Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

Het aantal nieuwe biomaterialen ontworpen voor het herstellen van grote bot laesies groeit voortdurend met als doel het verbeteren bot genezing en het overwinnen van de complicaties geassocieerd met bot transplantatie. Hier presenteren we een multidisciplinaire strategie voor preklinische biocompatibiliteit testen van biomaterialen voor bot reparatie.

Abstract

Grote non-adhesie botbreuken zijn een belangrijke uitdaging in de orthopedische chirurgie. Hoewel de auto- en allogene bottransplantaten uitstekend geschikt zijn voor de genezing van dergelijke laesies, zijn er mogelijke complicaties met hun gebruik. Dus, materiële wetenschappers ontwikkelen synthetische, biocompatibel biomaterialen om deze problemen. In deze studie presenteren wij een multidisciplinair platform voor de evaluatie van biomaterialen voor bot reparatie. We expertise uit bot biologie en immunologie te ontwikkelen van een platform met inbegrip van in vitro osteoclast (OC) en osteoblast (OB) testen en in vivo Muismodellen van bot reparatie, immunogeniciteit en allergeniciteit gecombineerd. We laten zien hoe uit te voeren van de experimenten, het samenvatten van de resultaten, en het verslag over biomaterial biocompatibiliteit. In het bijzonder, we getest OB levensvatbaarheid, differentiatie, en mineralisatie en OC levensvatbaarheid en differentiatie in de context van β-tricalciumfosfaat fosfaat (β-TCP) schijven. We zijn ook getest met een β-TCP/collageen (β-TCP/C) schuim die een commercieel beschikbare materiaal gebruikte klinisch voor bot reparatie in een kritische en middelgrote calvarial bot defect muismodel om te bepalen van de effecten op de vroege fase van het bot genezing. We geëvalueerd in parallelle experimenten, immuun en allergische reacties in muizen. Onze aanpak genereert een profiel van de biologische verenigbaarheid van een bot-biomaterial met een aantal parameters nodig voor het voorspellen van de biocompatibiliteit van biomaterialen gebruikt voor bot genezing en het herstel bij patiënten.

Introduction

Bot reparatie is een complex proces dat met de vorming van het hematoom, ontsteking begint, callus vorming en vervolgens het remodelleren van1,2. Bot regeneratie potentiële is echter beperkt tot de omvang van de bot fractuur1,3. Bijvoorbeeld grote botbreuken, veroorzaakt door trauma, kanker of osteoporose kunnen niet genezen en non-adhesie botbreuken worden genoemd. Deze letsels bot vereisen vaak behandeling ter bevordering van gezonde fysiologische bot reparatie en regeneratie. Momenteel, autograft en allograft bot transplantatie is de aanpak van keuze4 met 2,2 miljoen bot vervanging procedures jaarlijks5. Hoewel deze procedures een hoog slagingspercentage hebben, kunnen er complicaties, bijvoorbeeld, beperkte beschikbaarheid van bot, infectie, donor site morbiditeit en afwijzing4. Nieuwe alternatieven voor weefselengineering bot worden gezocht om deze uitdagingen.

Het ontwerp van biomaterialen op basis van natuurlijke of synthetische polymeren, Biokeramiek of metalen in combinatie met cellen en bioactieve moleculen is op de stijging-6. Ons huidige begrip van fysiologische bot genezing en genezing in de context van biomaterialen is afhankelijk van meerdere factoren zoals de mechanische eigenschappen en meerdere lokale en systemische factoren, met inbegrip van cellen uit de omloop en de breuk site7 ,8,9. Biomaterialen voor bot regeneratie gericht op de bevordering van osteogenicity en Osseointegratie10 en zijn een ideale biocompatibel, biologisch afbreekbaar en poreuze (bevordering van cel migratie, zuurstof en voedingsstoffen). Ze moeten ook sterk genoeg ter ondersteuning van de site van de fractuur ter verlichting van de pijn. Daarnaast zijn inflammatoire factoren vereist het helende proces in te leiden. Echter als de biomaterial buitensporige ontstekingen en allergische reacties induceert, kan dit beperken of hinderen van bot genezing11,12. Een interdisciplinaire benadering is dus nodig om te evalueren van biomaterialen ontwikkeld voor bot reparatie.

In deze studie presenteren wij een preklinische evaluatie van representatieve materialen, 1) Orthovita Vitoss schuim die een commercieel beschikbare poreus Bottransplantatievervanging bestaande uit tricalciumfosfaat is samengesteld uit nanometer middelgrote pure β-tricalciumfosfaat fosfaat (β-TCP) deeltjes en boviene collageen Type 1 (C) (β-TCP/C schuim) en 2) β-TCP schijven. Hier, we illustreren biocompatibiliteit testen van deze primaire osteoblast (OB) met biomaterialen en osteoclast (OC) testen, een in vivo model van bot reparatie, immunologische eenbeoordeling bestaande uit in vitro T lymfocyten proliferatie en cytokine productie, en in vivo immunogeniciteit en allergeniteit, als eerder gemeld13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De procedures werden gedaan met BALB/c muizen na alle richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het Oostenrijkse Ministerie van onderwijs, wetenschap en onderzoek en zijn goedgekeurd door de Commissie over de ethiek van het Oostenrijkse Ministerie van onderwijs, wetenschap en onderzoek.

1. primaire muisknop OB cultuur

  1. OB isolatie van neonatale muis snuituil met behulp van enzymatische spijsvertering
    1. 1 – 2 daagse oude neonatale pups (60 in totaal) euthanaseren door onthoofding en plaats de hoofden in een petrischaal met steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Houd het hoofd door de achterkant van de nek, en snijd de huid weg met behulp van steriele schaar. Incise de calvarium door het piercing (ongeveer 0,1-0,3 mm) met een schaar, die vervolgens worden ingevoegd onder de calvarium aan de achterkant van het hoofd aan de basis van de schedel en snijd langs de calvarial rand lateraal vanaf de achterkant naar voorkant boven de oren en dan abov e de neusrug (Figuur 1).
    3. Incubeer ontleed snuituil met 8 mL van een filter gesteriliseerde spijsvertering oplossing (300 eenheden/mL collagenase type IV en 2.14 eenheden/mL dispase II opgelost in α-minimum essentiële medium (α-MEM)) in een conische buis van 50 mL bij 37 ° C gedurende 10 minuten in een schudden incubator op 200 shakes /min.
    4. De eerste wordt weggeworpen en herhaal de procedure spijsvertering driemaal met 8 mL van de oplossing van de spijsvertering. Verzamelen van de bovendrijvende substantie met de cellen die na elke stap van de spijsvertering en toevoegen aan een conische tube van 50 mL. Bewaar de conische tube van 50 mL met de cellen in een bad met ijs water totdat het spijsvertering (ongeveer 40 min) is voltooid.
    5. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant (met een pipet van Pasteur gekoppeld aan een vacuümpomp) en resuspendeer in 40 mL bot groeimedium (BGM) met α-MEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), en 1% penicilline-streptomycine oplossing. Voeg vervolgens 10 mL van de celsuspensie aan 4 weefselkweek platen (10 cm).
    6. Cultuur de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot samenvloeiing (2-3 dagen).
    7. Bij samenvloeiing, gecombineerd het oude medium en de weefselkweek platen een keer met 1 x PBS (37 ° C) wassen. Dan de PBS gecombineerd en voeg 2 mL 1 x trypsine oplossing met 0,5% ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) om elke 10 cm weefselkweek plaat.
    8. Incubeer de platen 4 cultuur bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 min en controleer vervolgens de platen met een omgekeerde lichte Microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen worden losgekoppeld van de plastic. Breng alle cel schorsingen (totaal 8 mL) aan een conische tube van 50 mL, met 10 mL verse BGM. Wassen elke plaat met 5 mL verse BGM en overdracht aan de dezelfde conische tube van 50 mL.
    9. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 16 mL verse BGM. 16 nieuwe 10 cm weefselkweek platen (verdelende 1:4) met 9 mL BGM voor te bereiden. 1 mL van de celsuspensie toevoegen aan elke plaat.
    10. Herhaal stap 1.1.6. naar 1.1.8.
    11. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 10 mL verse BGM. Cellen tellen en bereken de concentratie van de cel.
      Opmerking: Deze procedure genereert ongeveer 7,5 – 8.3 x 105 cellen/pup.
    12. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer bevriezen gemiddeld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO), α-MEM 40% en 50% FBS. Breng 2 mL cryovials voor een totaal van 2 x 106 cellen per flacon 1,5 mL van de celsuspensie.
    13. Flash bevriezen de flesjes in vloeibare stikstof voor langdurige opslag in een tank met vloeibare stikstof. Gebruik de cellen binnen een jaar om de volledige functionaliteit. Deze primaire OBs gebruiken voor de evaluatie van de proliferatie (stap 1.2), differentiatie (ALP testen: stap 1.4., 1.5.) en mineralisatie (stap 1.6.) in aanwezigheid van de biomaterialen. Deze cellen gebruiken voor de rijping van bot-merg-afgeleide OC precursoren in co-cultuur (stap 2.3).
  2. OB proliferatie assay
    1. Vooraf Incubeer 14 mm diameter β-TCP schijven in 1 mL van BGM in een 24-well schorsing cultuur plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u primaire OBs. gebruik standaard weefselkweek platen voor besturingselementen toevoegt en schorsing cultuur platen de biomaterial monsters Vermijd cel gehechtheid aan de plastic.
    2. Het medium van de pre-incubatie gecombineerd en vervolgens resuspendeer primaire muisknop OBs in BGM. In een 24-well schorsing cultuur bord en voor de controlegroep, 4.4 x 104 OBs/cm2 naar de vooraf bebroede β-TCP schijven toevoegen in een 24-well weefselkweek plaat (1 mL/putje). OBs zal hechten aan de weefselkweek plaat of de biomaterial.
    3. Incubeer gedurende 14 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. Tijdens de incubatietijd, wijzig het medium elke 2-3 dagen en voeg 1 mL verse BGM aan elk putje.
    4. Om te beoordelen OB proliferatie, overbrengen in de β-TCP-schijven op dag 7 en 14 nieuwe putten uit te sluiten van de signalen van de cellen die zijn geteeld op de schorsing cultuur plaat.
    5. Het oude medium gecombineerd, Voeg 0,5 mL van BGM (37 ° C) en Incubeer de platen van de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Voeg vervolgens 55 µL van 10 x cel proliferatie reagens (1:10 verdunning) rechtstreeks in de cultuur goed. Lege cellen, drie putten met 0,5 mL van BGM en 55 µL van het 10 x cel proliferatie reagens te bereiden. Incubeer alle platen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
    6. Trekken en 150 µL van het supernatans van elk putje overboeken naar een 96-Wells zwarte plaat en lezen van fluorescentie met excitatie bij 560 nm en emissie bij 590 nm. Aftrekken van de lege lezingen uit de lezingen van de steekproef.
  3. OB differentiatie en mineralisatie testen
    1. Vooraf Incubeer 14 mm diameter β-TCP schijven in 1 mL van BGM in een 24-well schorsing cultuur plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u de OBs. gebruik standaard weefselkweek platen voor besturingselementen toevoegt en schorsing cultuur platen voor de biomaterial monsters te vermijden cel gehechtheid aan de plastic.
    2. Het medium van de pre-incubatie gecombineerd en vervolgens resuspendeer primaire muisknop OBs in BGM. In een 24-well schorsing cultuur plaat en voor de controlegroep, 8,8 x 104 OBs/cm2 naar de vooraf bebroede β-TCP schijven toevoegen in een 24-well weefselkweek plaat (1 mL/putje). OBs zal hechten aan de weefselkweek plaat of het biomaterial monster.
    3. Vervang de BGM met 1 mL van osteogenic mineralisatie medium (MM) met van BGM, 50 µg Mo/mL ascorbinezuur en 5 mM β-glycerophosphate 24 h na toevoeging van de OBs en incubeer gedurende 14 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. Het medium elke 2-3 dagen met 1 mL vers bereide MM aan elk putje wijzigen.
  4. OB differentiatie beoordeeld door alkalische fosfatase (ALP) activiteit van cel lysates
    1. Voor het meten van ALP activiteit op dag 7 na toevoeging van MM, gecombineerd het kweekmedium uit de putten en daarna wassen met 1 mL steriele 1 x PBS (37 ° C). Zorgvuldig gecombineerd de PBS zodat de gekoppelde cellen blijven op de weefselkweek plastic of biomaterial en het bevriezen van de platen bij-80 ° C.
    2. Na 24u (of maximaal 2 weken), ontdooien het besturingselement weefselkweek plaat en de biomaterial vering cultuur plaat bij kamertemperatuur (RT) voor te bereiden voor lysis van de OB. Breng de β-TCP-schijven in een nieuwe schorsing cultuur plaat uit te sluiten van de cellen die zijn gekoppeld aan de plaat voor de biomaterial monsters. Voeg 75 µL per putje van de 1 x lysis van de cel buffer aan beide platen. Schud de platen gedurende 5 minuten op een shaker op 400 shakes/min.
    3. Breng de cel lysate in een tube van 0,5 mL microcentrifuge en centrifuge op 300 x g voor 6 min op RT verwijderen van puin. 50 µL van het monster cel lysate supernatans toevoegen aan een 96-Wells zwarte plaat en voeg vervolgens 50 µL van een oplossing, bestaande uit 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfaat (DiFMUP) fluorogenic substraat opgelost in 2 x ALP buffer (pH 10) per putje. Twee lege putten met 100 µL van een oplossing van 1:1 met 1 x cellysis-buffermengsel en 2 x ALP buffer ingesteld.
    4. 8 referentiemonsters met 100 μl per putje met de 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) variërend van 0,5 tot 200 μM, opgelost in 1:1 met 1 x cellysis-buffermengsel en 2 x ALP buffer voor het genereren van een standaard referentie-curve voor te bereiden.
    5. Incubeer de zwarte plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten en lees vervolgens de fluorescentie met de excitatie op 358 nm en emissie bij 455 nm. De lege lezingen van de referentiemonsters of monster lezingen van elkaar aftrekt.
    6. Normaliseren van de ALP enzymactiviteit van de cel lysates met de totale hoeveelheid eiwit met behulp van een colorimetrische bepaling voor eiwitconcentratie. Bereiden bovien serumalbumine (BSA) eiwit referentie standaarden op een bereik van 0,05 tot 2,5 µg/µL opgelost in 1 x lysis van de cel buffer voor het genereren van een standaard curve.
    7. Het monster cel lysates en BSA eiwit normen in duplicaten voorbereiden. Voeg 5 µL van het monster cel lysate of 5 µL van BSA eiwit standaard in een 96-wells-plaat en voeg vervolgens 25 µL van het reagens A' en 200 µL van het reagens B. Set van twee lege putten met 5 µL van 1 x lysis van de cel buffer. Incubeer de platen bij RT gedurende 15 minuten en vervolgens lees de absorptie bij 690 nm. De lege lezingen van de referentiemonsters of monster lezingen van elkaar aftrekt.
  5. OB differentiatie beoordeeld door kleuring van ALP in celkweek
    1. ALP in gekweekte OBs vlek op dag 7 na de toevoeging van MM op een besturingselement weefselkweek plaat en de biomaterial in een schorsing cultuur plaat.
    2. Gecombineerd het kweekmedium uit de putten en 0,5 mL 1 x PBS (37 ° C) te vervangen. De PBS gecombineerd en monteren van de cellen door broeden ze in 0,5 mL 10% gebufferd formaline op RT voor 1 min.
    3. De 10% gebufferd formaline met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd en Voeg 0,5 mL was buffer (0.05% Tween20 in 1 x PBS).
    4. Ontbinden van een 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat/nitro blauwe tetrazolium (BVIE/NBT) substraat tablet in 10 mL ultrazuiver water en vortex totdat volledig is opgelost. De oplossing moet worden beschermd tegen licht en gebruikt binnen 2 uur.
    5. Het was buffer gecombineerd en vervang met 0,5 mL BVIE/NBT substraat oplossing en Incubeer de plaat duikt met RT in het donker gedurende 10 minuten Aspirate de kleurstofoplossing en vervang met 0,5 mL was buffer.
    6. Breng de gekleurde β-TCP-schijven in een nieuwe put en scannen van de ALP-gekleurde platen met een conventionele flatbed-scanner naar record ALP kleuring.
  6. OB mineralisatie beoordeeld door kleuring met Alizarine rood S (ARS)
    1. Het kweekmedium de putjes met primaire OBs 14 dagen na de toevoeging van MM gecombineerd en spoel tweemaal met 0,5 mL 1 x PBS op RT. Aspirate de PBS en monteren van de cellen door toevoeging van 0,5 mL van de 10% gebufferd formaline-oplossing op RT gedurende 10 minuten.
    2. De 10% gebufferd formaline met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd en tweemaal met 0,5 mL ultrazuiver water wassen.
    3. Toevoegen aan de vaste OBs, 0,25 mL kleurstofoplossing 40 mM ARS (pH 4.2) opgelost in ultrazuiver water en Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 10 minuten op een shaker op 100 shakes/min.
    4. De kleurstofoplossing met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd en spoel met 1 mL ultrazuiver water. Herhaal deze stap 5 – 10 keer verwijderen aspecifieke kleuring.
      Opmerking: De spoeldouche oplossing mag geen kleur.
    5. Gecombineerd het ultrazuiver water en voeg 1 mL koude PBS. Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 10 minuten op een shaker op 100 shakes/min.
    6. Gecombineerd de PBS, de gekleurde β-TCP schijven overbrengen in een nieuwe put en de platen te scannen met een flatbed-scanner naar record mineralisatie.
    7. Voeg 0,25 mL 10% cetylpyridinium chloride-oplossing en de plaat duikt met RT gedurende 15 minuten op een shaker op 100 shakes/min te uittreksel van de ARS kleurstof uit te broeden.
    8. Het supernatant overbrengen in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 5 min op RT.
    9. 10% cetylpyridinium chloride oplossing aan de extracten met een verdunningsverhouding van 1:10-1:20 toevoegt en de monsters (300 µL) in een 96-wells-plaat met inbegrip van twee lege putten met slechts 10% cetylpyridinium chloride.
    10. 7 ARS referentie standaarden variërend van 4 tot 400 µM door verdunning van de 40 mM ARS kleurstofoplossing (pH 4.2) met 10% cetylpyridinium chloride-oplossing voor het genereren van een standaard curve voor te bereiden.
    11. Voeg 300 µL van de norm in duplicaten naar de 96-wells-plaat.
    12. Lees de extinctie van de monsters, lege cellen, en verwijst naar de normen op 520 nm.
    13. De lege lezingen van de referentiemonsters of monster lezingen van elkaar aftrekt.

2. muis OB-OC co cultuur voor het afleiden van volwassen OCs

  1. Voorbereiding en sterilisatie van boviene corticaal bot segmenten
    1. Schoon segmenten van het bot van het omliggende weefsel en verwijder de trabecular botten en beenmerg.
    2. Het bot bij 50 ° C gedurende 24 uur drogen.
    3. Snijd het bot in kleinere stukjes en snijd het in reepjes (ongeveer 300-350 µm dik) met behulp van een low-speed zag met een mes van de diamant.
    4. Snijd de plakjes van 300 – 350 µm in kwadratische schijven (1 cm2).
    5. Voor de reiniging van de bot schijven (1 cm2), plaatst u deze in een afsluitbare glazen ampul en vul met gedestilleerd water. Breng de gevulde glazen ampul in een ultrasoonbad en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
    6. Giet af het gedestilleerd water, voeg 70% ethanol en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min.
    7. Giet af de 70% ethanol en vervangen door 100% ethanol.
      Opmerking: Bewaar het been segmenten in 100% ethanol bij 4 ° C voor maximaal 4 weken.
    8. Het been segmenten met UV-licht gedurende 15 minuten aan elke kant onder steriele omstandigheden te bestralen. Bewaren de gesteriliseerde bot segmenten in een steriele cultuur plaat op RT tot verder gebruik.
  2. Isolatie van het beenmerg OC precursoren
    1. Euthanaseren naïef 8 – 12 week oud BALB/c muizen met behulp van een intraperitoneaal (i.p.) injectie van een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
    2. Isoleren van het beenmerg OC precursoren van muis dijbeen en tibiae.
    3. Verwijderen van de benen met een steriele schaar van het dichtstbijzijnde punt naar het lichaam in het heupgewricht, snij van de ledematen in de gewrichten van knie- en enkel en verwijder het zachte weefsel met een steriel scalpel en pincet. De epifyses afgesneden. Spoelen en het merg met 1mL BGM in een 6 cm steriel petrischaal met behulp van een naald van de 27G gekoppeld aan een 1mL spuit te verkrijgen van een celsuspensie op te schorten.
    4. De celsuspensie toevoegen aan een conische tube van 50 mL en was na de 6 cm petrischaal met 5 mL BGM en overdracht aan de dezelfde conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 350 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in OC differentiatie medium (DM) met BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamine D3 en 1 µM prostaglandine E2 (1 mL/putje).
      Opmerking: Één BALB/c muis voorziet in voldoende aantal OC precursoren één 24-well cultuur plaat.
  3. Voorbereiding van muis OB-OC co cultuur met biomaterial
    1. Incubeer vooraf 14 mm diameter β-TCP schijven of runderen bot segmenten (1 cm2) in 1 mL van BGM in een 24-well schorsing cultuur plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u de cellen toevoegt.
      Opmerking: Boviene bot segmenten zijn een controlegroep fysiologische substraat voor het bestuderen van OC differentiatie in het bijzijn van biomaterialen.
    2. Toevoegen van 8,8 x 104 cellen/cm2 van primaire OBs geschorst in BGM op de biomaterialen of het besturingselement bot in een 24-well schorsing cultuur bord of op een bord 24-well weefselkweek. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
      Opmerking: OBs koppelen aan de plastic of de biomaterial of runderen bot.
    3. Voeg vers geïsoleerd beenmerg OC voorlopers van de 24 h gekweekte primaire OBs en cultuur bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 dagen. Vervang het medium met vers bereide OC DM om de andere dag. Vervolgens vlek OCs voor tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) te evalueren OC differentiatie.
  4. OC differentiatie beoordeeld door val kleuring
    1. Karakteriseren van volwassen multinucleaire OCs, verkregen uit stap 2.3.3, gecombineerd het kweekmedium uit het besturingselement weefselkweek plaat en de biomaterial plaat voor de cultuur van de opschorting en voeg 1 mL 1 x PBS (37 ° C). De PBS gecombineerd en monteren van de cellen door ze aan het broeden in 1 mL 10% gebufferd formaline-oplossing bij RT gedurende 10 minuten.
    2. De 10% gebufferd formaline-oplossing met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd Voeg 1 mL 1 x PBS op RT. Repeat deze stap drie keer, gecombineerd de PBS, vervangen door 1 mL TRAP buffer (pH 5) en Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    3. De TRAP buffer gecombineerd en voeg 1 mL aceton en 100% ethanol van 1:1. Incubeer de plaat duikt met RT voor 30 s. snel aspirate de aceton-ethanol oplossing met een pipet voor eenmalig gebruik en volledig droog de platen op RT.
    4. Voor de val kleurstofoplossing, bereiden een 10 mg/mL stockoplossing van de naftol-AS-MX fosfaat in N, N-dimethylformamide, Los 0,6 mg/mL snel rode violet zout in TRAP buffer en 0,1 mL van de stockoplossing naftol-AS-MX fosfaat aan 10 mL snel rode violet zout toevoegen in de buffer van de TRAP.
    5. Voeg 1 mL kleurstofoplossing TRAP en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 10 min, dan de TRAP kleurstofoplossing gecombineerd en voeg 1 mL ultrazuiver water om te stoppen met de reactie.
    6. Overdracht van de β-TCP schijven en boviene bot segmenten na kleuring in een nieuwe goed, observeren rood gekleurd OCs met behulp van een lichte Microscoop (vergroting: 10 X) en TRAP + volwassen OCs met drie of meer kernen opsommen.

3. kritieke en middelgrote muis Calvarial Defect Model

  1. Subcutaan injecteren van 0,1 mg/kg buprenorfine (SC) in 8 - weken oude BALB/c muizen voor analgesie.
  2. Anesthetize van de muizen met een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine i.p., een gel of zalf toevoegen aan de ogen houd ze vochtig en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende de gehele procedure te voorkomen hypothermie. Beoordelen de verdoving diepte door teen en staart snuifje.
  3. Scheren van de vacht op de bovenkant van het hoofd tussen de oren en reinig het oppervlak met 7,5% Povidon jodium oplossing en 70% ethanol.
  4. Maak een incisie middellijn Sagittaal op de bovenkant van de schedel tussen de oren met een steriel scalpel bloot de calvarium en het bindweefsel van de pericranium boven het rechter pariëtale bot verwijderen door het schrapen met een scalpel.
  5. Een kritische en middelgrote defect in het rechter pariëtale bot met behulp van een steriele dentale trephine met een diameter van 4 mm (2000 rpm) onder constante irrigatie met normale zoutoplossing notch het rechter pariëtale bot te snijden door de ectocortex en enkele endocortex te maken.
  6. Gebruiken om te voorkomen dat schade aan de dura mater, een kleine periosteal lift te doorbreken van de resterende endocortex, zorgvuldig het calvarial bot verheffen verwijderen met pincet. Het daaruit voortvloeiende gebrek moet circulaire en ongeveer 3,5 mm diameter.
  7. Vul het calvarial defect met vooraf doorweekt (steriele 1 x PBS op RT) β-TCP/C schuim met pincet.
  8. Het juiste aantal leeftijd-matched, schijnvertoning negatieve controles met een lege defect voor te bereiden.
  9. Zetten, zodat de biomaterial op zijn plaats, 0,5 µL van weefsel lijm aan de rand van het gebrek op twee tegenovergestelde punten.
  10. Sluit de huid met een niet-absorbeerbare hechtdraad.
  11. Reinig alle chirurgische instrumenten met de koude sterilant voorwaarden te handhaven steriele alvorens de volgende chirurgie uit te voeren op een narcose muis.
  12. Voor post chirurgische behandeling, plaatst u de dieren op een droge en schone verwarmingsplaat bij 37 ° C op het gebied van chirurgie voor adequaat toezicht tijdens de herstelperiode. Volgen van de ademhaling, de lichaamstemperatuur en de kleur van de slijmvliezen en de ogen elke 10 minuten totdat ze wakker.
  13. Breng de bediende bewuste muizen in een kooi met voedsel en water gescheiden van de andere dieren tot volledig herstel. 0,1 mg/kg buprenorfine injecteren s.c. voor post chirurgische pijnstillende therapie tweemaal per dag gedurende 72 h. terugkeer volledig hersteld muizen naar hun kooien.
  14. Euthanaseren om te bepalen van de effectiviteit van de biomaterial, de muizen i.p. met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
  15. Decapitate in 8-12 weken na implantatie, de euthanized muis met een scherpe schaar.
  16. Moeilijke situatie het hoofd van de onthoofde muis in 30 mL 4,5% gebufferd formaline oplossing voor 1-2 weken te garanderen van volledige penetratie van de fixeerspray in het weefsel.
  17. Breng de hoofden in 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 ° C voor maximaal één jaar.
  18. Gebruik micro berekend tomografie (microCT) of gestandaardiseerde undecalcified histologische technieken te evalueren bot regeneratie. Het is mogelijk om te gebruiken microCT scannen op postmortem monsters op hoge resolutie (90 kV, 4 min) in 2D en 3D Sagittaal en frontale vliegtuigen.
  19. Voor undecalcified histologie, uitdrogen van de hoofden in oplopende rangen van ethanol en insluiten in glycol methylmethacrylaat.
  20. Knip glycol methylmethacrylaat-embedded blokken met een diamant zagen en slijpen van de secties met een dikte van ongeveer 80-100 µm.
  21. Evalueren Levai Laczko gekleurd been secties om nieuwe bot vorming14vast te stellen.

4. in Vitro immuunresponsen

  1. Euthanaseren naïef 8 - weken oude BALB/c muizen i.p. met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
  2. Plaats de muis op de rechterkant, scheren van de vacht aan de linkerzijde en reinigen van de huid over de linkerkant van de buik met 70% ethanol.
  3. Maak een 10 mm lang en een 1 mm diep ingesneden in de huid van de muis op de linkerzijde posteriorly na de ribben in de maag met behulp van steriele schaar.
  4. Open de huid en dan bloot het buikvlies. Maken van een 10 mm lang en minder dan 1 mm diep ingesneden in de buikvlies, met behulp van schaar onder steriele omstandigheden.
  5. Druk op de maag proximally bloot van de milt te maken.
  6. Houd de milt zachtjes met steriel pincet en verwijder deze door het snijden van het weefsel en de vaartuigen die hieronder het zijn toegevoegd.
  7. Plaats de intact milt in een tube van 50 mL met 10 mL koude 1 x steriel PBS.
  8. Maak een suspensie van eencellige door het hakken van de milt met 2 steriel pincet of de dia's 2 steriele glas.
  9. Verwijderen puin door het passeren van een steriele 40 µm cel zeef met koud 1 x PBS met behulp van de zuiger van een injectiespuit 1 mL.
  10. Centrifugeer de eencellige schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een conische tube van 50 mL, gecombineerd en verwijder het supernatant. Vervolgens resuspendeer de pellet cel in 5 mL lysis-buffermengsel van rode bloedcellen (RBC).
  11. Incubeer de celsuspensie voor 14 min op RT en stop de reactie door toevoeging van 45 mL medium Roswell Park Memorial Instituut (RPMI).
  12. Centrifugeer de cellen na de lysis van de cel bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en vervolgens Verwijder het supernatant.
  13. Resuspendeer splenocytes in RPMI medium met 10% warmte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline-streptomycine-oplossing, 0,1% gentamicine, ß-mercaptoethanol 0,2% en 1% niet-essentiële aminozuren.
  14. Vooraf Incubeer β-TCP/C schuim in een steriele 96-Wells cultuur plaat met RPMI medium gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 voordat cel zaaien.
  15. Splenocytes toevoegen op milliliters gestelde getallen, bijv., 1.25 x 105, 2.5 x 105 en 5 x 10,5berichten aan putjes in een weefselkweek 96-wells-plaat met RPMI medium en additieven, met of zonder het vooraf bebroede β-TCP/C-schuim.
  16. Toevoegen van 10 µg/mL concanavalin een (Con A) opgelost in medium voor een totaal van 100 µL per putje aan de juiste putjes en vervolgens Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 72 uur.
  17. Celproliferatie van de maatregel met een bromodeoxyuridine (BrdU) test. 10 µL per putje van BrdU labeling oplossing op 48u van celkweek toevoegen en vervolgens de plaat voor een aanvullende 24 h uit te broeden.
  18. Bij 72 h, het supernatant verzamelen en opslaan bij-20 ° C tot verder gebruik.
  19. Voeg 200 µL per putje van de fixatie oplossing aan elk putje en vervolgens Incubeer gedurende 30 min op RT. Aspirate de fixatie-oplossing. Voeg 100 µL per putje van de werkoplossing voor anti-BrdU antilichaam en incubeer gedurende 90 min.
  20. De antilichaam-oplossing gecombineerd, spoel de putjes drie keer met 200-300 µL per putje oplossing te wassen en verwijder de wassen-oplossing.
  21. Voeg 100 µL van substraat oplossing en incubeer gedurende 3 – 10 min op de RT, dan meet de extinctie bij 450 nm.
  22. Meten van interferon-γ (IFN-γ) in de verzamelde supernatant met behulp van een standaard ELISA, interleukine-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2) en Interleukine-4 (IL-4).

5. high Throughput intraperitoneaal Model

  1. Anesthetize van de vrouwelijke 6-8-weekse oude BALB/c muizen met een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine i.p. en een gel of zalf toevoegen aan de ogen houd ze vochtig en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende de gehele procedure te voorkomen hypothermie. Beoordelen de verdoving diepte door teen en staart snuifje.
  2. Scheren van de abdominale vacht en reinig met 7,5% Povidon jodium oplossing en 70% ethanol.
  3. Maken van een 8 mm lange middellijn incisie via de huid langs de linea alba. Maken een kleine snede in het buikvlies met behulp van een scalpel.
  4. Plaats steriele PBS β-TCP/C schuim transplantaties (2 x 2 x 2 mm3) gedrenkt in de peritoneale holte of zonder toegevoegd materialen voor de leeftijd-matched sham controle muizen.
  5. Suture van het buikvlies en huid met absorbeerbare en niet-absorbeerbare hechtdraad, respectievelijk.
  6. Reinig alle chirurgische instrumenten met de koude sterilant voorwaarden te handhaven steriele alvorens de volgende chirurgie uit te voeren op een narcose muis.
  7. Voor post chirurgische behandeling, plaatst u de dieren op een droge en schone verwarmingsplaat bij 37 ° C op het gebied van chirurgie voor adequaat toezicht tijdens de herstelperiode. Volgen van de ademhaling, de lichaamstemperatuur en de kleur van de slijmvliezen en de ogen elke 10 minuten totdat ze wakker.
  8. Breng de bediende bewuste muizen in een kooi met voedsel en water gescheiden van de andere dieren tot volledig herstel. Volledig herstelde muizen terug naar hun kooien.
    Opmerking: Deze procedure induceert minimale pijn. Post chirurgische pijnstillende therapie is meestal niet nodig. Als de bediende 0.1 mg/kg buprenorfine dieren vertonen tekenen van pijn, injecteren s.c. of een andere geschikte pijnstillende drug voor verlichting van pijn.
  9. De muizen 7 dagen na implantatie, met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine i.p. euthanaseren
  10. Bij 7 dagen na implantatie, lavage de peritoneale holte met behulp van een 1 mL syringe met een 25 G naald voor een totaal van 3 mL koude PBS door het hoofd van de muis ingedrukt en invoegen van de naald in het linker onderste buik Kwadrant en gericht proximally.
    Opmerking: De peritoneale vloeistof vrij moet zijn van de RBC.
  11. Centrifugeer de peritoneale lavage vloeistof bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verzamelen de peritoneale vloeistof te bewaren bij-20 ° C voor ELISA metingen van IL-1β, IL-2, IL-4 en cytokinen.
  12. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS peritoneale cellen met behulp van trypan blauw op een hemocytometer tellen.
  13. Cytocentrifuge de celsuspensie op 5 x 105 cellen op glas dia's, zodat de dia's te droog en vlek voor een gedifferentieerde cel tellen.
  14. Met behulp van een lichte Microscoop, een minimum van 300 cellen in totaal tellen en macrofagen, eosinofielen en neutrofielen lymfocyten te onderscheiden.

6. subchronische subcutane Model

  1. Vrouwelijke 6 – 8 week oud BALB/c muizen met een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine i.p. anesthetize, gel of zalf toevoegen aan de ogen houd ze vochtig en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende de gehele procedure te voorkomen hypothermie. Beoordelen de verdoving diepte door teen en staart snuifje.
  2. Plaatst u de muisaanwijzer op zijn rug, de buik vacht scheren en schoon het geschoren oppervlak met 7,5% Povidon jodium oplossing en 70% ethanol.
  3. Maken van een 8 mm lange middellijn incisie via de huid langs de linea alba van de buik met behulp van een scalpel en vervolgens implantaat PBS gedrenkt biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) onder de huid of geen materialen voor de leeftijd-matched sham controle muizen toe te voegen.
  4. Sutuur (geologie) de huid met een niet-absorbeerbare hechtdraad.
  5. Reinig alle chirurgische instrumenten met de koude sterilant voorwaarden te handhaven steriele alvorens de volgende chirurgie uit te voeren op een narcose muis.
  6. Voor post chirurgische behandeling, plaatst u de dieren op een droge en schone verwarmingsplaat bij 37 ° C op het gebied van chirurgie voor adequaat toezicht tijdens de herstelperiode. Volgen van de ademhaling, de lichaamstemperatuur en de kleur van de slijmvliezen en de ogen elke 10 minuten totdat ze wakker.
  7. Breng de bediende bewuste muizen in een kooi met voedsel en water gescheiden van de andere dieren tot volledig herstel. Volledig herstelde muizen terug naar hun kooien.
    Opmerking: Deze procedure induceert minimale pijn. Post chirurgische pijnstillende therapie is meestal niet nodig. Als de bediende 0.1 mg/kg buprenorfine dieren vertonen tekenen van pijn, injecteren s.c. of een andere passende pijnstiller.
  8. Als u klaar bent om de site van implantatie te onderzoeken, euthanaseren de muizen i.p. met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
  9. Acht weken na implantatie, accijnzen de implantatie-site met het omliggende weefsel (1 cm2).
  10. Het weefsel hersteld in 4,5% gebufferd formaline oplossing 's nachts inbedden in paraffine en snijd in 4 µm secties.
  11. Vlek 4 µm paraffine-ingebedde weefselsecties met haematoxyline en eosine (H & E) voor de ontsteking of Masson van trichrome voor collageen afzetting en fibrose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om te beoordelen van β-TCP voor de doeltreffendheid ervan als een biomaterial voor bot reparatie, we gebruikten in vitro en in vivo screeningmethoden. Ten eerste, we gemeten de OB-reacties op de schijven van de β-TCP vergeleken met basislijn middellange alleen besturingselementen. Figuur 2 toont de levensvatbaarheid van de OB naar aanleiding van β-TCP schijven op 7 en 14 dagen van cultuur. Levensvatbaarheid van de cellen gemeten vanaf metabolisch actieve cellen in de cultuur-putten was hetzelfde voor OBs met medium in weefselkweek kunststof evenals met β-TCP schijven die aangeeft dat deze biomaterial is het onderdrukken van OB proliferatie noch verbeteren.

Voor verdere evaluatie van de OBs, we gemeten ALP activiteit als een marker van differentiatie met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve benaderingen. Figuur 2 illustreert ALP enzymactiviteit in cultuur putten na 7 dagen van cultuur. OBs in de putjes met het medium alleen had basislijn ALP activiteit, terwijl in optimale mineralisatie medium (MM) OBs intens ALP kleuring, als gevolg van een hoog niveau van OB differentiatie. In tegenstelling, vergulde de OBs op β-TCP schijven gedifferentieerde minder dan de OBs geïncubeerd in MM. In een kwantitatieve assay was ALP concentratie 77% hoger voor de putjes met MM vergeleken met de basislijn medium alleen, terwijl ALP concentratie 40% lager in de cellen gekweekt op β-TCP schijven vergeleken met MM besturingselementen was. Hoewel deze resultaten dat de cellen die zijn geteeld op β-TCP schijven minder dan die met optimale voorwaarden van kunststof met MM gedifferentieerd aantonen, ze voldoende gedifferentieerd op de biomaterialen.

Een andere essentiële eigenschap van OBs is hun capaciteit voor het opwekken van mineralisatie, dat is een essentiële stap in het bot genezing. Wij gekleurd gekweekte cellen van de OB met ARS na 14 dagen en vond dat mineralisatie hoger voor MM besturingselementen in vergelijking met OBs gekweekt in medium alleen en op β-TCP schijven in cultuur wells (Figuur 2). Toen we de ARS-concentratie gemeten, vonden we dat de besturingselementen MM meer dan 45% hoger dan de β-TCP-groep waren. Deze gegevens illustreren dat OBs gekweekt op plastic in aanwezigheid van MM volwassen, differentiëren en mineralize beter dan degenen met medium alleen en op β-TCP schijven.

Om te bepalen hoe OCs reageren op β-TCP schijven, gebruikten we een kweken technologie waarin OBs voor het samen met het beenmerg OC precursoren gevolgd door het onderzoek van OC morfologie worden gekweekt. OB-OC co culturen werden waargenomen bij 5 dagen en verschilde aanzienlijk tussen de cellen gekweekt op plastic met OC DM en de cellen die zijn geteeld op bot segmenten en β-TCP. Op plastic, de OCs waren groot en wijdverbreide terwijl de OCs op fysiologische substraten waren kleinere, minder-verspreid en onregelmatig gevormde (Figuur 3). Om te kwantificeren de OCs, we geïnventariseerd TRAP + OCs en vond dat er waren hogere aantallen wanneer geïncubeerd met β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) ten opzichte van weefselkweek besturingselementen (1140 ± 15.71/cm2) en been segmenten (709 ± 59.69/cm2), suggereren verbeterde OC differentiatie op β-TCP schijven (Figuur 3).

Om te bepalen een verkrijgbare β-TCP/C schuim in vivo, hebben we een calvarial defect kritische middelgrote model gebruikt in muizen. Wij tonen de representatieve histologische secties verwerkt door een undecalcified histologische techniek met glycol methylmethacrylaat insluiten en Levai Laczko kleuring. MicroCT en histologie kunnen worden gebruikt voor het evalueren van nieuwe biomineralisatie binnen het gebied van het defect. Hier, laten we een voorbeeld met histologische secties in Figuur 4. Wanneer het bot operatief-geïnduceerde defect bleef leeg (schijn), we waargenomen een dun laagje die betrekking hebben op het volledige gebrek, maar geen significante biomineralisatie was aanwezig bij 12 weken post operatie bevestiging van de kritische omvang van de gemaakte botbreuk. In tegenstelling, toen het gebrek β-TCP/C schuim bevatte, waren er overblijfselen van de β-TCP/C schuim omgeven door dichte vezelig weefsel, met inbegrip van sommige bloedvaten en ontstekingscellen overbruggen van het defect gebied zonder bewijs van biomineralisatie.

Om te beoordelen van de vreemd lichaam reactie, beoordeeld wij immunologische en allergische reacties op de biomaterialen, met behulp van een in vitro assay. Figuur 5 toont aan dat wanneer naïef splenocytes werden geïncubeerd met medium alleen of met β-TCP/C schuim, de cellen van de milt naïef niet reageerde door prolifererende of produceren IL-2, IL-4 en IFN-γ cytokines. Daarentegen waarin in ConA culturen, celproliferatie en cytokine productie steeg met uitzondering van IL-1β. Cel reacties waren niet beïnvloed wanneer mede gekweekt met ConA en β-TCP/C schuim vergeleken met ConA alleen, die aangeeft dat β-TCP/C schuim noch meer noch minder in vitro -reacties.

Om te bepalen of β-TCP/C schuim een immuunreactie in vivo veroorzaakt , geïmplanteerd we het 1) intraperitoneally en inflammatoire cel graven en cytokine concentraties in de peritoneale lavage vloeistof en 2) subcutaan gemeten en geëvalueerd ontsteking en fibrose op histologische secties van de plaats van implantatie. In tabel 1onthult de cel in de vloeistof peritoneale lavage differentiële dat het totale aantal ontstekingscellen significant hoger in de muizen van de β-TCP/C schuim geïmplanteerd in vergelijking met de sham-besturingselementen was. Bovendien waren er verhoogde aantallen van alle celtypes. In figuur 6Azijn er hogere concentraties van IL-1β, IL-2, IL-4 en cytokinen in het schuim van de β-TCP/C in vergelijking met de sham-besturingselementen. In β-TCP/C schuim s.c. geïmplanteerd muizen zien we een ontstekingsreactie met vreemde voorwerpen reus cellen op H & E gebeitste secties (figuur 6B) en bewijs van fibrose op Masson van Trichrome secties (Figuur 6 c) gekleurd op 8 weken. Daarentegen had de site van de inplanting van de sham-besturingselementen minimale ontsteking en geen fibrose (Figuur 6 c).

Figure 1
Figuur 1: snuituil verwijdering voor primaire OB cel isolatie diagram. Het diagram illustreert hoe te verwijderen van de calvarium met 4 bezuinigingen (rode stippellijn) met behulp van gebogen schaar. De eerste snede is loodrecht op de juiste (R) oogkas van X1 tot en met X 2 en de tweede staat loodrecht op de linker (L) oogkas van X3 tot en met X 4. De derde snede is te scheiden van de calvarium aan de voorzijde van X4 tot en met X 2 en de vierde cut is te scheiden van de achterkant van de X3 tot en met X 1. De calvarium is vervolgens vrij om te worden verwijderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: β-TCP-geïnduceerde in vitro OB differentiatie en rijping. OB levensvatbaarheid en verspreiding op dag 7 en 14 voor de cellen gekweekt in medium alleen (balken) of β-TCP (open balken) (gemiddelde ± SEM; n = 3). ALP activiteit kwantificering van cel lysates en normalisatie om het eiwitgehalte (µM DIFMU/µg eiwit, gemiddelde ± SEM, n = 3) met representatieve beelden ter illustratie van de ALP gebeitste cultuur putten van dag 7. Mineralisatie gekwantificeerd van ARS gebeitste culturen door een cetylpyridinium chloride-extractiemethode weergegeven als de concentratie van ARS (µM ARS, gemiddelde ± SEM, n = 3) met representatieve ARS gebeitste cultuur putten op dag 14. Groepen behoren bot groeimedium alleen (BGM); Mineralisatie medium (MM); Β-TCP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: β-TCP-geïnduceerde in vitro OC differentiatie. Representatieve photomicrographs Toon TRAP + MDL op dag 5 na muis OBs en beenmerg OC precursoren mede te kweken. Eindpunt analyse van TRAP + multinucleaire cellen (MDL) toont het absolute aantal TRAP + MDL (≥3 kernen) per cm2 (bedoel ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Groepen omvatten OC differentiatie middellange alleen (DM); Bot; Β-TCP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: In vivo evaluatie van β-TCP/C schuim bot versmelt in een kritieke middelgrote calvarial defect model. Niet-genezende calvarial gebreken gemaakt in 8 - weken oude vrouwelijke BALB/c (n = 3) muizen met behulp van een tandheelkundige trephine van 4 mm. Behandeling groepen opgenomen sham controle (lege defect) en behandelde met β-TCP/C schuim gebreken. Representatieve histologische secties voorbereid op 12 weken na implantatie. Formaline-vaste glycol methylmethacrylaat-embedded weefselsecties (80-100 µm) gekleurd met Levai Laczko kleurstof. Photomicrographs getoond op lage (links) en vergroting van de hoge (rechts). Zwarte driehoekjes geven aan het bot defect. Zwart * duidt botweefsel en wit * verwijst naar β-TCP/C schuim. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: β-TCP/C schuim-geïnduceerde in vitro cel proliferatie en cytokine productie. Splenocytes van naïeve BALB/c muizen, gekweekt in medium alleen, met β-TCP/C schuim of ConA. Supernatant celproliferatie (BrdU), en de productie van IL-1β, IL-2, IL-4 en IFN-γ (middellange alleen ●, ConA ○, β-TCP/C schuim ■, β-TCP/C schuim en ConA □). Proliferatie resultaten voorgesteld als het gemiddelde van de drievoudige monsters (OD ± SEM) in de BrdU assay en het gemiddelde van dubbele monsters (pg/mL ± SEM) voor cytokine concentratie van twee onafhankelijke experimenten. p < 0.05 wordt beschouwd als belangrijk voor biomaterial vs. medium en biomaterial en ConA vs. ConA alleen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: In vivo immuunrespons van β-TCP/C schuim bot versmelt in een snelle hoge doorvoer i.p. en subchronische muismodel. (A) vrouwelijke BALB/c muizen geïmplanteerd i.p. met β-TCP/C schuim of zonder toegevoegd materialen (schijn). Zeven dagen later, peritoneale lavage geanalyseerd voor cytokine concentraties (gegevens gepresenteerd als bedoel cytokine concentraties SEM ± pg/mL). Deze gegevens zijn vertegenwoordiger van twee onafhankelijke experimenten (n = 5). p < 0.05 wordt beschouwd als aanzienlijk ten opzichte van sham. (B-C) Vrouwelijke BALB/c muizen (n = 5) geïmplanteerd s.c. met β-TCP/C schuim of zonder toegevoegde materialen (schijn). Op 8 weken na implantatie, huid van de sites van de implantatie gekleurd met H & E (B) en de Masson Trichrome (C) voor de evaluatie van ontsteking en fibrose, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Sham Vitoss
Cel graven x 106 (% van totaal aantal cellen)
Macrofagen 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70,4) p < 0,001
Eosinofielen 0.120 ± 0.011 (8,5) 1.181 ± 0.254 (25,5) p < 0.01
Neutrofiele granulocyten 0,002 ± 0,001 (0.2) 0.029 ± 0.011 (0.6) NS
Lymfocyten 0.048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0,041 (3.5) NS
Cel totaal tellen 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tabel 1: In vivo immuunrespons van β-TCP/C schuim bot versmelt in een muismodel voor snelle high throughput i.p.. Vrouwelijke BALB/c muizen waren geïmplanteerde i.p. met β-TCP/C schuim of zonder materialen (schijn). Zeven dagen later, peritoneale lavage werd verkregen en geanalyseerd voor inflammatoire celaantal en differentiële cel telt (gegevens gepresenteerd als cel telt ± SEM te betekenen). Deze gegevens zijn vertegenwoordiger van twee onafhankelijke experimenten (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier, laten we een multidisciplinaire aanpak voor de preklinische beoordeling van biocompatibiliteit voor representatieve biomaterialen ontwikkeld voor bot regeneratie en reparatie. We testten de reacties van OBs, OCs, en de helende reactie van in vivo in een kritische bot defect model in muizen, alsmede in vitro en in vivo immuunrespons. We gericht om aan te tonen hoe de testen werken en de gegevens en conclusies die zijn afgeleid van het onderzoek van de biomaterialen samen te vatten. We laten zien dat onze strategie een waardevolle Profiel van bot biomaterial biocompatibiliteit genereert.

Primaire cellen werden gebruikt OB en OC-functie moet worden geëvalueerd. OBs zijn verantwoordelijk voor de vorming van bot en fysiologische reparatie. Ze moeten levensvatbaar blijven onderscheiden en induceren mineralisatie. In deze studie tonen we hoe uit te voeren tests voor de levensvatbaarheid van de cellen, ALP en ARS als markers van fysiologisch gedifferentieerde cellen met de capaciteit om mineralize. De besturingselementen voor de tests opgenomen medium alleen, dat een basis biedt en osteogenic mineralisatie medium (MM), die geoptimaliseerd differentiatie en mineralisatie van OBs op plastic. De laatste controlegroep was een standaard voor de biomaterial verwijzing. Voor de evaluatie van de OC, wij samen gekweekt OBs en beenmerg-afgeleide OC precursoren, onderscheid gemaakt tussen de precursoren multinucleaire cellen, gekleurd hen met TRAP, een osteoclastic enzym gebruikte OCs in vitro15 identificeren en vervolgens geïnventariseerd de cellen met behulp van de lichte microscopie. Deze testen zijn state-of-the-art en geen wijzigingen vereist. Echter we opgemerkt een beperking gerelateerde aan de kwaliteit van geïsoleerde primaire OBs te mineralize. Bewaarde OBs worden opgeslagen in vloeibare stikstof en gebruikt binnen één jaar voor optimale resultaten.

OB gehechtheid en activiteit waren hoger op weefselkweek plastic dan op de β-TCP-schijven getest. Bij de beoordeling van OCs, vastgesteld we hebben dat de verwachte verschillen tussen de reactie op kunststof en het bot, oftewel de fysiologische substraat16. In vergelijking geïnduceerde bot en β-TCP soortgelijke morfologische veranderingen. De TRAP assay opsomming van OCs in reactie op de β-TCP schijven toonde aan dat de nummers significant verschillend tussen been segmenten en β-TCP waren. Β-TCP geïnduceerde hogere OC differentiatie dan op been segmenten. OC de differentiatie is TRAP een gevestigde test. Er waren geen significante wijzigingen nodig zijn in deze methode. Echter, voor de beste resultaten, er absoluut niet voor Incubeer de cellen te lang, of alle cellen van monocytic oorsprong wordt TRAP-positief.

Om het antwoord in vivo , we gebruikten β-TCP/C schuim als een voorbeeldige biomaterial omdat het bevat β-TCP, die werd gebruikt in de in vitro testen en collageen en bevordert de genezing13bot. Hoewel β-TCP/C schuim verkrijgbaar gebruikte klinisch voor bot reparatie17,18 is, het is slechts één van vele verschillende soorten materialen die zou interessant zijn om te studeren, bijv., tweefase calciumfosfaat () hydroxyapatiet/β-TCP) zo goed als gedemineraliseerd menselijk bot in deze testen om te bepalen hoe biologische reacties verschillen tussen materialen. Voor de in vivo reactie, wij geïmplanteerd β-TCP/C schuim in een kritische en middelgrote calvarial bot defect in muizen en 12 weken later beoordeeld histologie en bleek verschillen ten opzichte van sham besturingselementen. Het is ook mogelijk om te evalueren van de reacties met microCT waarmee gratis informatie19. Het defect in de sham controle muizen had geen significante biomineralisatie, zoals verwacht, overwegende dat β-TCP/C schuim veroorzaakt een ontstekingsreactie, fibrose en angiogenese, die het bewijs van de vroege fase van biomineralisatie is. Deze methode is eerder aangetoond in JOVE20. Onze aanpak verschilden echter in dat we een gewijzigde "lift" techniek met een periosteal Lift gebruikt om het risico van de dura mater verwonden door de trephine. We redeneerde dat de dura mater een belangrijke rol in het genezingsproces van calvarial gebreken speelt door overlegging van de osteogenic cellen en osteo-inductief factoren3,21,22,23. Met name beïnvloedt het materiaal geïmplanteerd, de grootte van het defect, en de methode voor het maken van het gebrek bot regeneratie van calvarial gebreken. Een andere wijziging in de procedure betrokken de stabilisatie van de biomaterial in de calvarial defect met een biocompatibele weefsel lijm die routinematig klinisch wordt gebruikt voor de sluiting van de wond. Deze wijziging wordt gegarandeerd dat het materiaal op het gebied van het defect niet zou worden verplaatst tijdens de genezing.

Ontsteking regelt de vroege fase van het bot genezing, maar teveel ontstekingen of allergische reacties kunnen verminderen reparatie11. De ideale immune reactie op biomaterialen is te starten een inflammatoire cascade die biomineralisatie bevordert. Bepaalde biomaterialen kunnen echter een vreemd lichaam reactie leidt tot een matrix van inflammatoire signalen die leiden fibrose of allergische overgevoeligheid tot veroorzaken. In onze studies, we immuun reacties op β-TCP/C schuim geëvalueerd en heeft geconstateerd dat het niet giftig voor de naïeve milt cellen en niet bemoeien met de T-lymfocyten expansie of functioneren (cytokine secretie) wanneer toegevoegd aan culturen met ConA. In de intraperitoneaal experimenten, β-TCP/C schuim veroorzaakt ontsteking, en er was enig bewijs voor een toename in eosinofilie en macrofagen met een gelijktijdige toename Th1 - en Th2-type cytokines. In de onderhuidse implantatie experimenten, β-TCP/C schuim ook veroorzaakte ontsteking, maar er was geen bewijs voor chronische, destructieve inflammatoire of allergische reacties, hetgeen suggereert dat β-TCP/C schuim biocompatibel is. Deze modellen bevatten informatie over de immune reactie op biomaterialen. In de eerste plaats behandelt de in vitro -model het effect van de biomaterial op naïeve immune cellen in aanwezigheid van een mitogeen te bewijzen dat er geen onderdrukking van de mitogene reactie veroorzaakt door de biomaterial is. Ten tweede, het intraperitoneaal model biedt een snelle 7-daagse uitlezing van het soort immuunrespons, bv., allergische en ontsteking zoals waargenomen door het soort inflammatoire cel infiltratie en het cytokine-profiel. Ten derde, de subcutane, subchronische model illustreert het weefsel antwoord over een langere periode voorziet in de beoordeling van de chronische ontsteking, fibrose, antilichamen titers en kan worden gebruikt voor het testen van herhaalde implantatie voor geheugen van de immunologische reacties. Deze modellen zijn eerder gepubliceerd en worden hier getoond zonder enige wijzigingen-13. Het is van cruciaal belang dat er passende negatieve en positieve controles voor deze modellen zijn. Wij stellen voor het uitvoeren van alle drie de modellen om te voorkomen dat de beperkingen van elke methode. Hoewel de modellen getoond goed ingeburgerd in andere gebieden van de immunologie zijn, is de aanpak voor het testen van biomaterialen recente.

Kortom bieden bot- en immuun testen een biologische verenigbaarheid profiel op een biomaterial. OB en OC reacties op de biomaterial bieden voor bot, voorlopige gegevens die nodig zijn voor het uitvoeren van gecompliceerde en dure dierproeven en het voldoen aan het 3V-principe. Immunologische in vitro testen verstrekken gegevens over antigeen Kruisallergie en cytotoxiciteit, die ook verder dierproeven kan beletten. De snelle hoge doorvoer experimenten bieden resultaten op inflammatoire en cytokine reactie (bv., soort reacties van T-lymfocyten), terwijl de subchronische model handig omdat de gegevens over de duur van de ontsteking en het potentieel voor schade is fibrose. Deze nieuwe interdisciplinaire aanpak waarin bot en immuun reacties op biomaterialen biedt een uitstekende preklinische evaluatie van biocompatibiliteit voor toekomstige toepassingen op het gebied van materialen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoeksproject heeft financiering ontvangen van de Europese Unie zevende kaderprogramma (KP7/2007-2013) onder subsidie overeenkomst nr. 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

Bioengineering kwestie 141 regeneratieve geneeskunde biomaterialen skeletale tissue reparatie immunogeniciteit vreemd lichaam reactie in vitro in vivo
Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter