Summary
Burada, kantitatif spektrofotometrik yöntemle Synechocystis cyanobacterium phycobiliprotein içeriğini belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Çıkarma yordamı diğer Siyanobakteriler ve yosun suşları için de başarıyla uygulandı; Ancak, pigment soğurma spektrumları farklılığı nedeniyle, tek tek her zorlanma için spektrofotometrik denklemler test gereklidir.
Abstract
Bu modeli cyanobacterium Synechocystisiçeriğinde phycobiliprotein kantitatif tayini için basit bir protokoldür. Phycobiliproteins phycobilisomes, büyük ışık-hasat anten Siyanobakteriler içinde en önemli bileşenleri ve birkaç yosun özellikleri vardır. Synechocystis phycobilisomes iki phycobiliproteins içerir: phycocyanin ve allophycocyanin. Bu iletişim kuralı, verimli, basit ve güvenilir yöntem phycocyanin ve allophycocyanin bu modeli cyanobacterium yılında niceliksel belirlenmesi için açıklar. Biz phycobiliprotein çıkarma ve spektrofotometrik miktar birkaç yöntem göre. Bu protokol için açıklandığı gibi çıkarma yordamı Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., gibi diğer Siyanobakteriler suşları için de başarıyla uygulandı ve Nostoc sp., de kırmızı alg Porphyridium cruentumolarak. Ancak, çeşitli özellikleri üzerinden belirli phycobiliproteins tükenme katsayıları farklı olabilir ve bu nedenle, tek tek tek her zorlanma için spektrofotometrik miktar yöntemi doğrulamak için tavsiye edilir. Protokol az zaman gerektirir ve yalnızca standart donanım gerektirir beri herhangi bir standart yaşam bilim laboratuarında gerçekleştirilebilir.
Introduction
fPhycobiliproteins prokaryotik Siyanobakteriler (Cyanophyta) ışık-hasat anten ve birçok ökaryotik takson (Glaucophyta, Rhodophyta ana bileşenlerini temsil suda çözünen pigment-protein kompleksleri vardır ve Cryptophyta)1. Bunlar esas supramolecular kompleksleri phycobilisomes denilen ortaya ve fotosentetik membran yüzeyine stromal tarafında, Cryptophytanereye phycobiliproteins lokalize dışında genellikle takıldıkları thylakoid lümen2. Phycobiliproteins dört tür tarihine kadar tespit edilmiştir: çekirdek allophycocyanin ve periferik phycocyanin, phycoerythrin ve phycoerythrocyanin1. Işık-hasat ana kompleksler, phycobilisomes yosun ve Siyanobakteriler kitle kültürü verimlilik çok önemli faktörlerden biri temsil eder. O phycobilisomes kesme biyokütle birikimi güçlü ışık3altında geliştirebilirsiniz kanıtlanmıştır. Öte yandan, mütevazı veya düşük olma altında büyüme oranları ve biyokütle birikimi azaltma3,4anten kesme sonuçlandı. Phycobiliproteins ticari olarak yiyecek renklendirici, eczacılık ve kozmetik sanayi, gıda katkı maddeleri ve floresan olarak kullanılan probları akış sitometresi, floresan uzun ve floresan mikroskopi5uygulamaları ile.
Bu iletişim kuralı modeli cyanobacterium Synechocystisphycobiliproteins kantitatif tayin odaklanır. Siyanobakteriler temel erken fotosentetik Ototrofların vardır; Onlar Dünya'nın biyosfer 2.4 milyar yıl6' dan daha fazla bilgi için oluşturmuşlardır. Onlar azot, karbon, oksijen ve diğer öğeleri global biyojeokimyasal döngüleri çok önemli bir rol oynamaktadır. Siyanobakteriler arasında tek hücreli zorlanma tüm genomu ile ilk cyanobacterium olduğu benzersiz bir konum elde Synechocystis 7,8sıralı, eksojen DNA9tarafından doğal olarak transformable ve nispeten hızlı ve istikrarlı büyüme10,11gerçekleştirir. Synechocystis, çekirdek anten bileşeni allophycocyanin, integral membran proteinlerinin ile ilişkili ve ekli phycocyanin thylakoid membran çevre üzerinde yer alır.
Phycobiliprotein ayıklama ve miktar için birkaç yöntem bu protokolde karşılaştırılır. Son çıkarma yordamı başarıyla Synechocystisyanı sıra Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira de dahil olmak üzere diğer Siyanobakteriler suşları için uygulandı SP.ve Nostoc sp. ve de başarıyla uygulanma kırmızı alg Porphyridium cruentum. Bu nedenle, bu protokol için geliştirilen Yöntem phycobiliprotein çıkarılması için evrensel bir yöntem olarak kabul edilebilir. Birkaç test ayıklama yöntemi daha yüksek toplam protein verimleri sonuçlandı olsa bile, klorofil bir kalıntı en düşük içeriği ile birlikte en yüksek phycobiliprotein verimleri sağlanan burada açıklanan çıkarma yordamı phycobiliprotein ayıklayın. Klorofil bir içeriğini azaltmak doğru phycocyanin ve allophycocyanin spektrofotometrik miktar için gerekli.
Phycobiliprotein emme spectra önemli ölçüde çeşitli yosun ve Siyanobakteriler türler12,13,14,15,16,17 arasında farklılık gösterir ve hatta bir tek Siyanobakteriler cins18çeşitli suşları arasında. Bu nedenle, belirli dalga boylarında ve phycocyanin ve Synechocystis allophycocyanin tespiti için kullanılan gibi emme katsayıları genellikle diğer suşları için uygun değildir. Ayrıca, Synechocystis phycoerythrin ve bazı diğer algler ve Siyanobakteriler bulunan phycoerythrocyanin içermiyor. Suşları Synechocystisdışında phycobiliproteins belirlenmesi amacıyla spektrofotometrik denklemler her zorlanma için ayrı ayrı değerlendirmeniz önerilir.
Protokol (hücresel granül ve 1 saatlik protein çıkarma gecede dağılması) iki uzun adımlar içerse de, phycobiliproteins miktar toplam çalışma zamanı 2 saatten daha uzun geldi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Siyanobakteriler ekimi
- Synechocystis hücreleri Erlenmeyer şişe veya < 10 (17 mM HEPES10kullanarakÖrneğin,) pH korumak için arabelleğe alınan BG11 orta20 photobioreactors10,19 yetiştirmek.
Not: Standart yetiştirme koşulları kontrollü bir sıcaklık gereklidir (genellikle, 30 ° C, en uygun sıcaklık 35 ° C olur)21, aydınlatma (tipik olarak, bir ışık bir yoğunluk en fazla 800 µmol [fotonlar] / [m2·s])21ve bir CO 2 kaynağı (400 mL düz panel photobioreactor CO2 konsantrasyonu doyurarak büyüme 1,700 ppm dir)21. - Kültür yoğunluğu belirlemek için spectrophotometrically, 730 kültür optik yoğunluk ölçmek nm (OD730) alternatif olarak, bir ışık yolu 1 cm. ile bir küvet kullanarak otomatik bir hücre veya bir hemasitometre kullanarak bir mikroskop altında hücreleri saymak sayaç.
2. numune hazırlama
- Phycobiliprotein yıkımı önlemek için düşük olma altında çalışır.
- Hasat kültür süspansiyon güvenli kilit tüpler için 3 x 1 mL. Ölçüm Teknik hata tahmini için triplicates kullanın. Kültür örnekleme Steril koşullar altında gerçekleştirmek için laminer kukuIeta hücrelerde hasat ve uygun çalışma ve iş güvenliği uygulamaları izleyin.
- 15.000 x g , laboratuvar sıcaklığında 5 dk. düzgün dengeli santrifüj rotor dikkat için hücreleri santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sonra supernatants atın. Pelet bozmamaya dikkat edin.
- Örnekleri bir dolaba koydum. Uzun süreli depolama için örnekleri-80 ° C'de tutmak. Bu phycobiliprotein yıkımı önlemek gereklidir. Kısa süreli depolama için-20 ° C yeterli olur.
- Örnekleri gecede şeytanibir. Uygun bir freeze-drying işlem için-60 ° C altında donma kurutma makinesi kondansatör sıcaklığı tutmak ve donma kurutma makinesi basıncı Oda yaklaşık 1 inç.
- Freeze-drying döngüsü bittikten sonra en kısa zamanda su hava emiliminin önlemek için tüp kapatın.
3. hücre homojenizasyon ve pigmentler çıkarma
- Her örnek tüp için dört adet cam boncuk (2 mm çaplı) ekleyin ve tüpler kapatın.
Not: homojenizasyon için kullanılan güvenli kilit tüp kapak çok ince olduğunda, homojenizasyon sırasında zarar verebilir; Bu nedenle, yalnızca güvenli kilit tüpler güçlü kapakları ile bu iletişim kuralı için tavsiye edilir. - 15 cam boncuk örnekleriyle homojenize laboratuvar sıcaklığında bir homogenizer s.
Not: Düzgün homojenize bir örnek güvenli kilit tüpler bütün iç yüzeyi üzerine yayılır. - PBS arabellek (pH 7,4), 1 ile 4 ° C arasında phycobiliproteins ayıklamak için örnekleri için precooled mL ekleyin.
Not: Bu adımından örnekleri ayıklanan protein yıkımı önlemek için buz üzerinde tutun. Bu çok önemlidir. - Örnekleri PBS ile 5 için karıştırın, laboratuvar sıcaklığında homogenizer s.
Not: karıştırma sonra yeşilimsi örneklerindendir. - Karıştırma sonra buz 60 dk. kapak örnekleri buz banyosu pigmentler yıkımı önlemek için bir kapak ile tutun.
- Phycobiliprotein ekstraksiyon 60 dk sonra santrifüj kapasitesi 15.000 x g 5 dk. düzgün santrifüj rotor dengelemek için dikkat 4 ° C'de de örnekleri.
Not: Santrifüjü sonra Camgöbeği mavi renk süpernatant vardır.
4. Phycobiliprotein miktar
- Spektrofotometrik ölçüm önce PBS arabellek boş bir parola kullanarak temel spektrofotometre kalibre.
- Spektrofotometre kalibre edilmiş, PBS üzerinden bir spektrofotometre küvet atmak ve süpernatant ile atılan arabelleği ile yerine ayıklanan phycobiliproteins pipette.
- Phycobiliprotein toplama spectrophotometrically, 0,5 yarık genişliğini kullanarak ölçmek nm.
- Phycocyanin ve allophycocyanin karşı PBS arabellek 615 boş phycocyanobilins absorbans ölçmek nm (bir615) ve 652 nm (bir652), sırasıyla ve 720, hücresel enkaz absorbans ölçmek nm (bir720).
- Konsantrasyon phycocyanin ve allophycocyanin denklemler göre (1) ve (2), Bennett ve Bogorad12Hesapla:
Not:615,652ve bir720 spektrofotometre doğrusal absorbans aralığına uygun olmalıdır. Gerekirse, PBS arabellek örnekle oranında seyreltin.
- Orijinal örnekleri pigment konsantrasyon yeniden hesaplayın. Pigment konsantrasyon örnek denklemler (1) ve (2) kültürünün 1 mL ve 1 mL ayıklama arabellek analizi için kullanılır sonuçları ile doğrudan karşılık gelir. Siyanobakteriler örnekleri ve/veya PBS arabellek farklı birimleri kullanma durumunda, son pigment konsantrasyon Denklem (3) göre hesaplanması gereken:
(3)
Not: hücre Kuru ağırlık başına normalize bir phycobiliprotein içerik durumunda son pigment konsantrasyon Denklem (4) göre hesaplanması gereken
(4)
(3)
(4)5. (isteğe bağlı) hücre Kuru ağırlık tespiti
- Üç boş kasa-kilit tüpler analitik bakiyelere tartın.
Dikkat: Kasa kilidi tüpler kuru önemlidir. Tüpler bir ıslak ortamda saklanması durumunda, tüpler bir dondurma onları ağırlığında önce kurutma makinesi birkaç saat kuru. Tüpler yavaşça işlemek ve malzeme ve araştırmacı parmaklar arasında herhangi bir temas önlemek için yalnızca Pudrasız eldivenli elleri olan. Tüm sahipleri tutmak ve temiz herhangi bir malzeme transfer tüpler için önlemek için santrifüj kapasitesi. - Örnek 15-mL konik tüp kültür süspansiyon 1 x 15 mL.
- Kültür süspansiyon içeren her 15 mL su üç ek 15 mL konik tüpler, 4.000 x g laboratuvar sıcaklık 10 dk. denge santrifüj rotor için de 15 mL konik tüpler santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sonra 12 mL süpernatant atmak.
- Pelet kalan süpernatant içinde resuspend ve 3 x 1 mL karışımı üç 1.5 mL güvenli kilit tüpler bir pipet ile aktarın. Pelet artıklardan 15 mL konik tüp içinde kalması durumunda, konik Tüp, girdap veya kalan resuspend için tüp cips ve 3 x 0.5 mL karışımı üç 1.5 mL güvenli kilit tüpler (zaten containi aktarmak sallamak için 1,5 mL deiyonize su ekle NG Pelet 3 x 1 mL) ile bir pipet.
Not: Pelet üç 1.5 mL güvenli kilit tüpler üzerinde bölme Kuru ağırlık ölçü herhangi bir teknik hata tahmin sağlayacaktır. - 1.5 mL güvenli kilit tüpler 15.000 x g , laboratuvar sıcaklığında 5 dk. denge için de hücrelerde 1 mL su içeren ek bir 1.5 mL güvenli kilit tüp ile santrifüj rotor santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sonra supernatants atın.
- Örnekleri dondurucuya koydum. Uzun süreli depolama için örnekleri-80 ° C'de tutun; kısa vadeli depolamak için-20 ° C yeterli olur.
- Örnekleri gecede şeytanibir. Uygun bir freeze-drying işlem için donma kurutma makinesi kondansatör-90 ° C'den sıcaklığı tutmak ve donma kurutma makinesi basıncı Oda yaklaşık 1 inç.
- Dağılması sonra tüpler kapatın ve örnekleri analitik bakiyelere tartın.
Not: Kuru ağırlık değeri hücre Kuru ağırlık başına phycobiliprotein içerik normalleştirme için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk yöntem sınavlara Erlenmeyer şişe üzerinde bir shaker kültürlerde toplu olarak ekili Synechocystis (17 mM HEPES ile desteklenmiş) BG11 ekimi orta-20 dakika 50 µmol (fotonlar) bir yoğunluk sıcak bir beyaz ışık altında 25 ° C / (m 2·s) ve kodlamayla atmosferde % 1 CO2 . Ekimi sırasında kültür güvenli kilit tüpler için örnek ve (15.000 x g 5 min için laboratuvar sıcaklığında) centrifuged, süpernatant atıldı ve örnekleri ya-80 ° C'de depolanan ve için hazırlık olarak dondurulmuş Bu protokol tek tek adımları veya -20 ° C veya-80 ° C karşılaştırmalı analiz ayıklama ve quantifications saklı.
Test ayıklama yordamlar tarafından sonication, homojenizasyon zirkon boncuk PBS arabellek ve donma-çözülme ile hücre bozulma bulunuyordu. Farklı çıkarma yöntemleri sonuçları Şekil 1' de özetlenmiştir. Bu protokolde açıklandığı gibi yöntemi ile birlikte en düşük klorofil bir kirlenme ayıklama arabellekte en yüksek phycobiliproteins verimleri sağlanan. Sonication için hücre bozulma kullanıldığında klorofil bir ayıklama arabellekte algılandı. Yinelenen döngüler donma ve çözdürme buz üzerinde bir ultrason banyo örneklerinde yüksek protein verimleri ayıklama arabellekte sonuçlandı. Ancak, aynı zamanda, klorofil bir ayıklama arabellekte konsantrasyonu (Şekil 1 iç metin), hangi uygun phycobiliprotein içerik miktar hariç arttı.
15 s. homojenizasyon kısa her ikisi için en uygun homojenizasyon zamandı (5 s) ve uzun (20 s) dönemleri sağlanan biraz daha düşük phycobiliprotein verimleri, Şekil 2' de gösterildiği gibi. 2 mm çapında cam boncuk hücrelerle homojenizasyon en yüksek verimleri 0,5 mm, 1 mm veya 4 mm çapında cam boncuk ile zirkon boncuk 0.5 mm çapında veya deniz kum taneleri ile karşılaştırıldığında sonuçlandı. PBS ayıklama arabellek phycobiliproteins çıkarılması (Şekil 3) için en uygun tampon olarak test edildi. 100 mM NaCl veya 150 mM KCl PBS arabellek veya suya eklenmesi phycobiliprotein ayıklama verimliliğini artırmak değil ve aynı 20 mM sodyum asetat arabellek çıkarma (Şekil 3) için kullanmak için gitti. (240 dakika) daha fazla süre sonra phycobiliprotein toplama çıkarma arabellekte önemli ölçüde değişmedi çünkü en iyi phycobiliprotein ayıklama zaman 60 dakika oldu (Şekil 4).
Biz de spektrofotometre doğrusallık aralığı phycobiliprotein ölçüm (Şekil 5) için test ve phycobiliprotein miktar, birkaç denklemler phycocyanin ve allophycocyanin standartları (Şekil 6) kullanarak karşılaştırıldığında. Bu protokol için kullanılan spektrofotometre gösterdi bir doğrusal absorbans Aralık arasında 0.1 - 3.0 (Şekil 5). Spectra protein özü, maksimal emme yaklaşık 620 beri nm (bir620) ve vasıl 652 nm, emme (bir652) yapıldı bir620 (Şekil 7), spektrofotometre doğrusallık bir652 (maksimum için sadece % 33 allophycocyanin absorbans) yalnızca bir652 1.16 in kadar test edildi. Denklemler (1) ve Bennett ve Bogorad (2),12 phycocyanin ve allophycocyanin standartları tüm test denklemler (Şekil 6) arasında en iyi yeniden inşası. Streptomisin sülfat, membran ortadan kaldırılması içeren klorofil bir, parçaları için birkaç önceki çalışmalarda kullanılan gösterildi (Şekil 7) çıkarılması için gerekli gibi değil.
Temsilcisi deneme için Synechocystis nerede hücreleri tutulan üstel büyüme aşamasında optik yoğunluk tanımlanmış bir Aralık içinde bir turbidostat rejim photobioreactor25 ekili (680 ölçülen nm, OD 680) tarafından bir taze ekimi Orta (17 mM, HEPES tampon BG11 orta)11,26tarafından kontrollü bir seyreltme. Kültürler 32 ° C'de ekili ve giriş hava % 0.5 CO2yer. Kültür kırmızı ışık ile aydınlatılmış (λmax: 633 nm, λ1/2: 20 nm) 25-1100 µmol (fotonlar) bir yoğunluk / (m2·s), mavi bir ışık ile birlikte (λmax: 445 nm, λ1/2: 20 nm) 25 µmol (bir yoğunluk Fotonlar) / (m2·s). Kültür süspansiyon optik yoğunluk photobioreactor Bankası tarafından ölçüldü ve OD aralığı680 0,52 için - kuruldu 0,58 (2 x 107 4 x 107 hücre/ml). Kültürler her belirli ışık şiddeti calıştıkları yeterli zaman sağlamak amacıyla en az 24 saat altında ekili. Büyüme istikrar ulaştıktan sonra kültürler kuru ağırlığı (göre adımlar 2,1-2.8 Bu protokol), hücre sayısı ve phycocyanin ve allophycocyanin içerik için örnek. Işık yoğunluklarda artan altında phycobiliprotein değerlendirme sonuçlarını Şekil 8' de gösterilmiştir. Synechocystis hücresel kuru ağırlığı (505 fg/hücre) % 12'si phycobiliprotein içerikten hücresel kuru ağırlığı (280 fg/hücre) en yüksek olma altında % 3 en düşük olma altında azalmıştır.
Resim 1 : Bu protokol için birkaç başvuru yöntem ile açıklanan yöntemi ekstraksiyon etkinliğinin karşılaştırılması. Çekme 60 dk Yöntem A için PBS arabellek içinde bu protokolde anlatılan sonra phycocyanin (siyah çubuklar) ve allophycocyanin (beyaz çubukları) ham protein özü konsantrasyonu ölçülmüştür. Yöntemi B aşağıdaki gibi değiştirildi: hasat sonrası, hücreleri vardı (15.000 x g 5 min için laboratuvar sıcaklığında) centrifuged ve gecede-20 ° C'de depolanan. Donmuş numuneler için 120 sonicated s 4 ° C'de ve phycobiliproteins çıkarılan PBS arabellekte için 60 dk. yöntemi C B yönteminden granül-80 ° C'de 30 dk, hücresel granül dağılması için hasat hücrelerinin depolayarak güncellenmiştir ve Kuru granül ekleyerek PBS arabelleğe. Yöntemi D Chung ve arkgüncellenmiştir. 16: dağılması sonra (aynı yöntemi C olduğu gibi), Na-asetat 0.25 mL % 1 streptomisin sülfat arabelleği (pH 5.5) ile birlikte (0,5 mm çaplı), zirkonyum boncuk 0.25 mL kuru hücresel Pelet eklendi ve örnekleri iki kez homojenize 60 s homogenizer. Homojenizasyon sonra Na-asetat başka bir 0.5 mL % 1 streptomisin sülfat arabelleği (pH 5.5) ile örnek için eklendi, tüpler vortexed edildi ve PBS arabellekte tek bir donma-çözülme döngüsü 30 dk Yöntem E oluşan için proteinler buza elde ve protein çıkarma 4 ° C'de 24 h için (Başlangıçta, dondurulmuş ve PBS arabellekte resuspended) hücreler sıvı azot buza sonication tarafından takip, buz gibi bir ila altı döngüsü yöntemi F (iç metin şekil) oluşuyordu. Önemli klorofil nedeniyle bir varlığı ham protein özü, phycobiliproteins yöntemi F. içinde sayısal değil Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Pigment konsantrasyonları denklemler göre (1) ve (2), bu iletişim kuralı hesaplanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Phycobiliprotein ayıklama verimliliği homojenizasyon zaman etkisi. Lyophilized granül (adımları 3.1-3.5 Bu protokol) göre Synechocystis hücrelerinin cam boncuk homogenizer 5 için tarih ile kesintiye s, 15 s ve 20 s. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Phycobiliprotein ayıklama verimliliği çeşitli ayıklama arabelleklerindeki. Phycobiliproteins PBS arabelleği, 100 mM NaCl veya 150 mM KCl bir eklenmesi ile PBS arabellekte, deiyonize su ile 100 mM NaCl veya 150 mM KCl göre Hemlata ve Fareha22ve 20 mM sodyum asetat Chung göre elde ve ark < / C4 >. 16. çıkarma adımları 4.1-4.3 Bu protokol göre 4 ° C'de gerçekleştirildi. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Phycobiliprotein zaman ayıklama arabellekte istikrardır. Bu protokolü 4.1-4.3 adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirilen çıkarma yordamı sonra PBS arabelleği (pH 7,4) phycobiliprotein özü 4 ° C'de hiçbir önemli phycocyanin (daireler) ve allophycocyanin (kare) bozulması ile ilâ 4 saat boyunca depolanmıştır. Kesikli çizgi en küçük kareler yöntemi ile hesaplanan zaman puan doğrusal Sığdır temsil eder. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Phycocyanin ve allophycocyanin konsantrasyonlarda temsilcisi ölçümleri Synechocystis. Yoğun kültür süspansiyon (phycocyanin: 456 µg/mL, allophycocyanin: 106 µg/mL) yavaş yavaş 19 µg/mL phycocyanin ve allophycocyanin için bir konsantrasyon kadar düşürülmüştü. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Noktalı çizgi en küçük kareler yöntemi ile hesaplanan konsantrasyon puan doğrusal uyum gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Pigmentler standartları phycocyanin ve allophycocyanin konsantrasyonlarda tahmini. İçeriği allophycocyanin pigment standartlarında ve phycocyanin spectrophotometrically Bennett ve Bogorad12, denklemler göre ölçüldü Lüder ve ark. 13, rıdvan Wiley ve Neefus15, Evans14ve Chung ve ark. 16. protein içeriği (olarak phycobiliproteins tayini için gerekli) standartlarında sayılabilir (ile son pH değeri 11,25), bicinchoninic asit, sodyum karbonat, sodyum tartarat ve 0.1 N NaOH sodyum bikarbonat bir çözüm kullanarak %4 (w/v) copper(II) ile reaksiyonu pentahydrate27Sığır serum albumin proteini standart kullanarak, sülfat. Denklemleri Bennett ve Bogorad, her iki pigmentler en yüksek yeniden inşası sağlanan: phycocyanin standart % 96 ve allophycocyanin standart % 99. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Kesikli çizgi % 100 noktasını vurgular. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Ham protein soğurma spektrumu streptomisin sülfat etkisi ayıklamak PBS arabellekte. Bu iletişim kuralı veya (B) sonication için PBS arabellek (daireler) ve % 1'ile desteklenmiş PBS arabellek yöntemi F gerçekleştirildi Şekil 1 göstergede açıklandığı gibi kullanarak adımları 4.1-4.3 açıklandığı gibi (A) çıkarma yordamı streptomisin sülfat (kare). Phycobiliprotein miktar bu protokol 5,1-5,4 adımlardan gerçekleştirildi. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Phycocyanin (daireler) ve allophycocyanin (kare) içinde konsantrasyon Synechocystis 25-1100 µmol(photons)/(m2·s) bir yoğunluk kırmızı-turuncu ışık altında yetiştiriliyor. Synechocystis kültürler içinde bir photobioreactor 32 ° C'de % 0.5 CO2 giriş havada BG11 ekimi orta turbidostat rejim Zavrel vd göre 17 mM HEPES ile takıma ekili 11. phycobiliprotein konsantrasyonları bu protokole göre ölçüldü ve son phycobiliprotein içeriği bu protokolün 2 bölümde açıklandığı gibi hücresel Kuru ağırlık normalleştirilmiş. Kesik çizgiler en küçük kareler yöntemi ile hesaplanan ölçüm noktalarının güç uygun temsil eder. Görülen değerler ortalamalar üç teknik çoğaltır, standart sapmalar temsil eden hata çubukları ile temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı modeli cyanobacterium Synechocystisiçeriğinde phycobiliprotein miktar için basit, hızlı ve tekrarlanabilir yöntemi açıklar. Hücre homojenizasyon, protein çıkarma ve phycocyanin ve allophycocyanin miktar birkaç yöntem karşılaştırılır ve son iletişim kuralı tek her yordam en iyi adımlardan bir birleşimini temsil eder. Temsilcisi veri phycobiliproteins içeriğini ışık şiddeti artan altında Synechocystis hücrelerdeki sayısal. Labaratuar donanımları daha önce yayımlanmış yöntemleri12,13,14,15,16bazıları gibi ve benzer zaman analiz gerektirir rağmen bu iletişim kuralını avantajdır hiçbir klorofil bir ayıklama arabellek ve phycobiliprotein ölçüm, bu nedenle serbest bırakılmasını yüksek hassasiyetle tahmin edilebilir.
Hücre süspansiyon phycobiliprotein analiz için gerekli miktarı ile kültür yoğunluğu değişebilir. 1 ml numune hacmi 1.5, yaklaşık 2 x 107 hücre/mL hücre yoğunluğu OD730 kültürlerle, veya yaklaşık 20 mg/l phycobiliprotein içeriğini ile kültürler için en iyileştirilmiş olan Seyreltilmiş kültürler söz konusu olduğunda, daha büyük bir kültür hacim hasat. Öte yandan, yoğun kültürler söz konusu olduğunda, bir alt kültür birim-in yüksek yoğunluklu kültürler hasat, phycobiliproteins kısmen hücrelerde çıkarma sonra kalır. bir risk. Benzer şekilde, hücre süspansiyon kuru ağırlığı tayini için gerekli miktarı ile kültür yoğunluğu değişebilir. 15 mL örnekleme hacmi 1.5 OD730 veya yaklaşık 2 x 107 hücre/mL hücre yoğunluğu ile kültürler için optimize edilmiştir. Düşük yoğunluk kültürler veya düşük miktarlar, ölçüm hatası artırabilir. Aksine, daha büyük kültür birimleri veya daha yoğun kültür daha iyi yöntem kararları sağlar.
Kritik Protokolü'nün yüksek verim ve yüksek özgüllük sağlamalıdır hücre homojenizasyon ve phycobiliprotein çıkarma adımlardır. En yüksek verimi ve özleri ile eş zamanlı en fazla protein koruma saflığı örnekleri dağılması, cam boncuk tarafından kuru hücresel granül homojenizasyon ve phycobiliprotein ayıklama ( PBS arabellekte performans elde yapıldı. Şekil 1). Ham protein özü klorofil bir tarafından bile küçük bir kirlenme phycobiliprotein içerik tahmindi neden olabilir beri PBS arabelleği ekleyerek herhangi bir klorofil bir ayıklama önlemek gereklidir. Sonication için hücre bozulma kullanıldığında klorofil bir ham hulâsa içinde tespit edildi. Şekil 1, iç metin içinde yinelenen sonication döngüler, klorofil bir özü artış miktarı ile gösterildiği gibi. Öte yandan, protein miktarı çıkarılan (280 absorbans tarafından algılanan gibi nm) da sonra yinelenen sonication döngüler artırdı. Bu nedenle, toplam protein çıkarılması için uygun bir yöntem olarak (içinde donma-çözülme çevrimleri sıvı azot ile birlikte) sonication kullanımı görünür (ücretsiz hem membran bağlı proteinler hücrelerden salınır); Ancak, bu phycobiliprotein amacıyla spektrofotometrik miktar tavsiye edilmez. Chung ve ark. membran parçaları klorofil bir16. ile ortadan kaldırmak için % 1 streptomisin sülfat kullanımı tavsiye Burada, streptomisin sülfat kullanımı klorofil bir protein özü (Şekil 7) azaltılması için yol vermedi bu yana gerekli değil olduğu ortaya çıktı. Bir tek sonication döngüsü için 120 rağmen s-değil bozabilir hücreleri verimli bir şekilde (Yöntem B ve C, Şekil 1), diğer Yöntemler (Örneğin, yöntem olarak Şekil 1 veya Şekil 7Biçinde sunulan yöntemleri sunulan F) doğruladı bir etkin hücre bozulma yöntemi22,28olmak sonication önceki bulguları. Öte yandan, burada açıklanan testleri (yöntemi E, resim 1 en düşük verimleri de daha önce phycobiliproteins ayıklama22,28, verimli bir yöntem olarak rapor basit donma-çözülme çevrimleri sağlanan ). Homojenizasyon hücre (2 x 60 ayıklama arabelleğindeki s) tarafından Zirkonyum boncuk kurutulmuş hücresel Pelet (yöntemi D, Şekil 1) 15-s homojenizasyon daha verimli olarak test edildi. Ayıklama arabellek homojenizasyon yordamda daha önce bir daha uzun homojenizasyon zaman (10 dakika)29ile tanımlanmıştır. Biz did değil sınav 2 dk daha uzun süre homojenizasyon önemli ölçüde her homojenizasyon döngüsü sırasında ısıtılan örnekleri beri. Literatürde, diğer hücre bozulması yöntemlerini de açıklanan, bir kahve makinesi16 veya aşmaktadır13,15,30kullanımı da dahil olmak üzere; Ancak, bu tür yöntemler bu çalışmada test değil.
Protein ayıklama için 15 gerçekleştirildi PBS tampon s (Şekil 2). Tampon pH 7.4, hangi daha önce phycobiliprotein ayıklama22için en uygun olarak rapor edildi olduğunu. NaCl veya KCl eklenmesi önceki gözlemler22ters phycobiliprotein ayıklama verimliliği (Şekil 3), geliştirmek değil. Ancak, Şekil 3' te gösterildiği gibi fosfat tamponlu tuz çözüm olarak bu iletişim kuralı kullanıldığında 154 mM kurmak bize izin vermedi NaCl (5.6 mM Na2HPO4 ve ek 1 mM KH2PO4), bulunan PBS ayıklama arabellek NaCl ücretsiz kontrol olarak. Biz de PBS tamponu ve sodyum asetat arabellek16 ayıklama verimliliği karşılaştırıldığında. Sodyum fosfat ve potasyum fosfat PBS arabelleğindeki verimleri daha yüksek phycobiliproteins (Şekil 3) sağlanan. Bu bulgu Hemlata ve arkönceki bulguları ile denk. 22.
1 h. uzun ayıklama Lawrenz ve arkönceki çalışma ile denk önemli phycobiliprotein bozulma ya da çıkarma iyileştirme (Şekil 4), için yol değil için phycobiliprotein çıkarma zamanı optimize edildi. 28. 1 h test daha kısa bir çıkarma zamanı. Bu daha önce çıkarılan phycobiliproteins fosfat tampon 48 s28için kararlı bulundu benzer şekilde, çıkarma daha 4 h için test değil.
Biz her iki phycobiliproteins ticari standartlar ile bilinen protein içeriğini yeniden hesaplayarak literatürde, daha önce açıklandığı gibi birkaç denklemler spektrofotometrik miktar phycocyanin ve allophycocyanin göre konsantrasyonları (Şekil 6). Her iki pigmentler en iyi yeniden inşası Bennett ve Bogorad12denklemler ile sağlanır. Bu sonuç için fosfat belirli değildi bu yana böyle bir arabellek ayıklama arabellek kullanılan daha önce12,13,15. Ne oldu belirli pigment standartlarına beri bir615,618ve620 (phycocyanin tahmini önceki işleri için kullanılan dalga boyları) arasındaki fark % 1 ve bir arasındaki farkı phycocyanin standart oldu 650 ve bir652 (dalga boyu daha önce allophycocyanin tahmini12,13,14,16için kullanılan) standart allophycocyanin %3 idi. Benzer şekilde, Synechocystis protein özü bir615 ve620 arasındaki fark sadece % 2 oldu. Soğurma spektrumları böyle küçük farklılıklar % 36'e kadar (Şekil 6) bir son pigment varyasyon neden olamaz. Bu nedenle, bireysel denklemler arasındaki farklar oldukça değişimler belirli organizmaların12,13,14, için phycobiliprotein yok olma katsayıları bağlı idi 15 , 16 , 17. ilginçtir, denklemleri, Chung ve ark. Yazarlar ayrıca Synechocystis için onların deneyler16olmasına rağmen en düşük phycocyanin yeniden yapılanma (Şekil 6) sağlanan.
Tek dalga boylarında belirlenmesi yerine, bu phycobiliprotein özü klorofil bir ile her ikisi de engelleyebilir özü varlığını tahmin etmek için 280-720 nm arasında bir sürekli spektrum ölçmek için tavsiye edilir allophycocyanin ve phycocyanin emme. Ayrıca, 280 absorbans ölçme tarafından nm (bir280), bir saflık phycocyanin (615/A280 veya620/A280)21,22 ve allophycocyanin (bir652/A280) 24 saat içinde özü Tahmini (0,7: gıda sınıfı, 3.9: reaktif sınıf, > 4.0: analitik sınıf)21.
Temsilcisi veri ışık şiddeti artan altında phycocyanin ve allophycocyanin Synechocystis olarak tespit edilmiştir. Kültür yoğunluk turbidostat ekimi rejimi11içinde sürekli bir düzeyde muhafaza,21 doğrudan karşılaştırmalı deneme için gerekliydi. Phycocyanin ve allophycocyanin konsantrasyonu % 2.4-%10,2 ve % 0.6 - hücresel kuru ağırlığının % 1.7 sırasıyla, daha önce bildirilen değerleri11,31,32benzerdi. Ayrıca, phycobiliprotein içerik hücre başına temel olarak daha önce11,33rapor benzer. Artan ışıkla phycobiliproteins içerik düşmüştür. İlginçtir, 1100 µmol (fotonlar) en yüksek ışık yoğunluğu altında bile / (m2·s), phycobiliproteins değildi tamamen ağartılmış.
İletişim kuralı yalnızca standart donanım gerektirir ve nispeten hızlı beri bu kolayca hangi phycobiliproteins düzenli olarak analiz edilir herhangi bir laboratuvar olarak kabul edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Protokol bir önceki yayın11kabul edilmiştir. T. desteklenen Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor ulusal sürdürülebilirlik programı içinde Çek Cumhuriyeti tarafından Z., ö. bölüm ve J. Č. ben (NPU ben), sayı LO1415 verin. J. Č. Ayrıca GA CR, Grant sayı 18-24397S tarafından desteklenmiştir. Erişim cihazları ve diğer özellikler için Çek araştırma altyapı sistemleri biyoloji C4SYS (proje yok LM2015055) tarafından desteklenmiştir. M. A. S. Rus Bilim Vakfı [No 14-14-00904] bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, Paris, France | 6803 | Cyanobacterium strain |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9143.1 | Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4 |
| Eppendorf safe-lock tubes | Eppendorf, Hamburk, Germany | 30120086 | Safe-lock tubes 1.5 ml |
| VWR 80-Place Storage System | VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA | 30128-282 | Holder for safe-lock tubes |
| RAININ 100 µl -1000 µl | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 17014382 | Pipette |
| GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA | 30389272 | Pipette tips |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Germany | 4701 | Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Switzerland | 9005382197172 | Refrigerator and freezer -20 °C |
| Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | EXF24086V | Freezer -80 °C |
| CoolSafe | LaboGene, Lillerød, Denmark | 7.001.000.615 | Freeze dryer |
| UV-2600 | Shimadzu, Kyoto, Japan | UV-2600 | Spectrophotometer |
| Hellma absorption cuvettes, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z600288 | VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogenizer |
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | Z273627 | Glass bead of the diameter 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Göttingen, Germany | SECURA225D-1OBR | Analytical balances |
| C-Phycocyanin from Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P2172 | Phycocyanin standard |
| Allophycocyanin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7472 | Allophycocyanin standard |
| Bicinchoninic Acid Kit | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | BCA1, B9643 | Complete kit for total proteins determination |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | AG 130-ECO | Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere |
| Photobioreactor | Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic | FMT-150 | Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment |
| Cellometer | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA | Auto M10 | Cell counter |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS430791 | 15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 51024579 | Laminar flow hood |
References
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
- Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
- Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
- Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100 (2016).
- Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
- Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
- Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
- Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130 (2017).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
- Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
- Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
- Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
- Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
- Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
- Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
- Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
- Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
- Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
- Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
- Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
- Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
- Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
- Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
- Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133 (2015).
- Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
- Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).
