Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biologiske kompatibilitet profil på biologisk materiale for bein gjenfødelse

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

Antall romanen biologisk materiale utviklet for å reparere store bein lesjoner er kontinuerlig utvide med sikte på å styrke bein healing og overvinne komplikasjoner knyttet bein transplantasjon. Her presenterer vi en tverrfaglig strategi for pre-klinisk biocompatibility testing av biologisk materiale for bein reparasjon.

Abstract

Store ikke-unionen benbrudd er en viktig utfordring i Ortopedisk kirurgi. Selv om automatisk og allogene bein grafts er utmerket for helbredelse slik lesjoner, finnes det mulige komplikasjoner med bruken. Dermed utvikler materialet forskere syntetisk, biokompatible biologisk materiale for å overvinne disse problemene. I denne studien presenterer vi en tverrfaglig plattform for evaluering av biologisk materiale for bein reparasjon. Ekspertise fra bein biologi og immunologi å utvikle en plattform inkludert i vitro osteoclast (OC) og osteoblast (SR) analyser og i vivo musen modeller av bein reparasjon, immunogenisitet og allergi fremkallende kombineres. Vi viser hvordan å utføre eksperimenter, oppsummere resultatene og rapportere om biomateriale biocompatibility. Spesielt testet vi OB levedyktighet, differensiering, og mineralisering og OC levedyktighet og differensiering i sammenheng med β-tricalcium fosfat (β-TCP) disker. Vi testet en β-TCP/kollagen (β-TCP/C) skum som er et kommersielt tilgjengelig materiale brukes klinisk bein reparasjon i en kritisk-størrelse calvarial bein defekt musemodell for å bestemme effekten på den tidlige fasen av bein healing. Parallell eksperimenter vurdert vi immun og allergiske reaksjoner i mus. Vår tilnærming genererer en biologisk kompatibilitet profil av en bein-biomateriale med en rekke parametere som er nødvendige for å forutsi biokompatibilitet av biologisk materiale brukes for bein healing og reparasjon hos pasienter.

Introduction

Bein reparasjon er en komplisert prosess som begynner med hematom formasjon, betennelse, callus dannelse og deretter remodeling1,2. Men er bein gjenfødelse potensielle begrenset til størrelsen på den Ben brudd1,3. For eksempel store benbrudd forårsaket av trauma, kreft eller osteoporose kan ikke helbrede og kalles ikke-unionen benbrudd. Disse bein lesjoner krever ofte behandling å fremme sunn fysiologiske bein reparasjon og gjenfødelse. Foreløpig autograft og allograft bein transplantasjon er tilnærmingen til valg4 med 2,2 millioner bein erstatning prosedyrer årlig5. Selv om disse prosedyrene har en høy suksessrate, kan det hende komplikasjoner, for eksempel begrenset tilgjengelighet av bein, infeksjon, donor området sykelighet og avvisning4. Nye alternativer for bein vev engineering søkes disse utfordringene.

Utformingen av biologisk materiale basert på naturlige eller syntetiske polymerer, bioceramics eller metaller i kombinasjon med celler og bioaktive molekyler er på økningen6. Vår nåværende forståelse av fysiologiske bein healing og healing i sammenheng med biologisk materiale, avhenger av flere faktorer som mekaniske egenskaper og flere lokale og systemiske faktorer inkludert celler fra sirkulasjon og bruddet sted7 ,8,9. Biologisk materiale for bein regenerering mål å fremme osteogenicity og osseointegration10 og er en ideell biokompatible, biologisk nedbrytbart og porøs (fremme celle migrasjon, oksygen og næringsstoffer). De må også være sterke nok å støtte brudd området for å lindre smerter. I tillegg må inflammatoriske faktorer starte helbredelsesprosessen. Men hvis biomateriale induserer overdreven betennelse og allergiske reaksjoner, kan dette begrenser eller hindrer bein healing11,12. Dermed er en tverrfaglig tilnærming nødvendig for å evaluere biologisk materiale utviklet for bein reparasjon.

I denne studien presenterer vi en pre-klinisk evaluering av representant materialer, 1) Orthovita Vitoss skum som er kommersielt tilgjengelige cancellous bein pode erstatning bestående av tricalcium fosfat består av nanometer størrelse ren β-tricalcium fosfat (β-TCP) partikler og Type 1 bovin kollagen (C) (β-TCP/C skum) og 2) β-TCP disker. Her vi illustrere biocompatibility testing av disse biologisk materiale bruke primære osteoblast (SR) og osteoclast (OC) søk, en i vivo modell av bein reparasjon, en immunologiske vurdering omfatter i vitro T lymfocytt spredning og cytokin produksjon, og i vivo immunogenisitet og allergi fremkallende, som tidligere rapportert13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene ble gjort med BALB/c mus følger alle retningslinjer og bruk av forsøksdyr østerrikske departementet for utdanning, vitenskap og forskning og ble godkjent av komiteen på etikk østerrikske departementet for utdanning, vitenskap og forskning.

1. hovedknappen på musen OB kultur

  1. OB isolasjon fra neonatal musen calvaria bruker enzymatisk fordøyelse
    1. Euthanize 1 – 2 dag gammel neonatal pups (60 totalt) ved halshogging og plasser hodet i en Petriskål sterilt 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
    2. Hold hodet bak i nakken, og kutte huden bort med sterilt saks. Incise calvarium av piercing den (ca 0.1-0.3 mm) med en saks som deretter settes inn under calvarium på baksiden av hodet ved foten av skallen og skjær langs calvarial kanten sidelengs fra tilbake foran over ørene og deretter Torna e det nasal bridge (figur 1).
    3. Inkuber dissekert calvaria med 8 mL filter sterilisert fordøyelse (300 enheter/mL collagenase type IV og 2,14 enheter/mL dispase II oppløses i α-minimum viktig medium (α-MEM)) i et 50 mL konisk rør ved 37 ° C i 10 minutter i en risting inkubator på 200 rister / minutt.
    4. Forkast første nedbryting og gjenta fordøyelsen tre ganger med 8 mL fordøyelsen. Samle nedbryting inneholder cellene etter hvert fordøyelsen trinn og legge den til en 50 mL konisk rør. Lagre 50 mL konisk røret med celler i et isvann bad før fordøyelsen prosedyren (ca 40 minutter) er fullført.
    5. Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C, Sug opp nedbryting (med en Pasteur pipette knyttet til en vakuumpumpe) og resuspend i 40 mL av bein vekst medium (BGM) som inneholder α-MEM med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin løsning. Deretter legge til 10 mL av cellen suspensjon 4 vev kultur plater (10 cm).
    6. Kultur cellene på 37 ° C og 5% CO2 til samløpet (2-3 dager).
    7. Sug opp den gamle mediet der, og vaske vev kultur platene gang med 1 x PBS (37 ° C). Deretter Sug opp PBS og legge 2 mL 1 x trypsin løsning inneholder 0,5% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) til hver 10 cm vev kultur plate.
    8. Inkuber 4 kultur platene på 37 ° C og 5% CO2 i 5 min og merker platene med en invertert lys mikroskopet slik at cellene er løsrevet fra plasten. Overføre alle cellen suspensjoner (totalt 8 mL) til en 50 mL konisk rør som inneholder 10 mL av fersk BGM. Vask hver plate med 5 mL av fersk BGM og overføre til samme 50 mL konisk rør.
    9. Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C, Sug opp nedbryting og resuspend cellene i 16 mL frisk BGM. Forberede 16 nye 10 cm vev kultur plater (splitting 1:4) som inneholder 9 mL BGM. Legge til 1 mL av cellen suspensjon hver plate.
    10. Gjenta 1.1.6. til 1.1.8.
    11. Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C, Sug opp nedbryting og resuspend i 10 mL av fersk BGM. Telle celler og beregne celle konsentrasjonen.
      Merk: Denne fremgangsmåten genererer ca 7.5-8.3 x 105 celler/pup.
    12. Sentrifuge på 300 x g i 5 min på 4 ° C, Sug opp nedbryting og resuspend i iskaldt middels inneholder 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), 40% α-MEM og 50% FBS. Overføre 1.5 mL av cellen suspensjon til 2 mL cryovials totalt 2 x 106 celler per medisinglass.
    13. Flash fryse ampullene i flytende nitrogen for langtidslagring i en flytende nitrogen tank. Bruke cellene innen ett år for å sikre full funksjonalitet. Bruke disse primære OBs for evaluering spredning (trinn 1.2), differensiering (ALP analyser: trinn 1.4., 1,5.) og mineralisering (trinn 1.6.) i nærvær av biologisk materiale. Bruk disse cellene for modning av bein margtransplantasjon-avledet OC forløpere i co kultur (trinn 2.3).
  2. OB spredning analysen
    1. Pre ruge 14 mm diameter β-TCP disker i 1 mL av BGM i en 24-vel suspensjon kultur plate på 37 ° C og 5% CO2 for 24 timer før du legger til primære OBs. Bruk standard vev kultur plater for kontroller og suspensjon kultur plater biomateriale prøver å unngå celle vedlegg plast.
    2. Sug opp pre-inkubering medium og deretter resuspend hovedknappen på musen OBs i BGM. Legge til 4,4 ganger 104 OBs/cm2 på pre inkubert β-TCP diskene i en 24-vel suspensjon kultur plate og kontrollgruppen, i en 24-og vev kultur plate (1 mL/vel). OBs vil legge til vev kultur plate eller i biomateriale.
    3. Inkuber i 14 dager på 37 ° C og 5% CO2. Under inkubasjonstiden, endre mediet hver 2-3 dager og tilsett 1 mL av fersk BGM hver brønn.
    4. For å vurdere OB spredning, overføre β-TCP diskene på 7 og 14 nye brønner utelate signalene fra celler dyrket på suspensjon kultur plate.
    5. Sug opp den gamle mediet, Legg til 0,5 mL BGM (37 ° C) og ruge kultur platene i 30 min på 37 ° C og 5% CO2. Legg deretter til 55 µL av 10 x celle spredning reagens (1:10 fortynning) direkte inn i kulturen godt. For tomme, forberede tre brønner med 0,5 mL BGM og 55 µL av 10 x celle spredning reagensen. Inkuber alle platene i 30 min på 37 ° C og 5% CO2.
    6. Ta ut og overføre 150 µL nedbryting av fra hver brønn i en 96-brønns svart plate og lese fluorescens eksitasjon på 560 nm og utslipp på 590 nm. Trekk tom målingene fra prøven målingene.
  3. OB differensiering og mineralisering analyser
    1. Pre ruge 14 mm diameter β-TCP disker i 1 mL av BGM i en 24-vel suspensjon kultur plate på 37 ° C og 5% CO2 for 24 timer før du legger til OBs. Bruk standard vev kultur platene for kontroller og suspensjon kultur plater biomateriale prøver å unngå cellen vedlegg plast.
    2. Sug opp pre-inkubering medium og deretter resuspend hovedknappen på musen OBs i BGM. Legge til 8,8 x 104 OBs/cm2 på pre inkubert β-TCP diskene i en 24-vel suspensjon kultur plate og kontrollgruppen, i en 24-og vev kultur plate (1 mL/vel). OBs vil legge til vev kultur plate eller biomateriale prøven.
    3. Erstatt BGM med 1 mL av osteogenic mineralisering medium (MM) som inneholder BGM, 50 µg/mL askorbinsyre og 5 mM β-glycerophosphate 24 timer etter at OBs og ruge i 14 dager på 37 ° C og 5% CO2. Endre mediet hver 2-3 dager med 1 mL av nylagde MM i hver brønn.
  4. OB differensiering vurdert av alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet fra cellen lysates
    1. For å måle ALP aktivitet på dagen 7 etter tillegg av MM, Sug opp kultur medium fra brønnene og deretter vaske med 1 mL steril 1 x PBS (37 ° C). Nøye Sug opp PBS slik at tilknyttede cellene til å forbli på vev kultur plast eller biomateriale og fryse platene på-80 ° C.
    2. Etter 24 timer (eller opp til 2 uker), tine kontroll vev kultur plate og biomateriale suspensjon kultur plate ved romtemperatur (RT) å forberede OB lysis. For biomateriale prøver, overføre β-TCP diskene i en ny suspensjon kultur plate utelate cellene knyttet til plate. Legge til 75 µL per brønn 1 x celle lyseringsbuffer begge platene. Riste platene i 5 min på en shaker på 400 rister/min.
    3. Overføre cellen lysate til en 0,5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge på 300 x g for 6 min på RT å fjerne rusk. Legge til 50 µL eksempel celle lysate nedbryting av en 96-brønns svart plate, og legg deretter til 50 µL av en løsning bestående av 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfat (DiFMUP) fluorogenic substrat oppløst i 2 x ALP buffer (pH 10) per brønn. Definere to tomme brønner med 100 µL av en 1:1 løsning som inneholder 1 x celle lyseringsbuffer og 2 x ALP buffer.
    4. Forberede 8 referanse standarder med 100 μL/godt med den 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) alt fra 0,5 til 200 μM oppløst i 1:1 løsning som inneholder 1 x celle lyseringsbuffer og 2 x ALP buffer til å generere en standardreferanse kurve.
    5. Inkuber den svarte platen på 37 ° C i 15 min og deretter lese fluorescens magnetisering på 358 nm og utslipp på 455 nm. Trekk tom målingene fra referanse standarder og prøve opplesninger.
    6. Normalisere ALP enzymaktiviteten fra cellen lysates til den totale mengden protein bruker en kolorimetrisk analysen for protein konsentrasjon. Forberede bovin serum albumin (BSA) protein referanse standarder på et område fra 0,05-2.5 µg/µL oppløst i 1 x celle lyseringsbuffer til å generere en standard kurve.
    7. Forberede prøven cellen lysates og BSA protein standarder i duplikater. Legge til 5 µL for eksempel cellen lysate eller 5 µL av BSA protein standard i en 96-brønns plate, og legg deretter til 25 µL til reagensen A' og 200 µL til reagensen B. Sett opp to tomme brønner med 5 µL av 1 x celle lyseringsbuffer. Inkuber platene på RT i 15 min og deretter lese absorbansen på 690 nm. Trekk tom målingene fra referanse standarder og prøve opplesninger.
  5. OB differensiering vurdert av farging ALP i cellekultur
    1. Stain ALP i kulturperler OBs på dagen 7 etter tillegg av MM på en kontroll vev kultur plate og biomateriale i en suspensjon kultur plate.
    2. Sug opp kultur medium fra brønnene og erstatte den med 0,5 mL 1 x PBS (37 ° C). Sug opp PBS og løs cellene ved rugende dem i 0,5 mL 10% bufret formalin på RT for 1 min.
    3. Sug opp 10% bufret formalin med en engangs Pipetter og Legg til 0,5 mL vaskebuffer (0,05% Tween20 i 1 x PBS).
    4. Oppløse en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat/nitro blå tetrazolium (BCIP/NBT) substrat-tablett i 10 mL ultrapure vann og vortex til helt oppløst. Løsningen må beskyttes lys og brukes innen 2 t.
    5. Sug opp vaskebuffer og erstatte med 0,5 mL BCIP/NBT substratløsningen og ruge platen på RT i mørket 10 min. leveringstanken flekker løsningen og erstatte med 0,5 mL vaskebuffer.
    6. Overføre farget β-TCP diskene i en ny brønn og skanne ALP-farget platene med en konvensjonell planskanner for posten ALP flekker.
  6. OB mineralisering vurdert av flekker med Alizarin rød S (ARS)
    1. Sug opp kultur medium fra brønnene som inneholder primære OBs 14 dager etter at MM og skyll to ganger med 0,5 mL 1 x PBS på RT. leveringstanken PBS og fikse cellene ved å legge til 0,5 mL 10% bufret formalin løsning på RT i 10 min.
    2. Sug opp 10% bufret formalin med en engangs Pipetter og vask to ganger med 0,5 mL ultrapure vann.
    3. De faste OBs, legge 0,25 mL av 40 mM ARS flekker løsning (pH 4.2) oppløst i ultrapure vann og ruge platen på RT i 10 min på en shaker på 100 rister/min.
    4. Sug opp den flekker løsningen med en engangs Pipetter og skyll med 1 mL ultrapure vann. Gjenta dette trinnet 5-10 ganger for å fjerne uspesifikke flekker.
      Merk: Skyllingsprosess løsningen skal være uten farge.
    5. Sug opp ultrapure vann og tilsett 1 mL kaldt PBS. Inkuber platen på RT i 10 min på en shaker på 100 rister/min.
    6. Sug opp PBS, overføre farget β-TCP diskene til en ny brønn og skanne platene med en planskanner til posten mineralisering.
    7. Legg 0,25 mL 10% cetylpyridinium chloride løsning og ruge platen på RT i 15 min på en shaker på 100 rister/min trekke ut ARS fargestoff.
    8. Overføring av supernatants til en 1,5 mL tube og sentrifuge 17000 x g for 5 min på RT.
    9. Legge til 10% cetylpyridinium chloride løsning ekstrakter med en fortynning av 1:10-1:20 og Legg prøvene (300 µL) i en 96-brønns plate inkludert to tomme brønner som inneholder bare 10% cetylpyridinium chloride.
    10. Forberede 7 ARS referanse standarder, fra 4 til 400 µM ved å fortynne 40 mM ARS flekk løsning (pH 4.2) med 10% cetylpyridinium chloride løsning for å generere en standard kurve.
    11. Legge til 300 µL av referanse standard i duplikater i 96-brønnen platen.
    12. Lese absorbansen prøvene, mellomrom og referanse standarder på 520 nm.
    13. Trekk tom målingene fra referanse standarder og prøve opplesninger.

2. musen OB-OC co kultur å utlede modne OCs

  1. Forberedelse og sterilisering av bovin kortikalt benvev skiver
    1. Rengjør segmenter av bein fra de omkringliggende vev og fjerne trabekulært bein og benmarg.
    2. Tørr benet ved 50 ° C i 24 timer.
    3. Skjær benet i mindre biter og skjær den i skiver (ca 300-350 µm tykk) bruker en lav hastighet så med diamant blad.
    4. Skjær 300-350 µm skiver i kvadratiske disker (1 cm2).
    5. For å rengjøre bein diskene (1 cm2), setter du dem inn i en låsbar hetteglass og fyll med destillert vann. Overføre fylt glass ampullen i ultralydbad og sonicate for 5 min. Gjenta dette trinnet tre ganger.
    6. Hell av destillert vann, legge til 70% etanol, og sonicate i 5 minutter.
    7. Hell av 70% etanol og erstatte med 100% etanol.
      Merk: Lagre bein skiver i 100% etanol 4 ° c i opptil fire uker.
    8. Irradiate bein skiver med UV lys i 15 minutter på hver side under sterile forhold. Lagre sterilisert bein skiver i en steril kultur plate på RT til fremme bruk.
  2. Isolering av benmarg OC forløpere
    1. Euthanize naiv 8-12 uke gamle BALB/c mus ved hjelp av en intraperitoneal (IP)-injeksjon i en løsning av 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazine.
    2. Isolere benmarg OC forløpere fra mus femurs og tibiae.
    3. Fjerne bena med sterilt saks fra det nærmeste punktet til kroppen på hofteleddet, kuttet av lemmer i kne og ankel og fjerne bløtvev sterilt skalpell og tang. Klipp av epiphyses. Skylle ut og suspendere margen med 1mL BGM i en 6 cm sterilt Petriskål bruker en 27G nål knyttet til en 1mL sprøyte vil ha en celle suspensjon.
    4. Legg celle suspensjon slik 50 mL koniske, vaske 6 cm Petriskål med 5 mL BGM og overføring til samme 50 mL konisk rør. Sentrifuge 350 x g på 4 ° C for 5 min. Resuspend cellene i OC differensiering medium (DM) som inneholder BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 og 1 µM prostaglandin E2 (1 mL/vel).
      Merk: En BALB/c mus gir tilstrekkelig antall OC forløpere for en 24-brønnen plate.
  3. Utarbeidelse av musen OB-OC co kultur med biomateriale
    1. Pre ruge 14 mm diameter β-TCP disker eller storfe bein skiver (1 cm2) i 1 mL av BGM i en 24-vel suspensjon kultur plate på 37 ° C og 5% CO2 for 24 timer før du legger til cellene.
      Merk: Storfe bein stykker er en fysiologiske substrat kontrollgruppe for å studere OC differensiering i nærvær av biologisk materiale.
    2. Legge til 8,8 x 104 celler/cm2 av primære OBs suspendert i BGM på de biologisk materiale eller kontroll ben i en 24-vel suspensjon kultur plate eller til en 24-og vev kultur plate. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 for 24 timer.
      Merk: OBs knytte til plast eller biomateriale eller storfe bein.
    3. Legge fersk isolert benmarg OC forløpere til 24 h kultivert primære OBs og kultur på 37 ° C og 5% CO2 i 5 dager. Erstatt medium med nylagede OC DM annenhver dag. Deretter flekken OCs for tartrate-resistente sure fosfatase (TRAP) å vurdere OC differensiering.
  4. OC differensiering vurdert av FELLE flekker
    1. Betegner moden multinucleated OCs, fra trinn 2.3.3, Sug opp kultur mediet kontroll vev kultur plate og biomateriale suspensjon kultur plate og tilsett 1 mL 1 x PBS (37 ° C). Sug opp PBS og løs cellene ved rugende dem i 1 mL av 10% bufret formalin løsning på RT for 10 min.
    2. Sug opp 10% bufret formalin løsningen med en engangs Pipetter legge 1 mL 1 x PBS på RT. Gjenta dette trinnet tre ganger, Sug opp PBS, erstatte med 1 mL av FELLE buffer (pH 5) og ruge platene på 37 ° C i 30 min.
    3. Sug opp FELLE bufferen og legge 1 mL 1:1 aceton og 100% etanol. Inkuber platen ved RT 30 s. raskt leveringstanken aceton-etanol løsning med en engangs Pipetter og tørke helt platene på RT.
    4. For FELLEN flekker løsning, forberede en 10 mg/mL naphthol-AS-MX fosfat lagerløsning i N, N-vannistedenfor, oppløses 0.6 mg/mL av rask rød fiolett salt i FELLEN buffer, og legge til 0,1 mL av naphthol-AS-MX fosfat lagerløsning 10 mL rask rød fiolett salt FELLE buffer.
    5. Legg 1 mL av FELLE flekker løsning og ruge platen ved 37 ° C i 10 min, så Sug opp FELLEN flekker løsning, og Legg 1 mL ultrapure vann for å stoppe reaksjonen.
    6. Overføre β-TCP disker og storfe bein stykker etter farging i en ny brønn, observere rød farget OCs bruker lys mikroskop (forstørrelse: 10 X) og nummerere FELLE + modne OCs med tre eller flere kjerner.

3. kritisk mus Calvarial feil modell

  1. Injisere 0,1 mg/kg buprenorfin subcutaneously (SC) til 8 - uke gamle BALB/c mus for analgesi.
  2. Bedøve mus med en blanding av 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazine IP, legge til en gel eller salve øynene for å holde dem fuktige og plassere musen på en oppvarming plate på 37 ° C i løpet av hele fremgangsmåten for å hindre nedkjøling. Vurdere anestesi dybden av tå og hale knipe.
  3. Barbere pels på toppen av hodet mellom ørene og rengjør overflaten med 7,5% povidon joden løsning og 70% etanol.
  4. Gjøre en midtlinjen sagittal snitt på skallen mellom ørene med sterilt skalpell å avsløre calvarium og fjerne pericranium bindevev over høyre parietal benet ved skraping det med en skalpell.
  5. Opprette en kritisk størrelse defekt i høyre parietal benet et sterilt dental trephine med en diameter på 4 mm (2000 rpm) under konstant vanning med vanlig saltvann hakk høyre parietal benet og skjære gjennom ectocortex og noen endocortex.
  6. For å unngå skade den dura mater, bruk en liten periostal heis bryte gjennom de gjenværende endocortex, nøye løft calvarial bein og fjern den med tang. Den resulterende feilen skal rundskriv og ca 3,5 mm i diameter.
  7. Fyll calvarial feilen med pre-gjennomvåt (sterilt 1 x PBS på RT) β-TCP/C skum ved hjelp av pinsett.
  8. Forberede riktig antall alder-matchet, falske negative kontroller med en tom defekt.
  9. For å holde biomateriale på plass, satte 0,5 µL av vev lim på kanten av mangelen på to motsatte poeng.
  10. Lukk huden med en ikke-absorberbare Sutur.
  11. Rengjør alle kirurgiske instrumenter med kaldt sterilisering å opprettholde sterile forhold før neste operasjonen på en bedøvet musen.
  12. Post-kirurgisk behandling, plasser dyrene på en tørr og ren varmeplaten på 37 ° C i kirurgi området for riktig oppfølging under restitusjonsperioden. Overvåke pustefrekvens, kroppstemperatur og fargen på slimhinnene og øyne hvert 10 min før de våkner.
  13. Overføre styres bevisst musene i et bur med mat og vann atskilt fra de andre dyrene til full gjenoppretting. Injisere 0,1 mg/kg buprenorfin SC for post-kirurgiske smertestillende terapi to ganger per dag for 72 h. tilbake helt frisk mus til deres burene.
  14. For å fastslå effektiviteten av biomateriale, euthanize mus IP med en løsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazine.
  15. På 8-12 uker etter implantasjon, halshugge euthanized musen med skarp saks.
  16. Fastsette decapitated mus hodet i 30 mL 4,5% bufret formalin løsning for 1-2 uker å garantere full penetrasjon av bindemiddel i vevet.
  17. Overføre hodene til 70% etanol for langtidslagring på 4 ° C i opptil ett år.
  18. Bruk mikro beregnet tomografi (microCT) eller standardiserte undecalcified histologiske teknikker å evaluere bein gjenfødelse. Det er mulig å bruke microCT skanning på postmortem prøver med høy oppløsning (90 kV, 4 min) i 2D og 3D sagittal og frontal fly.
  19. Undecalcified histology, tørke hoder i stigende graderinger av etanol og bygge i glycol methyl methacrylate.
  20. Kutt glykol methyl methacrylate-innebygd blokker med en diamant så og male delene til en tykkelse på ca 80-100 µm.
  21. Evaluere Levai Laczko farget benet seksjoner for å identifisere nye bein formasjon14.

4. in Vitro immunreaksjoner

  1. Euthanize naiv 8 - uke gamle BALB/c mus IP med en løsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazine.
  2. Plasser musen på høyre side, barbere pelsen på venstre side og rense huden over venstre side av magen med 70% etanol.
  3. Lage en 10 mm lang og 1 mm dyp snitt i huden av musen til venstre posteriorly følgende ribbeina over magen med sterilt saks.
  4. Åpne huden og dermed eksponere peritoneum. Gjør en 10 mm lange og mindre enn 1 mm dyp snitt i peritoneum med saks under sterile forhold.
  5. Skyv magen proximally å avsløre milten.
  6. Hold milten forsiktig med sterilt tang og fjerne den ved å kutte vev og fartøy knyttet nedenfor.
  7. Plass intakt milten i en 50 mL tube som inneholder 10 mL kaldt 1 x sterilt PBS.
  8. Forberede en enkeltcelle suspensjon av hakking milten 2 sterilt tang eller 2 sterilt glass lysbilder.
  9. Fjerne rester av passerer det gjennom en steril 40 µm celle sil med kaldt 1 x PBS bruker stempelet til en 1 mL sprøyte.
  10. Sentrifuge enkeltcelle suspensjon på 300 x g i 10 min på 4 ° C i et 50 mL konisk rør, Sug opp og kast nedbryting. Deretter resuspend celle pellet i 5 mL av røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer.
  11. Inkuber celle suspensjon i 14 min på RT og stoppe reaksjonen ved å legge til 45 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
  12. Sentrifuge cellene etter celle lysis på 300 x g i 10 min på 4 ° C, og deretter kaste nedbryting.
  13. Resuspend splenocytes i RPMI medium som inneholder 10% inaktivert FBS, 1% penicillin-streptomycin løsning, 0,1% gentamicin, 0,2% ß-mercaptoethanol og 1% ikke-essensielle aminosyrer.
  14. Pre ruge β-TCP/C skum i en 96-brønns steril kultur plate inneholder RPMI medium for 24 h på 37 ° C og 5% CO2 før cellen seeding.
  15. Legge til splenocytes på titrerte tall, f.eks., 1,25 x 105, 2,5 x 105 og 5 x 105/well brønner i en 96-brønns vev kultur plate inneholder RPMI medium og tilsetningsstoffer, med eller uten pre inkubert β-TCP/C skum.
  16. Legge 10 µg/mL concanavalin en (Con A) oppløst i medium for totalt 100 µL/vel riktig fordelt og deretter ruge på 37 ° C og 5% CO2 72 h.
  17. Måle celle spredning med en bromodeoxyuridine (BrdU)-analysen. Legg til 10 µL/vel BrdU merking løsning på 48 timer med cellekulturer og deretter ruge platen i en ekstra 24 h.
  18. På 72 h, samle nedbryting og lagre på 20 ° C til fremme bruk.
  19. Legg til 200 µL/vel av fiksering løsningen i hver brønn og deretter ruge i 30 min på RT. leveringstanken fiksering løsningen. Legg 100 µL/vel av anti-BrdU antistoff arbeider løsningen og ruge for 90 min.
  20. Sug opp antistoff løsningen, skyll brønnene tre ganger med 200-300 µL/godt vaske løsning og fjerne den vask-løsningen.
  21. Legge til 100 µL av substratløsningen ruge for 3-10 minutter på RT, og måle absorbansen ved 450 nm.
  22. Måle interleukin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4) og interferon-γ (IFN-γ) i samlet supernatants hjelp av en standard ELISA.

5. høy gjennomstrømning Intraperitoneal modell

  1. Bedøve kvinnelige 6-8-ukers gamle BALB/c mus med en blanding av 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazine IP og legge en gel eller salve for øyet å holde dem fuktige og plassere musen på en oppvarming plate på 37 ° C i løpet av hele fremgangsmåten for å hindre nedkjøling. Vurdere anestesi dybden av tå og hale knipe.
  2. Barbere abdominal pelsen og ren med 7,5% povidon joden løsning og 70% etanol.
  3. Gjøre et 8 mm lang midtlinjen snitt gjennom huden langs linea alba. Lag et lite innsnitt i peritoneum ved hjelp av en skalpell.
  4. Sted sterilt PBS gjennomvåt β-TCP/C skum grafts (2 x 2 x 2 mm3) i bukhulen eller uten lagt materialer for alder-matchet humbug kontroll mus.
  5. Sutur peritoneum, og huden med absorberbare og ikke-absorberbare Sutur, henholdsvis.
  6. Rengjør alle kirurgiske instrumenter med kaldt sterilisering å opprettholde sterile forhold før neste operasjonen på en bedøvet musen.
  7. Post-kirurgisk behandling, plasser dyrene på en tørr og ren varmeplaten på 37 ° C i kirurgi området for riktig oppfølging under restitusjonsperioden. Overvåke pustefrekvens, kroppstemperatur og fargen på slimhinnene og øyne hvert 10 min før de våkner.
  8. Overføre styres bevisst musene i et bur med mat og vann atskilt fra de andre dyrene til full gjenoppretting. Return fullstendig gjenopprettet mus til deres burene.
    Merk: Denne fremgangsmåten induserer minimal smerte. Post-kirurgiske smertestillende terapi er vanligvis ikke nødvendig. Hvis de opererte dyr viser underskriver av smerte, injisere 0,1 mg/kg buprenorfin SC eller et riktig smertestillende medikament for smertelindring.
  9. Euthanize mus 7 dager etter implantation, med en løsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazine IP
  10. På 7 dager etter implantasjon, lavage bukhulen ved hjelp av en 1 mL sprøyte med en 25 G nål for totalt 3 mL kaldt PBS ved mus hodet og sette inn nålen i venstre nedre mage kvadranten og sikte proximally.
    Merk: Peritoneal væsken skal være gratis RBCs.
  11. Sentrifuge peritoneal lavage væske på 300 x g i 5 min på 4 ° C og samle peritoneal væsken lagre på 20 ° C for ELISA målinger av IL-1β og IL-2 IL-4 cytokiner.
  12. Sug opp nedbryting, resuspend celle pellet i 1 mL av PBS og telle peritoneal celler med trypan blå på en hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge celle suspensjon på 5 x 105 celler på glass lysbilder, kan lysbildene tørke og flekker for en differensiell celletall.
  14. Bruker lys mikroskop, telle minst 300 celler totalt og skille mellom makrofager, eosinofile, nøytrofile og lymfocytter.

6. Subkronisk subkutan modell

  1. Bedøve kvinnelige 6 – 8 uke gamle BALB/c mus med en blanding av 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazine IP, Legg gel eller salve for øyet å holde dem fuktige og plassere musen på en oppvarming plate på 37 ° C i løpet av hele fremgangsmåten for å hindre nedkjøling. Vurdere anestesi dybden av tå og hale knipe.
  2. Plasser musen på ryggen, barbere abdominal pelsen og rengjør barbert overflaten med 7,5% povidon joden løsning og 70% etanol.
  3. Gjøre et 8 mm lang midtlinjen snitt gjennom huden langs linea alba av magen ved hjelp av en skalpell og deretter implantat PBS gjennomvåt biomateriale (2 x 2 x 2 mm3) under huden eller legge til ingen materialer for alder-matchet humbug kontroll mus.
  4. Sutur i huden med en ikke-absorberbare Sutur.
  5. Rengjør alle kirurgiske instrumenter med kaldt sterilisering å opprettholde sterile forhold før neste operasjonen på en bedøvet musen.
  6. Post-kirurgisk behandling, plasser dyrene på en tørr og ren varmeplaten på 37 ° C i kirurgi området for riktig oppfølging under restitusjonsperioden. Overvåke pustefrekvens, kroppstemperatur og fargen på slimhinnene og øyne hvert 10 min før de våkner.
  7. Overføre styres bevisst musene i et bur med mat og vann atskilt fra de andre dyrene til full gjenoppretting. Return fullstendig gjenopprettet mus til deres burene.
    Merk: Denne fremgangsmåten induserer minimal smerte. Post-kirurgiske smertestillende terapi er vanligvis ikke nødvendig. Hvis de opererte dyr viser underskriver av smerte, injisere 0,1 mg/kg buprenorfin SC eller et annet passende smertestillende.
  8. Når du er klar til å undersøke implantasjon området, euthanize mus IP med en løsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazine.
  9. Åtte uker etter implantasjon, avgiftsdirektoratet implantasjon området med omkringliggende vev (1 cm2).
  10. Reparere vevet i 4,5% bufret formalin løsning over natten, bygge inn i parafin og skjær i 4 µm deler.
  11. Stain 4 µm parafin-embedded vev deler med Hematoxylin og Eosin (H & E) for betennelse eller Masson's trichrome for avleiring av kollagen og fibrose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å vurdere β-TCP for sin effektivitet som en biomateriale for bein reparasjon, brukte vi i vitro og i vivo screening metoder. Først målt vi OB svar β-TCP diskene sammenlignet med opprinnelige middels alene kontroller. Figur 2 viser OB levedyktigheten svar β-TCP disker på 7 til 14 dager av kultur. Cellen levedyktighet målt fra metabolically aktiv celler i kultur brønnene var den samme for OBs med medium i vev kultur plast og β-TCP disker som indikerer at denne biomateriale er verken styrke eller undertrykke OB spredning.

For å ytterligere evaluere OBs, målt vi ALP aktivitet som en markør av differensiering bruke kvalitativ og kvantitativ tilnærminger. Figur 2 viser ALP enzym aktivitet i kultur brønner etter 7 dager kultur. OBs i brønnene med mediet alene hadde planlagt ALP aktivitet, mens i optimal mineralisering medium (MM) OBs hadde intens ALP flekk, reflekterer høy OB differensiering. I motsetning belagt til OBs på β-TCP disker differensiert mindre enn OBs ruges i MM. I en kvantitative analysen var ALP konsentrasjon 77% høyere for brønnene som inneholder MM sammenlignet med det opprinnelige mediet alene, mens ALP konsentrasjon var 40% lavere i cellene kultivert på β-TCP disker sammenlignet MM kontroller. Selv om disse resultatene viser at cellene dyrket på β-TCP disker differensiert mindre enn de med optimale forhold av plast med MM, differensiert de tilstrekkelig på de biologisk materiale.

En annen viktig funksjon i OBs er evnen til å indusere mineralisering, som er et viktig skritt i bein healing. Vi flekkete kulturperler OB celler med ARS etter 14 dager og fant at mineraliseringen var høyere MM kontrollene i forhold til OBs kultivert i medium alene og på β-TCP disker i kultur brønner (figur 2). Når vi målt ARS konsentrasjonen, fant vi at MM kontrollene var mer enn 45% høyere enn gruppen β-TCP. Disse dataene viser at OBs kultivert på plast i nærvær av MM modne og skille mineralize bedre enn de med medium alene og på β-TCP disker.

For å avgjøre hvordan OCs reagerer β-TCP disker, brukte vi en culturing teknologi som OBs er co kultivert med benmarg OC forløpere etterfulgt av undersøkelse av OC morfologi. OB-OC co kulturer ble observert på 5 dager og skilte seg betydelig mellom cellene dyrket på plast med OC DM og celler dyrket på bein stykker og β-TCP. På plast, OCs var store og utbredt mens OCs på fysiologiske underlag var mindre, mindre-spredt og irregularly-formet (Figur 3). For å quantitate OCs, vi nummerert FELLE + OCs og fant at det var høyere tall når inkubert med β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) sammenlignet med vev kultur kontroller (1140 ± 15.71/cm2) og bein stykker (709 ± 59.69/cm2), tyder forbedret OC differensiering på β-TCP disker (Figur 3).

For å finne en kommersielt tilgjengelig β-TCP/C skum i vivo, brukte vi en kritisk størrelse calvarial feil modell i mus. Vi viser representant histologiske deler behandles av en undecalcified histologiske teknikk med glykol methyl methacrylate innebygging og Levai Laczko flekker. MicroCT og histology kan brukes til å evaluere nye bein formasjon innen defekt. Her viser vi et eksempel histologiske inndelinger i Figur 4. Når kirurgisk indusert bein feilen var igjen tom (svindel), vi observerte et tynt lag dekker hele feilen, men ingen betydelig bein formasjon var tilstede ved 12 uker post-operasjonen bekrefter kritiske størrelsen på den opprettede beinbrudd. I kontrast, når feilen inneholdt β-TCP/C skum, var det β-TCP/C skum restene omgitt av tett fibrøst vev inkludert noen blodkar og inflammatoriske celler bro defekt området uten bevis av bein formasjon.

For å evaluere fremmedlegeme svaret, vurdert vi immunologiske og allergiske reaksjoner på biologisk materiale, bruker i vitro analysen. Figur 5 viser at når naiv splenocytes ble inkubert med middels alene eller med β-TCP/C skum, naiv milt cellene ikke svarte av voksende eller produsere IL-2, IL-4 og IFN-γ cytokiner. I kontrast inneholder i ConA kulturer, celle spredning og cytokiner produksjonen økte bortsett fra IL-1β. Cellen svar var upåvirket når co kultivert med ConA og β-TCP/C skum sammenlignet med ConA alene, som indikerer at β-TCP/C skum verken økt eller redusert i vitro svar.

For å fastslå om β-TCP/C skum indusert en immunrespons i vivo , implantert vi det 1) intraperitoneally og målt inflammatorisk celle teller og cytokin konsentrasjoner i peritoneal lavage væske og 2) subcutaneously og evaluert inflammasjon og fibrose på histologiske deler av webområdet implantasjon. I tabell 1avslører cellen differensial i peritoneal lavage væske at antall inflammatoriske celler var betydelig høyere i β-TCP/C skum implantert mus sammenlignet med humbug kontrollene. Videre var det økte antall alle celletyper. Figur 6Ahar høyere konsentrasjoner av IL-1β og IL-2 IL-4 cytokiner i β-TCP/C skummet sammenlignet med humbug kontrollene. I β-TCP/C skum SC implantert mus observerte vi en betennelsesreaksjon med fremmedlegeme gigantiske celler H & E-farget deler (figur 6B) og bevis på fibrose på Masson's Trichrome farget deler (figur 6C) i 8 uker. Derimot hadde webområdet implantasjon humbug kontrollene minimal betennelse og ingen fibrose (figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Calvaria fjerning primære OB celle isolasjon diagrammet. Diagrammet illustrerer hvordan fjerne calvarium med 4 kutt (rød stiplet linje) med buet saks. Det første kuttet er vinkelrett til høyre (R) øyet kontakten fra X1 til X 2, og andre er vinkelrett til venstre (L) øyet kontakten fra X3 til X 4. Den tredje kuttet er å skille calvarium foran fra X4 til X 2 og den fjerde kuttet er å skille baksiden fra X3 til X 1. Calvarium er da fri fjernes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: β-TCP-indusert i vitro OB differensiering og modning. OB levedyktighet og spredning på dager 7 og 14 for cellene kultivert i middels alene (barer) eller β-TCP (åpne barer) (gjennomsnittlig ± SEM, n = 3). ALP aktivitet kvantifisering av cellen lysates og normalisering til proteininnholdet (µM DIFMU/µg protein, gjennomsnittlig ± SEM, n = 3) med representant bilder illustrerer ALP-farget kultur brønner fra dag 7. Mineraliseringen kvantifisert fra ARS-farget kulturer av en cetylpyridinium chloride utvinning metoden vises som konsentrasjonen av ARS (µM ARS, gjennomsnittlig ± SEM, n = 3) med representant ARS-farget kultur brønner på dag 14. Gruppene omfatter bein vekst medium alene (BGM); Mineraliseringen medium (MM); Β-TCP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: β-TCP-indusert i vitro OC differensiering. Representant photomicrographs show FELLE + MNCs på dag 5 etter co dyrking musen OBs og benmarg OC prekursorer. Endepunktet analyse av FELLE + multinucleated celler (MNCs) viser absolutt antall FELLE + MNCs (≥3 kjerner) per cm2 (mener ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Gruppene omfatter OC differensiering middels alene (DM); Benet; Β-TCP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: I vivo evaluering av β-TCP/C skum bone graft i en kritisk størrelse calvarial feil modell. Ikke-healing calvarial feil opprettet i 8 - uke gamle kvinnelige BALB/c (n = 3) mus med en 4 mm dental trephine. Behandling grupper inkludert humbug kontroll (tom defekt) og mangler behandlet med β-TCP/C skum. Representant histologiske deler forberedt på 12 uker etter implantasjon. Formalin-fast vev glykol methyl methacrylate-innebygd deler (80-100 µm) farget med Levai Laczko dye. Photomicrographs på lav (venstre) og høy (høyre) forstørrelse. Trekanter viser bein feilen. Black * angir benvev og hvit * refererer til β-TCP/C skum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: β-TCP/C skum-indusert i vitro spredning og cytokin celleproduksjon. Splenocytes fra naive BALB/c mus kultivert i medium alene, med β-TCP/C skum eller ConA. Supernatant celle spredning (BrdU), og produksjon av IL-1β, IL-2, IL-4 og IFN-γ (middels alene ●, ConA ○, β-TCP/C skum ■, β-TCP/C skum og ConA □). Spredning resultatene presenteres som gjennomsnittet av tre eksemplarer prøver (OD ± SEM) i BrdU analysen og gjennomsnittet av dupliserte prøver (pg/mL ± SEM) for cytokin konsentrasjonen fra to uavhengige eksperimenter. p < 0,05 anses viktig for biomateriale vs medium og biomateriale og ConA vs ConA alene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: I vivo immunrespons av β-TCP/C skum bone graft rask høy gjennomstrømning IP og Subkronisk musemodell. (A) kvinnelige BALB/c mus implantert IP med β-TCP/C skum eller uten lagt materialer (svindel). Syv dager senere, peritoneal lavage analysert for cytokin konsentrasjoner (data presentert som mener cytokin konsentrasjoner pg/mL ± SEM). Disse dataene er representant for to uavhengige eksperimenter (n = 5). p < 0,05 anses betydelig sammenlignet med humbug. (ABC) Kvinnelige BALB/c mus (n = 5) implantert SC med β-TCP/C skum eller uten lagt materialer (svindel). På 8 uker etter implantasjon, huden fra implantasjon områder med H & E (B) og Masson's Trichrome (C) vurdere betennelse og fibrosis, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Humbug Vitoss
Cellen teller x 106 (% av totalt celler)
Makrofager 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70,4) p < 0,001
Eosinofile 0.120 ± 0,011 (8,5) 1.181 ± 0.254 (25,5) p < 0,01
Nøytrofile 0.002 ± 0,001 (0,2) 0.029 ± 0,011 (0,6) NS
Lymfocytter 0.048 ± 0.020 (3,2) 0.148 ± 0.041 (3,5) NS
Totalt celletall 1.410 ± 0,066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tabell 1: I vivo immunrespons av β-TCP/C skum bone graft i en rask høy gjennomstrømning IP musemodell. Kvinnelige BALB/c mus var implantert IP med β-TCP/C skum eller uten materialer (svindel). Syv dager senere, peritoneal lavage ble innhentet og analysert for inflammatorisk celle nummer og differensial celle teller (data presentert som mener celle teller ± SEM). Disse dataene er representant for to uavhengige eksperimenter (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi en tverrfaglig tilnærming for prekliniske vurdering av biocompatibility for representant biologisk materiale utviklet for bein regenerering og reparasjon. Vi testet svarene på OBs, OCs, og i vivo healing respons i kritiske bein feil modell i mus som i vitro og i vivo immunreaksjoner. Vi som mål å demonstrere hvordan analyser arbeide og oppsummere data og konklusjonene avledet fra undersøkelse av de biologisk materiale. Viser vi at vår strategi genererer en verdifull profil av bein biomateriale biocompatibility.

Primær celle analyser ble brukt for å evaluere OB og OC-funksjonen. OBs er ansvarlig for bein dannelse og fysiologiske reparasjon. De må være levedyktig, differensiere og indusere mineralisering. I denne studien viser vi hvordan å utføre analyser for cellen levedyktighet og ALP ARS som markører av fysiologisk differensierte celler med kapasitet til å mineralize. Kontrollene for analyser inkludert medium alene, som genererer en baseline og osteogenic mineralisering medium (MM), hvilke optimert differensiering og mineralisering av OBs på plast. Sistnevnte kontrollgruppen var en referanse standard for biomateriale. For OC vurdering vi co kultivert OBs og Ben margtransplantasjon-avledet OC forløpere, differensiert forløpere til multinucleated celler, farget dem med FELLE, en osteoclastic enzym mye brukt til å identifisere OCs i vitro15 og deretter nummerert cellene med * lys. Disse analyser er state-of-the-art og krever ikke endringer. Men bemerket vi en begrensning knyttet til kvaliteten på isolerte primære OBs til mineralize. Bevarte OBs lagres i flytende nitrogen og brukes innen ett år for optimale resultater.

OB vedlegg og aktivitet var høyere på vev kultur plast enn på β-TCP diskene testet. Når vi vurdert OCs, observerte vi forventet forskjellene mellom responsen plast og bein, som er de fysiologiske substrat16. Sammenligning indusert bein og β-TCP lignende morfologiske endringer. FELLE analysen opplisting av OCs svar β-TCP diskene viste at tallene var signifikant forskjellig mellom bein stykker og β-TCP. Β-TCP indusert høyere OC differensiering enn på bein skiver. For OC differensiering er TRAP en veletablert analysen. Det var ingen betydelige endringer nødvendig i denne metoden. Men for å oppnå de beste resultatene, er det viktig ikke å ruge celler for lenge, eller alle celler monocytic opprinnelse blir FELLE-positive.

For å håndtere responsen i vivo , brukte vi β-TCP/C skum som en eksemplarisk biomateriale fordi den inneholder β-TCP, som ble brukt i i vitro analyser og kollagen og fremmer bein healing13. Selv om β-TCP/C skum kommersielt tilgjengelig og brukes klinisk for bein reparasjon17,18, er det bare en av mange forskjellige typer materialer som ville være interessant å studere, f.eks., bifasisk kalsium fosfat ( hydroxyapatite/β-TCP) så vel som demineralisert menneskelig bein i disse analyser for å avgjøre hvordan biologiske responser forskjellige materialer. I vivo svaret, vi implantert β-TCP/C skum til kritisk-størrelse calvarial bein feil mus og 12 uker senere vurdert histology og viste forskjeller sammenlignet med humbug kontroller. Det er også mulig å vurdere svarene med microCT som gir gratis informasjon19. Feil i humbug kontroll musene hadde ingen betydelig bein formasjon, som forventet, mens β-TCP/C skum indusert en inflammatorisk respons, fibrose og angiogenese, som bevis på den tidlige fasen av bein formasjon. Denne metoden har vist tidligere i JOVE20. Men forskjellig vår tilnærming at vi brukte en modifisert "elevator" teknikk med en periostal heis for å redusere risikoen for skade den dura mater av trephine. Vi tenkte at den dura mater spiller en viktig rolle i den helbredende prosessen med calvarial feil ved å produsere osteogenic celler og osteoinductive faktorer3,21,22,23. Spesielt påvirker materialet implantert, størrelsen av feil og metoden for å opprette feilen bein regenerering av calvarial feil. En annen endring i prosedyren involvert stabilisering av biomateriale i calvarial feilen med en biokompatible vev lim som brukes rutinemessig klinisk for såret nedleggelse. Denne endringen garantert at materialet i området defekt ikke ville være fortrenges under healing.

Betennelse regulerer den tidlige fasen av bein healing, men mye betennelse eller allergiske reaksjoner kan redusere reparasjon11. Ideell immunforsvaret til biologisk materiale er å starte en inflammatorisk kaskade som fremmer bein formasjon. Imidlertid kan bestemte biologisk materiale forårsake et fremmedlegeme svar fører til en rekke inflammatorisk signaler som forårsaker fibrosis eller økt følsomhet. I våre studier, vi vurdert immunreaksjoner til β-TCP/C skum og fant at det ikke var giftige naiv milt celler og ikke forstyrre T lymfocytt utvidelse eller fungere (cytokin sekresjon) når lagt til kulturer med ConA. Β-TCP/C skum indusert betennelser i intraperitoneal eksperimenter, og det var noen bevis på en økning i eosinophilia og makrofager samtidig øker i Th1 og Th2 Skriv cytokiner. I subcutaneous implantasjon eksperimentene, β-TCP/C skum også indusert betennelser, men det var ingen bevis for kronisk, destruktive inflammatoriske eller allergiske reaksjoner, noe som antyder at β-TCP/C skum er biokompatible. Disse modellene gir informasjon om immunforsvaret til biologisk materiale. For det første adresser modell i vitro effekten av biomateriale på naiv immunceller i nærvær av en mitogen beviser at det er ingen undertrykkelse av mitogenic svaret skyldes biomateriale. Dernest den intraperitoneal modellen gir en rask 7 dagers avlesning av immunforsvaret, f.eks., allergiske og betennelse som observert av inflammatoriske celle infiltrasjon og cytokin profilen. For det tredje subkutan, Subkronisk modellen illustrerer vev svar over en lengre periode, tillater for vurdering av kronisk betennelse, fibrose, antistoff titers, og kan brukes til å teste gjentatte implantasjon immunologisk minne respons. Disse modellene er tidligere publisert og vises her uten noen modifikasjoner13. Det er avgjørende at det er aktuelle negative og positive kontroller for disse modellene. Vi foreslår utfører alle tre modeller for å unngå begrensningene for hver metode. Mens modellene som vises er godt etablert i andre områder av immunologi, er tilnærming til testing biologisk materiale nyere.

I sammendraget gir bein og immun analyser en biologisk kompatibilitet profil på en biomateriale. For bein gi OB og OC svar på biomateriale foreløpige data før du utfører kompliserte og dyre dyreforsøk og overholder 3Rs prinsippet. Immunologiske i vitro analyser gi data på antigen kryssreaktivitet og cytotoksisitet, som kan også utelukke ytterligere dyreforsøk. Rask høy gjennomstrømning eksperimenter tilbyr resultater på inflammatoriske og cytokin svar (f.eks., type T lymfocytt svar), mens den Subkronisk modellen er nyttig på grunn av data på varigheten av betennelse og potensialet for skade fibrose. Denne romanen tverrfaglig tilnærming som inkluderer bein og immunreaksjoner til biologisk materiale tilbyr en utmerket pre-klinisk vurdering av biocompatibility for fremtidige anvendelser innen materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forskningsprosjektet har mottatt finansiering fra EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under grant avtalen nr. 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

Bioteknologi problemet 141 regenerativ medisin biologisk materiale skjelettlidelser tissue reparasjon immunogenisitet fremmedlegemer reaksjon i vitro i vivo
Biologiske kompatibilitet profil på biologisk materiale for bein gjenfødelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter