Summary
Здесь мы представляем протокол количественно определить содержание phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis спектрофотометрическим методом. Процедура извлечения также успешно применяется для других штаммов водорослей и цианобактерий; Однако из-за различий в спектрах поглощения пигмент, необходимо отдельно проверить спектрофотометрические уравнения для каждого штамма.
Abstract
Это простой протокол для количественного определения содержания phycobiliprotein в модели цианобактерии Synechocystis. Фикобилипротеинов являются наиболее важных компонентов phycobilisomes, основных светособирающего антенн в цианобактерий и несколько таксонов водорослей. Phycobilisomes Synechocystis содержат два фикобилипротеинов: фикоцианина и аллофикоцианин. Этот протокол описывает простой, эффективный и надежный метод количественного определения фикоцианина и аллофикоцианин в этой модели цианобактерии. Мы сравнили несколько методов добычи phycobiliprotein и спектрофотометрические количественной оценки. Процедура извлечения, как описано в настоящем протоколе был также успешно применяется для других штаммов цианобактерий например Arthrospira sp., Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, спирулина sp., и Nostoc sp., а также относительно красных водорослей порфиридиума cruentum. Однако коэффициенты вымирания конкретных фикобилипротеинов из различных таксонов могут отличаться и таким образом, рекомендуется проверить метод спектрофотометрические квантификации для каждое одного штамма индивидуально. Протокол требует немного времени и могут быть выполнены в любой лаборатории стандартного науки о жизни, так как он требует только стандартное оборудование.
Introduction
fPhycobiliproteins являются водорастворимый пигмент белковых комплексов, которые представляют собой основные компоненты светособирающего антенн в прокариотических цианобактерий (синезеленых) и несколько эукариотические таксоны (Glaucophyta, Rhodophyta и криптофитов)1. Они возникают главным образом как супрамолекулярные комплексы, называется phycobilisomes, и обычно они прикреплены к поверхности фотосинтетических мембран на стороне стромы, за исключением криптофитов, где фикобилипротеинов локализованы в тилакоидов люмен2. Были определены четыре вида фикобилипротеинов до Дата: аллофикоцианин основных и периферийных фикоцианин, фикоэритрин и Фикоэритроцианин1. Как основной светособирающих комплексов phycobilisomes представляют собой один из важнейших факторов производительности массовой культуры водорослей и цианобактерий. Доказано, что phycobilisomes усечение может повысить накопления биомассы под сильный свет3. С другой стороны под скромным или низкой освещенности, антенна усечения привело темпы роста и биомассы накопления сокращение3,4. Фикобилипротеинов коммерчески используются красители пищевые, фармацевтических препаратов и пищевых добавок, в косметической промышленности, а также флуоресценции зондов с приложениями в проточной цитометрии, флуоресцентного иммуноанализа и микроскопии флуоресцирования5.
Этот протокол фокусируется на количественное определение фикобилипротеинов в модели цианобактерии Synechocystis. Цианобактерии являются ранние oxygenic фотосинтетических автотрофы; они формировании биосферы земли более 2,4 миллиарда лет6. Они играют решающую роль в глобальных биогеохимических циклах, азота, углерода, кислорода и других элементов. Среди цианобактерий, одноклеточные штамм Synechocystis получила уникальное положение, поскольку он был первым цианобактерии с весь геном последовательности7,8, это естественно трансформер экзогенной ДНК9, и Он выполняет стабильным и относительно быстрый рост10,11. В Synechocystis, основной компонент антенна, аллофикоцианин, ассоциируется с составной мембранных белков и прилагаемый фикоцианина расположен на периферии тилакоидной мембраны.
Несколько методов для извлечения phycobiliprotein и количественной оценки сравниваются в рамках настоящего Протокола. Процедура окончательного извлечения был успешно применен Synechocystis, а также другие цианобактерий штаммов, включая Arthrospira Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, спирулина sp., СП.и Nostoc sp. и он был также успешно применяется для красных водорослей порфиридиума cruentum. Таким образом метод, разработанный в этом протоколе может рассматриваться как универсальный метод для извлечения phycobiliprotein. Даже несмотря на то, что некоторые из методов испытания извлечения привело к повышению урожайности общего белка, здесь описывается процедура извлечения условии высоким phycobiliprotein дает вместе с наименьшим содержанием остатков хлорофилла в Экстракт Phycobiliprotein. Для правильной фикоцианина и аллофикоцианин спектрофотометрические количественной оценки необходимо уменьшить содержание хлорофилла .
Спектры поглощения phycobiliprotein может значительно различаться между различными водоросли и цианобактерии видов12,13,14,,1516,17 и даже среди нескольких штаммов одного цианобактерий рода18. Таким образом конкретные длинах волн и поглощения коэффициенты, используемые для определения фикоцианина и аллофикоцианин в Synechocystis не применяются обычно для других штаммов. Кроме того Synechocystis не содержат фикоэритрин и Фикоэритроцианин, которые могут быть найдены в некоторых других водорослей и цианобактерий. Для целей определения фикобилипротеинов штаммов Synechocystisпомимо рекомендуется оценить спектрофотометрические уравнения для каждого штамма индивидуально.
Хотя протокол содержит два больше шагов (на ночь паром для лиофильной сушки сотовой окатышей и извлечения протеина 1 час), общее рабочее время для количественной оценки фикобилипротеинов не более 2 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. цианобактерий культивирование
- Культивируйте Synechocystis клеток в колбах Эрленмейер или в фотобиореакторах10,19 в буферизации BG11 средний20 для поддержания pH < 10 (например, с помощью 17 мм HEPES10).
Примечание: Стандартные культивирования условия требуют контролируемой температуре (30 ° С, оптимальная температура обычно 35 ° C)21, освещения (как правило, белый свет интенсивности до 800 мкмоль [фотоны] / [m2·s])21и CO 2 поставка (в 400 мл photobioreactor плоских, роста, насыщая концентрации CO2 -1700 ppm)21. - Для определения плотности культуры, измерения оптической плотности культуры спектрофотометрически на 730 Нм (OD730) с помощью кювета с светового луча от 1 см. Кроме того, граф клетки под микроскопом, используя Горяева или автоматизированные ячейки Счетчик.
2. образцы подготовка
- Работа при низкой освещенности для предотвращения деградации phycobiliprotein.
- Урожай 3 x 1 мл суспензии культуры до упора Сейф трубы. Используйте triplicates для оценки технических ошибок в измерении. Для выборки культуры в стерильных условиях, урожай клетки в ламинарных капюшоном и следуйте рекомендациям по работе и безопасности.
- Центрифуга клетки на 15000 x g при температуре лаборатории для 5 минут обращать внимание на ротор надлежащим образом сбалансированной центрифуги. После центрифугирования отбросить supernatants. Будьте уверены, чтобы не мешать гранулы.
- Поместите образцы в морозильную камеру. Для длительного хранения сохранить образцы в-80 ° C. Это необходимо для предотвращения деградации phycobiliprotein. Для краткосрочного хранения-20 ° C является достаточным.
- Freeze-Dry образцы на ночь. Для надлежащего процесса сушки Держите температуру замораживания сушилка конденсатора ниже-60 ° C и давление в камере замораживания сушилка вокруг 1 гПа.
- После окончания цикла Плаурайта, закройте трубку как можно скорее, чтобы предотвратить реабсорбции воды из воздуха.
3. сотовый гомогенизации и пигменты извлечения
- Добавление четырех штук стеклянных шариков (с диаметром 2 мм) для каждого образца трубки и закрыть трубы.
Примечание: Когда крышку трубки Сейф lock используется для гомогенизации слишком тонкая, она может разорвать во время гомогенизации; Таким образом только Сейф замок трубы с сильным крышками рекомендуются для этого протокола. - Однородный образцы с Стеклошарики для 15 s на гомогенизатор температуре лаборатории.
Примечание: Образец надлежащим образом гомогенизированный распространяется всей внутренней поверхности трубы Сейф lock. - Добавьте 1 mL PBS буфера (рН 7,4), охладить до 4 ° C, для пробы для того чтобы извлечь фикобилипротеинов.
Примечание: От этого шага на Храните пробы на льду для предотвращения деградации извлечения белков. Это очень важно. - Смешать образцы с PBS для 5 s на гомогенизатор температуре лаборатории.
Примечание: После смешивания, образцы зеленоватый. - После смешивания, храните пробы на льду на 60 мин Обложка ледяной ванне с крышкой для предотвращения деградации пигменты.
- После 60 мин phycobiliprotein добычи Центрифугуйте образцы на 15000 x g при 4 ° C за 5 мин обращать внимание на правильно сбалансировать ротора центрифуги.
Примечание: После центрифугирования, супернатанта имеет голубой синий цвет.
4. Phycobiliprotein количественная оценка
- До спектрофотометрические измерения калибровки спектрофотометр базовой линии с помощью буфера PBS как пустой.
- Как только калиброванные спектрофотометра, отменить PBS от одного спектрофотометр кювет и Пипетка супернатант с извлеченными фикобилипротеинов вместо с буфера отбрасываются.
- Количественную оценку концентрации phycobiliprotein спектрофотометрически, используя щель шириной 0,5 Нм.
- Измерение поглощения phycocyanobilins фикоцианина и аллофикоцианин против PBS буфере пустыми в 615 Нм (615) и 652 Нм (652), соответственно, и измерения оптической плотности сотовой мусора на 720 Нм (720).
- Рассчитайте концентрацию фикоцианина и аллофикоцианин согласно уравнений (1) и (2) Беннетт и Богорад12:
Примечание:615,652и720 должны соответствовать линейной оптической плотности спектр спектрофотометра. При необходимости разбавьте образца с PBS буфера.
- Пересчет концентрации пигмента в оригинальные образцы. Концентрации пигмента в примере соответствует непосредственно с результатами уравнений (1) и (2) когда 1 мл культуры и 1 мл буфера извлечения используются для анализа. В случае с использованием различных объемов цианобактерий образцы или PBS буфера, концентрации пигмента окончательный должен рассчитываться по формуле (3):
(3)
Примечание: В случае нормализации содержания phycobiliprotein на сухой массы клеток, концентрации пигмента окончательный должен рассчитываться по формуле (4)
(4)
(3)
(4)5. Определение ячейки сухого веса (опционально)
- Весят три пустые трубы Сейф замок на аналитические весы.
Предупреждение: Важно, что Сейф lock трубки сухим. В случае хранения труб в влажной среде, сухие трубы на несколько часов перед началом взвешивания их замораживания. Манипулировать трубы аккуратно и только с неопудренные перчатках, чтобы избежать любой контакт между материалом и исследователь пальцев. Держите все держатели и центрифуги чистой, чтобы избежать передачи любого материала трубы. - Пример 1 x 15 мл суспензии культуры до 15 мл Конические трубки.
- Центрифуга культуры подвеска в 15 мл конические трубы на 4000 x g при температуре лаборатории для 10 min. баланс ротора центрифуги с трех дополнительных 15 мл конические трубы, каждый содержащий 15 мл воды. После центрифугирования отбросить 12 мл супернатант.
- Ресуспензируйте гранулы в оставшихся супернатант и передачи 3 x 1 мл смеси в три пробирки Сейф замок 1,5 мл с пипеткой. В случае, если некоторые остатки гранулы остаются в 15 мл Конические трубки, добавьте 1,5 мл деионизованной воды в конической трубки, вихревой или трясти трубки Ресуспензируйте оставшиеся Пелле и передачи 3 x 0.5 мл смеси в три пробирки Сейф lock 1,5 мл (уже containi нг 3 x 1 мл гранул) с пипеткой.
Примечание: Деления Пелле за три трубки Сейф замок 1,5 мл позволит оценить любой технической ошибки измерения сухого веса. - Центрифуга клетки в 1,5 мл Сейф замок трубы на 15000 x g при температуре лаборатории для 5 минут баланс ротора центрифуги с дополнительной 1,5 Сейф замок мл, содержащий в 1 мл воды. После центрифугирования отбросить supernatants.
- Поместите образцы в морозильную камеру. Для длительного хранения сохранить образцы в-80 ° C; для краткосрочного хранения,-20 ° C является достаточным.
- Freeze-Dry образцы на ночь. Для надлежащего процесса сушки Держите температуру замораживания сушки конденсатора ниже-90 ° C и давление в камере замораживания сушилка вокруг 1 гПа.
- После для, закройте трубы и взвесить образцы на аналитические весы.
Примечание: Значение сухого веса, может использоваться для нормализации содержания phycobiliprotein на сухой массы клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для первоначального метода испытаний, Synechocystis культивировалось как пакетного культур в колбах Эрленмейер на шейкер в BG11 культивирование средний20 (ДОПОЛНЕНО 17 мм HEPES) при 25 ° C, под теплый белый свет интенсивности 50 мкмоль (фотонов) / (м 2·s) и с 1% CO2 в атмосфере культивирования. В ходе выращивания, культур были взяты пробы в Сейф замок трубы центрифугировали (15000 x g при температуре лаборатории 5 мин), супернатанта была отвергнута и образцы были либо хранятся при температуре-80 ° C и Сублимированные замораживанием для подготовки отдельные этапы этого протокола или температуре-20 ° C или ° C-80 для сравнительного анализа добычи и количественной.
Процедуры испытания извлечения включены разрушения клеток sonication, гомогенизации с бисером циркония в рамках PBS буфер и замораживания оттаивания. Результаты извлечения различных методов приводится на рисунке 1. Метод, как описано в рамках настоящего Протокола при условии, что высокая фикобилипротеинов дает вместе с низкие хлорофилл загрязнение в буфере извлечения. Хлорофилл был обнаружен в буфере экстракции при sonication был использован для разрушения клеток. Повторяющихся циклов замораживания и оттаивания образцов в ультразвуковой ванне на льду привело к повышению урожайности белка в буфере добычи. Однако в то же время, концентрация хлорофилла в буфере добыча увеличилась ( врезныерис. 1 ), которые исключены надлежащего phycobiliprotein контента количественной оценки.
Оптимальной однородности времени было 15 s. гомогенизации для обоих короче (5 s) и больше (20 s) периодов предусмотрено несколько ниже phycobiliprotein урожайности, как показано на рисунке 2. Гомогенизация клетки с бисер диаметром 2 мм привели к высокой урожайности по сравнению с бисер диаметром 0,5 мм, 1 мм или 4 мм, цирконий бисер диаметром 0,5 мм или с зернами морской песок. PBS извлечения буфер был испытан как оптимальный буфер для извлечения фикобилипротеинов (рис. 3). Добавлением 100 NaCl или 150 мм KCl в PBS буфер или воды не повышается эффективность добычи phycobiliprotein, и то же пошел за использование буфера ацетат натрия 20 мм для извлечения (рис. 3). Время экстракции оптимальное phycobiliprotein было 60 минут потому что, после больше времени (до 240 минут), концентрация phycobiliprotein в буфере добычи существенно не изменилось (рис. 4).
Мы также протестировали спектрофотометр линейность диапазон измерения phycobiliprotein (рис. 5) и сравнить несколько уравнений phycobiliprotein количественной оценки, используя фикоцианина и аллофикоцианин стандартов (рис. 6). Спектрофотометр, используемые в настоящем Протоколе показал линейной оптической плотности диапазоне 0.1 - 3.0 (рис. 5). Так как спектров белков экстракта было его максимальное поглощение около 620 Нм (620) и на 652 Нм, поглощения (652) был всего лишь 33%620 (рис. 7), линейность спектрофотометр для652 (максимум аллофикоцианин поглощения) был протестирован только до652 1.16. Уравнения (1) и (2) и Беннетт Богорад12 лучших реконструкция фикоцианина и аллофикоцианин стандартов среди всех протестированных уравнений (рис. 6). Стрептомицина сульфат, используемых в нескольких предыдущих исследований для ликвидации мембраны фрагменты содержащих хлорофилл , был показан как не обязательно для извлечения (рис. 7).
Для представителя эксперимента, Synechocystis выращивался в photobioreactor25 в turbidostat режиме, где клетки были сохранены в фазе экспоненциального роста в пределах определенного диапазона оптической плотности (измеряется в 680 нм, ОД 680) путем контролируемого разбавления свежие культивирования среднего (средне BG11 буфер с 17 мм HEPES)11,26. Культур культивировались в 32 ° C и входного воздуха содержится 0,5% CO2. Культур были освещены с красный свет (λМакс: 633 нм, λ1/2: 20 Нм) интенсивности 25-1100 мкмоль (фотонов) / (м2·s), вместе с голубой свет (λМакс: 445 Нм, λ1/2: 20 Нм) интенсивности мкмоль (25) фотоны) / (м2·s). Оптической плотности суспензии культуры измерялась photobioreactor база, и диапазон ОД680 был установлен на 0,52 - 0,58 (2 x 107 до 4 x 107 клеток/мл). Под каждой конкретной интенсивности света для по крайней мере 24 часов, чтобы обеспечить достаточно времени для адаптационного выращивали культуры. После достижения стабильности роста, культур были взяты пробы для сухого веса (согласно шаги 2,1-2,8 настоящего Протокола), клеток и фикоцианина и аллофикоцианин содержание. На рисунке 8показаны результаты оценки phycobiliprotein под увеличение интенсивности света. Synechocystis уменьшилось содержание phycobiliprotein от 12% сотовой сухого веса (505 fg/клетка) при низкой освещенности до 3% сотовых сухого веса (280 fg/клетка) под высокой освещенности.
Рисунок 1 : Сравнение эффективности извлечения метода, описанного в этом протоколе с несколькими методами ведения. Концентрация фикоцианина (черные полосы) и аллофикоцианин (Белый баров) в экстракте сырого белка была измерена после экстракции в буфере PBS для 60 мин метод A описан в рамках настоящего Протокола. Метод B была изменена следующим образом: после сбора урожая, были клетки центрифугировали (15000 x g при температуре лаборатории 5 мин) и хранятся при температуре-20 ° C на ночь. Замороженные пробы были sonicated для 120 s при температуре 4 ° C и фикобилипротеинов были извлечены в буфере PBS для 60 мин метод C был изменен метод B хранение гранул заготовленных клеток на-80 ° C в течение 30 мин, для сотовых гранулы и добавление PBS буфер для сухих гранул. D метод был изменен с Чун и др. 16: после для (же, как и метод C), 0,25 мл с 1% Стрептомицина сульфат буфере (рН 5,5) Na-ацетата был добавлен к сухим сотовой Пелле, вместе с 0,25 мл циркония бусины (с диаметром 0,5 мм), и образцы были гомогенизированные дважды для 60 s на гомогенизатор. После гомогенизации, другой 0,5 мл Na ацетат с 1% Стрептомицина сульфат буфере (рН 5,5) был добавлен к образцу, трубы были vortexed и белки были извлечены на льду, за 30 мин метод E состоит из одного цикла замораживания оттаивания в буфере PBS и экстракции белка для 24 ч при 4 ° C. Метод F (врезные рисунок) состояла из одной и шесть циклов замораживания клетки (первоначально, Сублимированные замораживанием и высокомобильна в буфере PBS) в жидком азоте, а затем sonication на льду. Из-за значительных хлорофилл присутствия в сырого белка выдержке фикобилипротеинов были количественно не в методе F. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Концентрации пигмента были рассчитаны по формулам (1) и (2) настоящего Протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Эффект времени усреднения на эффективность извлечения phycobiliprotein. Лиофилизированные гранулы Synechocystis клеток (в зависимости от меры 3.1-3.5 настоящего Протокола) были сорваны с стеклянные бусы на гомогенизатор для 5 s, 15 s и 20 s. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Phycobiliprotein эффективность добычи в различные буферы извлечения. Фикобилипротеинов были извлечены в буфере PBS, в буфере PBS с добавлением 100 NaCl или 150 мм KCl, в деионизированной воде с 100 NaCl или 150 мм KCl, согласно Hemlata и Fareha22и в ацетат натрия 20 мм согласно Чун et al < / C4 >. 16. добыча была исполнена на 4 ° C согласно шаги 4.1-4.3 настоящего Протокола. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Phycobiliprotein стабильность в буфере извлечения времени. После процедуры извлечения, выполняется, как описано в шагах 4.1-4.3 настоящего Протокола phycobiliprotein экстракт в PBS буфере (рН 7,4) хранился при температуре 4 ° C до 4 часов, без значительных фикоцианина (круги) и деградация аллофикоцианин (квадраты). Пунктирная линия представляет линейную fit моментов времени, вычисляется методом наименьших квадратов. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель измерения концентраций фикоцианина и аллофикоцианин в Synechocystis. Подвеска плотная культуры (фикоцианина: 456 мкг/мл, аллофикоцианин: 106 мкг/мл) был постепенно разбавляют до концентрации 19 мкг/мл для фикоцианина и аллофикоцианин. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пунктирная линия представляет линейную fit точек концентрации, вычисляется методом наименьших квадратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Оценка концентраций фикоцианина и аллофикоцианин в стандартах пигментов. Содержание и аллофикоцианин в стандартах пигмента фикоцианина было измерено спектрофотометрически по формулам Беннетт и Богорад12, Людер и др. 13, Сампатх-Уайли и Neefus15, Эванс14и Чун и др. 16. содержание белка в стандартах (как необходимых для определения фикобилипротеинов) был количественно с помощью решения bicinchoninic кислоты, натрия карбонат, натрия тартрата и бикарбоната натрия в 0,1 Н NaOH (с окончательной pH 11,25), в реакция с 4% (w/v) Небходимая сульфата пентагидрат27, используя альбумина bovine сыворотки как белок стандарта. Уравнения Беннетт и Богорад предусмотрено высоким реконструкция обоих пигменты: 96% фикоцианина стандартных и 99% аллофикоцианин стандарта. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пунктирная линия выделяет точку 100%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Эффект Стрептомицина сульфат на спектр сырой белок поглощения экстракта в буфере PBS. (A) добыча процедура, как описано в шагах 4.1-4.3 настоящего Протокола и (B), используя sonication, как описано в Легенда о Рисунок 1 для метода F была выполнена в буфере PBS (круги) и в буфере PBS с 1% Стрептомицина сульфат (квадраты). Количественная оценка phycobiliprotein была выполнена согласно шаги 5.1-5.4 настоящего Протокола. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Концентрация фикоцианина (круги) и аллофикоцианин (квадраты) в Synechocystis выращивают под красно оранжевый свет интенсивности 25-1100 µmol(photons)/(m2·s). Synechocystis культур выращивали в photobioreactor при температуре 32 ° C, с 0,5% CO2 в входного воздуха, в среде культивирования BG11 дополнена 17 мм HEPES в turbidostat режиме согласно Zavrel и др. 11. phycobiliprotein концентрации были измерены согласно протоколу и содержание окончательного phycobiliprotein нормализована в клеточных сухого веса, как описано в разделе 2 настоящего Протокола. Пунктирные линии представляют власть fit измеренных точек, вычисляется методом наименьших квадратов. Изображены значения представляют собой средние от трех технических реплицирует, с погрешностей, представляющие стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает простой, быстрый и воспроизводимый метод количественного определения содержания phycobiliprotein в модели цианобактерии Synechocystis. Сравниваются несколько методов клеток гомогенизации, экстракции белков и фикоцианина и аллофикоцианин количественной оценки, и Заключительный протокол представляет собой сочетание оптимальных шагов каждый одной процедуры. Как репрезентативных данных содержание фикобилипротеинов был количественно в клетках Synechocystis под увеличение интенсивности света. Даже несмотря на то, что анализ требует аналогичного времени и лабораторное оборудование, как некоторые из опубликованных ранее методы12,13,14,,1516, преимущество этого протокола является что нет хлорофилла высвобождается в буфере добычу и, таким образом, phycobiliprotein измерения могут быть оценены с высокой точностью.
Количество необходимых для анализа phycobiliprotein суспензию клеток может варьироваться с плотностью культуры. Объем образца 1 мл оптимизирована для культур с ОД730 1,5, плотность клеток 2 x 107 клеток/мл, или для культур с phycobiliprotein содержанием около 20 мг/л. В случае разреженных культур урожай больший объем культуры. С другой стороны, в случае плотного культур, урожай ниже культуры тома в высокой плотности культур, существует риск того, что после извлечения фикобилипротеинов частично остаются в клетках. Аналогичным образом количество суспензии клеток, необходимых для определения сухого веса может варьироваться с плотностью культуры. Объем выборки 15 мл оптимизирована для культур с ОД730 1,5 или плотность ячеек 2 x 107 клеток/мл. С нижней плотности культур или с более низких объемов ошибка измерения можно увеличить. Наоборот больше культуры томов или плотной культуры обеспечивают лучший метод резолюций.
Важнейшие шаги протокола являются клетки гомогенизации и phycobiliprotein экстракции, который должен обеспечивать высокий урожай и высокая специфичность. Высокая урожайность и чистоты экстрактов с одновременным максимальная белка сохранения было достигнуто за счет для образцов, гомогенизации сухим сотовой окатышей, стеклянные бусы и выполнение phycobiliprotein экстракции в PBS буфера ( Рисунок 1). Поскольку даже небольшое загрязнение экстракта сырого протеина, хлорофилл может привести к phycobiliprotein контента переоценка, необходимо избегать любой хлорофилл добычи, добавив PBS буфера. Хлорофилл был обнаружен в сырой экстракт когда sonication был использован для разрушения клеток. Как показано на врезные рис. 1, с повторяющимися sonication циклов, количество хлорофилла в экстракте увеличилось. С другой стороны, количество извлечено белков (как определяется поглощения в 280 Нм) также возросла после повторяющихся циклах sonication. Таким образом, использование sonication (в сочетании с циклов замораживания оттаивания в жидком азоте) появляется как подходящий метод для извлечения общего белка (как бесплатные, так и мембраны прыгните белки освобождаются от клеток); Однако это не рекомендуется для целей phycobiliprotein спектрофотометрические количественной оценки. Чун и др. рекомендуется использование Стрептомицина сульфат 1% для того, чтобы ликвидировать фрагменты мембраны с хлорофиллом 16. Здесь использование Стрептомицина сульфат не представляется быть необходимым, поскольку оно не привело к сокращению хлорофилла в экстракт белка (рис. 7). Даже несмотря на то, что один sonication цикл для 120 s не нарушается эффективно работа клетки (методы B и C, рис. 1), подтвердила другие методы (например, метод F, представленные на рисунке 1 или методы, представленные в Рисунок 7B) предыдущие результаты sonication, будучи22,метод срыв эффективный клетки28. С другой стороны простой циклов замораживания оттаивания, также ранее сообщалось как эффективный метод для извлечения фикобилипротеинов22,28, условии низкие урожаи в испытаниях, описанных здесь (метод E, Рисунок 1 ). Сотовый гомогенизации (в буфере добычи, 2 x 60 s), циркония бисер был испытан как менее эффективным, чем 15-s гомогенизации лиофилизированной сотовой Пелле (метод D, рис. 1). Процедура гомогенизации в буфере добычи было описано ранее с больше гомогенизации время (10 мин)29. Мы не проверяли гомогенизации дольше, чем 2 мин после пробы значительно нагревается во время каждого цикла гомогенизации. В литературе другие методы разрушение клеток также были описаны, включая использование французской прессе16 или griding13,15,30; Однако такие методы не были проверены в этом исследовании.
Экстракции белка была выполнена для 15 s (Рисунок 2) в буфере PBS. Буфер рН был 7.4, который было сообщено ранее как оптимальный для извлечения phycobiliprotein22. Добавлением NaCl или хлористого калия не улучшить эффективность извлечения phycobiliprotein (рис. 3), который противоречащим предыдущие замечания22. Однако, как указано на рисунке 3, фосфат амортизированное физиологический раствор, используемые в настоящем Протоколе содержится 154 мм NaCl (помимо 5,6 мм Na2HPO4 и 1 мм х2PO4), которые не позволяют нам установить Бесплатные NaCl PBS извлечения буфер как элемент управления. Мы также сравнили PBS буфер и натрия ацетата буфера16 эффективность добычи. Сочетание фосфат натрия и калия фосфат в буфере PBS при условии, что выше фикобилипротеинов дает (рис. 3). Этот вывод соответствует с предыдущими выводами Hemlata и др. 22.
Время экстракции phycobiliprotein был оптимизирован для 1 ч. больше добычи не приводят к значительным phycobiliprotein деградации или извлечения улучшение (рис. 4), который переписывался с предыдущей работой Лоренц и др. 28. Добыча времени короче, чем 1 час не тестировалось. Аналогичным образом добыча для более чем 4 h не тестировалось, поскольку ранее было установлено, что извлеченные фикобилипротеинов в фосфатного буфера стабильны для по крайней мере 48 h28.
Мы сравнили несколько уравнений спектрофотометрические фикоцианина и аллофикоцианин количественной оценки, как описано ранее в литературе, путем пересчета содержание обоих фикобилипротеинов в коммерческих стандартов с известными белка концентрации (рис. 6). Лучшие реконструкция обоих пигментов была достигнута с уравнениями Беннетт и Богорад12. Этот результат не был для фосфат извлечения буфер с такой буфер был использован ранее12,13,15. Он не был ни конкретных стандартов пигмент с разницу между615,618и620 (длины волн, используемых для оценки фикоцианина в предыдущих работах) в стандартный фикоцианина был 1% и разница между 650 и652 (ранее использовалось аллофикоцианин оценки12,13,,1416длин волн) в стандартный аллофикоцианин составила 3%. Кроме того разница между615 и620 в экстракт белка Synechocystis был всего лишь 2%. Такие небольшие различия в спектрах поглощения не может привести в окончательный пигмент вариации до 36% (рис. 6). Таким образом различия между отдельными уравнений скорее были подключены к вариации в phycobiliprotein вымирание коэффициенты конкретных организмов12,13,14, 15 , 16 , 17. интересно, что уравнения Чун и др. условии низкие реконструкции фикоцианина (рис. 6), хотя авторы также использовали Synechocystis для их эксперименты16.
Вместо определения одного длин волн, рекомендуется измерить непрерывный спектр экстракта phycobiliprotein между 280-720 Нм, для оценки наличия хлорофилла в экстракт, которые могут помешать с обоими аллофикоцианин и фикоцианина поглощения. Кроме того, путем измерения оптической плотности при 280 Нм (280), чистоту фикоцианина (615/A280 или620/A280)21,22 и аллофикоцианин (652/A280) 24 в экстракт может быть оценена (0,7: пищевой, 3.9: реактивный класс, > 4.0: чда)21.
Как репрезентативных данных концентрация фикоцианина и аллофикоцианин в Synechocystis было определено при увеличении интенсивности света. Сохранение культуры плотность на постоянном уровне в рамках режима turbidostat в выращивании11,21 имеет важное значение для прямого сравнительного эксперимента. Концентрации фикоцианина и аллофикоцианин в 10,2% - 2,4% и 0,6% - 1,7% сотовой сухого веса, соответственно, были похожи, как сообщалось ранее значения11,,3132. Кроме того phycobiliprotein контента за ячейкой был похож, как сообщалось ранее,11,33. С увеличение света содержание фикобилипротеинов уменьшилось. Интересно, что даже при высокой интенсивности света 1100 мкмоль (фотонов) / (м2·s), фикобилипротеинов были не полностью обесцвеченные.
Поскольку протокол требует только стандартное оборудование и относительно быстро, он может легко принят в любой лаборатории, в которой регулярно анализируются фикобилипротеинов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Протокол был принят от предыдущей публикации11. Т. з., Ch. ум и J. Č. были поддержаны министерства образования, молодежи и спорта Чешской Республики в рамках национальной программы устойчивого развития я (НПУ я), предоставить номер LO1415. J. Č. было также поддержано GA CR, номер гранта 18-24397S. Доступ к документам и другим объектам было поддержано чешский исследовательской инфраструктуры для систем биологии C4SYS (проект не LM2015055). М. а. с. была поддержана грантом от российского фонда науки [№ 14-14-00904].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
