek olarak, histolojik kesitler kornea, stroma ve endotel, derin katmanları zarar olduğunu tarafından oküler burr belirtti. Bu iki doku aşınır ve ikili göz örnekleri benzer ortaya çıktı. 18 h sonrası yaralanma, iyileşme süreci etkindir ve yeniden epithelialization devam ediyor. Bu bir öncü görünümünü tarafından önerildi. Öncü sadece 1-2 epitel hücre katmanları içerir ve yeniden stratifikasyon25oluşabilir önce maruz kalan bölge kapsar. Şekil 3Asonuçlarına paralel olarak yüzey tam 72 h tarafından zaman geçirme cephede yara kaplamıştı ve epitel katmanları yeniden mevcuttu yeniden epithelialized. İkili göz histolojik kesitler (Şekil 3Akontrolü gözlerine gözlem döneminde olduğu gibi kaldı) doğruladı.
Son olarak, biz aşınma modeli için kornea epitel kısıtlanır ve yaralanma gibi neovaskülarizasyon stromal yanıt çağırmak değil kanıt sağlar. Şekil 4 fare kornea 18 h aşınma sonra gösterir. Makroskopik görünümünü temel alan, böylece bizim protokol derin korneal katmanları bozmak değil gösteren stromal yanıt, bu zaman noktası göstermedi. Buna karşılık, alkali bir yaralanma 0,75 mol/L NaOH ile hemen neovaskülarizasyon stroma içinde indüklenen. Hızlı neovaskülarizasyon alkalin yaralanma göz önüne alındığında, bizim yönteminde zaman puan stroma yanıtta olasılığını ekarte etmek kanıt sağlar.
Şekil 1: kornea epitel aşınma için gerekli araçları. Sol tarafta bir titreşimli oküler çapak var. Kobalt Mavisi kalem ışık sağ floresein leke görünür getirmek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kornea aşınma görüntüleme. (A) araçları görüntüleme için esnek kol bir ayarlanabilir kamera kolla kelepçe (solda), SLR fotoğraf makinesi (Merkezi) ve bir masa lambası ve kelepçe (sağda). Kobalt Mavisi kalem ışık lamba kubbe için iki kablo bağları ile bağlanmış. (B) bir genel görünümünü görüntüleme Kur; her ek araç mesafesinde cm görüntü işaretlenir. Her iki kelepçeler ısı plaka uzak 6 cm ve fare 10 cm uzaklıkta ısı plaka kenarına yerleştirilir. (C) önerilen mesafe ve konuma fare göz cm. ile aşınma görüntülemede daha yakından bakmak Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: algılama ve yerelleştirme kornea aşınma. (A) fare gözlere 0, 18 ve 72 h aşınma sonra. Tüm diğer bölgelerde epitel karanlık kalır, ancak floresein sinyal aşınır bölge parlak yeşil renkle işaretler. İkili gözleri denetimi olarak hizmet vermektedir. Kesikli çizgi yara sınırlarının işaretler ve her gözün beyaz yerde kamera yansımasıdır. Histolojik olarak (B) kesitli ve Hematoksilen ve eozin 0, 18 ve 72 h fare gözlere örnekleri aşınma sonra lekeli. Limbus her taraftan kornea epitel çevreleyen kenarlığın var. Asteriks aşınma kenarına işaretler. Ölçek çubuğu var. 100 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kornea aşınma değil harekete geçirmek stromal yanıt. 0,75 mol/L % 0,9 ile sulama ardından NaOH ile alkali pozlama NaCl kornea neovaskülarizasyon (hemen tedavi sonrası toplanan göz) üretir. Sonra bile 18 h. aşınma sitesi tirelerden oluşan bir çizgiyle işaretlenir aşınma oküler burr ile hiçbir neovaskülarizasyon gösterir. Ölçek 1 mm. bar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaralama yöntemleri kornea homeostazı ve patolojileri farklı yönlerini incelemek için popüler araçlardır. Aşınma modeli Oftalmoloji ilgili sorunları çözmek için iyi kontrollü bir yöntem sunar. Ancak, bazı kritik noktaları iletişim kuralındaki vurgulayan değer vardır. Özellikle, belirlenen veteriner ilaçları, yara iyileşme zaman çizelgesi ve sonucu ile ilgili ayrıntıları outbred NMRI ve ICR stokları ile kullanım için optimize edilmiştir, ama fareler26suşları arasında değişebilir. Bu iletişim kuralı ile deneysel hayvan yaklaşık 20 dakikadır imzalat kalacaktır. Bu kısa ama yeterli pencere aşınma gerçekleştirmek için zaman verir. Ancak, oküler burr kullanırken, aşınma kendisi yapmak çok hızlı bir işlemdir ve bu zaman dilimi içinde gerçekleştirmek mümkün olacaktır.
Kolay ve erişilebilir görselleştirme aşınma modeli ana avantajlarından biri olduğunu. Moleküler Biyoloji yöntemleri ile birlikte, bu ayrıntılı olarak epitel hücreleri çalışma için olanaklar açar. Aşınır kornealar histolojik veya immünolojik'ın boyama için işlenebilir ve proteinler veya nükleik asitler olabilir toplanan ve daha da inceledi. Pajoohesh-Ganji ve ark. o gen ifade desenleri üzerine bir bıçak dulled27ile kornea hakaret kornea epitel hücreleri değişiklik gösterdi. Kontrollü örnekleme sağlamak için aşınmalar görüntülerini işleminden hemen sonra alınır ve örnek koleksiyonları tam olarak planlanan zaman çizelgeleri izleyin öneririz.
Bu iletişim kuralı kullanımı kornea epithelialization incelenmesi ötesinde vardır. Örneğin, kornea limbus kök hücre niş kornea aşınma kök hücre dinamiği7çalışma için kullanılabilir. Epitel olmayan çizikler bölgenin iyileşme süreci sırasında normal kaldı gösterdi ancak bazı yazarlar membran ve arka plandaki stromal keratocytes etkilenir göz tarafından24,28burr iddia. Membran kaldırılması belirli membran boyama ile tahmin edilebilir. Ayrıca, tekrarlanan aşınma daha uzun bir zaman çizelgesi üzerinde ilginç şifa desenleri açığa olabilir. Bu protokol için biz epitel mimarisi üzerinde uzun vadeli bir kovalamaca gözlemleme. Her ikisi de neşter dulled ve oküler burr yaralanma olaylarının artması bir kornea erozyon için bir yaralanma24,29,30sonra birkaç hafta sonra gösterdi. Bu aşınma modeli için uzun vadeli çalışmalar kullanırken göz önünde tutulmalıdır. Ancak, kornea erozyon üzerinde odaklanan çalışmalar bu protokolü yararlı bulabilirsiniz.
Yaralama diğer modelleri uzun uzun Stepp vd. gözden geçirme5tarafından tanımlanır. Birlikte, bu iletişim kuralını ve varolan yaklaşımlar hem temel biyolojik soru hem de pratik klinik sorunlar incelemek için çok yönlü seçenekleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Kaisa Ikkala onun çok değerli teknik yardım ve ne zaman bu yöntem gerçekleştirirken anlayışlı yardım yanı sıra daha sonra sırasında uygulama bizim Merkezi araştırma soruları için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca laboratuvar hayvan merkez ve Anna Meller veterinerlik eser yönergeleri planlama konusunda ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
