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Biochemistry

Cyanobacterium Synechocystis में Phycobiliprotein सामग्री का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक निर्धारण

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/58076
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1
1Department of Adaptive Biotechnologies, Global Change Research Institute, Czech Academy of Sciences, 2Department of Plant Physiology, Faculty of Science, Masaryk University, 3Laboratory of Intracellular Regulation, Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

Summary

यहाँ, हम एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक पद्धति का उपयोग करते हुए cyanobacterium Synechocystis में phycobiliprotein सामग्री को मात्रात्मक रूप से निर्धारित करने के लिए कोई प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. निष्कर्षण प्रक्रिया भी सफलतापूर्वक अंय cyanobacteria और शैवाल उपभेदों के लिए लागू किया गया था; हालांकि, वर्णक अवशोषण स्पेक्ट्रा में भिन्नता के कारण, यह व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक तनाव के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक समीकरणों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है ।

Abstract

यह मॉडल cyanobacterium Synechocystisमें phycobiliprotein सामग्री के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल है । Phycobiliproteins phycobilisomes के सबसे महत्वपूर्ण घटक हैं, cyanobacteria और कई शैवाल taxa में प्रमुख प्रकाश संचयन एंटेना । Synechocystis के phycobilisomes में दो phycobiliproteins होते हैं: phycocyanin और allophycocyanin. इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सरल, कुशल, और इस मॉडल cyanobacterium में दोनों phycocyanin और allophycocyanin के मात्रात्मक निर्धारण के लिए विश्वसनीय विधि । हम phycobiliprotein निष्कर्षण और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ठहराव के कई तरीकों की तुलना में । इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में निष्कर्षण प्रक्रिया भी सफलतापूर्वक Cyanothece sp जैसे अंय cyanobacteria उपभेदों के लिए लागू किया गया था ।, Synechococcuselongatus, Spirulina एसपी., Arthrospira एसपी., और Nostoc एसपी., साथ ही लाल शैवाल को Porphyridium cruentum. हालांकि, विभिन्न taxa से विशिष्ट phycobiliproteins के विलुप्त गुणांक अलग कर सकते हैं और यह है, इसलिए, हर एक तनाव के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ठहराव विधि व्यक्तिगत रूप से मान्य करने के लिए अनुशंसित. प्रोटोकॉल थोड़ा समय की आवश्यकता है और किसी भी मानक जीवन विज्ञान प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है क्योंकि यह केवल मानक उपकरण की आवश्यकता है ।

Introduction

fPhycobiliproteins पानी में घुलनशील वर्णक-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं जो prokaryotic cyanobacteria (Cyanophyta) में प्रकाश संचयन एंटीना के प्रमुख घटकों का प्रतिनिधित्व करते हैं और कई eukaryotic taxa (Glaucophyta, Rhodophyta , और Cryptophyta)1. वे मुख्य रूप से phycobilisomes बुलाया supramolecular परिसरों के रूप में होते हैं और वे आम तौर पर stromal ओर संश्लेषक झिल्ली की सतह से जुड़े रहे हैं, Cryptophytaके अपवाद के साथ, जहां phycobiliproteins में स्थानीयकृत रहे हैं thylakoid लुमेन2. phycobiliproteins के चार प्रकार की तारीख तक की पहचान की गई है: कोर allophycocyanin, और परिधीय phycocyanin, phycoerythrin, और phycoerythrocyanin1। मुख्य प्रकाश कटाई परिसरों के रूप में, phycobilisomes शैवाल और cyanobacteria जन संस्कृतियों उत्पादकता के महत्वपूर्ण कारकों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह प्रदर्शित किया गया है कि phycobilisomes जनचेतना मजबूत प्रकाश3के तहत बायोमास संचय में वृद्धि कर सकते हैं । दूसरी ओर, मामूली या कम विकिरण के तहत, एंटीना जनचेतना वृद्धि दर और बायोमास संचय में कमी के परिणामस्वरूप3,4. Phycobiliproteins व्यावसायिक रूप से खाद्य colorants, फार्मास्यूटिकल्स के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, और खाद्य additives, कॉस्मेटिक उद्योग में, और प्रवाह cytometry, फ्लोरोसेंट immunoassays, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी5में आवेदनों के साथ प्रतिदीप्ति जांच के रूप में ।

इस प्रोटोकॉल मॉडल cyanobacterium Synechocystisमें phycobiliproteins के मात्रात्मक निर्धारण पर केंद्रित है । Cyanobacteria हैं जल्द आक्सीजन संश्लेषक autotrophs; वे २,४००,०००,००० से अधिक6वर्षों के लिए किया गया है पृथ्वी जैव मंडल के गठन । वे नाइट्रोजन, कार्बन, ऑक्सीजन, और अंय तत्वों के वैश्विक biogeochemical चक्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । cyanobacteria में, एक कोशिकीय तनाव Synechocystis एक अद्वितीय स्थिति प्राप्त के बाद से यह पूरा जीनोम7,8अनुक्रम के साथ पहली cyanobacterium था, यह स्वाभाविक रूप से exogenous डीएनए9द्वारा रूपांतरित है, और यह स्थिर और अपेक्षाकृत तेजी से वृद्धि10,11करता है । Synechocystisमें, कोर एंटीना घटक, allophycocyanin, अभिंन झिल्ली प्रोटीन के साथ जुड़ा हुआ है, और संलग्न phycocyanin thylakoid झिल्ली परिधि पर स्थित है ।

phycobiliprotein निष्कर्षण और ठहराव के लिए कई तरीके इस प्रोटोकॉल के भीतर की तुलना में हैं । अंतिम निष्कर्षण प्रक्रिया Synechocystisकरने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था, साथ ही Cyanothece sp सहित अन्य cyanobacteria उपभेदों के लिए, Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira एसपी., और Nostoc sp., और यह भी सफलतापूर्वक लाल शैवाल Porphyridium cruentumके लिए लागू किया गया था । इसलिए, इस प्रोटोकॉल में विकसित विधि phycobiliprotein निष्कर्षण के लिए एक सार्वभौमिक विधि के रूप में माना जा सकता है । हालांकि परीक्षण निष्कर्षण तरीकों में से कुछ उच्च कुल प्रोटीन पैदावार के परिणामस्वरूप, यहां वर्णित निष्कर्षण प्रक्रिया क्लोरोफिल के सबसे कम सामग्री के साथ एक साथ उच्चतम phycobiliprotein पैदावार प्रदान की एक अवशेष में phycobiliprotein निकालें । क्लोरोफिल की सामग्री को कम करना एक सही phycocyanin और allophycocyanin स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ठहराव के लिए आवश्यक था ।

phycobiliprotein अवशोषण स्पेक्ट्रा विभिंन शैवाल और cyanobacteria प्रजातियों के बीच काफी भिंन हो सकते है12,13,14,15,16,17 और यहां तक कि एक एकल cyanobacteria जीनस18के कई उपभेदों के बीच । इसलिए, विशिष्ट तरंग दैर्ध्य और अवशोषण गुणांक Synechocystis में phycocyanin और allophycocyanin के निर्धारण के लिए उपयोग के रूप में आम तौर पर अन्य उपभेदों के लिए लागू नहीं हैं. इसके अतिरिक्त, Synechocystis phycoerythrin और phycoerythrocyanin कि कुछ अंय शैवाल और cyanobacteria में पाया जा सकता है शामिल नहीं है । Synechocystisके अलावा अंय उपभेदों में phycobiliproteins के निर्धारण के प्रयोजन के लिए, यह एक अलग तनाव के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक समीकरणों का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है ।

हालांकि प्रोटोकॉल दो अब कदम है (रात भर रुक-सेलुलर छर्रों और 1 घंटे के प्रोटीन निष्कर्षण के सुखाने), phycobiliproteins ठहराव के लिए कुल श्रम समय 2 घंटे से अधिक नहीं है ।

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Protocol

1. Cyanobacteria खेती

  1. Erlenmeyer कुप्पी में या photobioreactors10,19 में बफ़र्ड BG11 मध्यम20 में Synechocystis कोशिकाओं की खेती करने के लिए एक पीएच बनाए रखने के लिए < 10 (जैसे, 17 मिमी HEPES10का उपयोग कर).
    नोट: मानक खेती की स्थिति एक नियंत्रित तापमान (आम तौर पर, 30 डिग्री सेल्सियस, इष्टतम तापमान ३५ डिग्री सेल्सियस)21, रोशनी (आमतौर पर, ८०० µmol [फोटॉनों]/[एम2· s] के लिए एक तीव्रता के एक सफेद प्रकाश की आवश्यकता है)21, और एक सह 2 आपूर्ति (४०० मिलीलीटर फ्लैट पैनल photobioreactor में, वृद्धि संतृप्त सह2 एकाग्रता १,७०० पीपीएम है)21।
  2. संस्कृति घनत्व निर्धारित करने के लिए, ७३० एनएम (आयुध डिपो७३०) पर संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व spectrophotometrically मापने 1 सेमी की एक प्रकाश पथ के साथ एक cuvette का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल का उपयोग कर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गणना काउंटर.

2. नमूनों की तैयारी

  1. phycobiliprotein क्षरण को रोकने के लिए कम विकिरण के तहत काम करें ।
  2. फसल 3 एक्स 1 मिलीलीटर संस्कृति निलंबन के लिए सुरक्षित-ताला ट्यूब । माप में तकनीकी त्रुटियों के आकलन के लिए triplicates का उपयोग करें । बाँझ शर्तों के तहत संस्कृति नमूना प्रदर्शन करने के लिए, एक लामिना हूड में कोशिकाओं फसल और उचित काम और सुरक्षा प्रथाओं का पालन करें ।
  3. 5 मिनट के लिए प्रयोगशाला के तापमान पर १५,००० x g में कोशिकाओं के केंद्रापसारक ठीक से संतुलित केंद्रापसारक रोटर पर ध्यान देना । केंद्रापसारक के बाद, supernatants त्यागें । हो गोली परेशान नहीं यकीन है ।
  4. नमूनों को फ्रीजर में रख दें । लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें । इस phycobiliprotein क्षरण को रोकने के लिए आवश्यक है । अल्पकालिक भंडारण के लिए,-20 डिग्री सेल्सियस पर्याप्त है ।
  5. फ्रीज-नमूने रातोंरात सूखी । एक उचित फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के लिए, फ्रीज के तापमान-ड्रायर संघनित्र नीचे-६० ° c और 1 hPa के आसपास फ्रीज ड्रायर चैंबर में दबाव रखने के लिए ।
  6. फ्रीज-सुखाने चक्र खत्म करने के बाद, हवा से पानी के पुनर्अवशोषण को रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके ट्यूब बंद ।

3. सेल Homogenization और pigments निष्कर्षण

  1. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए (2 मिमी के एक व्यास के साथ) कांच के मोती के चार टुकड़े जोड़ें और ट्यूबों को बंद करें ।
    नोट: जब homogenization के लिए इस्तेमाल किया सुरक्षित लॉक ट्यूब का ढक्कन बहुत पतली है, यह homogenization के दौरान टूट सकता है; इसलिए, मजबूत ढक्कन के साथ केवल सुरक्षित लॉक ट्यूबों इस प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।
  2. एक homogenizer पर प्रयोगशाला के तापमान पर 15 एस के लिए कांच के मोतियों के साथ नमूनों को Homogenize ।
    नोट: एक ठीक से homogenized नमूना सुरक्षित ताला ट्यूबों के पूरे भीतरी सतह पर फैला हुआ है ।
  3. phycobiliproteins निकालने के लिए नमूनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक ठंडा, पंजाबियों बफर (पीएच ७.४) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: इस कदम से, बर्फ पर नमूनों को निकाले गए प्रोटीन के क्षरण को रोकने के लिए रखें । यह महत्वपूर्ण है ।
  4. homogenizer पर प्रयोगशाला के तापमान पर 5 एस के लिए पंजाब के साथ नमूनों को मिलाएं ।
    नोट: मिश्रण के बाद, नमूनों हरा कर रहे हैं ।
  5. मिश्रण के बाद, ६० मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रखने के लिए एक ढक्कन के साथ बर्फ स्नान कवर pigments क्षरण को रोकने के लिए ।
  6. phycobiliprotein निष्कर्षण के ६० मिनट के बाद, 5 मिनट के लिए 4 ° c पर १५,००० x g पर नमूनों को ठीक केंद्रापसारक रोटर संतुलन के लिए ध्यान देना ।
    नोट: इस केंद्रापसारक के बाद, supernatant एक सियान नीला रंग है ।

4. Phycobiliprotein ठहराव

  1. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप से पहले, एक रिक्त के रूप में पंजाबियों बफर का उपयोग कर आधारभूत करने के लिए spectrophotometer जांचना ।
  2. एक बार spectrophotometer पर तुले हुए हैं, तो एक spectrophotometer cuvette से पंजाबियों को त्यागें और supernatant के बजाय निकाली गई phycobiliproteins के साथ पिपेट के साथ छोड़ दिया बफर ।
  3. phycobiliprotein एकाग्रता spectrophotometrically मात्रा, ०.५ एनएम के एक भट्ठा चौड़ाई का उपयोग कर ।
    1. ६१५ एनएम (एक६१५) और ६५२ एनएम (एक६५२), क्रमशः में phycocyanin और allophycocyanin में phycocyanobilins के अवशोषण को मापने के लिए सेलुलर मलबे के अवशोषण को मापने के लिए ७२० एनएम (एक७२०) ।
    2. समीकरण (1) और बेनेट और Bogorad12के (2) के अनुसार phycocyanin और allophycocyanin की एकाग्रता की गणना:
      Equation 1
      Equation 2
      नोट: a६१५, a६५२और एक७२० spectrophotometer के रेखीय अवशोषक श्रेणी के लिए फ़िट होना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो पंजाबियों बफर के साथ नमूना पतला ।
  4. मूल नमूनों में वर्णक एकाग्रता पुनर्गणना । नमूने में वर्णक एकाग्रता समीकरणों के परिणाम (1) और (2) जब संस्कृति के 1 मिलीलीटर और निष्कर्षण बफर के 1 मिलीलीटर विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है के साथ सीधे से मेल खाती है । cyanobacteria नमूनों और/या पंजाबियों बफर के विभिन्न संस्करणों का उपयोग करने के मामले में, अंतिम वर्णक एकाग्रता समीकरण के अनुसार गणना की जानी चाहिए (3):
    Equation 33
    नोट: सेल सूखी वजन के अनुसार एक सामान्य phycobiliprotein सामग्री के मामले में, अंतिम वर्णक एकाग्रता समीकरण के अनुसार गणना की जानी चाहिए (4Equation 4 ) (4)

5. सेल शुष्क वजन का निर्धारण (वैकल्पिक)

  1. तीन खाली सुरक्षित-विश्लेषणात्मक शेष राशि पर ताला ट्यूबों तौलना ।
    चेतावनी: यह महत्वपूर्ण है कि सुरक्षित ताला ट्यूब शुष्क कर रहे हैं । एक गीले वातावरण में ट्यूबों भंडारण के मामले में, उंहें वजन से पहले एक फ्रीज ड्रायर में कई घंटे के लिए ट्यूबों सूखी । ट्यूब धीरे और केवल पाउडर मुक्त दस्ताने हाथ के साथ हेरफेर करने के लिए सामग्री और शोधकर्ता की उंगलियों के बीच किसी भी संपर्क से बचें । सभी धारकों रखें और ट्यूबों के लिए किसी भी सामग्री के हस्तांतरण से बचने के लिए साफ करने के लिए ।
  2. 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए संस्कृति का नमूना 1 x 15 मिलीलीटर ।
  3. 15 एमएल शंकु ट्यूबों में ४,००० x g पर प्रयोगशाला के तापमान में 10 मिनट के लिए संस्कृति निलंबन केंद्रापसारक । तीन अतिरिक्त 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के साथ केंद्रापसारक रोटर संतुलन, प्रत्येक 15 मिलीलीटर पानी से युक्त । केंद्रापसारक के बाद, supernatant के 12 मिलीलीटर त्यागें ।
  4. शेष supernatant में गोली resuspend और एक पिपेट के साथ तीन १.५ मिलीलीटर सुरक्षित-ताला ट्यूबों के लिए मिश्रण की 3 एक्स 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । मामले में गोली के कुछ बचे 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रहते हैं, शंकु ट्यूब, भंवर करने के लिए पानी की १.५ मिलीलीटर जोड़ें या शेष गोली resuspend करने के लिए ट्यूब हिला, और तीन १.५ मिलीलीटर सुरक्षित लॉक ट्यूबों के लिए मिश्रण के 3 x ०.५ मिलीलीटर स्थानांतरण (पहले से ही containi एनजी 3 गोली के एक्स 1 मिलीलीटर) एक पिपेट के साथ ।
    नोट: तीन से अधिक गोली विभाजन १.५-मिलीलीटर सुरक्षित लॉक ट्यूब शुष्क वजन माप के किसी भी तकनीकी त्रुटि के आकलन की अनुमति देगा ।
  5. १.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं को सुरक्षित-लॉक ट्यूबों में १५,००० x g पर प्रयोगशाला के तापमान के लिए 5 मिनट के लिए एक अतिरिक्त १.५-एमएल सुरक्षित लॉक ट्यूब है कि पानी की 1 मिलीलीटर शामिल है के साथ केंद्रापसारक रोटर संतुलन । केंद्रापसारक के बाद, supernatants त्यागें ।
  6. नमूनों को फ्रीजर में रख दिया । लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें; अल्पकालिक भंडारण के लिए,-20 डिग्री सेल्सियस पर्याप्त है ।
  7. फ्रीज-नमूने रातोंरात सूखी । एक उचित फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के लिए, फ्रीज ड्रायर के तापमान संघनित्र नीचे-९० डिग्री सेल्सियस और 1 hPa के आसपास फ्रीज ड्रायर चैंबर में दबाव रखने के लिए ।
  8. फ्रीज-सुखाने के बाद, ट्यूबों बंद और विश्लेषणात्मक संतुलन पर नमूनों तौलना ।
    नोट: सूखी वजन मूल्य प्रति सेल शुष्क वजन phycobiliprotein सामग्री के सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

प्रारंभिक विधि परीक्षणों के लिए, Synechocystis BG11 खेती मध्यम20 में एक शेखर पर Erlenmeyer कुप्पी में बैच संस्कृतियों के रूप में खेती की थी (17 मिमी HEPES के साथ पूरक) 25 डिग्री सेल्सियस पर, एक की तीव्रता के एक गर्म सफेद प्रकाश के तहत ५० µmol (फोटॉनों)/ 2· s) और संवर्धन वातावरण में 1% CO2 के साथ । खेती के दौरान, संस्कृतियों को सुरक्षित-ताला ट्यूबों और (5 मिनट के लिए प्रयोगशाला के तापमान पर १५,००० x g ) के लिए नमूने थे, supernatant खारिज कर दिया गया था, और नमूनों या तो-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत थे और फ्रीज के लिए तैयारी के रूप में सूख इस प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत कदम या-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित तुलनात्मक निष्कर्षण और quantifications विश्लेषण के लिए ।

परीक्षण निष्कर्षण प्रक्रियाओं में sonication द्वारा सेल व्यवधान शामिल, homogenization के भीतर zirconia मोतियों के साथ, और फ्रीज-गल । अलग निष्कर्षण विधियों के परिणाम चित्रा 1में संक्षेप हैं । विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित सबसे phycobiliproteins पैदावार एक साथ सबसे कम क्लोरोफिल निष्कर्षण बफर में एक संदूषण के साथ प्रदान की है । क्लोरोफिल एक निष्कर्षण बफर में पाया गया था जब sonication सेल व्यवधान के लिए इस्तेमाल किया गया था । ठंड के चक्र दोहरा और बर्फ पर एक अल्ट्रासाउंड स्नान में नमूनों पिघलने निष्कर्षण बफर में उच्च प्रोटीन पैदावार के परिणामस्वरूप । हालांकि, एक ही समय में, क्लोरोफिल की एकाग्रता एक निष्कर्षण बफर में वृद्धि हुई (चित्रा 1 इनसेट), जो एक उचित phycobiliprotein सामग्री ठहराव बाहर रखा ।

इष्टतम homogenization समय था 15 s. homogenization के लिए दोनों कम (5 s) और अब (20 s) अवधियों थोड़ा कम phycobiliprotein पैदावार प्रदान की, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । 2 मिमी के व्यास के कांच के मोतियों के साथ कोशिकाओं अनुमन्य जब ०.५ मिमी, 1 मिमी, या 4 मिमी के एक व्यास के कांच के मोतियों के साथ तुलना में सबसे अधिक पैदावार के परिणामस्वरूप, एक ०.५ मिमी व्यास के zirconia मोतियों के साथ, या समुद्र रेत अनाज के साथ । पंजाब निष्कर्षण बफर phycobiliproteins निष्कर्षण (चित्रा 3) के लिए इष्टतम बफर के रूप में परीक्षण किया गया था । १०० mm NaCl या १५० mm KCl के अलावा या तो पंजाबियों बफर या पानी के लिए phycobiliprotein निष्कर्षण दक्षता में वृद्धि नहीं किया, और एक ही निष्कर्षण के लिए 20 मिमी सोडियम एसीटेट बफर का उपयोग करने के लिए चला गया (चित्रा 3) । इष्टतम phycobiliprotein निष्कर्षण समय ६० मिनट था, क्योंकि अधिक समय (२४० मिनट तक) के बाद, phycobiliprotein एकाग्रता निष्कर्षण बफ़र में उल्लेखनीयतया परिवर्तित नहीं हुआ (आरेख 4) ।

हम भी phycobiliprotein माप के लिए spectrophotometer रैखिकता रेंज का परीक्षण किया (चित्रा 5) और phycobiliprotein ठहराव के कई समीकरणों की तुलना में, दोनों phycocyanin और allophycocyanin मानकों (चित्रा 6) का उपयोग कर. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त spectrophotometer ०.१-३.० (चित्रा 5) के बीच एक रैखिक अवशोषक रेंज दिखाया । के बाद से प्रोटीन निकालने के स्पेक्ट्रा ६२० एनएम के आसपास अपनी अधिक से अधिक अवशोषण था (एक६२०), और ६५२ एनएम पर, अवशोषण (एक६५२) एक ३३ (चित्रा 7) के केवल ६२०% था, एक६५२ के लिए spectrophotometer रैखिकता (अधिकतम allophycocyanin अवशोषक) केवल १.१६ के एक६५२ करने के लिए परीक्षण किया गया था । बेनेट और Bogorad12 के समीकरण (1) और (2) सभी परीक्षण समीकरणों (चित्रा 6) के बीच दोनों phycocyanin और allophycocyanin मानकों का सबसे अच्छा पुनर्निर्माण प्रदान की है । Streptomycin सल्फेट, क्लोरोफिल एकयुक्त झिल्ली टुकड़े के उंमूलन के लिए कई पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया निष्कर्षण (चित्रा 7) के लिए आवश्यक नहीं के रूप में दिखाया गया था ।

प्रतिनिधि प्रयोग के लिए, Synechocystis एक turbidostat शासन में एक photobioreactor25 में खेती की गई थी, जहां कोशिकाओं को घातीय वृद्धि चरण में ऑप्टिकल घनत्व के एक परिभाषित सीमा के भीतर बनाए रखा गया था (६८० एनएम, आयुध डिपो पर मापा ६८०) द्वारा एक नियंत्रित कमजोर पड़ने के एक ताजा खेती मध्यम (BG11 मध्यम 17 मिमी HEPES के साथ बफर)11,26। संस्कृतियों ३२ डिग्री सेल्सियस पर खेती की गई थी और इनपुट हवा ०.५% सह2निहित । संस्कृतियों एक लाल बत्ती (λमैक्सके साथ प्रबुद्ध थे: ६३३ एनएम, λ1/2: 20 एनएम) की एक तीव्रता के 25-1100 µmol (फोटॉनों)/(एम2· s), एक साथ एक नीली बत्ती (λमैक्स: ४४५ एनएम, λ1/2: 20 एनएम) की तीव्रता के 25 µmol ( फोटॉनों)/(m2· s). संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व निलंबन photobioreactor आधार द्वारा मापा गया था, और६८० आयुध डिपो की सीमा ०.५२-०.५८ (2 x 107 से 4 x 107 कोशिकाओं/एमएल) के लिए सेट किया गया था । संस्कृतियों acclimation के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए प्रत्येक विशिष्ट प्रकाश तीव्रता के तहत कम से कम 24 घंटे के लिए खेती की गई । विकास स्थिरता तक पहुंचने के बाद, संस्कृतियों शुष्क वजन के लिए नमूना थे (कदम २.१-इस प्रोटोकॉल के २.८ के अनुसार), सेल गणना, और phycocyanin और allophycocyanin सामग्री । प्रकाश तीव्रता में वृद्धि के तहत phycobiliprotein मूल्यांकन के परिणाम चित्रा 8में दिखाया गया है । Synechocystis सेलुलर शुष्क वजन के 12% से phycobiliprotein सामग्री में कमी आई (५०५ fg/सेल) सबसे कम विकिरण के तहत सेलुलर शुष्क वजन के 3% (२८० fg/

Figure 1
चित्रा 1 : कई संदर्भ विधियों के साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि की निष्कर्षण क्षमता की तुलना । phycocyanin (काली पट्टियां) और कच्चे प्रोटीन निकालने में allophycocyanin (सफेद सलाखों) की एकाग्रता ६० min. Method के लिए पंजाबियों बफर में निष्कर्षण के बाद मापा गया था इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित है । विधि B निम्नानुसार संशोधित किया गया था: कटाई के बाद, कोशिकाओं (5 मिनट के लिए प्रयोगशाला के तापमान पर १५,००० x g ) और संग्रहीत-20 डिग्री सेल्सियस रात भर में थे । जमे हुए नमूनों 4 डिग्री सेल्सियस पर १२० एस के लिए sonicated थे, और phycobiliproteins ६० मिनट के लिए पंजाबियों बफर में निकाले गए थे. विधि सी विधि बी से संशोधित किया गया था पर काटा कोशिकाओं के छर्रों के भंडारण के लिए-८० ° c 30 मिनट के लिए, फ्रीज-सेलुलर छर्रों सुखाने , और सूखी छर्रों के लिए पंजाबियों बफर जोड़ने । विधि डी चुंग एट अलसे संशोधित किया गया था । १६: के बाद फ्रीज-सुखाने (विधि सी के रूप में ही), एनए-एसीटेट के ०.२५ मिलीलीटर 1% streptomycin सल्फेट बफर (पीएच ५.५) के साथ सूखी सेलुलर गोली, एक साथ zirconium मोतियों की ०.२५ मिलीलीटर के साथ जोड़ा गया था (०.५ मिमी के व्यास के साथ), और नमूने दो बार homogenized थे homogenizer पर ६० एस के लिए । homogenization के बाद, Na-1% streptomycin सल्फेट बफर (पीएच ५.५) के साथ एसीटेट के एक और ०.५ मिलीलीटर नमूना में जोड़ा गया था, ट्यूबों भंवर थे, और प्रोटीन 30 मिनट के लिए बर्फ पर निकाले गए थे । विधि ई शामिल एक एकल ठंड-गल साइकिल के लिए पंजाबियों बफर में और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्रोटीन निष्कर्षण । विधि एफ (इनसेट चित्रा) कोशिकाओं ठंड के एक और छह चक्रों के शामिल (शुरू में, फ्रीज-सूखे और पंजाब के बफर में resuspend) तरल नाइट्रोजन, बर्फ पर sonication द्वारा पीछा किया । महत्वपूर्ण क्लोरोफिल के कारण कच्चे प्रोटीन निकालने में एक उपस्थिति, phycobiliproteins के भीतर विधि एफ quantified नहीं थे । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । वर्णक सांद्रता समीकरण (1) और इस प्रोटोकॉल के (2) के अनुसार गणना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : phycobiliprotein निष्कर्षण दक्षता पर homogenization समय का प्रभाव । Synechocystis कोशिकाओं के lyophilized छर्रों (कदम ३.१-इस प्रोटोकॉल के ३.५ के अनुसार) 5 एस, 15 एस, और 20 एस के लिए homogenizer पर कांच के मोतियों के साथ बाधित किया गया । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : Phycobiliprotein निष्कर्षण दक्षता में विभिंन निष्कर्षण बफ़र्स । phycobiliproteins में निकाले गए थे, पंजाबियों बफर में १०० mm NaCl या १५० mm KCl के अलावा, १०० mm NaCl या १५० mm KCl के साथ जल में, हेमलता और Fareha के अनुसार22, और 20 मिमी सोडियम एसीटेट के अनुसार में चुंग एट अल . 16. निष्कर्षण इस प्रोटोकॉल के कदम ४.१-४.३ के अनुसार 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया था । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Phycobiliprotein स्थिरता में निष्कर्षण बफ़र में समय । निष्कर्षण प्रक्रिया के बाद, इस प्रोटोकॉल के चरणों ४.१-४.३ में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया, पंजाबियों बफर (पीएच ७.४) में phycobiliprotein निकालने 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए, कोई महत्वपूर्ण phycocyanin (हलकों) और allophycocyanin (चौकों) गिरावट के साथ संग्रहित किया गया था । डैश्ड रेखा ंयूनतम वर्ग पद्धति द्वारा परिकलित समय बिंदुओं के रेखीय फ़िट का प्रतिनिधित्व करता है । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : phycocyanin और allophycocyanin सांद्रता के प्रतिनिधि मापन में Synechocystis। एक घने संस्कृति निलंबन (phycocyanin: ४५६ µ g/ml, allophycocyanin: १०६ µ g/एमएल) धीरे-दोनों µ और phycocyanin के लिए 19 allophycocyanin g/एमएल की एकाग्रता के लिए पतला था । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । डॉटेड रेखा ंयूनतम वर्ग पद्धति द्वारा परिकलित एकाग्रता बिंदुओं के रेखीय फ़िट का प्रतिनिधित्व करती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : phycocyanin और pigments मानकों में allophycocyanin सांद्रता का आकलन । वर्णक मानकों में phycocyanin और allophycocyanin की सामग्री बेनेट और Bogorad12, Lüder एट अलके समीकरणों के अनुसार spectrophotometrically मापी गई थी. १३, संपथ-विले आणि Neefus१५, इवांस१४, आणि चुंग एट अल. 16. मानकों में प्रोटीन सामग्री (phycobiliproteins निर्धारण के लिए आवश्यक के रूप में) ०.१ N बिकारबोनिट में bicinchoninic एसिड, सोडियम कार्बोनेट, सोडियम tartrate, और सोडियम NaOH के एक समाधान का उपयोग कर quantified था (११.२५ के अंतिम पीएच के साथ), में 4% (w/v) तांबे के साथ प्रतिक्रिया (द्वितीय) सल्फेट pentahydrate27, एक प्रोटीन मानक के रूप में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन का उपयोग कर । बेनेट और Bogorad के समीकरणों दोनों pigments के उच्चतम पुनर्निर्माण प्रदान की: phycocyanin मानक के ९६% और allophycocyanin मानक के ९९% । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । डैश्ड रेखा १००% बिंदु पर प्रकाश डाला गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : पंजाबियों बफर में कच्चे प्रोटीन निकालने के अवशोषण स्पेक्ट्रम पर streptomycin सल्फेट के प्रभाव । (A) इस प्रोटोकॉल के चरणों ४.१-४.३ में वर्णित के रूप में निष्कर्षण प्रक्रिया या (B) sonication का उपयोग कर के रूप में विधि F के लिए आरेख 1 की कथा में वर्णित के रूप में पंजाब के बफर (हलकों) में किया गया था और पंजाब 1% के साथ पूरक बफर streptomycin सल्फेट (चौकों) । phycobiliprotein ठहराव इस प्रोटोकॉल के चरणों ५.१-५.४ के अनुसार किया गया था । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : phycocyanin (हलकों) और allophycocyanin (चौकों) की एकाग्रता Synechocystis 25-1100 µmol (फोटॉनों)/(m2 · s) की तीव्रता के लाल-नारंगी प्रकाश के नीचे खेती। Synechocystis संस्कृतियों में एक photobioreactor में खेती की गई ३२ ° c, ०.५% CO2 के साथ इनपुट हवा में, BG11 खेती मध्यम में turbidostat एट अल के अनुसार एक Zavrel शासन में 17 मिमी HEPES के साथ पूरक । 11. phycobiliprotein सांद्रता इस प्रोटोकॉल के अनुसार मापा और अंतिम phycobiliprotein सामग्री सेलुलर शुष्क वजन के प्रति सामान्यीकृत किया गया था, के रूप में इस प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित है । डैश्ड रेखाएं कम वर्गों पद्धति द्वारा परिकलित, मापा बिंदुओं की पावर फ़िट का प्रतिनिधित्व करते हैं । दर्शाया गया मान तीन तकनीकी प्रतिकृतियों, मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों से औसत दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल मॉडल cyanobacterium Synechocystisमें phycobiliprotein सामग्री के ठहराव के लिए एक सरल, तेज, और reproducible विधि का वर्णन करता है । सेल homogenization, प्रोटीन निष्कर्षण, और phycocyanin और allophycocyanin ठहराव की कई विधियों की तुलना कर रहे हैं, और अंतिम प्रोटोकॉल हर एक प्रक्रिया के इष्टतम चरणों का एक संयोजन का प्रतिनिधित्व करता है । प्रतिनिधि डेटा के रूप में, phycobiliproteins की सामग्री प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि के तहत Synechocystis कोशिकाओं में quantified था. हालांकि विश्लेषण पहले से प्रकाशित तरीकों में से कुछ के रूप में इसी तरह के समय औरप्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता12,13,14,15,16, इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि कोई क्लोरोफिल एक निष्कर्षण बफर में जारी की है और, इस प्रकार, phycobiliprotein माप उच्च परिशुद्धता के साथ अनुमान लगाया जा सकता है ।

phycobiliprotein विश्लेषण के लिए आवश्यक सेल निलंबन की राशि संस्कृति घनत्व के साथ भिन्न हो सकते हैं । 1 मिलीलीटर का नमूना मात्रा १.५ के एक आयुध डिपो७३० के साथ संस्कृतियों के लिए अनुकूलित है, लगभग के एक सेल घनत्व 2 x 107 कोशिकाओं/एमएल, या संस्कृतियों के लिए लगभग 20 मिलीग्राम/L की एक phycobiliprotein सामग्री के साथ पतला संस्कृतियों के मामले में, फसल एक बड़ा संस्कृति मात्रा । दूसरी ओर, घने संस्कृतियों के मामले में, एक कम संस्कृति मात्रा फसल उच्च घनत्व संस्कृतियों में, वहां एक जोखिम है कि phycobiliproteins आंशिक रूप से निष्कर्षण के बाद कोशिकाओं में रहना है । इसी तरह, शुष्क वजन निर्धारण के लिए आवश्यक सेल निलंबन की राशि संस्कृति घनत्व के साथ भिंन हो सकते हैं । 15 मिलीलीटर की नमूना मात्रा १.५ के एक आयुध डिपो७३० के साथ या लगभग 2 x 107 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व के साथ संस्कृतियों के लिए अनुकूलित है/ कम घनत्व संस्कृतियों के साथ या कम मात्रा के साथ, माप त्रुटि बढ़ा सकते हैं । इसके विपरीत, बड़ी संस्कृति की मात्रा या सघन संस्कृतियों बेहतर विधि संकल्प प्रदान करते हैं ।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम सेल homogenization और phycobiliprotein निष्कर्षण कि दोनों उच्च पैदावार और उच्च विशिष्टता प्रदान करना चाहिए रहे हैं । एक साथ अधिकतम प्रोटीन संरक्षण के साथ अर्क की सबसे अधिक पैदावार और शुद्धता को फ्रीज-सुखाने के नमूनों से प्राप्त किया गया था, कांच के मोतियों से सूखी सेलुलर छर्रों अनुमन्य, और पंजाब में phycobiliprotein निष्कर्षण प्रदर्शन बफर ( चित्रा 1) । के बाद भी क्लोरोफिल द्वारा कच्चे प्रोटीन निकालने के एक छोटे से संदूषण एक phycobiliprotein सामग्री का अनुमान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यह किसी भी क्लोरोफिल पंजाबियों बफर जोड़कर एक निष्कर्षण से बचने के लिए आवश्यक है । क्लोरोफिल एक क्रूड निकालने में पाया गया जब sonication सेल व्यवधान के लिए इस्तेमाल किया गया था । के रूप में चित्रा 1के इनसेट में दिखाया गया है, दोहराया sonication चक्र के साथ, एक निकालने में क्लोरोफिल की मात्रा बढ़ गई । दूसरी ओर, निकाले गए प्रोटीन की मात्रा (के रूप में २८० एनएम पर अवशोषक द्वारा पता चला) भी दोहराया sonication चक्र के बाद वृद्धि हुई है । इसलिए, sonication का उपयोग (तरल नाइट्रोजन में ठंड-गल चक्र के साथ संयोजन में) कुल प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त विधि के रूप में प्रकट होता है (दोनों स्वतंत्र और झिल्ली से बंधे प्रोटीन कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं); हालांकि, यह phycobiliprotein स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ठहराव के प्रयोजन के लिए अनुशंसित नहीं है । चुंग एट अल. 1% streptomycin सल्फेट के उपयोग की सिफारिश की क्लोरोफिल के साथ झिल्ली टुकड़े को खत्म करने के लिए एक16। यहां, streptomycin सल्फेट के उपयोग के लिए आवश्यक नहीं दिखाई के बाद से यह क्लोरोफिल एक प्रोटीन निकालने में एक कमी (चित्रा 7) के लिए नेतृत्व नहीं किया । भले ही १२० s के लिए एक एकल sonication चक्र कक्षों कुशलता से बाधित नहीं किया (तरीके B और C, आरेख 1), अंय विधियों (जैसे, पद्धति F के रूप में चित्र 1 में प्रस्तुत या चित्र 7Bमें प्रस्तुत विधियों) की पुष्टि की sonication के पिछले निष्कर्षों एक कुशल सेल व्यवधान विधि जा रहा है22,28। दूसरी ओर, सरल ठंड-गल चक्र, यह भी पहले phycobiliproteins निष्कर्षण के लिए एक कुशल विधि के रूप में रिपोर्ट22,28, प्रदान की परीक्षण में सबसे कम पैदावार यहां वर्णित (विधि ई, चित्रा 1 ). सेल homogenization (निष्कर्षण बफर के भीतर, 2 x ६० s) zirconium मोतियों से कम 15-फ्रीज के एस homogenization-सेलुलर गोली सूख (विधि डी, चित्रा 1) की तुलना में कुशल के रूप में परीक्षण किया गया । निष्कर्षण बफ़र के भीतर homogenization प्रक्रिया पहले अब homogenization समय (10 मिनट)29के साथ वर्णित किया गया था । हम लंबे समय से 2 मिनट के लिए homogenization परीक्षण नहीं किया है के बाद से काफी एक homogenization चक्र के दौरान गरम नमूने । साहित्य में, अन्य कोशिका व्यवधान विधियों का भी वर्णन किया गया है, जिनमें एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग16 या ग्रिडिंग13,15,30; हालांकि इस अध्ययन में इस तरह की विधियों का परीक्षण नहीं किया गया ।

प्रोटीन निष्कर्षण 15 एस के लिए प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 2) पंजाबियों बफर में । बफ़र पीएच ७.४, जो पहले के रूप में phycobiliprotein निष्कर्षण22के लिए इष्टतम बताया गया था । NaCl या KCl के अलावा phycobiliprotein निष्कर्षण दक्षता (चित्रा 3), जो पिछले टिप्पणियों22विरोध है सुधार नहीं किया । हालांकि, के रूप में चित्रा 3में संकेत दिया, इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता के रूप में फास्फेट बफर खारा समाधान १५४ मिमी NaCl (के अलावा में ५.६ मिमी न2HPO4 और 1 मिमी KH2PO4), जो हमें स्थापित करने की अनुमति नहीं थी निहित NaCl एक नियंत्रण के रूप में मुक्त पंजाबियों निष्कर्षण बफर । हम भी तुलना में पंजाबियों बफर और सोडियम एसीटेट बफर16 निष्कर्षण क्षमता । पंजाबियों बफर के भीतर सोडियम फॉस्फेट और पोटेशियम फॉस्फेट के संयोजन उच्च phycobiliproteins पैदावार (चित्रा 3) प्रदान की है. यह खोज हेमलता एट अलके पिछले निष्कर्षों के साथ मेल खाती है । 22.

phycobiliprotein निष्कर्षण समय के लिए अनुकूलित किया गया था 1 h. अब निष्कर्षण महत्वपूर्ण phycobiliprotein गिरावट या निष्कर्षण सुधार (चित्रा 4) है, जो Lawrenz एट अलके पिछले काम के साथ संगत करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था । 28. एक निष्कर्षण समय 1 h से छोटा परीक्षण नहीं किया गया था । इसी तरह, निष्कर्षण से अधिक 4 एच के लिए परीक्षण नहीं किया गया था क्योंकि यह पहले पाया गया था कि फास्फेट बफर में निकाले phycobiliproteins कम से ४८ ज28के लिए स्थिर हैं ।

हम साहित्य में पहले वर्णित के रूप में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक phycocyanin और allophycocyanin ठहराव के कई समीकरणों की तुलना में, ज्ञात प्रोटीन के साथ वाणिज्यिक मानकों में दोनों phycobiliproteins की सामग्री की गणना करके सांद्रता (चित्रा 6) । दोनों pigments के सर्वश्रेष्ठ पुनर्निर्माण बेनेट और Bogorad12के समीकरणों के साथ हासिल किया गया था । इस तरह के एक बफर के बाद से फास्फेट निष्कर्षण बफर के लिए विशिष्ट नहीं था पहले12,13,15इस्तेमाल किया गया है । यह न तो एक६१५, एक६१८के बीच अंतर के बाद से वर्णक मानकों के लिए विशिष्ट था, और एक६२० (तरंग दैर्ध्य पिछले कार्यों में phycocyanin आकलन के लिए इस्तेमाल किया) phycocyanin मानक में 1% और एक के बीच का अंतर था ६५० और एक६५२ (तरंग दैर्ध्य पहले allophycocyanin अनुमान12,13,14,16के लिए इस्तेमाल किया) allophycocyanin मानक में 3% था । इसी तरह, एक६१५ और Synechocystis के प्रोटीन निकालने में६२० के बीच का अंतर केवल 2% था । अवशोषण स्पेक्ट्रा में इस तरह के छोटे मतभेद ३६% (चित्रा 6) अप करने के लिए एक अंतिम वर्णक भिन्नता में परिणाम नहीं कर सकते. इसलिए, व्यक्तिगत समीकरणों के बीच अंतर विशिष्ट जीवों के phycobiliprotein विलुप्त होने के गुणांकों में भिन्नता से जुड़े थे12,13,14, 15 , 16 , 17. दिलचस्प है, चुंग एट अलके समीकरण । प्रदान की सबसे कम phycocyanin पुनर्निर्माण (चित्रा 6) हालांकि लेखकों ने भी अपने प्रयोगों के लिए Synechocystis का इस्तेमाल किया16.

इसके बजाय एकल तरंग दैर्ध्य के निर्धारण के, यह २८०-७२० एनएम के बीच phycobiliprotein निकालने की एक सतत स्पेक्ट्रम को मापने के लिए सिफारिश की है, को निकालने में क्लोरोफिल एक की उपस्थिति का अनुमान है, जो दोनों के साथ हस्तक्षेप कर सकता है allophycocyanin और phycocyanin अवशोषण । इसके अलावा, २८० एनएम (एक२८०), दोनों phycocyanin की एक पवित्रता (एक६१५/२८० या एक६२०/२८०)21,22 और allophycocyanin (एक६५२/२८०) में अवशोषक को मापने के द्वारा 24 निकालने के भीतर का अनुमान लगाया जा सकता है (०.७: खाद्य ग्रेड, ३.९: प्रतिक्रियाशील ग्रेड, > ४.०: विश्लेषणात्मक ग्रेड)21।

प्रतिनिधि डेटा के रूप में, Synechocystis में phycocyanin और allophycocyanin दोनों की एकाग्रता में वृद्धि प्रकाश की तीव्रता के तहत निर्धारित किया गया था । एक turbidostat खेती शासन के भीतर एक निरंतर स्तर पर संस्कृति घनत्व को बनाए रखने11,21 प्रत्यक्ष तुलनात्मक प्रयोग के लिए आवश्यक था । phycocyanin और allophycocyanin सांद्रता के २.४%-१०.२% और ०.६%-सेलुलर शुष्क वजन के १.७%, क्रमशः, पहले की रिपोर्ट मान11,31,३२के रूप में समान थे । इसके अलावा, सेल के आधार प्रति phycobiliprotein सामग्री समान था के रूप में पहले11,३३की सूचना दी । बढ़ती रोशनी के साथ ही phycobiliproteins कंटेंट में कमी आई । दिलचस्प बात यह है कि ११०० µmol (फोटॉनों)/(एम2· s) की उच्चतम हल्की तीव्रता के तहत भी phycobiliproteins पूरी तरह से ब्लीच नहीं किए गए थे ।

चूंकि प्रोटोकॉल केवल मानक उपकरण की आवश्यकता है और अपेक्षाकृत तेज है, यह आसानी से किसी भी प्रयोगशाला में phycobiliproteins नियमित रूप से विश्लेषण कर रहे है में अपनाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्रोटोकॉल पिछले प्रकाशन11से अपनाया गया था । टी. जेड., डी. Ch., और जे. Č. राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम मैं (NPU मैं), अनुदान संख्या LO1415 के भीतर शिक्षा, युवा और चेक गणराज्य के खेल मंत्रालय द्वारा समर्थित थे । जे. के. Č ने भी गा सीआर, ग्रांट नंबर 18-24397S का समर्थन किया था । उपकरणों और अन्य सुविधाओं के लिए उपयोग सिस्टम्स बायोलॉजी C4SYS (प्रोजेक्ट no LM2015055) के लिए चेक अनुसंधान अवसंरचना द्वारा समर्थित किया गया था. एम. ए. एस. रूसी विज्ञान फाउंडेशन [no. 14-14-00904] से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synechocystis sp. PCC 6803 Institut Pasteur, Paris, France 6803 Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 9143.1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes  Eppendorf, Hamburk, Germany 30120086 Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 30128-282 Holder for safe-lock tubes 
RAININ 100 µl -1000 µl  Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 17014382 Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 30389272 Pipette tips
Rotina 420R Hettich, Kirchlengern, Germany 4701 Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010 Liebherr, Bulle, Switzerland 9005382197172 Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA EXF24086V  Freezer -80 °C
CoolSafe LaboGene, Lillerød, Denmark 7.001.000.615 Freeze dryer 
UV-2600 Shimadzu, Kyoto, Japan UV-2600 Spectrophotometer 
Hellma absorption cuvettes, semi Micro Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z600288  VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm 
Silamat S6 Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein 602286WU Homogenizer 
Solid-glass beads Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z273627 Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE Sartorius AG, Göttingen, Germany SECURA225D-1OBR Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P2172 Phycocyanin standard
Allophycocyanin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA A7472 Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA BCA1, B9643 Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron  Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic AG 130-ECO  Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic FMT-150 Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer  Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA Auto M10 Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS430791  15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 51024579 Laminar flow hood

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References

  1. Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
  2. Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
  3. Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
  4. Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
  5. Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
  6. Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
  7. Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
  8. Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
  9. Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
  10. Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
  11. Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
  12. Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
  13. Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
  14. Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
  15. Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
  16. Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
  17. Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
  18. Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
  19. Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
  20. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  21. Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
  22. Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
  23. Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
  24. Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
  25. Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
  26. Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  28. Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
  29. Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
  30. Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
  31. Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
  32. Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
  33. Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).

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जैव रसायन १३९ अंक Phycobilisomes phycobilins phycocyanobilins phycocyanin allophycocyanin pigments प्रकाश संचयन प्रोटीन cyanobacteria शैवाल spectrophotometry निष्कर्षण
Cyanobacterium <em>Synechocystis</em> में Phycobiliprotein सामग्री का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक निर्धारण
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Zavřel, T., Chmelík, D.,… More

Zavřel, T., Chmelík, D., Sinetova, M. A., Červený, J. Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis. J. Vis. Exp. (139), e58076, doi:10.3791/58076 (2018).

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