Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد كمية المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس باستخدام أسلوب سبيكتروفوتوميتريك. تم تطبيق إجراءات استخراج أيضا بنجاح لسلالات البكتيريا والطحالب الأخرى؛ ومع ذلك، نظراً للاختلافات في أطياف امتصاص الصباغ، من الضروري اختبار المعادلات سبيكتروفوتوميتريك لكل سلالة على حدة.
Abstract
هذا بروتوكول بسيط لتحديد كمية المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم نموذج سينيتشوسيستيس. فيكوبيليبروتينس هي أهم مكونات فيكوبيليسوميس، وهوائيات حصاد الضوء الرئيسية في البكتيريا والعديد من الأصناف الطحالب. فيكوبيليسوميس من سينيتشوسيستيس تحتوي على فيكوبيليبروتينس اثنين: phycocyanin واللوفيكوسيانين. ويصف هذا البروتوكول بسيطة، تتسم بالكفاءة، وطريقة يمكن الاعتماد عليها لتحديد كمية كل من phycocyanin واللوفيكوسيانين في هذا سيانوباكتيريوم النموذجي. نحن مقارنة عدة طرق لاستخراج فيكوبيليبروتين والتقدير الكمي سبيكتروفوتوميتريك. طبق إجراءات استخراج كما هو موضح في هذا البروتوكول أيضا بنجاح لسلالات البكتيريا الزرقاء الأخرى مثل sp سبيرولينا سيانوثيسي sp.، سينيتشوكوككوسيلونجاتوس،.، س Arthrospira .، و نوستوك sp.، فضلا عن الطحالب الحمراء كروينتوم بورفيريديوم. بيد يمكن أن تختلف معاملات الانقراض من فيكوبيليبروتينس محددة من مختلف الأصناف وذلك، من المستحسن للتحقق من صحة الأسلوب الكمي سبيكتروفوتوميتريك لكل سلالة واحدة على حدة. البروتوكول يتطلب الكثير من الوقت، ويمكن أن يتم في أي مختبر علوم الحياة العادية نظراً لأنه يتطلب المعدات القياسية فقط.
Introduction
ففيكوبيليبروتينس هي مجمعات البروتين الصباغ للذوبان في الماء التي تمثل عناصر رئيسية من هوائيات حصاد الضوء في البكتيريا بدائية (Cyanophyta) وعدد الأصناف حقيقية النواة (جلاوكوفيتا، رهودوفيتا ، وكريبتوفيتا)1. حدوثها أساسا كمجمعات سوبراموليكولار تسمى فيكوبيليسوميس وهي عادة يعلقونها على سطح الأغشية التمثيل الضوئي على الجانب stromal، باستثناء كريبتوفيتا، حيث تكون مترجمة فيكوبيليبروتينس في ثايلاكويد التجويف2. وقد حددت أربعة أنواع من فيكوبيليبروتينس حتى تاريخ: اللوفيكوسيانين الأساسية، و الأجهزة الطرفية phycocyanin وفيكوريثرين وفيكوريثروسيانين1. كمجمعات حصاد الضوء الرئيسي، فيكوبيليسوميس تمثل أحد العوامل الحاسمة للطحالب والبكتيريا الزرقاء الإنتاجية الثقافات الجماعية. وقد ثبت أن اقتطاع فيكوبيليسوميس يمكن أن يعزز تراكم الكتلة الأحيائية تحت ضوء قوي3. من ناحية أخرى، أسفر الاقتطاع هوائي تحت الإشعاع متواضعة أو متدنية، معدلات النمو والكتلة الأحيائية تراكم الحد3،4. فيكوبيليبروتينس تستخدم تجارياً ملونات الأغذية والمستحضرات الصيدلانية، والمواد المضافة إلى الأغذية، في صناعة مستحضرات التجميل، والأسفار تحقيقات مع تطبيقات في التدفق الخلوي وتحديدكم الفلورسنت، والأسفار مجهرية5.
ويركز هذا البروتوكول على تحديد كمية من فيكوبيليبروتينس في سيانوباكتيريوم نموذج سينيتشوسيستيس. البكتيريا الزرقاء هي أقرب أوتوتروفس التمثيل الضوئي أوكسيجينيك؛ أنها تشكل المحيط الحيوي للأرض لأكثر من سنة 2.4 بیلیون6. أنها تلعب دوراً حاسما في الدورات البيوجيوكيميائيه العالمية من النيتروجين والكربون والأكسجين وعناصر أخرى. بين البكتيريا الزرقاء، تسلسل سلالة أحادي الخلية سينيتشوسيستيس اكتسبت موقعا فريداً حيث أنه سيانوباكتيريوم الأولى مع أن الجينوم كامل7،8، بطبيعة الحال الخاصة ب الحمض النووي خارجية9، و فإنه يقوم بتحقيق نمو مستقر وسريع نسبيا10،11. في سينيتشوسيستيس، عنصر الهوائي الأساسية، اللوفيكوسيانين، ويرتبط مع بروتينات الغشاء لا يتجزأ، ويقع phycocyanin المرفقة على هامش غشاء ثايلاكويد.
تتم مقارنة عدة طرق لاستخراج فيكوبيليبروتين والتقدير الكمي ضمن هذا البروتوكول. إجراءات الاستخراج النهائي قد طبقت بنجاح إلى سينيتشوسيستيس، وكذلك لسلالات البكتيريا الزرقاء الأخرى، بما في ذلك س سبيرولينا سيانوثيسي sp.، سينيتشوكوككوسيلونجاتوس،.، Arthrospira س.، نوستوك sp.، وهو طبق بنجاح أيضا على الطحالب الحمراء كروينتوم بورفيريديوم. ولذلك، يمكن اعتبار الطريقة التي وضعت في هذا البروتوكول طريقة عالمية لاستخراج فيكوبيليبروتين. على الرغم من أن بعض طرق استخراج اختبار أسفرت عن غلات مجموع البروتين، هنا وصف إجراءات استخراج شريطة فيكوبيليبروتين أعلى غلة جنبا إلى جنب مع محتوى الكلوروفيل بقايا في أدنى استخراج فيكوبيليبروتين. خفض محتوى الكلوروفيل ضروري phycocyanin الصحيح والتقدير الكمي سبيكتروفوتوميتريك اللوفيكوسيانين.
أطياف امتصاص فيكوبيليبروتين يمكن أن تتفاوت تفاوتاً كبيرا بين مختلف الطحالب والبكتيريا الزرقاء الأنواع12،13،،من1415،،من1617 وحتى بين عدة سلالات جنس واحد من البكتيريا الزرقاء18. ولذلك، بأطوال موجية محددة ومعاملات امتصاص كما تستخدم لتحديد phycocyanin واللوفيكوسيانين في سينيتشوسيستيس لا تنطبق عموما على السلالات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، لا تحتوي على سينيتشوسيستيس فيكوريثرين وفيكوريثروسيانين التي يمكن أن توجد في بعض الطحالب والبكتيريا الزرقاء الأخرى. غرض تحديد فيكوبيليبروتينس في سلالات خلاف سينيتشوسيستيس، من المستحسن تقييم المعادلات سبيكتروفوتوميتريك لكل سلالة على حدة.
على الرغم من أن البروتوكول يتضمن خطوتين أطول (بين عشية وضحاها التجميد الخلوية الكريات واستخراج البروتين 1 ساعة)، وقت العمل الإجمالي للتقدير الكمي فيكوبيليبروتينس لا تتجاوز ساعتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة البكتيريا الزرقاء
- زراعة الخلايا سينيتشوسيستيس في قوارير ارلينمييير أو في photobioreactors10،19 في مخزنة BG11 المتوسطة20 للمحافظة على الرقم الهيدروجيني من < 10 (مثلاً، استخدام 17 ملم حبيس10).
ملاحظة: شروط زراعة القياسية تتطلب درجة حرارة التي تسيطر عليها (عادة، 30 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثلى 35 درجة مئوية)21، والإضاءة (عادة، ضوء أبيض كثافة تصل إلى 800 µmol [الفوتونات]/[م2·s])21، وأول أكسيد الكربون العرض 2 (في فوتوبيوريكتور لوحة مسطحة 400 مل، هو نمو تشبع CO2 تركيز 1,700 جزء في المليون)21. - لتحديد كثافة الثقافة، قياس الكثافة البصرية الثقافة سبيكتروفوتوميتريكالي في 730 نانومتر (OD730) استخدام ومبومو مع مسار ضوء من 1 سم. وبدلاً من ذلك، عد الخلايا تحت مجهر باستخدام هيموسيتوميتير أو خلية الآلي العداد.
2-إعداد العينات
- العمل بموجب الإشعاع المنخفضة لمنع تدهور فيكوبيليبروتين.
- حصاد 3 × 1 مل تعليق الثقافة لأنابيب قفل صندوق الأمانات. استخدام تريبليكاتيس لتقدير الأخطاء التقنية في القياس. لإجراء أخذ العينات الثقافة تحت ظروف معقمة، حصاد الخلايا الموجودة في غطاء الصفحي واتباع ممارسات العمل والسلامة المناسبة.
- الطرد المركزي الخلايا في 15,000 س ز في درجة حرارة المختبر لأدنى 5 إيلاء الاهتمام للدوار الطرد المركزي متوازنة بشكل صحيح. بعد الطرد المركزي، تجاهل في سوبيرناتانتس. يجب التأكد من عدم الإخلال بيليه.
- وضع العينات في ثلاجة. للتخزين على المدى الطويل، تبقى العينات في-80 درجة مئوية. وهذا ضروري لمنع تدهور فيكوبيليبروتين. للتخزين القصير الأجل، و-20 درجة مئوية كافية.
- فريزيدري العينات بين عشية وضحاها. لعملية التجفيف سليم، والحفاظ على درجة حرارة المكثف مجفف التجميد أدناه-60 درجة مئوية والضغط في قاعة مجفف التجميد حول 1 hPa.
- بعد الانتهاء من دورة التجفيف، إغلاق الأنبوب بالسرعة الممكنة للحيلولة دون إعادة استيعاب المياه من الجو.
3-خلية التجانس وأصباغ الاستخراج
- إضافة أربع قطع من الزجاج الخرز (التي يبلغ قطرها 2 ملم) لكل أنبوبة العينة وإغلاق الأنابيب.
ملاحظة: عندما يكون غطاء صندوق الأمانات-قفل الأنبوبة المستخدمة لتحقيق التجانس رقيقة جداً، فإنه يمكن كسر خلال مجانسة؛ ولذلك، يوصي بألا قفل صندوق الأمانات في الأنابيب مع أغطية قوية لهذا البروتوكول. - مجانسة العينات مع الخرز الزجاج لمدة 15 ق في الخالطون في درجة حرارة المختبر.
ملاحظة: عينة بشكل صحيح المتجانس تنتشر على السطح الداخلي كله من أنابيب قفل صندوق الأمانات. - أضف 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4)، بريكوليد إلى 4 درجات مئوية، للعينات من أجل استخراج فيكوبيليبروتينس.
ملاحظة: من هذه الخطوة، تبقى العينات على الجليد لمنع تدهور البروتينات المستخرجة. وهذا أمر بالغ الأهمية. - خلط العينات مع برنامج تلفزيوني ل 5 ق على الخالطون في درجة حرارة المختبر.
ملاحظة: بعد خلط، العينات مخضر. - بعد خلط، تبقى العينات على الجليد ل 60 دقيقة غطاء حمام الثلج مع غطاء لمنع تدهور أصباغ.
- بعد 60 دقيقة لاستخراج فيكوبيليبروتين، الطرد المركزي هذه العينات في س 15,000 ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إيلاء الاهتمام لتحقيق التوازن بشكل صحيح بين الدوار أجهزة الطرد المركزي.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، المادة طافية بلون أزرق سماوي.
4-فيكوبيليبروتين الكمي
- قبل أخذ القياس سبيكتروفوتوميتريك، معايرة جهاز المطياف الضوئي لخط الأساس باستخدام المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني كقرص فارغ.
- حالما يتم معايرة جهاز المطياف الضوئي، تجاهل برنامج تلفزيوني من واحد جهاز المطياف الضوئي ومبومو و "الماصة؛" المادة طافية مع فيكوبيليبروتينس المستخرج بدلاً من تجاهل المخزن المؤقت.
- قياس تركيز فيكوبيليبروتين سبيكتروفوتوميتريكالي، باستخدام عرض شق 0.5 نانومتر.
- قياس امتصاص فيكوسيانوبيلينس في phycocyanin واللوفيكوسيانين ضد برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت فارغاً في 615 نانومتر (615) و 652 نانومتر (652)، على التوالي، وقياس امتصاص الحطام الخلوية في 720 نانومتر (720).
- حساب تركيز phycocyanin واللوفيكوسيانين وفقا للمعادلات (1) و (2) من بينيت وبوجوراد12:
ملاحظة:615و652من720 ينبغي أن تناسب نطاق امتصاص الخطية جهاز المطياف الضوئي. إذا لزم الأمر، تخفف العينة مع المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني.
- إعادة حساب تركيز الصباغ في عينات الأصلي. يتوافق مع تركيز الصباغ في العينة مباشرة مع نتائج المعادلات (1) و (2) عندما تستخدم 1 مل ثقافة و 1 مل من المخزن المؤقت الاستخراج للتحليل. في حالة استخدام أحجام مختلفة من عينات البكتيريا الزرقاء و/أو برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت، يجب حساب تركيز الصبغة النهائية وفقا للمعادلة (3):
(3)
ملاحظة: في حالة تطبيع فيكوبيليبروتين محتوى كل خلية من الوزن الجاف، تركيز الصبغة النهائية ينبغي أن تحسب وفقا للمعادلة (4)
(4)
(3)
(4)5-تحديد الوزن الجاف الخلية (اختياري)
- تزن ثلاثة أنابيب قفل صندوق الأمانات فارغة على الأرصدة التحليلية.
تنبيه: من الأهمية بمكان أن الأنابيب قفل صندوق الأمانات جافة. في حالة تخزين الأنابيب في بيئة رطبة، جافة الأنابيب لعدة ساعات في تجميد مجفف قبل وزنها لهم. التعامل مع هذه الأنابيب برفق وإلا بأيدي القفاز خالية من مسحوق لتجنب أي اتصال بين المواد والأصابع للباحث. الحفاظ على جميع أصحاب والطرد المركزي نظيفة لتجنب نقل أي مواد للأنابيب. - عينة 1 × 15 مل تعليق الثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- الطرد المركزي تعليق الثقافة في الأنابيب المخروطية 15 مل في س 4,000 ز في درجة حرارة المختبر عن 10 دقيقة التوازن الدوار الطرد المركزي مع ثلاثة إضافية 15 مل مخروطية أنابيب، كل يحتوي على 15 مل من الماء. بعد الطرد المركزي، تجاهل 12 مل من المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه في المادة طافية المتبقية ونقل 3 × 1 مل المخلوط إلى ثلاثة أنابيب قفل صندوق الأمانات 1.5 مل مع ماصة. في حالة تبقى بعض بقايا من بيليه في أنبوب مخروطي 15 مل، إضافة 1.5 مل مياه إلى الأنبوبة المخروطية أو دوامة أو اهتزاز الأنبوب ريسوسبيند المتبقية بيليه، ونقل 3 × 0.5 مل المخلوط إلى أنابيب 1.5 مل قفل صندوق الأمانات الثلاث (الفعل كونتايني نانوغرام 3 × 1 مل بيليه) مع ماصة.
ملاحظة: تقسيم بيليه على ثلاثة أنابيب قفل صندوق الأمانات 1.5 مل سيسمح تقدير أي خطأ فني لقياس الوزن الجاف. - الطرد المركزي الخلايا في أنابيب 1.5 مل قفل صندوق الأمانات في س 15,000 ز في درجة حرارة المختبر ل 5 كحد أدنى من التوازن الدوار الطرد المركزي مع أنبوب قفل صندوق الأمانات 1.5 مل إضافي يحتوي على 1 مل من الماء. بعد الطرد المركزي، تجاهل في سوبيرناتانتس.
- وضع العينات في الثلاجة. للتخزين على المدى الطويل، تبقى العينات في-80 درجة مئوية؛ لتخزين قصيرة الأجل، من-20 درجة مئوية كافية.
- فريزيدري العينات بين عشية وضحاها. لعملية التجفيف سليم، والحفاظ على درجة حرارة المكثف مجفف التجميد أدناه-90 درجة مئوية والضغط في قاعة مجفف التجميد حول 1 hPa.
- وبعد التجميد، إغلاق الأنابيب ووزن العينات على الأرصدة التحليلية.
ملاحظة: يمكن استخدام قيمة الوزن الجاف لتطبيع فيكوبيليبروتين محتوى كل خلية من الوزن الجاف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للاختبارات الأولية الأسلوب، كان سينيتشوسيستيس المزروعة كثقافات دفعة في قوارير ارلينمييير على شاكر في BG11 زراعة متوسطة20 (تستكمل مع 17 ملم حبيس) في 25 درجة مئوية، وتحت ضوء أبيض حار كثافة 50 µmol (الفوتونات)/(m 2·s) ومع أول أكسيد الكربون 1%2 في الجو تثقيف. أثناء زراعة والثقافات أخذت عينات لقفل صندوق الأمانات أنابيب تثفيل (15,000 س ز في درجة حرارة المختبر لمدة 5 دقائق)، وتم تجاهل المادة طافية، والعينات كانت أما المخزنة في-80 درجة مئوية والمجفف كإعداد الخطوات الفردية لهذا البروتوكول أو المخزنة في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية للتحليل المقارن الاستخراج وكوانتيفيكيشنز.
تشمل إجراءات استخراج اختبار اضطراب خلية sonication، تجانس مع الخرز الزركونيا داخل المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني، وذوبان التجميد. ويرد في الشكل 1نتائج أساليب الاستخراج مختلفة. وقدم الأسلوب كما هو موضح في هذا البروتوكول فيكوبيليبروتينس أعلى غلة جنبا إلى جنب مع أدنى الكلوروفيل التلوث في المخزن المؤقت للاستخراج. الكلوروفيل اكتشفت في المخزن المؤقت لاستخراج عندما استخدمت سونيكاتيون لتعطيل الخلية. تكرار دورات التجميد والإذابة العينات في حمام الموجات فوق الصوتية على الجليد أدى إلى زيادة الغلات البروتين في المخزن المؤقت لاستخراج. بيد في الوقت نفسه، تركيز الكلوروفيل في المخزن المؤقت لاستخراج زيادة (الشكل 1 الإطار الداخلي)، الذي استبعد إجراء تقييم كمي محتوى فيكوبيليبروتين سليم.
كان الوقت الأمثل التجانس تجانس س. 15 على حد سواء أقصر (5 s) وأطول (20 ق) قدمت فترات أقل بشكل طفيف فيكوبيليبروتين الغلال، كما هو مبين في الشكل 2. المجانسة الخلايا مع حبات زجاجية قطرها 2 مم نتج عن غلات أعلى بالمقارنة مع الزجاج الخرز ليبلغ قطرها 0.5 ملم أو 1 ملم أو 4 مم، مع حبات الزركونيا قطرها 0.5 ملم، أو مع الحبوب رمال البحار. تم اختبار برنامج تلفزيوني استخراج المخزن المؤقت كالمخزن المؤقت المثلى لاستخراج فيكوبيليبروتينس (الشكل 3). إضافة كلوريد الصوديوم 100 مم أو 150 مم بوكل للمخزن المؤقت برنامج تلفزيوني أو للمياه لم يؤد إلى زيادة كفاءة استخراج فيكوبيليبروتين، ونفس ذهب لاستخدام المخزن المؤقت خلات الصوديوم 20 مم لاستخراج (الشكل 3). وقت استخراج فيكوبيليبروتين الأمثل يرجع إلى 60 دقيقة، بعد المزيد من الوقت (يصل إلى 240 دقيقة)، تركيز فيكوبيليبروتين في المخزن المؤقت لاستخراج لم تتغير كثيرا (الشكل 4).
ونحن أيضا اختبار النطاق الخطي جهاز المطياف الضوئي لقياس فيكوبيليبروتين (الشكل 5) ومقارنة عدة معادلات للتقدير الكمي فيكوبيليبروتين، باستخدام معايير phycocyanin واللوفيكوسيانين (الشكل 6). جهاز المطياف الضوئي المستخدمة في هذا البروتوكول وأظهرت مجموعة امتصاص خطية بين 0.1-3.0 (الشكل 5). منذ استخراج أطياف البروتين قد استيعابه القصوى حوالي 620 نانومتر (620)، وفي 652 نانومتر، الاستيعاب (652) كان 33 في المائة فقط من620 (الشكل 7)، الخطي جهاز المطياف الضوئي ل652 (بحد أقصى تم اختبار امتصاص اللوفيكوسيانين) حتى652 من 1.16 فقط. المعادلات (1) وقدم12 (2) من بينيت وبوجوراد التعمير أفضل المعايير phycocyanin واللوفيكوسيانين بين جميع المعادلات المختبرة (الشكل 6). كان سيظهر ستربتوميسين سلفات، واستخدمت في العديد من الدراسات السابقة للقضاء على غشاء الأجزاء التي تحتوي على الكلوروفيل ، كما ليس من الضروري للاستخراج (الشكل 7).
للتجربة التمثيلية، سينيتشوسيستيس كانت تزرع في فوتوبيوريكتور25 في نظام توربيدوستات، حيث تم الاحتفاظ بالخلايا في مرحلة النمو الهائل في نطاق محدد من الكثافة البصرية (مقيسة عند 680 نانومتر، OD 680) بإضعاف الخاضعة للرقابة زراعة جديدة متوسطة (متوسطة BG11 مخزنة مع 17 مم هيبيس)11،26. الثقافات كانت تزرع في 32 درجة مئوية والهواء المدخلات الواردة 0.5% CO2. الثقافات كانت مضيئة مع ضوء الأحمر (λmax: 633 نانومتر، λ1/2: 20 نانومتر) كثافة µmol 25-1100 (الفوتونات)/(م2·s)، جنبا إلى جنب مع ضوء أزرق (λmax: 445 nm, λ1/2: 20 نانومتر) كثافة 25 µmol ( الفوتونات)/(·s م2). وتم قياس الكثافة البصرية لتعليق الثقافة بقاعدة فوتوبيوريكتور، وتم تعيين مجموعة من التفجير المكشوف680 إلى 0.52-0.58 (2 × 107 إلى 4 × 107 خلايا/مل). كانت تزرع الثقافات تحت كل شدة الضوء محددة لمدة 24 ساعة على الأقل لتوفير ما يكفي من الوقت للتأقلم. وبعد التوصل إلى استقرار النمو، أخذت عينات الثقافات للوزن الجاف (وفقا للخطوات 2.1-2.8 من هذا البروتوكول) وعدد الخلايا ومحتوى phycocyanin واللوفيكوسيانين. وترد نتائج التقييم فيكوبيليبروتين تحت زيادة كثافة الضوء في الشكل 8. وانخفض سينيتشوسيستيس محتوى فيكوبيليبروتين من 12 في المائة وزن الجاف الخلوية (505 جي في الخلية) تحت الإشعاع أدنى إلى 3 في المائة وزن الجاف الخلوية (280 جي في الخلية) تحت الإشعاع أعلى.
الشكل 1 : مقارنة بين كفاءة الاستخراج من الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول مع عدة أساليب مرجعية. وتم قياس تركيز phycocyanin (أشرطة سوداء) واللوفيكوسيانين (أشرطة بيضاء) في استخراج البروتين الخام بعد الاستخراج في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني عن 60 دقيقة الأسلوب A يرد ضمن هذا البروتوكول. تعديل الأسلوب B كما يلي: بعد الحصاد، كانت الخلايا تثفيل (15,000 س ز في درجة حرارة المختبر لمدة 5 دقائق) وتخزينها في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. كانت سونيكاتيد العينات المجمدة ل 120 s عند 4 درجة مئوية، وفيكوبيليبروتينس استخرجت في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني لتعديل الحد الأدنى 60 أسلوب ج من الأسلوب ب عن طريق تخزين الكريات الخلايا المقطوع في-80 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، التجميد الكريات الخلوية ، وإضافة المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني للكريات الجافة. د الأسلوب تعديل من تشونغ وآخرون. 16: بعد التجميد (نفس كما هو الحال في أسلوب ج)، 0.25 مل خلات نا مع 1% ستربتوميسين سلفات المخزن المؤقت (pH 5.5) أضيفت إلى بيليه الخلوية الجافة، جنبا إلى جنب مع 0.25 مل حبات الزركونيوم (يبلغ قطرها 0.5 ملم)، وكانت تجانس العينات مرتين 60 ثانية على الخالطون. بعد التجانس، آخر مل 0.5 من خلات نا مع ستربتوميسين 1% كبريتات المخزن المؤقت (pH 5.5) أضيفت إلى العينة والأنابيب فورتيكسيد وتم استخراج البروتينات على الجليد ل 30 دقيقة أسلوب ه تتكون من دورة واحدة في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني ذوبان التجميد و استخراج البروتين عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية. و أسلوب (الرقم الداخلي) تتألف من واحد وست دورات تجميد الخلايا (في البداية، المجفف وحراكه في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني) في النتروجين السائل، تليها سونيكيشن على الجليد. سبب الكلوروفيل كبيرة وجود في استخراج البروتين الخام، كمياً فيكوبيليبروتينس كانت لا داخل الأسلوب f. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. وقد حسبت التركيزات الصباغ وفقا للمعادلات (1) و (2) من هذا البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تأثير الوقت التجانس على كفاءة الاستخراج فيكوبيليبروتين. وتعطلت الكريات المجففة بالتبريد للخلايا سينيتشوسيستيس (وفقا للخطوات 3.1 3.5 من هذا البروتوكول) مع حبات الزجاج على الخالطون ل 5 ق، 15 s، و 20 s. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : فيكوبيليبروتين كفاءة الاستخراج في المخازن المؤقتة لاستخراج مختلف. استخرجت في فيكوبيليبروتينس في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني وفي المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني مع إضافة كلوريد الصوديوم 100 مم أو 150 مم بوكل، في المياه مع كلوريد الصوديوم 100 مم أو 150 مم بوكل، وفقا هيملاتا وفرحة22، وفي خلات الصوديوم 20 مم حسب تشونغ وآخرون . 16-تم إجراء الاستخراج في 4 درجات مئوية وفقا للخطوات 4، 4، 1-3 من هذا البروتوكول. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : فيكوبيليبروتين الاستقرار في المخزن المؤقت للاستخراج في وقت. بعد هذا الإجراء استخراج، يؤديها كما هو موضح في الخطوات 4، 4، 1-3 من هذا البروتوكول، تم تخزين استخراج فيكوبيليبروتين في برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) عند 4 درجة مئوية ليصل إلى 4 ساعات، مع عدم وجود phycocyanin كبيرة (الدوائر) وتدهور اللوفيكوسيانين (المربعات). خط متقطع يمثل الخطية تناسب النقاط الزمنية المحسوبة بطريقة المربعات الصغرى. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الممثل قياسات التركيزات phycocyanin واللوفيكوسيانين في سينيتشوسيستيس. تعليق ثقافة كثيفة (phycocyanin: 456 ميكروغرام/مل، اللوفيكوسيانين: 106 ميكروغرام/مل) قد تضعف تدريجيا حتى تركيز 19 ميكروغرام/مل لكل من phycocyanin واللوفيكوسيانين. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. ويمثل الخط المنقط تناسب خطي نقاط تركيز تحسب بطريقة المربعات الصغرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : تقدير تركيزات phycocyanin واللوفيكوسيانين في المعايير أصباغ. وتم قياس محتوى phycocyanin واللوفيكوسيانين في المعايير الصباغ سبيكتروفوتوميتريكالي وفقا لمعادلات بينيت وبوجوراد12، Lüder وآخرون. 13سامباث إيلي ونفس15، إيفانز14وتشونغ وآخرون. 16-محتوى البروتين في المعايير (حسب الضرورة لتحديد فيكوبيليبروتينس) كان كمياً باستخدام حل من حمض بيسينتشونينيك، وكربونات الصوديوم، طرطرات الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم في هيدروكسيد الصوديوم N 0.1 (مع الرقم الهيدروجيني نهائي من 11.25)، في رد فعل مع النحاس الثنائي 4% (w/v) كبريتات بينتاهيدراتي27، استخدام ألبومين المصل البقري بروتين قياسية. المعادلات بينيت وبوجوراد قدم التعمير أعلى من كلا أصباغ: 96% phycocyanin القياسية و 99 ٪ من اللوفيكوسيانين القياسية. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. خط متقطع يسلط الضوء على هذه النقطة 100%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : استخراج أثر ستربتوميسين سلفات على طيف امتصاص البروتين الخام في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. (أ) الاستخراج الإجراء كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.3 من هذا البروتوكول أو (ب) استخدام سونيكاتيون كما هو موضح في أسطورة الرقم 1 "الأسلوب و" أنجز في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (الدوائر) وفي برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت تستكمل مع 1% كبريتات ستربتوميسين (المربعات). تم إجراء التقدير الكمي فيكوبيليبروتين وفقا للخطوات 5، 1-5، 4 من هذا البروتوكول. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : تركيز phycocyanin (دوائر) واللوفيكوسيانين (المربعات) في سينيتشوسيستيس المزروعة تحت الضوء الأحمر-البرتقالي كثافة µmol(photons)/(m2·s) 25-1100. الثقافات سينيتشوسيستيس كانت تزرع في فوتوبيوريكتور عند 32 درجة مئوية، مع 0.5% CO2 في الهواء الإدخال، في BG11 زراعة المتوسطة وتستكمل مع 17 ملم حبيس في نظام توربيدوستات حسب زافريل et al. 11-تم قياس تركيزات فيكوبيليبروتين وفقا لهذا البروتوكول ومحتوى فيكوبيليبروتين النهائي كان تطبيع كل الوزن الجاف الخلوية، كما هو موضح في القسم 2 من هذا البروتوكول. وتمثل الخطوط المتقطعة تناسب الطاقة النقاط المقاسة، تحسب بطريقة المربعات الصغرى. تمثل القيم يصور المتوسطات من replicates التقنية الثلاث، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة واستنساخه للتحديد الكمي لمحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم نموذج سينيتشوسيستيس. تتم مقارنة عدة طرق لتجانس الخلية واستخراج البروتين والكمي phycocyanin واللوفيكوسيانين، والبروتوكول النهائي يمثل مزيجاً من الخطوات المثلى لكل إجراء واحد. كبيانات تمثيلية، كان كمياً محتوى فيكوبيليبروتينس في الخلايا سينيتشوسيستيس تحت زيادة كثافة الضوء. على الرغم من أن التحليل يتطلب وقتاً مماثلاً والمعدات المختبرية كبعض الأساليب المنشورة سابقا12،13،14،،من1516، الاستفادة من هذا البروتوكول ويمكن تقدير أن لا يوجد الكلوروفيل يتم تحريرها في المخزن المؤقت الاستخراج، ومن ثم قياس فيكوبيليبروتين بدقة عالية.
يمكن أن تختلف كمية تعليق الخلية المطلوبة لتحليل فيكوبيليبروتين مع كثافة الثقافة. حجم العينة 1 مل هو الأمثل للثقافات مع OD730 من 1.5، كثافة خلية 2 × 10 تقريبا7 خلايا/مل، أو للثقافات ذات محتوى فيكوبيليبروتين من حوالي 20 مغ/لتر. وفي حالة الثقافات المخفف، حصاد حجم ثقافة أكبر. من ناحية أخرى، في حالة الثقافات كثيفة، والحصاد على ثقافة أقل حجم في ثقافات عالية الكثافة، وهناك خطر أن تظل فيكوبيليبروتينس جزئيا في الخلايا بعد الاستخراج. وبالمثل، يمكن أن تختلف كمية تعليق الخلية المطلوبة لتحديد الوزن الجاف مع كثافة الثقافة. حجم العينات 15 مل هو الأمثل للثقافات مع OD730 1.5 أو مع كثافة خلية 2 × 10 تقريبا7 خلايا/مل. مع انخفاض كثافة الثقافات أو بكميات أقل، يمكن زيادة الخطأ القياس. على العكس من ذلك، توفير كميات أكبر من الثقافة أو الثقافات أكثر كثافة أفضل أسلوب القرارات.
خطوات حاسمة للبروتوكول يتم استخراج التجانس وفيكوبيليبروتين الخلية التي ينبغي أن توفر عالية الغلة وخصوصية عالية. تحقق أعلى مستوى من الغلال ونقاء المقتطفات مع الحفاظ على البروتين الحد الأقصى المتزامن بالتجميد العينات والمجانسة الكريات الخلايا الجافة بالزجاج الخرز، وأداء استخراج فيكوبيليبروتين في برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت ( الشكل 1). منذ حتى تلوث صغير من استخراج البروتين الخام من الكلوروفيل يمكن أن يؤدي إلى المبالغة في تقدير فيكوبيليبروتين محتوى، من الضروري تجنب أي الكلوروفيل استخراج عن طريق إضافة المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني. الكلوروفيل اكتشفت في استخراج النفط الخام عندما استخدمت سونيكاتيون لتعطيل الخلية. كما هو مبين في الإطار الداخلي ل الشكل 1، مع تكرار دورات سونيكيشن، وكمية الكلوروفيل في استخراج زيادة. من ناحية أخرى، استخراج الكمية البروتينات (كما الكشف عنها بواسطة امتصاص في 280 nm) زادت أيضا بعد تكرار دورات sonication. ولذلك، يبدو أن استخدام سونيكيشن (بالاقتران مع دورات ذوبان التجميد في النيتروجين السائل) كطريقة مناسبة لاستخراج البروتين الكلي (تم إصدارها البروتينات الحرة والغشاء زمنياً من الخلايا)؛ ومع ذلك، لا ينصح غرض التقدير الكمي سبيكتروفوتوميتريك فيكوبيليبروتين. تشونغ وآخرون. وأوصى باستخدام 1% ستربتوميسين سلفات بغية القضاء على أجزاء الغشاء مع الكلوروفيل16. هنا، يبدو استخدام سلفات ستربتوميسين لا يكون ضروريا نظراً لأنه لم يؤد إلى الحد من الكلوروفيل في استخراج البروتين (الشكل 7). حتى ولو سونيكاتيون واحد دورة عن 120 s عدم تعطيل الخلايا كفاءة (طرق ب وج، الشكل 1)، أكدت طرق أخرى (مثلاً، الأسلوب و النحو المبين في الشكل 1 أو الأساليب التي عرضت في الشكل 7B) النتائج السابقة من سونيكيشن يجري كفاءة خلية تعطيل أسلوب22،28. من ناحية أخرى، تقدم دورات ذوبان تجميد بسيطة، كما سبق وذكرت كطريقة فعالة لاستخراج فيكوبيليبروتينس22،28، غلة أدنى في الاختبارات الموصوفة هنا (أسلوب ه، الرقم 1 ). خلية التجانس (داخل المخزن المؤقت الاستخراج، 2 × 60 ثانية) من الزركونيوم الخرز تم اختباره كأقل كفاءة من تجانس 15-إس بيليه الخلوية المعصوفه (أسلوب د، الشكل 1). ووصفت الإجراء التجانس داخل المخزن المؤقت الاستخراج سابقا مع أطول تجانس وقت (10 دقيقة)29. ونحن لا اختبار التجانس لمدة أطول من 2 دقيقة منذ العينات تسخينه إلى حد كبير أثناء كل دورة التجانس. في الأدب، أساليب تعطيل خلية أخرى وصفت أيضا، بما في ذلك الاستفادة من الصحافة الفرنسية16 أو شركة13،،من1530؛ ومع ذلك، لم يتم اختبار هذه الأساليب في هذه الدراسة.
وأجرى استخراج البروتين لمدة 15 ثانية (الشكل 2) في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. وكان الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت 7.4، الذي ذكر سابقا المثلى ل استخراج فيكوبيليبروتين22. إضافة كلوريد الصوديوم أو بوكل لم يحسن كفاءة الاستخراج فيكوبيليبروتين (الشكل 3)، وهو يتناقض مع الملاحظات السابقة22. ومع ذلك، كما هو مبين في الشكل 3، المحلول الملحي مخزنة الفوسفات المستخدمة في هذا البروتوكول الواردة 154 مم كلوريد الصوديوم (بالإضافة إلى 5.6 ملم Na2هبو4 و 1 مم خ2ص4)، التي لم تسمح لنا إقامة خالية من كلوريد الصوديوم PBS استخراج المخزن المؤقت كعنصر تحكم. كما قارنا المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني وخلات الصوديوم المخزن المؤقت16 استخراج الكفاءة. وقدمت المزيج من فوسفات الصوديوم والبوتاسيوم الفوسفات داخل المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني فيكوبيليبروتينس أعلى غلة (الشكل 3). تتفق هذه النتيجة مع النتائج السابقة من هيملاتا وآخرون. 22.
وكان الأمثل وقت استخراج فيكوبيليبروتين h. 1 استخراج أطول لا يؤدي إلى فيكوبيليبروتين كبيرة التدهور أو استخراج التحسين (الشكل 4)، التي تقابل مع الأعمال السابقة التي لاورينز وآخرون. 28-لاستخراج وقت أقصر مما كان لم تختبر ح 1. وبالمثل، كان لم تختبر استخراج لأكثر من 4 ح حيث اتضح سابقا أن فيكوبيليبروتينس المستخرج في المخزن المؤقت للفوسفات مستقرة لمالا يقل عن 48 ح28.
نحن مقارنة عدة معادلات للقياس الكمي phycocyanin واللوفيكوسيانين سبيكتروفوتوميتريك كما هو موضح سابقا في الأدب، بإعادة حساب محتوى كلا فيكوبيليبروتينس في المعايير التجارية مع البروتين المعروفة تركيزات (الشكل 6). وقد تحقق التعمير أفضل كلا أصباغ مع معادلات بينيت وبوجوراد12. هذه النتيجة لم تكن محددة للفوسفات المخزن المؤقت الاستخراج ومنذ هذا المخزن مؤقت المستخدمة سابقا12،،من1315. لم تكن محددة بمعايير الصباغ منذ الفرق بين615،618و620 (الأطوال الموجية المستخدمة لتقدير phycocyanin في الأعمال السابقة) في phycocyanin القياسية كان 1% والفرق بين 650 و652 (الأطوال الموجية المستخدمة سابقا اللوفيكوسيانين تقدير12،13،،من1416) كانت 3 في المائة في اللوفيكوسيانين القياسية. وبالمثل، كان الفرق بين615 و620 في استخراج البروتين من سينيتشوسيستيس 2% فقط. لا تؤدي هذه الاختلافات الصغيرة في أطياف امتصاص اختلاف صبغة نهائية لتصل إلى 36% (الشكل 6). ولذلك، الاختلافات بين المعادلات الفردية بدلاً من ذلك متصلة بالاختلافات في معاملات انقراض فيكوبيليبروتين من الكائنات المحددة12،،من1314، 15 , 16 , 17-من المثير للاهتمام، معادلات تشونغ وآخرون. قدم التعمير phycocyanin أدنى (الشكل 6) على الرغم من أن المؤلفين أيضا تستخدم سينيتشوسيستيس لتلك التجارب16.
بدلاً من تحديد أطوال موجية وحيد، من المستحسن لقياس طيف مستمر من استخراج فيكوبيليبروتين بين 280-720 نانومتر، لتقدير وجود الكلوروفيل في النص المقتبس، التي يمكن أن تتداخل مع كل اللوفيكوسيانين وامتصاص phycocyanin. وعلاوة على ذلك، عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر (280)، ودرجة نقاء phycocyanin (/A615280 أو &/A620280)21،22 واللوفيكوسيانين (652&/A280) يمكن تقدير 24 في الاستخراج (0.7: الغذاء الصف، 3.9: الصف التفاعلي، > 4.0: الصف التحليلية)21.
كبيانات تمثيلية، تقرر تركيز phycocyanin واللوفيكوسيانين في سينيتشوسيستيس تحت زيادة كثافة الضوء. المحافظة على كثافة الثقافة عند مستوى ثابت داخل نظام زراعة توربيدوستات11،21 ضروري للتجربة المقارنة المباشرة. Phycocyanin واللوفيكوسيانين من 2.4 إلى 10.2% و 0.6%-1.7 في المائة وزن الجاف الخلوية، على التوالي، كانت التركيزات مماثلة كالقيم المبلغ عنها سابقا11،،من3132. أيضا، كان أساس كل خلية فيكوبيليبروتين محتوى مماثلة كما ذكرت سابقا11،33. مع تزايد الضوء، انخفض محتوى فيكوبيليبروتينس. من المثير للاهتمام، وحتى تحت ضوء كثافة أعلى من 1100 µmol (الفوتونات)/(م2·s)، فيكوبيليبروتينس لم تكن أبيض تماما.
البروتوكول يتطلب المعدات القياسية فقط وسريع نسبيا، فإنه يمكن اعتماد أي المختبرات التي يتم تحليلها بشكل روتيني فيكوبيليبروتينس بسهولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
واعتمد البروتوكول منشور سابق11. ت. Č ز.، والفصل دال، وياء-حظيت بوزارة التربية والتعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية ضمن "البرنامج الوطني للاستدامة" وأنا (نبو أنا)، منح رقم LO1415. ج. Č. كما أيده GA CR، رقم المنحة 18 24397S. وأيد البنية التحتية البحثية التشيكية لبيولوجيا الأنظمة C4SYS (المشروع لا LM2015055) إمكانية الوصول إلى الأدوات والمرافق الأخرى. م. أ. س. أيد على منحة من "مؤسسة العلوم الروسية" [رقم 14-14-00904].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
