Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

המספר של הרומן biomaterials מתוכנן עבור תיקון גדול עצמות נגעים מתרחבת באופן רציף, במטרה לשפר את עצם ריפוי ולהתגבר על הסיבוכים עם השתלת עצם. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה רב תחומיים לניסויים קליניים הביו של biomaterials לתיקון העצם.

Abstract

שברים בעצמות, והמעלית גדול הם אתגר משמעותי בכירורגיה אורתופדית. למרות אוטומטי, שתלי עצם allogeneic מצוינים לריפוי פצעים כאלה, ישנם סיבוכים פוטנציאליים עם השימוש שלהם. לפיכך, מפתחים מדענים גשמי biomaterials סינתטי, מסתיימים כדי להתגבר על בעיות אלה. במחקר זה, אנו מציגים פלטפורמה רב תחומיים להערכת biomaterials לתיקון העצם. אנו משלבים מומחיות של ביולוגיה עצם ואימונולוגיה לפתח פלטפורמה כולל במבחנה אוסטאוקלסט (OC) ואת אוסטאובלסט (אבוב) מבחני ויוו העכבר מודלים של עצם תיקון, immunogenicity ו- allergenicity. נדגים כיצד לבצע את הניסויים, לסכם את התוצאות, ולדווח על הביו biomaterial. בפרט, בדקנו הכדאיות OB, בידול, ואת מינרליזציה ו OC הכדאיות ובידול בהקשר של β-tricalcium פוספט (β-TCP) דיסקים. בדקנו גם קצף (β-TCP/C) β-TCP/קולגן שהינו חומר זמין מסחרית בשימוש קלינית לתיקון עצם במודל של עכברים פגם קריטי בגודל העצם calvarial כדי לקבוע את ההשפעות על שלב מוקדם של עצם ריפוי. בניסויים מקבילים, הערכנו תגובות מערכת החיסון ו אלרגית בעכברים. הגישה שלנו יוצר פרופיל תאימות ביולוגית של biomaterial העצם עם מגוון של הפרמטרים הדרושים לניבוי את התאימות של biomaterials המשמש עבור עצם ריפוי ותיקון בחולים.

Introduction

תיקון העצם הוא תהליך מורכב זה מתחיל עם היווצרות שטף דם, דלקת, מתייבש היווצרות ובניה ואז1,2. עם זאת, פוטנציאל התחדשות העצם מוגבל לגודל של1,שבר עצם3. למשל, שברים בעצמות גדולים. הנגרם על ידי הטראומה, סרטן או אוסטיאופורוזיס לא יכול לרפא, מכונים שברים בעצמות, והמעלית. נגעים עצם לעיתים קרובות דורשים טיפול כדי לקדם את עצם בריאה פיזיולוגיים תיקון והתחדשות. כיום, השתלת עצם בשתל, להשתלת הוא הגישה של בחירה4 עם הליכי החלפת עצם 2.2 מיליון מדי שנה5. למרות הליכים אלה שיש אחוזי הצלחה גבוהים, ייתכנו סיבוכים, למשל, המוגבל של העצם, זיהום, תורם אתר תחלואה ודחייה4. חלופות חדשות עבור הנדסת רקמות העצם להיות מתבקשות לטפל באתגרים אלה.

העיצוב של biomaterials המבוססת על פולימרים טבעיים או סינתטיים, bioceramics או מתכות בשילוב עם תאים ומולקולות ביואקטיביות הוא על עלייתו6. ההבנה הנוכחית שלנו של עצם פיזיולוגיים הילינג וריפוי בהקשר של biomaterials תלוי גורמים רבים כגון תכונות מכניות גורמים המקומי ומערכתית מרובים כולל תאים זרימת הדם ואת האתר שבר7 8, ,9. Biomaterials עבור התחדשות העצם שואפת לקדם את osteogenicity ואת פונקציונלי אורתופדיים10 והם אידיאלי מסתיימים, מתכלה, נקבובי (קידום נדידת תאים, חמצן וחומרים מזינים). הם גם צריכים להיות חזק מספיק כדי לתמוך באתר שבר להקל על כאבים. בנוסף, גורמים דלקתיים נדרשים כדי להתחיל את תהליך הריפוי. עם זאת, אם biomaterial גורם דלקת מופרזת ותגובות אלרגיות, זה עלול להגביל או לעכב את עצם ריפוי11,12. לפיכך, הבינתחומיות יש צורך להעריך biomaterials שפותחו עבור תיקון עצם.

במחקר זה, אנו מציגים הערכה טרום קליניים של חומרים נציג, 1) Orthovita Vitoss קצף המהווה תחליף שתל עצם ספוגית זמינים מסחרית המורכב tricalcium פוספט המורכב בגודל ננומטר טהור β-tricalcium חלקיקים פוספט (β-TCP), סוג 1, קולגן (C) (β-TCP/C קצף) ו- 2) β-TCP דיסקים. . כאן, אנחנו להמחיש הביו בדיקה של אלה biomaterials באמצעות ראשי אוסטאובלסט (אבוב), אוסטאוקלסט (OC) assays, מודל ויוו של עצם תיקון, הערכה אימונולוגי הכוללת במבחנה לימפוציטים-T התפשטות ו ייצור ציטוקינים, ויוו immunogenicity, allergenicity, כפי שדווחה בעבר13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים נעשו עם עכברים BALB/c בעקבות הנחיות כל טיפול, שימוש של חיות מעבדה של אוסטריה משרד חינוך, מדע ומחקר, אושרו על ידי ועדת האתיקה של משרד החינוך, המדע אוסטרי ומחקר.

1. תרבות העכבר הראשי אוב

  1. OB בידוד מן העכבר neonatal calvaria באמצעות עיכול אנזימטי
    1. המתת חסד בת 1-2 יום neonatal הגורים (60 סה כ) ע י עריפת ראשו ולמקם את ראשי בצלוחית עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    2. . תחזיק את הראש על ידי העורף של הצוואר, לחתוך את העור משם באמצעות מספריים סטרילי. פצעים וחתכים החילונית על ידי פירסינג זה (כ- 0.1 – 0.3 מ"מ) עם זוג מספריים ואז מוכנס מתחת החילונית בעורף בבסיס הגולגולת, גזור לאורך הקצה calvarial רוחבית מאחורה לקדימה מעל האוזניים ולאחר מכן abov e גשר האף (איור 1).
    3. דגירה calvaria ביתור עם 8 מ של מסנן לעקר עיכול פתרון (300 יחידות/mL collagenase הסוג הרביעי ו יחידות/mL 2.14 dispase II מומס α-מינימום הכרחי בינוני (α-מם)) צינור חרוטי 50 מ ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב חממה חזק ב 200 שייקס /min.
    4. למחוק את תגובת שיקוע הראשון וחזור על הליך העיכול שלוש פעמים עם 8 מ של פתרון מערכת העיכול. לאסוף את תגובת שיקוע המכילות את התאים לאחר כל שלב העיכול ולהוסיף אותו צינור חרוטי 50 מ. לאחסן את הצינור חרוט 50 מ עם תאי באמבט מים קרים עד להשלמת ההליך עיכול (כ 40 דקות).
    5. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע (עם פיפטה פסטר המצורפת משאבת ואקום) ו resuspend ב 40 מ"ל של מדיום הגידול עצם (בגמ) המכיל α-מ עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS), ו- 1% פניצילין-סטרפטומיצין פתרון. לאחר מכן להוסיף 10 מ של התליה תא תרביות רקמה 4 צלחות (10 ס מ).
    6. התרבות התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד למפגש (2-3 ימים).
    7. הנהרות, תשאף המדיום הישן, לשטוף צלחות תרביות רקמה פעם עם 1 x PBS (37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן וארוקן את PBS, להוסיף 2 מ"ל של פתרון טריפסין 1 x המכילה 0.5% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כל צלחת תרביות רקמה של 10 ס מ.
    8. דגירה הלוחות תרבות 4-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5 דקות ולאחר מכן בדוק את הצלחות עם מיקרוסקופ אור הפוך כדי להבטיח כי התאים ינותקו מעמוד הפלסטיק. ואז להעביר תא כל המתלים (סה כ 8 מ ל) צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של בגמ טריים. לשטוף כל צלחת עם 5 מ ל בגמ ורענן העברת הצינור חרוט באותה 50 מ.
    9. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend התאים מ 16 ל בגמ טריים. להכין 16 10 ס מ תרביות רקמה את לוחיות הרישוי (פיצול 1:4) המכיל 9 מ ל בגמ. להוסיף 1 מ"ל של התליה תא כל צלחת.
    10. חזור על שלבים 1.1.6. כדי 1.1.8.
    11. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- 10 מ"ל של בגמ טריים. לספור את התאים ולחשב את הריכוז התא.
      הערה: הליך זה יוצר כ 7.5-8.3 x 105 תאים/גור.
    12. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend קפואים בינוני המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 40% α-מ ו- 50% FBS. העברה 1.5 מ של התליה תא cryovials 2 mL עבור סכום כולל של 2 x 106 תאים לכל מבחנה.
    13. פלאש להקפיא את הבקבוקונים של חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך בתוך מיכל חנקן נוזלי. השתמש בתאים תוך שנה אחת כדי להבטיח פונקציונליות מלאה. להשתמש אלה OBs העיקרי להערכת תפוצת (שלב 1.2), בידול (ALP מבחני: שלב 1.4., 1.5.) ואת מינרליזציה (שלב 1.6.) בנוכחות biomaterials. השתמש תאים אלה ההבשלה של עצם מח-נגזר מבשרי OC בתרבות שיתוף (שלב 2.3).
  2. OB התפשטות assay
    1. מראש דגירה 14 מ"מ קוטר β-TCP דיסקים 1 מ"ל של בגמ צלחת תרבות ההשעיה. ובכן 24-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 24 שעות לפני הוספת ראשי לוחות תרביות רקמה סטנדרטי תשיג לשימוש עבור פקדים, ההשעיה תרבות עומדי הדגימות biomaterial כדי הימנע תא שיצורפו לפלסטיק.
    2. האחות המדיום הדגירה מראש, ואז resuspend העכבר הראשי OBs ב בגמ. להוסיף 4.4 x 10 ס מ/OBs4 2 על גבי הדיסקים מראש מודגרות β-TCP בצלחת תרבות ההשעיה 24-ובכן, עבור קבוצת בקרה, לתוך צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (1 מ"ל/טוב). OBs לצרף את הצלחת תרביות רקמה או את biomaterial.
    3. תקופת דגירה של 14 ימים-CO 37 ° C ו-5%2. במהלך תקופת דגירה, שינוי המדיום כל 2-3 ימים ולהוסיף 1 מ"ל של בגמ טריים מכל קידוח.
    4. כדי להעריך את התפשטות OB, להעביר את הדיסקים β-TCP בימים 7 ו-14 בארות חדשות כדי לא לכלול את האותות התאים גדל על הצלחת תרבות ההשעיה.
    5. האחות המדיום הישן, להוסיף 0.5 מ ל בגמ (37 מעלות צלזיוס), דגירה הלוחות תרבות למשך 30 דקות-CO 37 ° C ו- 5%2. לאחר מכן להוסיף µL 55 של 10 x ריאגנט התפשטות תאים (1:10 דילול) ישירות לתוך התרבות היטב. עבור תאים ריקים, מכינים משלוש בארות המכילה 0.5 מ ל בגמ ו µL 55 מהתרכובת התפשטות תאים 10 x. דגירה כל הצלחות במשך 30 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.
    6. לסגת, להעביר µL 150 של תגובת שיקוע מכל קידוח לתוך צלחת שחורה 96-ובכן ולקרוא זריחה עם עירור ב 560 nm, פליטה-590 ננומטר. להחסיר את הקריאות ריק מן המקראות מדגם.
  3. מבחני הבידול והיתרון מינרליזציה אוב
    1. מראש דגירה 14 מ"מ קוטר β-TCP דיסקים 1 מ"ל של בגמ צלחת תרבות ההשעיה. ובכן 24-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 24 שעות לפני הוספת הלוחות תרביות רקמה סטנדרטי תשיג לשימוש עבור פקדים, ההשעיה תרבות עומדי הדגימות biomaterial להימנע תא שיצורפו לפלסטיק.
    2. האחות המדיום הדגירה מראש, ואז resuspend העכבר הראשי OBs ב בגמ. להוסיף 8.8 x 10 ס מ/OBs4 2 על גבי הדיסקים מראש מודגרות β-TCP בצלחת תרבות ההשעיה 24-ובכן, עבור קבוצת בקרה, לתוך צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (1 מ"ל/טוב). OBs לצרף את הצלחת תרביות רקמה או המדגם biomaterial.
    3. החלף את בגמ 1 מ"ל של מינרליזציה osteogenic בינוני (מ מ) המכיל בגמ, 50 חומצה אסקורבית µg/mL, 5 מ מ β-glycerophosphate 24 שעות לאחר התוספת של מכשול, תקופת דגירה של 14 ימים-CO 37 ° C ו-5%2. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עם 1 מ"ל של מ מ שזה עתה הוכנו מכל קידוח.
  4. בידול OB מוערך על ידי פעילות פוספטאז אלקליין (ALP) מתא lysates
    1. למדידת פעילות ALP ביום 7 לאחר התוספת של מ מ, תשאף המדיום תרבות מן הבארות ולאחר מכן לשטוף עם 1 מ"ל של PBS סטרילי x 1 (37 מעלות צלזיוס). בזהירות מחוק לגמרי מגניב כדי לאפשר את התאים המצורף כדי להישאר על תרביות רקמה פלסטיק או biomaterial ומקפיאים את הצלחות ב- 80 ° c
    2. לאחר 24 שעות (או עד שבועיים), להפשיר את הבקרה תרביות רקמה צלחת וצלחת biomaterial ההשעיה התרבות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להתכונן OB פירוק. עבור הדגימות biomaterial, להעביר את הדיסקים β-TCP לתוך צלחת חדשה של תרבות ההשעיה כדי לא לכלול את התאים מחובר לצלחת. להוסיף µL 75 לכל טוב 1 x תא פירוק מאגר שתי צלחות. לנער את הצלחות במשך 5 דקות על מטרף ב 400 שייקים/דקה.
    3. להעביר את התא lysate לתוך צינור microcentrifuge 0.5 mL צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 6 דקות ב RT להסיר את הלכלוך. להוסיף 50 µL של תגובת מדגם של lysate תא שיקוע צלחת שחורה 96-ובכן, ולאחר מכן להוסיף 50 µL של פתרון בהיקף של 200 מיקרומטר פוספט 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl (DiFMUP) fluorogenic המצע מומס 2 x מאגר ALP (pH 10) לכל טוב. להגדיר את שתי בארות ריק עם 100 µL של פתרון 1:1 המכיל מאגר של פירוק התא x 1 ו- 2 x ALP מאגר.
    4. הכנת סטנדרטים 8 עם 100 μL טוב עם 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) ועד 0.5 μM 200 מומס ב- 1:1 פתרון המכיל מאגר של פירוק התא x 1 x 2 ALP מאגר ליצירת עיקול רגיל הפניה.
    5. דגירה לוח שחור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן קרא את זריחה עם עירור ב 358 nm, פליטה-455 ננומטר. להחסיר את קריאות ריק מכל הסטנדרטים הפניה ובחומר מדגם.
    6. לנרמל את הפעילות האנזים ALP מתוך lysates התא כדי הסכום הכולל של חלבון שימוש assay ערכי צבע מוחלטים של ריכוז חלבון. להכין שור אלבומין (BSA) סטנדרטים חלבון בטווח מ 0.05 – 2.5 µg/µL מומס 1 x תא מאגר פירוק ליצירת עיקול רגיל.
    7. להכין את דגימת תאים lysates BSA חלבון סטנדרטים כפולים. להוסיף 5 µL של התא מדגם lysate או µL 5 של BSA חלבון סטנדרטית לתוך צלחת 96-ובכן ולאחר מכן להוסיף 25 µL של ריאגנט A' ו- µL 200 של ריאגנט B. קבע את שתי בארות ריק עם µL 5 1 x מאגר פירוק התא. דגירה הצלחות ב- RT למשך 15 דקות ולאחר מכן קרא את ספיגת-690 ננומטר. להחסיר את קריאות ריק מכל הסטנדרטים הפניה ובחומר מדגם.
  5. בידול OB מוערך על ידי צביעת ALP בתרבות תא
    1. כתם ALP ב- OBs בתרבית ביום 7 לאחר התוספת של מ מ על צלחת תרביות רקמה שליטה, את biomaterial בצלחת תרבות ההשעיה.
    2. האחות המדיום תרבות מן הבארות ולהחליף אותו עם 0.5 מ ל 1 x PBS (37 מעלות צלזיוס). מחוק לגמרי מגניב ולתקן את התאים על ידי המקננת בהם ב- 0.5 מ ל 10% buffered פורמלין-RT עבור 1 דקות.
    3. האחות של פורמלין 10% באגירה מלאה עם pipet לשימוש יחיד ולהוסיף 0.5 mL שטיפת מאגר (0.05% Tween20 ב 1 x PBS).
    4. להמיס טבליה המצע tetrazolium (BCIP/NBT) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl פוספט/ניטרו כחולה אחת ב 10 מ"ל של מים הנדסה גנטית, מערבולת עד התפרקה לחלוטין. הפתרון חייב להיות מוגן מפני אור ומשמשים בתוך שעתיים.
    5. תשאף המאגר לשטוף, להחליף 0.5 מ של BCIP/NBT המצע פתרון, דגירה הצלחת ב RT בחושך במשך 10 דקות לשאוב את הפתרון מכתימים ולהחליף עם 0.5 מ של מאגר לשטוף.
    6. להעביר את הדיסקים β מוכתם-TCP לתוך באר חדשה ולסרוק את הצלחות שהוכתמו ALP עם סורק גרר קונבנציונליות כדי להכתים ALP הרשומה.
  6. OB מינרליזציה מוערך על ידי צביעת עם S אדום Alizarin (ARS)
    1. תשאף המדיום תרבות מן הבארות המכיל העיקרי OBs 14 ימים לאחר התוספת של מ מ, לשטוף פעמיים עם 0.5 מ ל 1 x PBS ב RT. וביופסיה של PBS ותקן את התאים על-ידי הוספת 0.5 מיליליטר 10% buffered פורמלין פתרון ב RT 10 דקות.
    2. האחות של פורמלין 10% באגירה מלאה עם pipet לשימוש יחיד ולשטוף פעמיים עם 0.5 מיליליטר מים הנדסה גנטית.
    3. כדי מכשול קבוע, להוסיף 0.25 mL של 40 מ מ ARS מכתימים פתרון (pH 4.2) מומס במים הנדסה גנטית, דגירה את הצלחת ב RT למשך 10 דקות על מטרף-שייק 100/min.
    4. האחות הפתרון מכתימים עם pipet לשימוש יחיד ולשטוף עם 1 מ ל מים הנדסה גנטית. חזור על צעד זה 5-10 פעמים כדי להסיר לא ספציפי מכתים.
      הערה: הפתרון השטיפה צריך להיות ללא צבע.
    5. האחות המים הנדסה גנטית ולהוסיף 1 מ"ל של PBS קר. דגירה את הצלחת ב RT למשך 10 דקות על מטרף-שייק 100/min.
    6. מחוק לגמרי מגניב, להעביר את הדיסקים β מוכתם-TCP באר חדשה ולסרוק את הצלחות עם סורק משטח אופקי כדי להקליט מינרליזציה.
    7. הוסף 0.25 mL של 10% cetylpyridinium פתרון כלוריד, דגירה את הצלחת ב RT למשך 15 דקות על מטרף ב 100 שייקים/דקה כדי לחלץ את צבען ארס.
    8. להעביר את supernatants צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה ב 17,000 x g למשך 5 דקות ב- RT.
    9. להוסיף 10% cetylpyridinium פתרון כלוריד תמציות עם יחס דילול של 1:10 – 1:20 ולהוסיף את הדגימות (300 µL) לתוך צלחת 96-ובכן כולל שתי בארות ריק המכיל רק 10% cetylpyridinium כלוריד.
    10. להכין 7 סטנדרטים הפניה של ארס, החל 4 מיקרומטר 400 על ידי דילול של ארס 40 מ מ מכתים פתרון (pH 4.2) עם 10% cetylpyridinium כלוריד פתרון ליצירת עיקול רגיל.
    11. הוסף µL 300 של תקן התייחסות למצב שבו כפילויות לצלחת 96-ובכן.
    12. לקרוא את ספיגת של הדגימות, כדורי סרק, וההתייחסות סטנדרטים-520 ננומטר.
    13. להחסיר את קריאות ריק מכל הסטנדרטים הפניה ובחומר מדגם.

2. העכבר OB-OC תרבות משותפת להפיק OCs בוגרת

  1. הכנה ועיקור של פרוסות שור קליפת העצם שקצרנו
    1. לנקות חלקי עצם הרקמה שמסביב ולהסיר את עצם trabecular, מח עצם.
    2. יבש את העצם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    3. לחתוך את העצם לתוך חתיכות קטנות וקאט לפרוסות (כ 300-350 מיקרומטר עבה) באמצעות מהירות נמוכה ראה עם להב היהלום.
    4. חותכים את הפרוסות מיקרומטר 300-350 דיסקים ריבועית (1 ס מ2).
    5. כדי לנקות את הדיסקים עצם (1 ס מ2), לשים אותם לתוך בקבוקון זכוכית לנעילה מילוי עם מים מזוקקים. להעביר את המבחנה זכוכית מלא לתוך באמבט אולטרא, sonicate עבור 5 דק. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    6. יוצקים את המים מזוקקים, להוסיף 70% אתנול, sonicate במשך 5 דקות.
    7. יוצקים את האתנול 70% והחלף 100% אתנול.
      הערה: אחסן את הפרוסות עצם 100% אתנול ב 4 ° C עד 4 שבועות.
    8. להאיר את הפרוסות עצם עם אור UV למשך 15 דקות בכל צד בתנאים סטריליים. לאחסן את הפרוסות סטיריליים עצם צלחת תרבות סטרילי-RT עד שימוש נוסף.
  2. בידוד של מח העצם OC מבשרי
    1. המתת חסד תמים שבוע 8 – 12 BALB/c עכברים באמצעות זריקה בקרום הבטן (i.p.) של פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
    2. לבודד את מבשרי OC מח עצמות הירך העכבר ו tibiae.
    3. להסיר את הרגליים עם מספריים סטרילי הנקודה הקרובה ביותר לגוף-מפרק הירך, חותכים את הגפיים המפרקים בברך ובקרסול ולהסיר הרקמות הרכות עם האזמל סטרילי וחדים. לחתוך את epiphyses. לשטוף, להשעות את מח העצם עם 1 מ ל בגמ לתוך 6 ס מ עקר פטרי באמצעות מחט 27G המצורפת מזרק 1 מ"ל לקבל השעיה התא.
    4. להוסיף התליה תא צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את 6 ס מ צלחת פטרי עם 5 מ ל בגמ ואת העברת הצינור חרוט באותה 50 מ. צנטריפוגה ב x 350 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק Resuspend התאים OC בידול בינוני (DM) המכילים בגמ, 1 nM 1,25-(OH)2-ויטמין D3 ו- 1 מיקרומטר פרוסטגלנדין E2 (1 מ"ל/טוב).
      הערה: עכבר BALB/c אחד מספק מספר מספיק של OC מבשרי לצלחת תרבות 24-טוב אחד.
  3. הכנה של העכבר OB-OC תרבות משותפת עם biomaterial
    1. מראש דגירה 14 מ"מ קוטר β-TCP דיסקים או עצם שור פרוסות (1 ס מ2) ב 1 מ"ל בגמ בצלחת תרבות ההשעיה. ובכן 24-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 24 שעות לפני הוספת התאים.
      הערה: פרוסות עצם שור הם קבוצת ביקורת המצע הפיזיולוגיות ללמוד OC בידול בנוכחות biomaterials.
    2. הוסף 8.8 x 10 תאים/ס מ4 2 של ראשי OBs הושעו ב בגמ biomaterials או את העצם שליטה בצלחת תרבות 24-ובכן השעיה או צלחת תרביות רקמה 24-. טוב. דגירה-37 ° C ו- 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: OBs לצרף את הפלסטיק או העצם biomaterial או שור.
    3. הוסף טרי מבודד מח עצם OC המבשרות על 24 שעות ביממה תרבותי העיקרי OBs ותרבות -37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 5 ימים. החלף את המדיום מיט OC טריות בכל יום אחר. ואז כתם OCs עבור tartrate חסיני חומצה פוספטאז (השמנה) כדי להעריך את הבידול OC.
  4. בידול OC מוערך על ידי מלכודת מכתים
    1. כדי לאפיין OCs multinucleated בוגר, המתקבל שלב 2.3.3, תשאף המדיום תרבות מן הלוח תרביות רקמה שליטה לצלחת תרבות ההשעיה biomaterial ולהוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x (37 מעלות צלזיוס). מחוק לגמרי מגניב ולתקן את התאים על ידי המקננת בהם ב 1 מ"ל של 10% buffered פורמלין פתרון RT למשך 10 דקות.
    2. תשאף הפתרון 10% buffered פורמלין עם pipet לשימוש יחיד להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x בכל RT. חזור על שלב זה שלוש פעמים, וארוקן את PBS, להחליף 1 מ"ל של מאגר מלכודת (pH 5) ואז דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. האחות מאגר מלכודת ולהוסיף 1 מ"ל אתנול אצטון ל- 100% 1:1. דגירה לצלחת-RT 30 ס' במהירות וביופסיה אצטון-האתנול פתרון עם pipet לשימוש יחיד, יבש לחלוטין את הצלחות ב- RT.
    4. המלכודת מכתים פתרון, להכין פוספט naphthol-AS-MX פתרון מניות ב- N, N-dimethylformamide, התמוססות 0.6 מ"ג/מ"ל של סגול מהר אדום מלח במאגר מלכודת, ולהוסיף 0.1 מ"ל של פתרון מניות פוספט naphthol-AS-MX 10 מ"ל של מלח מהר אדום סגול 10 מ"ג/מ"ל מאגר מלכודת.
    5. להוסיף 1 מ"ל של מלכודת מכתים פתרון דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן וארוקן את המלכודת מכתים פתרון ו להוסיף 1 מ"ל של מים הנדסה גנטית כדי לעצור את התגובה.
    6. להעביר את הדיסקים β-TCP ואת עצם שור פרוסות לאחר צביעת לתוך באר חדשה, להתבונן אדום OCs מוכתם בסיוע מיקרוסקופ אור (הגדלה: 10 X) ולספור השמנה + OCs בוגרת עם גרעינים שלושה או יותר.

3. קריטי בגודל של עכבר פגם Calvarial דגם

  1. מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously (ש) לתוך עכברים BALB/c 8 - בן שבועיים על שיכוך כאבים.
  2. עזים ומתנגד העכברים עם תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p., להוסיף ג'ל או משחה לעיניים כדי שיישארו לחים ומניחים את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו כדי למנוע היפותרמיה. להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן וזנב.
  3. לגלח את הפרווה על ראש בראש בין האוזניים, לנקות את השטח עם 7.5% povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
  4. עושים חתך הסאגיטלי קו האמצע בראש הגולגולת בין האוזניים עם איזמל סטרילי כדי לחשוף את קליפת הגולגולת ולהסיר את רקמות החיבור pericranium לעיל חוזק על ידי גירוד זה עם אזמל.
  5. יוצר פגם קריטי בגודל חוסן באמצעות trephine שיניים סטרילי בקוטר של 4 מ מ (2000 סל ד) תחת השקיה קבועה עם תמיסת מלח רגיל חלק על חוזק, לחתוך את ectocortex, כמה endocortex.
  6. כדי למנוע נזק קרום הדורה, להשתמש מפשיל קטן כדי לפרוץ את endocortex הנותרים, בזהירות להרים את העצם calvarial, להסיר אותו עם מלקחיים. הפגם שנוצר צריך להיות עגול כ 3.5 מ מ קוטר.
  7. למלא את הפגם calvarial עם טרום רטוב (1 x סטרילי PBS ב RT) קצף β-TCP/C באמצעות מלקחיים.
  8. הכן מספר מתאים של פקדים שלילי מתאימים-גיל, דמה עם פגם ריק.
  9. כדי לשמור את biomaterial במקום, שים 0.5 µL של רקמת דבק בקצה הפגם בנקודות מול שני.
  10. סגור את העור בתפר נספגים.
  11. נקה כל מכשירי ניתוח עם sterilant קר כדי לשמור על תנאים סטריליים לפני ביצוע הניתוח הבא עכבר anesthetized.
  12. לטיפול לאחר ניתוח, במקום החיות על צלחת חימום יבשים ונקיים ב 37 מעלות צלזיוס באזור הניתוח לניטור המתאים במהלך תקופת ההחלמה. לנטר את קצב נשימה, טמפרטורת הגוף וצבע של הקרומים הריריים והעיניים כל 10 דקות עד שהם להעיר.
  13. העברת העכברים בהכרה המופעלים לתוך כלוב עם מזון ומים מופרדים משאר בעלי החיים עד החלמה מלאה. מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ספורטינג לטיפול כאבים לאחר ניתוח פעמיים ביום למשך 72 ה' שובו החלים לחלוטין עכברים לכלובים.
  14. כדי לקבוע את היעילות של biomaterial, המתת חסד i.p. עכברים עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
  15. ב- 8-12 שבועות שלאחר ההשתלה, לערוף את העכבר לאללה עם מספריים חדות.
  16. תיקון הראש העכבר שראשו נערף ב 30 מ של 4.5% buffered פורמלין פתרון 1-2 שבועות להבטיח חדירה מלאה של מקבע לתוך הרקמה.
  17. להעביר את ראשי לתוך 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך ב 4 ° C עד שנה אחת.
  18. השימוש מיקרו שמחושב טומוגרפיה (microCT) או טכניקות היסטולוגית undecalcified מתוקננים להערכת התחדשות העצם. ניתן להשתמש microCT סריקה על דגימות לאחר המוות ברזולוציה גבוהה (90 kV, 4 דקות) 2D ו 3D הווריד, מטוסים הקדמית.
  19. היסטולוגיה undecalcified, מייבשים את ראשי בסדר עולה ציונים של אתנול, להטביע חומצתי גליקול.
  20. חותכים גליקול חומצתי-מוטבע עם מסור יהלום, לטחון את המקטעים בעובי של-80 – 100 מיקרומטר.
  21. הערכת Laczko Levai צבעונית סעיפים עצם לזהות את היווצרות העצם החדש14.

4. במבחנה תגובות מערכת החיסון

  1. המתת חסד תמים 8 - בן שבועיים BALB/c i.p. עכברים עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
  2. הנח את העכבר בצד ימין שלה, לגלח את הפרווה בצד שמאל, לנקות את העור מעל בצד שמאל של הבטן עם 70% אתנול.
  3. להפוך את 10 מ"מ 1 מ"מ חתך עמוק בעור של העכבר בצד שמאל posteriorly בעקבות הצלעות מעל הקיבה באמצעות מספריים סטרילי.
  4. פתח את העור, ואז לחשוף את הצפק. הפוך של 10 מ מ ארוך ופחות מ 1 מ"מ חתך עמוק לתוך הצפק באמצעות מספריים בתנאים סטריליים.
  5. דחף את הבטן הציר הקרוב כדי לחשוף את הטחול.
  6. החזק את הטחול בעדינות עם מלקחיים סטרילי ולהסיר אותו על ידי חיתוך רקמה וכלי מחובר מתחתיו.
  7. מקום הטחול בשלמותם לתוך צינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של קר 1 x PBS סטרילי.
  8. הכן השעיה תא בודד על ידי לקמץ הטחול באמצעות מלקחיים סטרילי 2 או 2 מגלשות זכוכית סטריליים.
  9. הסרת לכלוך על ידי העברתו דרך מסננת סטרילית 40 µm תא עם PBS קר 1 x באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל.
  10. Centrifuge התליה תא בודד ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 ° C צינור חרוטי 50 מ ל, תשאף וזורקים את תגובת שיקוע. ואז resuspend בגדר תא ב 5 מ של מאגר פירוק תאי הדם האדומים (RBC).
  11. דגירה התליה תא למשך 14 דקות ב RT ולהפסיק את התגובה על-ידי הוספת 45 מ של מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני.
  12. Centrifuge התאים לאחר פירוק תאים ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
  13. Resuspend splenocytes RPMI בינוני המכיל 10% חום-להשבית FBS 1% פתרון פניצילין-סטרפטומיצין, 0.1% גנטמיצין, 0.2% ß-mercaptoethanol, 1% חומצות אמינו שאינן הכרחיות.
  14. מראש תדגור β-TCP/C קצף לתוך צלחת תרבות סטרילי 96-ובכן המכיל RPMI בינונית במשך 24 שעות ביממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפני זריעה תא
  15. להוסיף splenocytes, טיטרציה המספרים, למשל., 1.25 x 105, 2.5 10x5 ו 5 x 105/well כדי בארות בצלחת תרביות רקמה 96-ובכן המכיל RPMI בינוני ותוספים, עם או בלי הקצף β-TCP/C incubated מראש.
  16. להוסיף 10 concanavalin µg/mL (קון A) התפרקה בינוני עבור סכום כולל של 100 µL טוב לבארות המתאים, אז דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 72 h.
  17. למדוד התפשטות תאים עם וזמינותו bromodeoxyuridine (BrdU). להוסיף 10 µL/טוב של פתרון תיוג BrdU ב 48 שעות של תרבית תאים, ואז דגירה את הצלחת. בשביל h 24 נוספים.
  18. 72 h, לאסוף את תגובת שיקוע, לאחסן ב-20 ° C עד שימוש נוסף.
  19. להוסיף 200 µL טוב של הפתרון קיבוע מכל קידוח, ואז תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT. וביופסיה הפתרון קיבעון. להוסיף 100 µL טוב של הפתרון עובד נוגדן anti-BrdU, תקופת דגירה של 90 דקות.
  20. האחות הפתרון נוגדן, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 200 – 300 µL/טוב של שטיפת פתרון ולהסיר הפתרון כביסה.
  21. להוסיף 100 µL של פתרון המצע תקופת דגירה של 3 – 10 דקות ב RT ואז למדוד את ספיגת ב 450 ננומטר.
  22. למדוד אינטרלוקין-1β (IL-1β), interleukin-2 (il-2), אינטרלויקין-4 (IL-4), אינטרפרון-γ (IFN-γ) ב- supernatants שנאספו באמצעות של אליסה סטנדרטי.

5. מודל בקרום הבטן תפוקה גבוהה

  1. עזים ומתנגד הנשי 6-8 שבועות הישן BALB/c עכברים עם תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p., להוסיף ג'ל או משחה לעיניים כדי שיישארו לחים ומניחים את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו כדי למנוע היפותרמיה. להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן וזנב.
  2. לגלח את הפרווה בטן ולנקות עם 7.5% povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
  3. 8 מ מ רב קו האמצע בחתך דרך העור לאורך linea alba. עושים חתך קטן לתוך הצפק באמצעות אזמל.
  4. המקום סטרילי PBS שנספג שתלי קצף β-TCP/C (2 x 2 x מ מ 23) לתוך חלל הצפק או בלי להוסיף חומרים עבור העכברים שליטה מתאימים לגיל המזויפים.
  5. תפר של הצפק ועור בתפר חומרים נספגים ולא נספגים, בהתאמה.
  6. נקה כל מכשירי ניתוח עם sterilant קר כדי לשמור על תנאים סטריליים לפני ביצוע הניתוח הבא עכבר anesthetized.
  7. לטיפול לאחר ניתוח, במקום החיות על צלחת חימום יבשים ונקיים ב 37 מעלות צלזיוס באזור הניתוח לניטור המתאים במהלך תקופת ההחלמה. לנטר את קצב נשימה, טמפרטורת הגוף וצבע של הקרומים הריריים והעיניים כל 10 דקות עד שהם להעיר.
  8. העברת העכברים בהכרה המופעלים לתוך כלוב עם מזון ומים מופרדים משאר בעלי החיים עד החלמה מלאה. שהחלמת באופן מלא עכברים לשוב הכלובים.
    הערה: הליך זה גורם כאב מינימלי. טיפול כאבים לאחר ניתוח הוא בדרך כלל לא הכרחי. אם המופעלים בעלי חיים מראים סימנים של כאב, מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ספורטינג או אחר תרופה לשיכוך כאבים כאבים המתאים.
  9. המתת חסד עכברים 7 ימים שלאחר ההשתלה, עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p.
  10. ב 7 ימים שלאחר ההשתלה, שטיפת חלל הצפק באמצעות 1 מ"ל מזרק עם מחט 25 גרם עבור סכום כולל של 3 מ"ל של PBS קר על-ידי החזקת הראש העכבר החדרת המחט ברבע הבטן התחתון השמאלי ואת המטרה הציר הקרוב.
    הערה: הנוזל הצפק צריך להיות ללא RBCs.
  11. Centrifuge נוזל שטיפת הצפק ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאסוף את הנוזלים הצפק לאחסון ב-20 ° C למדידות אליסה של ציטוקינים IL-1β, il-2, IL-4.
  12. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל ל- PBS, ולספור את התאים הצפק באמצעות trypan blue על hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge התליה תא ב 5 x 10 תאים5 על שקופיות זכוכית, לאפשר את השקופיות יבש, כתם על ספירת תאים דיפרנציאלית.
  14. באמצעות מיקרוסקופ אור, נחשב למינימום של תאים 300 סה כ, להבדיל בין, אאוזינופילים, נויטרופילים, מאקרופאגים לימפוציטים.

6. מודל תת עורית subchronic

  1. עזים ומתנגד בשבוע 6-8 נקבה בת BALB/c עכברים עם תערובת של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים i.p., להוסיף ג'ל או משחה לעיניים כדי שיישארו לחים ומניחים את העכבר על צלחת חימום ב 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו כדי למנוע היפותרמיה. להעריך את עומק הרדמה על ידי צביטה הבוהן וזנב.
  2. הנח את העכבר על גבו, לגלח את הפרווה בטן, לנקות את השטח מגולח עם 7.5% povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
  3. 8 מ מ רב קו האמצע בחתך דרך העור לאורך לינאה אלבה של הבטן בעזרת אזמל. ואז שתל PBS ספוג biomaterial (2 x 2 x מ מ 23) מתחת לעור או להוסיף בלי חומרים עבור העכברים שליטה מתאימים לגיל המזויפים.
  4. תפר את העור בתפר נספגים.
  5. נקה כל מכשירי ניתוח עם sterilant קר כדי לשמור על תנאים סטריליים לפני ביצוע הניתוח הבא עכבר anesthetized.
  6. לטיפול לאחר ניתוח, במקום החיות על צלחת חימום יבשים ונקיים ב 37 מעלות צלזיוס באזור הניתוח לניטור המתאים במהלך תקופת ההחלמה. לנטר את קצב נשימה, טמפרטורת הגוף וצבע של הקרומים הריריים והעיניים כל 10 דקות עד שהם להעיר.
  7. העברת העכברים בהכרה המופעלים לתוך כלוב עם מזון ומים מופרדים משאר בעלי החיים עד החלמה מלאה. שהחלמת באופן מלא עכברים לשוב הכלובים.
    הערה: הליך זה גורם כאב מינימלי. טיפול כאבים לאחר ניתוח הוא בדרך כלל לא הכרחי. אם המופעלים בעלי חיים מראים סימנים של כאב, מזריקים 0.1 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ספורטינג או כאבים מתאים אחר.
  8. כאשר מוכן לבחון את האתר השרשה, המתת חסד i.p. עכברים עם פתרון של 200 מ"ג/ק"ג קטמין ו 24 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים.
  9. שמונה שבועות שלאחר ההשתלה, נכנסים לאתר ההשתלה עם הרקמה (1 ס מ2) שמסביב.
  10. את הרקמה בפתרון 4.5% buffered פורמלין בן לילה, להטביע פרפין וחתוכים לקוביות 4 סעיפים מיקרומטר.
  11. כתם 4 מיקרומטר רקמות פרפין-מוטבע סעיפים ועם Hematoxylin אאוזין (H & E) דלקת או מאסון trichrome עבור התצהיר קולגן ו פיברוזיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להעריך β-TCP עבור יעילותו כמו biomaterial לתיקון העצם, השתמשנו במבחנה , ויוו הקרנת שיטות. ראשית, אנחנו נמדדים OB התגובות הדיסקים β-TCP בהשוואה עם פקדים לבד בינוני בסיסית. איור 2 מדגים את הכדאיות OB בתגובה β-TCP דיסקים ב 7 ו 14 ימים של תרבות. תא הכדאיות נמדדת מתאי סמויה פעיל ב הבארות התרבות היה זהה עבור OBs בינונית בפלסטיק תרביות רקמה, כמו גם עם דיסקים β-TCP המציין biomaterial הזה זה לא שיפור ולא דיכוי התפשטות OB.

להעריך עוד יותר מכשול, מדדנו פעילות ALP כסמן של בידול באמצעות גישות כמותיים. איור 2 מדגימה פעילות האנזים ALP בבארות תרבות לאחר 7 ימים של תרבות. OBs בבארות עם המדיום לבד הייתה פעילות בסיסית ALP, בעוד במינרליזציה אופטימלית OBs בינוני (מ מ) היה אינטנסיבי ALP מכתים, המשקף רמה גבוהה של בידול OB. לעומת זאת, מכשול מצופה בדיסקים β-TCP הבדיל פחות מכשול מודגרות במ מ. Assay כמותיים, ALP הריכוז היה 77% גבוה יותר עבור הבארות המכיל מ"מ לעומת המדיום בסיסית בלבד, ואילו ALP הריכוז היה 40% נמוך יותר בתאים תרבותי בדיסקים β-TCP לעומת שולט מ מ. למרות תוצאות אלו ממחישות את התאים גדל בדיסקים β-TCP הבדיל פחות מאשר אלה עם תנאים אופטימליים של פלסטיק עם מ מ, הם מבודלים מספיק על biomaterials.

עוד תכונה קריטית של OBs הוא היכולת שלהם לגרום מינרליזציה, אשר הוא צעד חיוני בריפוי העצם. אנחנו צבעונית תאים בתרבית OB עם ארס לאחר 14 ימים ומצא שמינרליזציה הזה היה גבוה יותר עבור פקדים מ"מ לעומת OBs תרבותי בינוני לבד ו β-TCP הדיסקים בבארות תרבות (איור 2). כאשר נמדוד את ריכוז ארס מצאנו כי הפקדים מ מ היו יותר מ 45% גבוה יותר מאשר קבוצת ה-β-TCP. נתונים אלה ממחישים את OBs תרבותי על פלסטיק במעמד מ מ בוגרים, להבדיל, mineralize טובים יותר מאלו בינונית לבד, בדיסקים β-TCP.

כדי לקבוע כיצד OCs מגיבים β-TCP דיסקים, השתמשנו טכנולוגיה culturing שבו OBs משותפת מתורבתים עם מח עצם OC מבשרי ואחריו הבחינה של מורפולוגיה OC. OB-OC תרבויות המשנה היו נצפו על 5 ימים, שונה באופן משמעותי בין התאים גדל על פלסטיק עם OC מיט התאים גדל על עצם פרוסות וβ-TCP. על פלסטיק, OCs היו גדולים ונפוץ ואילו OCs על מצעים פיזיולוגיים היו קטנים יותר, פחות-פרוש, ומתפשטים בצורת (איור 3). כדי quantitate את OCs, נוכל לספור השמנה + OCs ומצא כי שם היו מספרים גבוהים יותר כאשר מודגרות עם β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) לעומת תרביות רקמה פקדים (1140 ± 15.71/cm2) ופרוסות עצם 709 ± 59.69/cm, (2) רומז התמיינות משופרת OC בדיסקים β-TCP (איור 3).

כדי לקבוע עם קצף β-TCP/C זמינים מסחרית ויוו, השתמשנו קריטי בגודל פגם calvarial מודל בעכברים. אנו מראים נציג מקטעים היסטולוגית שעובדו על-ידי טכניקה היסטולוגית undecalcified עם הטבעה חומצתי גליקול, Levai Laczko מכתים. MicroCT, היסטולוגיה עשוי לשמש כדי להעריך את היווצרות העצם החדשה בתוך אזור פגם. כאן, אנו מראים דוגמה עם מקטעים היסטולוגית באיור4. כאשר בניתוח המושרה עצם הפגם נותר ריק (דמה), הבחנו שכבה דקה המכסה את הפגם כולו, אך היווצרות העצם משמעותי לא היה נוכח בפעולה פוסט 12 שבועות, המאשרת את גודל קריטי של השבר שנוצר העצם. לעומת זאת, כאשר הפגם הכיל קצף β-TCP/C, היו שאריות קצף β-TCP/C מוקפת רקמה סיבית צפופה, כולל כמה כלי דם ותאים דלקתיים גישור האזור הפגם ללא ראיות היווצרות העצם.

כדי להעריך את התגובה גוף זר, אנחנו העריכו תגובות חיסוניות, אלרגיות biomaterials, שימוש assay במבחנה . איור 5 מדגים כי כאשר תמים splenocytes היו מודגרות בינונית-לבד או עם קצף β-TCP/C, תאי הטחול תמימה לא הגיב על-ידי מתרבים או בהפקת il-2, IL-4, ו- IFN-γ ציטוקינים. לעומת זאת, ב- ConA המכילה תרבויות, התפשטות תאים וייצור ציטוקין גדל מלבד איל-1β. תא תגובות היו כאשר לא מושפע תרבותי משותף עם ConA וקצף β-TCP/C בהשוואה ConA לבד, המציין קצף β-TCP/C גם תגובות מוגבר ולא ירד במבחנה .

כדי לקבוע אם קצף β-TCP/C המושרה תגובה חיסונית ויוו , אנחנו קטנטנים זה 1) intraperitoneally תא דלקתיות ריכוזים ספירות, ציטוקינים בנוזל שטיפת הצפק, subcutaneously 2) ולא מוערכים דלקת, פיברוזיס במקטעי היסטולוגית של אתר ההשתלה. טבלה 1, התא דיפרנציאלית בנוזל שטיפת הצפק מגלה כי המספר הכולל של תאים דלקתיים היה גבוה משמעותית בעכברים קצף β-TCP/C מושתל לעומת הפקדים המזויפים. יתר על כן, היו מספר רב יותר של כל סוגי תאים. איור 6A, יש ריכוז גבוה של ציטוקינים IL-1β, il-2, IL-4 בקצף β-TCP/C בהשוואה הפקדים המזויפים. בעכברים ספורטינג מושתל קצף β-TCP/C, הבחנו לתגובה דלקתית עם גוף זר תאי ענק על H & מקטעים שהוכתמו E (איור 6B) או ראיות של פיברוזיס על Trichrome של מאסון צבעונית מקטעים (איור 6C) ב- 8 שבועות. לעומת זאת, האתר השרשה של הפקדים דמה היה מינימלי דלקת ללא פיברוזיס (איור 6C).

Figure 1
איור 1: Calvaria להסרת העיקרי אוב תא בידוד דיאגרמה. הדיאגרמה מדגימה כיצד להסיר החילונית עם קיצוצים 4 (קו מקווקו אדום) באמצעות מספריים מעוגלים. החתך הראשון הוא בניצב נכון ארובת העין (R) מ- X1 ל- X 2, והשני הוא בניצב השמאלי ארובת העין (L) מ- X3 ל- X 4. החתך השלישי הוא להפריד את קליפת הגולגולת בחזית X4 ל- X 2, החתך הרביעי הוא להפריד את הגב X3 ל- X 1. החילונית יש אפשרות להסירו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: בידול β-TCP-induced במבחנה OB והתבגרות. OB הכדאיות והתפשטות בימים 7 ו-14 עבור התאים תרבותי בינוני לבד (ברים) או β-TCP (הסורגים פתוח) (זאת אומרת ± SEM; n = 3). ALP כימות פעילות של תא lysates, נורמליזציה של התוכן חלבון (מיקרומטר DIFMU/µg חלבון, זאת אומרת ± SEM, n = 3) להחליפן בתמונות הממחישות תרבות שהוכתמו ALP בארות מיום 7. מינרליזציה לכמת מתרבויות שהוכתמו ארס על ידי שיטת החילוץ כלוריד cetylpyridinium כמוצג את הריכוז של ארס (מיקרומטר ARS, זאת אומרת ± SEM, n = 3) עם נציג שהוכתמו ארס תרבות וולס ביום 14. קבוצות כוללות עצם מדיום הגידול לבד (בגמ); מינרליזציה בינוני (מ מ); Β-TCP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: β-TCP-induced במבחנה בידול OC- Photomicrographs נציג במופע השמנה + MNCs יום 5 לאחר שיתוף culturing העכבר OBs ו מח עצם OC סימנים מקדימים. ניתוח נקודת הקצה של השמנה + תאי multinucleated (MNCs) מדגים את ספירת מוחלטת של השמנה + MNCs (≥ 3 גרעינים) לכל ס מ2 (זאת אומרת ± SEM, n = 3) * * *p < 0.001. קבוצות כוללות בידול OC בינוני לבד (DM); עצם; Β-TCP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: שתלי In vivo הערכה של עצם β-TCP/C קצף במודל קריטי בגודל פגם calvarial. ריפוי ללא פגמים calvarial שנוצרו ב- 8 - בן שבועיים הנשי BALB/c (n = 3) עכברים באמצעות trephine שיניים של 4 מ מ. טיפול קבוצות שליטה כלולים דמה (פגם ריק), פגמים שטופלו עם קצף β-TCP/C. סעיפים היסטולוגית ייצוגית מוכן ב- 12 השבועות שלאחר ההשתלה. רקמות פורמלין-קבוע גליקול חומצתי-מוטבע מקטעים (80 – 100 מיקרומטר) צבעונית עם צבע Levai Laczko. Photomicrographs המוצגות נמוכה (משמאל), הגדלה גבוהה (מימין). משולשים שחורים מציינים את הפגם העצם. שחור * מציין רקמת העצם ולבן * מתייחס β-TCP/C קצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: β-TCP/C קצף-induced במבחנה תא התפשטות ציטוקין ייצור,. Splenocytes של עכברים BALB/c תמים תרבותי לבד, עם קצף β-TCP/C או ConA בינוני. התפשטות תאים supernatant (BrdU), וייצור של IL-1β, il-2, IL-4, ו- IFN-γ (● לבד בינוני ConA ○, ■ קצף β-TCP/C, C/β-TCP קצף, ConA □). התפשטות תוצאות שהוצגו כמו הממוצע של דוגמאות triplicate (יתר ± SEM) וזמינותו BrdU הממוצע של דגימות כפולים (pg/mL ± SEM) ציטוקין ריכוז של שני ניסויים עצמאית. p < 0.05 נחשב משמעותי עבור biomaterial לעומת בינונית ו biomaterial ConA לעומת ConA לבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: שתלי In vivo התגובה החיסונית של העצם β-TCP/C קצף i.p. מהירה תפוקה גבוהה, דגם העכבר subchronic. (א) BALB הנשי/c עכברים מושתל i.p. β-TCP/C קצף עם או ללא הוספת חומרים (דמה). שבעה ימים מאוחר יותר, הצפק שטיפה ניתח עבור ריכוזים ציטוקין (נתונים שהוצגו אומר ציטוקין ריכוזים pg/mL ± SEM). נתונים אלה הם נציגים של שני ניסויים עצמאית (n = 5). p < 0.05 נחשב משמעותי בהשוואה המזויפים. (בג) נקבה BALB/c עכברים (n = 5) מושתל ספורטינג β-TCP/C קצף עם או בלי להוסיף חומרים (דמה). ב- 8 שבועות לאחר ההשתלה, העור מן האתרים השרשה מוכתם H & E (B) ולא של מאסון Trichrome (ג) כדי להעריך את דלקת, פיברוזיס, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קטי נחום Vitoss
תא ספירות x 106 (% של תאים סה)
מקרופאגים 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70.4) p < 0.001
אאוזינופילים 0.120 ± 0.011 (8.5) 1.181 ± 0.254 (25.5) p < 0.01
נויטרופילים ± 0.002 0.001 (0.2) 0.029 ± 0.011 (0.6) ns
לימפוציטים 0.048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0.041 (3.5) ns
ספירת התאים הכולל 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0.001

טבלה 1: אין ויוו התגובה החיסונית של העצם β-TCP/C קצף שתלי במודל של עכברים i.p. תפוקה גבוהה מהירה. נקבה BALB/c עכברים היו i.p. מושתל β-TCP/C קצף עם או בלי חומרים (דמה). אחרי 7 ימים, שטיפת הצפק שהושג וניתח למספר תאים דלקתיים וסופרת תא דיפרנציאלית (נתונים שהוצגו אומר תא ספירות ± SEM). נתונים אלה הם נציגים של שני ניסויים עצמאית (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מראים רב תחומית להערכה פרה של הביו עבור נציג biomaterials שפותחו עבור התחדשות העצם ותיקון. . בדקנו את התגובות של OBs, OCs, ומודל תגובת ריפוי vivo בפגם קריטי עצם עכברים, כמו גם בתוך חוץ גופית ו ויוו תגובות מערכת החיסון. אנחנו נועדו להדגים איך מבחני עבודה ולסכם את הנתונים והמסקנות הנגזרות בחינת biomaterials. אנו מראים כי האסטרטגיה שלנו יוצר פרופיל בעל ערך של עצם biomaterial הביו...

מבחני התא הראשי שימשו להערכת OB ו- OC. OBs אחראים עצם היווצרות ותיקון פיזיולוגיים. הם חייבים להישאר בר קיימא. להבדיל, זירוז מינרליזציה. במחקר זה, אנו מראים כיצד לבצע מבחני תא הכדאיות, ALP של ארס כסמני פיזיולוגית תאים עם יכולת mineralize. הפקדים עבור מבחני כלל בינונית לבד, אשר מספק תוכנית בסיסית, בינונית מינרליזציה osteogenic (מ מ), אשר אופטימיזציה הבידול והיתרון מינרליזציה של OBs-פלסטיק. קבוצת הביקורת האחרון היה תקן biomaterial הפניה. להערכת OC, אנחנו תרבותי משותף OBs ו מח עצם-derived OC סימנים מקדימים, הבדיל את מבשרי לתוך תאים multinucleated, מוכתם להם מלכודת, אנזים osteoclastic בשימוש נרחב כדי לזהות OCs במבחנה15 , ואז לספור התאים באמצעות מיקרוסקופ אור. אלה מבחני המדינה-of-the-art, לא מחייבים שינויים. עם זאת, ציינו מגבלה הקשורים לאיכות מבודד OBs הראשי כדי mineralize. OBs שהשתמרו המאוחסן בחנקן נוזלי, בשימוש בתוך שנה לקבלת תוצאות אופטימליות.

OB מצורף ופעילות היו גבוהות בתרביות רקמה פלסטיק מאשר על הדיסקים β-TCP נבדק. כאשר אנחנו העריך OCs, הבחנו ההבדלים הצפויים התגובה פלסטיק לבין העצם, המהווה המצע הפיזיולוגיות16. לשם השוואה, עצם וβ-TCP המושרה שינויים מורפולוגיים דומים. שהספירה assay מלכודת של OCs בתגובה הדיסקים β-TCP הראה כי המספרים היו שונים באופן משמעותי בין עצם פרוסות וβ-TCP. Β-TCP המושרה בידול OC גבוה יותר מאשר על עצם פרוסות. בידול OC, השמנה היא assay ומבוססת. היו שינויים משמעותיים אין צורך בשיטה זו. עם זאת, כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, חיוני לא התאים יותר מדי זמן דגירה, או יהפוך כל התאים מוצאם monocytic השמנה-חיוביות.

כדי לטפל התגובה ויוו , השתמשנו קצף β-TCP/C בתור biomaterial למופת מכיוון שהוא מכיל β-TCP, אשר שימש את מבחני במבחנה ואת קולגן ומקדם את עצם ריפוי13. למרות קצף β-TCP/C הוא זמין מסחרית ומשמש קליניות עבור עצם תיקון17,18, זה רק אחד של סוגים שונים של חומרים זה יהיה מעניין ללמוד, למשל., (סידן פוספט biphasic עצמות אנושיות כמו גם כמו demineralized היידרוקסיאפטיט/β-TCP) במבחני אלה כדי לקבוע תגובות ביולוגיות איך שונים בין חומרים. על התגובה ויוו , אנחנו מושתל β-TCP/C קצף לתוך פגם קריטי בגודל העצם calvarial בעכברים, לאחר 12 שבועות העריך היסטולוגיה והראה את ההבדלים לעומת המזויפים פקדים. זה גם אפשרי להעריך את התגובות עם microCT אשר מספק מידע ללא תשלום19. הפגם בעכברים שליטה המזויפים היו ללא היווצרות עצם משמעותית, כצפוי, ואילו β-TCP/C קצף המושרה תגובה דלקתית, פיברוזיס, אנגיוגנזה, המהווה הראיות בשלב מוקדם של היווצרות העצם. שיטה זו כבר הוכיחה בעבר יופיטר20. עם זאת, הגישה שלנו שונה כי השתמשנו בטכניקה שונה "מעלית" עם מנוף פריוסט כדי להפחית את הסיכון של ופצעו את הדורה מאת trephine. אנחנו הסיק כי קרום הדורה ממלאת תפקיד משמעותי בתהליך ההחלמה של פגמים calvarial על ידי ייצור תאים osteogenic ו- osteoinductive גורמים3,21,22,23. ראוי לציין, החומר מושתל, הגודל של פגם, וכן שיטה ליצירת את הפגם משפיע על התחדשות העצם של פגמים calvarial. שינוי אחר בהליך מעורב ייצוב biomaterial ב הפגם calvarial עם דבק רקמות מסתיימים המשמש באופן שגרתי קליניות עבור סגירת הפצע. שינוי זה מובטח כי החומר באזור פגם לא יורחקו במהלך הריפוי.

דלקת מווסת את שלב המוקדמות של עצם ריפוי, אך מדי דלקת או תגובות אלרגיות עשוי להפחית את תיקון11. התגובה החיסונית אידיאלי biomaterials הוא ליזום בהתאם להירארכיית הקשרים דלקתיות המקדמת את היווצרות העצם. עם זאת, biomaterials מסוימים עלול לגרום לתגובה גוף זר שמוביל מערך של אותות דלקתיים לגרום פיברוזיס או רגישות אלרגית עולה. במחקרים שלנו, אנחנו להעריך תגובות מערכת החיסון כדי קצף β-TCP/C, מצאו כי לא היה רעיל לתאים הטחול תמים ולא להפריע לימפוציטים-T הרחבה או לתפקד (הפרשת ציטוקינים) כאשר נוספו תרבויות עם ConA. בניסויים בקרום הבטן, β-TCP/C קצף המושרה דלקת, והיה על ראיות של עלייה אאוזינופיליה ו מקרופאגים עם עליות והמצוות ציטוקינים מסוג Th1 Th2. בניסויים השתלה תת עורית, β-TCP/C קצף המושרה גם דלקת, אך לא היו ראיות כרונית, הרסני אלרגית או דלקתית של תגובות, אשר טוען כי קצף β-TCP/C הוא מסתיימים. מודלים אלה מספקים מידע על התגובה החיסונית biomaterials. ראשית, המודל במבחנה מטפל השפעת biomaterial על תאים חיסוניים תמים בנוכחות mitogen כדי לספק ראיות לכך שיש אין דיכוי התגובה mitogenic הנגרמת על ידי biomaterial. שנית, המודל בקרום הבטן מספק מהר יום 7 מפרט. של החלקים הסוג של תגובה חיסונית, למשל., אלרגיות ודלקת כפי שנצפה על ידי הסוג של תאים דלקתיים הסתננות והפרופיל ציטוקין. שלישית, המודל התת עורית, subchronic ממחישה את התגובה רקמות לאורך תקופה ארוכה יותר, מאפשר על ההערכה של דלקת כרונית, פיברוזיס, נוגדן titers והוא יכול לשמש כדי לבדוק את ההשתלה חוזרות ונשנות של תגובות זיכרון אימונולוגי. מודלים אלה פורסמו בעבר, מוצגות כאן ללא כל שינויים13. זה הכרחי כי ישנם הפקדים שליליים או חיוביים המתאימים עבור מודלים אלה. אנו מציעים מבצע כל שלושת הדגמים כדי למנוע את המגבלות של כל שיטה. ואילו הדגמים המוצגים מבוססים היטב באזורים אחרים של אימונולוגיה, הגישה לבדיקות biomaterials היא האחרונה.

לסיכום, עצם, החיסון מבחני לספק פרופיל תאימות ביולוגית biomaterial. עבור עצם, OB ו OC התגובות biomaterial לספק הכרחי לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים מורכב ויקר וכדי לדבוק העקרון 3Rs הראשוניים. מבחני אימונולוגי במבחנה לספק נתונים על אנטיגן אשיג ו cytotoxicity, אשר עשויה גם למנוע עוד ניסויים בבעלי חיים. הניסויים מהירה תפוקה גבוהה מציעים התוצאות דלקתיות והתגובה ציטוקין (למשל., סוג של לימפוציט T תגובות), בעוד המודל subchronic הוא שימושי בגלל נתונים על משך הדלקת ואת הפוטנציאל עבור נזק פיברוזיס. זו גישה בינתחומית הרומן הכולל עצם החיסון התגובות biomaterials מציעה הערכה קדם-קליניות מצוינות של הביו עבור יישומים עתידיים בתחום חומרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

פרויקט מחקרי זה קיבל מימון תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 141 רפואה רגנרטיבית biomaterials תיקון רקמת שלד immunogenicity גוף זר התגובה הפריה אין ויוו
פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter