Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

Roman Biyomalzeme büyük kemik lezyonlar onarmak için tasarlanmış sayısı sürekli olarak kemik iyileşmesi geliştirmek ve kemik nakli ile ilgili komplikasyonlar aşmak amacı ile genişletiyor. Burada, önceden klinik biyouyumluluk Biyomalzeme kemik onarımı için test edilmesi için çok disiplinli bir strateji mevcut.

Abstract

Büyük sendikasız kemik kırıkları ortopedik cerrahi önemli bir sorun vardır. Auto - ve allojenik kemik grefti böyle lezyonlar iyileşmek için mükemmel olmakla birlikte, onların kullanımı ile potansiyel komplikasyonları vardır. Böylece, maddi bilim adamları bu sorunların üstesinden gelmek için sentetik, biyouyumlu Biyomalzeme geliştiriyoruz. Bu çalışmada, Biyomalzemeler kemik onarımı için değerlendirmek için çok disiplinli bir platform sunuyoruz. Biz uzmanlık kemik biyoloji ve İmmünoloji vitro osteoklast (OC) ve osteoblast (OB) deneyleri ve kemik onarımı, immünojenisite ve alerjenite vivo içinde fare modelleri de dahil olmak üzere bir platform geliştirmek için birlikte. Biz nasıl deneyler yapmak, sonuçları özetlemek ve raporlamak biomaterial biyouyumluluk göstermektedir. Özellikle, test ettik OB canlılığı, farklılaşma ve Qafqaz ve OC canlılığı ve farklılaşma β-trikalsiyum fosfat (β-TCP) diskleri bağlamında. Ayrıca kemik grefti kemik kritik ölçekli kusur fare modeli tamir için klinik olarak kemik iyileşme erken faz üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılan piyasada bulunan bir malzeme olan bir β-TCP/kollajen (β-TCP/C) köpük test ettik. Paralel deneylerde, bağışıklık ve alerjik tepkiler farelerde değerlendirildi. Yaklaşımımız bir kemik biomaterial kemik iyileşmesi ve hastalarda onarım için kullanılan Biyomalzeme biyouyumluluk tahmin için gerekli parametreleri bir dizi ile bir biyolojik uyumluluk profili oluşturur.

Introduction

Kemik onarımı ile hematom oluşumu, inflamasyon başlar karmaşık bir süreçtir, oluşumu ve1,2remodeling Nasıra. Ancak, kemik rejenerasyon olası kemik kırığı1,3boyut için sınırlıdır. Örneğin, büyük kemik kırıkları nedeni travma, kanser veya osteoporoz değil iyileşmek olmayabilir ve sendikasız kemik kırıkları denir. Bu kemik lezyonlar genellikle sağlıklı fizyolojik kemik onarım ve rejenerasyon teşvik için tedavi gerektirir. Şu anda, otogrefti ve homogreft kemik nakli seçim4 2.2 milyon kemik değiştirme işlemleri ile yaklaşımdır her yıl5. Gerçi bu yordamları yüksek başarı oranı var, komplikasyonlar, kemik, enfeksiyon, donör sitesi morbidite ve ret4Örneğin, sınırlı yer olabilir. Kemik doku mühendisliği için yeni alternatifler bu sorunları ele almak üzere aranan.

Doğal veya sentetik polimerler, biyo seramik veya metaller hücreleri ve biyoaktif molekülleri ile birlikte bağlı Biyomalzeme üzerinde artış6tasarımıdır. Mekanik özellikleri gibi multipl faktörler ve dolaşım ve kırık site7 hücreleri de dahil olmak üzere birden fazla yerel ve sistemik faktörleri geçerli şifa ve biyomalzeme bağlamında şifa fizyolojik kemik anlayışımızı bağlıdır ,8,9. Biyomalzeme kemik rejenerasyon için osteogenicity ve osseointegration10 tanıtmak için amaç ve ideal biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen ve gözenekli (hücre göç, oksijen ve besin teşvik). Aynı zamanda ağrı gidermek için kırık sitesini desteklemek için yeterince güçlü olması gerek. Ayrıca, inflamatuar faktörlerin iyileşme süreci başlatmak için gereklidir. Ancak, biomaterial aşırı inflamasyon ve alerjik tepkiler neden olmaktadır, bu sınırlamak veya kemik11,12şifa inhibe. Böylece, disiplinler arası bir yaklaşım kemik onarım için geliştirilen Biyomalzeme değerlendirmek gereklidir.

Bu çalışmada, biz önceden klinik değerlendirme 1) Orthovita trikalsiyum fosfat oluşan bir piyasada bulunan Süngerimsi Kemik Grefti İkamesi olan köpük nanometre boyutunda saf β-trikalsiyum oluşan Vitoss temsilcisi malzemelerin mevcut fosfat (β-TCP) parçacıklar ve Type 1 sığır kollajen (C) (β-TCP/C köpük) ve 2) β-TCP diskler. Burada, biz birincil osteoblast (OB) kullanarak bu Biyomalzeme biyouyumluluk test göstermek ve osteoklast (OC) deneyleri, in vivo modeli kemik onarımı, vitro T lenfosit proliferasyonu oluşan immünolojik bir değerlendirme ve sitokin üretim ve in vivo immünojenisite ve alerjenite, daha önce bildirilen13olarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Yordamlar bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Avusturya Bakanlığı Eğitim, bilim ve araştırma için tüm yönergeleri izleyerek BALB/c fareler ile yapıldı ve eğitim, bilim Avusturya Bakanlığı Etik Komitesi tarafından kabul edildi ve araştırma.

1. birincil fare OB kültür

  1. Kullanarak tekrar tekrar enzimatik sindirim yenidoğan fare calvaria OB izolasyon
    1. 1-2 gün eski yenidoğan pups (Toplam 60) işten çıkarma tarafından ötenazi ve başkanları ile steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x Petri kabına yerleştirin.
    2. Kafa boynun ense tarafından tutun ve uzak steril makas kullanarak deriyi kesme. Piercing tarafından hasta deşmek (yaklaşık 0,1-0,3 mm) sonra hasta kafatasının dibinde başının arkasında altında takılı ve açık belgili tanımlık ears ve sonra abov yukarıda grefti kenarına yanal arkadan boyunca kesin makas ile e burun Köprüsü (Şekil 1).
    3. 8 mL steril filtre sindirim çözeltisi ile disseke calvaria kuluçkaya (300 adet/mL collagenase tip IV ve 2.14 adet/mL dispase II α-en az gerekli Orta (α-MEM) çözünmüş) 50 mL konik tüp 37 ° c 200 sallar, titreyen bir kuluçka 10 dk içinde /Min.
    4. İlk süpernatant atın ve üç kez 8 mL sindirim çözeltisi ile sindirim yordamı yineleyin. Her sindirim adımdan sonra hücreleri içeren süpernatant toplayabilir ve 50 mL konik tüp ekleyebilir. (Yaklaşık 40 dk) sindirim yordam tamamlanıncaya kadar hücreleri ile 50 mL konik tüp bir buz su banyosu içinde saklayın.
    5. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, (ile bir vakum pompa bağlı Pasteur pipet) süpernatant Aspire edin ve α-MEM ile % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve % 1'i içeren 40 ml kemik büyüme ortamının (BGM) resuspend penisilin-streptomisin çözüm. Sonra hücre süspansiyon 10 mL 4 doku kültürü plakaları (10 cm) ekleyin.
    6. 37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri izdiham (2-3 gün) kadar kültür.
    7. İzdiham, eski orta Aspire edin ve doku kültürü plakaları bir kez 1 x PBS (37 ° C) ile yıkayın. Sonra PBS Aspire edin ve 2 mL 1 x tripsin çözeltisi % 0.5 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) her 10 cm doku kültürü plaka içeren ekleyin.
    8. 4 kültür plakaları 37 ° C ve % 5 CO2 5 min için kuluçkaya ve tabakları hücreleri plastik ayrılır emin olmak için bir ters ışık mikroskobu ile kontrol edin. O zaman bir 50 mL konik tüp 10 mL taze BGM içeren tüm hücre süspansiyonlar (Toplam 8 mL) transferi. Her plaka 5 mL taze BGM ve aynı 50 mL konik tüp transfer ile yıkayın.
    9. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 16 mL taze BGM hücrelerde resuspend. BGM 9 mL içeren 16 yeni 10 cm doku kültürü tabak (yarma 1:4) hazırlayın. Hücre süspansiyon 1 mL her plaka için ekleyin.
    10. 1.1.6 adımları yineleyin. 1.1.8 için.
    11. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 10 mL taze BGM resuspend. Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu hesaplayın.
      Not: Bu yordam yaklaşık 7.5 – 8,3 x 105 hücreleri/yavru oluşturur.
    12. Santrifüj kapasitesi 300 x g 4 ° C'de 5 min için de, süpernatant Aspire edin ve dondurma orta içeren % 10 dimetil sülfoksit (DMSO), % 40 α-MEM ve % 50 resuspend FBS. Hücre süspansiyon 1,5 mL şişe başına 2 x 106 hücre olmak üzere toplam 2 mL cryovials aktarın.
    13. Flaş bir sıvı azot tank uzun süreli depolama için sıvı azot şişeleri dondur. Hücreleri bir yıl içinde tam işlevselliğinden emin olmak için kullanın. Bu birincil OBs yayılması (adım 1.2), farklılaşma değerlendirmek için kullanın (ALP deneyleri: adım 1.4., 1.5.) ve biyomalzeme huzurunda Qafqaz (adım 1.6.). Bu hücreler kemik iliği türevi OC öncüleri ortak kültür (adım 2.3) olgunlaşma için kullanın.
  2. OB nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
    1. 14 mm çap β-TCP diskleri BGM 1 ml 37 ° C ve % 5 CO2 birincil OBs. kullanımı standart doku kültürü plakaları denetimler için eklemeden önce 24 h için bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve süspansiyon kültür plakaları biomaterial örnekleri için önceden kuluçkaya Plastik hücre eki kaçının.
    2. Ön kuluçka orta Aspire edin ve sonra birincil fare OBs BGM içinde resuspend. 4.4 x 104 OBs/cm2 önceden inkübe β-TCP disk üzerine bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve kontrol grubu için bir 24-iyi doku kültürü plaka (1 mL/de) ekleyin. OBs doku kültürü tabak ya da biomaterial eklemek olacaktır.
    3. 37 ° C ve % 5 CO214 gün için kuluçkaya. Kuluçka döneminde Orta 2-3 günde değiştirin ve her şey için 1 mL taze BGM ekleyin.
    4. OB yayılması değerlendirmek için β-TCP diskleri 7 ve 14 gün süspansiyon kültür plaka üzerinde yetiştirilen hücrelerin sinyalleri çıkarılacak yeni kuyu aktarın.
    5. Eski orta Aspire edin, BGM (37 ° C) 0.5 mL ekleyin ve kültür tabaklar CO237 ° C ve %5 30 dk için kuluçkaya. 10 hücre proliferasyonu reaktif x 55 µL ekleyin (1:10 seyreltme) iyi kültür içine doğrudan. İçin boşluklar, BGM 0.5 mL ve 10 x hücre proliferasyonu reaktif 55 µL içeren üç kuyular hazırlayın. 30 dk 37 ° C ve % 5 CO2için tüm plakaları kuluçkaya.
    6. Geri çekilin ve süpernatant ile 150 µL her kuyudan 96-şey siyah bir tabak aktarmak ve floresan 560 nm, uyarma ve emisyon 590, okumak nm. Örnek değerler üzerinden boş değerler çıkarma.
  3. OB farklılaşma ve Qafqaz deneyleri
    1. 14 mm çap β-TCP diskleri BGM 1 ml 37 ° C ve % 5 CO2 OBs. kullanımı standart doku kültürü plakaları denetimler için eklemeden önce 24 h için bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve süspansiyon kültür plakaları önlemek biomaterial örnek için önceden kuluçkaya Plastik hücre Eki.
    2. Ön kuluçka orta Aspire edin ve sonra birincil fare OBs BGM içinde resuspend. 8,8 x 104 OBs/cm2 önceden inkübe β-TCP disk üzerine bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka ve kontrol grubu için bir 24-iyi doku kültürü plaka (1 mL/de) ekleyin. OBs doku kültürü tabak ya da biomaterial örnek eklemek olacaktır.
    3. BGM BGM, 50 µg/mL askorbik asit ve 5 mM β-gliserofosfat 24 h OBs eklenmesinden sonra içeren 1 mL osteojenik Qafqaz Orta (MM) ile değiştirin ve 37 ° C ve % 5 CO214 gün için kuluçkaya. Orta 2-3 günde 1 mL taze hazırlanmış mm ile her şey için değiştirin.
  4. OB farklılaşma hücre lysates aktivitesinden alkalen fosfataz (ALP) tarafından değerlendirildi
    1. Gün 7'den sonra MM ilavesi ALP etkinliğini ölçmek için kuyuları kültür ortamından Aspire edin ve sonra 1 mL steril 1 x PBS (37 ° C) ile yıkayın. Dikkatli bir şekilde bağlı hücre doku kültürü plastik veya biomaterial kalır ve plakaları-80 ° C'de dondurmak izin vermek için PBS Aspire
    2. 24 saat sonra (veya 2 hafta maksimum), denetim doku kültürü plaka ve biomaterial süspansiyon kültür plaka (RT) OB lizis için hazırlamak için oda sıcaklığında erimek. Biomaterial örnekleri için β-TCP diskler için plaka bağlı hücreleri dışlamak için yeni bir süspansiyon kültür plaka içine aktarın. 1 x hücre lizis arabellek kuyu başına 75 µL her iki tabak için ekleyin. Bir shaker 400 sallar/dk üzerinde plakaları 5 min için salla.
    3. Lysate hücre içine 0.5 mL microcentrifuge tüp ve enkaz kaldırmak için RT, 6 min için 300 x g , santrifüj aktarın. 96-şey siyah bir tabağa örnek hücre lysate süpernatant ile 50 µL ekleyin ve sonra 50 µL 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfat (DiFMUP) fluorogenic substrat ALP arabellek iyi (pH 10) x 2 çözünmüş oluşan bir çözüm ekleyin. İki boş wells 1 x hücre lizis tampon ve 2 x ALP arabellek içeren bir 1:1 çözeltinin 100 µL ile ayarlayın.
    4. 8 kullanılan standartlar ile 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) 0,5 1 x hücre lizis tampon ve standart referans eğri oluşturmak için 2 x ALP arabellek içeren 1:1 çözüm içinde çözünmüş 200 mikron arasında değişen 100 μL/kuyu ile hazırlayın.
    5. Siyah plaka 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya ve floresan 358 nm, uyarma ve emisyon, 455 okumak nm. Kullanılan standartlar üzerinden boş okumalar ve örnek okuma çıkarma.
    6. Hücre lysates ALP enzim aktivitesinden kolorimetrik bir tahlil için protein konsantrasyonu kullanarak protein toplam miktarı normalleştirmek. Sığır serum albumin (BSA) protein başvuru standartları 0.05 – 2,5 bir mesafeden hazırlamak µg/µL çözünmüş standart bir eğri oluşturmak için hücre lizis arabellek x 1.
    7. Örnek hücre lysates ve çoğaltmaları BSA proteini standartları hazırlamak. Lysate örnek hücrenin 5 µL veya 5 µL BSA protein standart bir 96-şey plaka ekleyin ve sonra ekleyin reaktif A 25 µL' ve reaktif B. Set iki boş kuyu kadar 200 µL hücre lizis arabellek x 1 5 µL ile. RT, plakalar 15dk için kuluçkaya ve 690 absorbans okuyun nm. Kullanılan standartlar üzerinden boş okumalar ve örnek okuma çıkarma.
  5. OB farklılaşma hücre kültüründe ALP boyama tarafından değerlendirildi
    1. Kültürlü OBs ALP gün 7'den sonra MM ek bir denetim doku kültürü plaka ve biomaterial bir süspansiyon kültür plaka üzerinde leke.
    2. Kuyuları kültür ortamından Aspire edin ve 0.5 mL 1 x PBS (37 ° C) ile değiştirin. PBS Aspire edin ve onları RT, arabelleğe alınan % 10 formalin 1 dk. için 0.5 ml kuluçka hücreleri tamir.
    3. Arabelleğe alınan % 10 formalin tek kullanımlık damlalıklı ile Aspire edin ve yıkama arabellek (%0,05 Tween20 1 x PBS) 0.5 mL ekleyin.
    4. Bir 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat/nitro mavi tetrazolium (BCIP/NBT) substrat tablet Ultrasaf Su ve tamamen eriyene kadar girdap 10 ml geçiyoruz. Çözüm ışıktan korunan ve içinde 2 h kullanılan gerekir.
    5. Yıkama arabellek Aspire edin ve 0.5 mL BCIP/NBT substrat çözeltisi ile değiştirin ve RT plaka 10 dk. aspiratı karanlıkta boyama çözüm kuluçkaya ve yıkama arabellek 0.5 mL ile değiştirin.
    6. Lekeli β-TCP diskleri yeni bir kuyunun içine aktarmak ve ALP lekeli levha kayıt ALP boyama için geleneksel masaüstü tarayıcı tarama'yı.
  6. OB Qafqaz alizarin Red S (ARS) ile boyama tarafından değerlendirildi
    1. Birincil OBs 14 gün sonra MM ek içeren wells kültür ortamından Aspire edin ve iki kez ile 0.5 mL 1 x PBS RT. aspiratı adlı PBS durulayın ve %10 0.5 mL formalin çözüm RT 10 dakikadır arabelleğe ekleyerek hücreleri tamir.
    2. Arabelleğe alınan % 10 formalin tek kullanımlık damlalıklı ile Aspire edin ve iki kez 0.5 mL Ultrasaf Su yıkayın.
    3. Sabit OBs için 0.25 mL 40 mM ARS boyama çözeltisi (pH 4.2) Ultrasaf Su içinde çözünmüş ve RT, plaka üzerinde bir shaker 100 sallar/dk 10 min için kuluçkaya ekleyin.
    4. Tek kullanımlık damlalıklı boyama çözümle Aspire edin ve 1 mL Ultrasaf Su ile durulayın. Belirsiz kaldırmak için tekrarlamak bu adım 5-10 kat boyama.
      Not: Yıkama çözüm olmadan renk olmalıdır.
    5. Ultrasaf Su Aspire edin ve 1 mL soğuk PBS ekleyin. RT, plaka üzerinde bir shaker 100 sallar/dk 10 min için kuluçkaya.
    6. PBS Aspire edin, lekeli β-TCP diskler için yeni bir kuyu aktarmak ve tabakları kayıt Qafqaz için düz yataklı tarayıcı tarama'yı.
    7. 0.25 mL % 10 cetylpyridinium klorür çözeltisi ekleyin ve RT, plaka üzerinde bir shaker ARS boya ayıklamak için 100 sallar/dk 15 dk için kuluçkaya.
    8. Bir 1,5 mL tüp ve RT., 5 min için 17.000 x g , santrifüj supernatants transfer
    9. Özleri ile seyreltme oranı 1:10 – 1:20 in % 10 cetylpyridinium klorür çözüm ekleyin ve örnekleri (300 µL) sadece % 10 cetylpyridinium klorür içeren iki boş wells de dahil olmak üzere bir 96-şey plaka ekleyin.
    10. Standart bir eğri oluşturmak için çözüm (pH 4.2) % 10 cetylpyridinium klorür solüsyonu ile boyama 40 mM ARS sulandrarak 4'ten 400 µM arasında değişen 7 ARS kullanılan standartlar hazırlamak.
    11. Referans standart 300 µL çoğaltmaları için 96-şey plaka ekleyin.
    12. Örnekleri, boşluklar, absorbans okumak ve başvuru standartlarda 520 nm.
    13. Kullanılan standartlar üzerinden boş okumalar ve örnek okuma çıkarma.

2. fare OB-OC ortak kültür olgun OCs türetmek için

  1. Hazırlık ve sterilizasyon sığır kemik dilimleri
    1. Çevreleyen doku kemik parçalarını temiz ve trabeküler kemik ve kemik iliği çıkarmak.
    2. 50 ° c 24 h için kemik kuru.
    3. Kemik daha küçük parçalara ayırır dilim ve dilimler halinde (yaklaşık 300-350 µm kalınlığında) kesin bir düşük hızda kullanarak bir elmas bıçak ile gördüm.
    4. İkinci dereceden disklere (1 cm2) 300-350 µm dilimler kesin.
    5. Kemik diskler (1 cm2) temizlemek için kilitlenebilir cam şişe ve distile su ile doldurun içine koydum. Doldurulmuş cam şişe bir ultrasonik banyo içine aktarmak ve üç kez bu adım 5 dk. tekrarlamak için solüsyon içeren temizleyicide.
    6. Distile su dökün, % 70 etanol ekleyin ve 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.
    7. % 70 etanol dökün ve % 100 etanol ile değiştirin.
      Not: kemik dilimleri 4 ° C'de % 100 etanol 4 haftaya kadar saklayın.
    8. UV ışık steril koşullarda her tarafta 15 dakika kemik dilimlerle ışınlatayım. Steril kemik dilimleri RT bir steril kültür plaka kadar daha fazla kullanılmasını saklayın.
  2. İzolasyon-in kemik iliği OC kara filmin tarih öncesi
    1. 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine lik mayi (IP) iğne kullanarak saf 8-12 hafta yaşlı BALB/c fare ötenazi.
    2. Kemik iliği OC öncüleri fare uyluk ve tibiae yalıtmak.
    3. Bacaklar steril makasla en yakın noktadan kalça eklemi, vücuda, bacaklarda diz ve ayak bileği eklemleri kesmek steril neşter ve forseps ile yumuşak doku sökün ve. Epifizleri kesti. Ortaya çıkartmak ve kemik iliği hücre süspansiyon elde etmek için 1 mL şırınga bağlı 27 G iğne kullanarak bir 6 cm steril Petri çanak içine 1 mL BGM ile askıya alma.
    4. Hücre süspansiyon 50 mL konik tüp ekleyin, 6 cm Petri kabına BGM ve aynı 50 mL konik tüp transfer 5 mL ile yıkayın. Vasıl 350 x g 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj Resuspend OC farklılaşma Orta (DM) BGM, 1 nM 1,25-(OH)2bulunduğu hücreleri-vitamin D3 ve 1 µM prostaglandin E2 (1 mL/de).
      Not: Bir BALB/c fare için bir 24-şey kültür plaka OC öncüleri yeterli sayıda sağlar.
  3. Fare OB-OC ortak kültür biomaterial ile hazırlanması
    1. 14 mm çap β-TCP diskleri veya sığır kemik dilim (1 cm2) 1 ml BGM bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka 37 ° C ve % 5 CO2 için 24 saat önceden kuluçkaya hücreleri eklemeden önce.
      Not: Sığır kemik dilimler OC farklılaşma Biyomalzeme huzurunda eğitimi için bir fizyolojik substrat kontrol grubu olur.
    2. 8,8 x 104 hücreleri/cm2 birincil OBs Biyomalzeme veya denetim kemik bir 24-iyi süspansiyon kültür plaka veya 24-iyi doku kültürü plaka üzerine BGM içinde askıya ekleyin. 37 ° C ve 24 saat için % 5 CO2 kuluçkaya.
      Not: OBs plastik ya da biomaterial ya da sığır kemik ekleme.
    3. Taze izole kemik iliği OC öncüleri 24 h birincil OBs ve kültür CO2 37 ° C ve % 5, 5 gün boyunca kültürlü ekleyin. Orta ile taze hazırlanmış OC DM her gün değiştirin. Sonra OCs tartarat dayanıklı asit fosfataz (OC farklılaşma değerlendirmek için tuzak) için leke.
  4. OC farklılaşma tuzak boyama tarafından değerlendirildi
    1. Adım 2.3.3, elde edilen olgun multinucleated OCs karakterize etmek için denetim doku kültürü plaka ve biomaterial süspansiyon kültür plaka kültür ortamından Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS (37 ° C) ekleyin. PBS Aspire edin ve onları RT, arabelleğe alınan % 10 formalin üçün 10 dk 1 ml kuluçka hücreleri tamir.
    2. Tek kullanımlık damlalıklı arabelleğe alınan % 10 formalin çözümle Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS RT. tekrarı bu adımı üç kez ekleyin, sonra PBS Aspire edin, tuzak arabelleği (pH 5) ile 1 mL yerine ve plakaları için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. TUZAK arabelleği Aspire edin ve 1 mL 1:1 aseton ve % 100 etanol ekleyin. 30 hızlı bir şekilde tek kullanımlık damlalıklı çözümle aspiratı aseton-etanol s. ve tamamen RT., tabak Makinası RT plaka kuluçkaya
    4. Çözüm boyama tuzak için bir 10 mg/mL 0.6 mg/mL hızlı kırmızı mor tuzak arabellekte tuz ve hızlı kırmızı mor tuz için 10 mL 0.1 mL naftol-AS-MX fosfat stok çözeltisi ekleyin N, N-dimethylformamide, erime naftol-AS-MX fosfat hisse senedi çözümde hazırlamak. TUZAK bir arabellek.
    5. Çözüm boyama tuzak 1 mL ekleyin ve 10 dakika, 37 ° C'de plaka kuluçkaya sonra çözüm boyama tuzak Aspire edin ve 1 mL reaksiyonu durdurmak için ultrasaf su ekleyin.
    6. Aktarım β-TCP diskler ve sığır kemik dilimleri yeni bir kuyuya boyama sonra hafif bir mikroskop kullanarak kırmızı lekeli OCs gözlemlemek (büyütme: 10 X) ve üç veya daha fazla hücre çekirdeği ile tuzak + olgun OCs numaralandırılamıyor.

3. kritik ölçekli fare grefti kusur modeli

  1. 0.1 mg/kg buprenorfin subkutan enjekte (SC) 8 - hafta eski BALB/c fareler analjezi için içine.
  2. 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine ı.p. karışımı ile fareler anestezi, jel veya merhem onları nemli tutmak ve hipotermi önlemek için tüm işlem sırasında 37 ° C'de bir ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin gözler ekleyin. Anestezi derinliği ayak ve Kuyruk tutam tarafından değerlendirmek.
  3. Kulaklar arasında baş üstünde kürk tıraş ve % 7.5 povidone iyot çözüm ve % 70 etanol ile yüzey temiz.
  4. Sagittal bir ensizyon kafatası hasta maruz ve neşterle kazıma zarından bağ dokusu sağ parietal kemik kaldırmak için steril neşter kulaklarıyla arasında üst olun.
  5. Sağ parietal kemik çentik ve ectocortex ve bazı endocortex ile kesmek için normal serum fizyolojik solüsyonu ile sabit sulama altında sağ parietal kemik steril bir diş trephine çapı 4 mm (2000 rpm) kullanarak kritik ölçekli bir üründe oluşturun.
  6. Dura mater zarar görmesini önlemek için küçük bir periosteal Asansör kalan endocortex kırmak, dikkatle grefti kemik kaldırın ve forseps ile kaldırmak için kullanın. Elde edilen kusur daire ve yaklaşık 3,5 mm çapında olmalıdır.
  7. Grefti kusur ile önceden sırılsıklam doldurun (RT, steril 1 x PBS) β-TCP/C köpük forseps kullanarak.
  8. Boş bir defekt yaş eşlemeli, sahte negatif denetimleriyle uygun sayıda hazırlayın.
  9. Biomaterial yerde tutmak için iki zıt noktalarında kusur kenarında doku yapıştırıcı 0.5 µL koymak.
  10. Cilt absorbe olmayan dikiş ile kapatın.
  11. Tüm cerrahi aletler Steril koşullar imzalat bir fare sonraki ameliyat gerçekleştirmeden önce korumak için soğuk sterilant ile temizleyin.
  12. Sonrası cerrahi tedavi için bir kuru ve temiz ısıtma yüzeyi uygun iyileşme döneminde izlemek için cerrahi alanında 37 ° C'de hayvanlar koyun. Onlar uyanmak kadar solunum hızı, vücut ısısı ve müköz membranlar ve gözleri her 10 min rengini izleyin.
  13. İşletilen bilinçli fareler yiyecek ve su kadar tam kurtarma diğer hayvanlardan ayrı bir kafes içine aktarın. 0.1 mg/kg buprenorfin enjekte SC 72 h. dönüş için günde iki kez ameliyat sonrası analjezik tedavi için fareler onların kafes için tamamen iyileşti.
  14. Biomaterial etkinliğini belirlemek için 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine bir çözüm ile fareler ı.p. ötenazi.
  15. 8-12 hafta sonrası implantasyonu euthanized fare ile keskin makas başını kesmek.
  16. Düzeltme üç fare başından %4,5 30 mL formalin çözüm 1-2 hafta sabitleştirici tam penetrasyon doku içine garanti arabelleğe alınmış.
  17. Kafaları % 70 etanol 4 ° C'de uzun süreli depolama için içine bir yıl için transfer.
  18. Kullanım mikro tomografi (microCT) veya kemik rejenerasyon değerlendirmek için standart undecalcified histolojik teknikler hesaplanır. Yüksek çözünürlükte öldükten sonra örnekleri üzerinde tarama microCT kullanmak mümkündür (90 kV, 4 dk) 2D ve 3D sagittal ve frontal uçaklar.
  19. Undecalcified Histoloji için etanol sınıflarda artan kafaları kurutmak ve Glikol Metil metakrilat embed.
  20. Glikol blok Metil metakrilat gömülü bir elmas testere ile kesme ve bölümlerini yaklaşık 80-100 µm kalınlığa eziyet.
  21. Yeni kemik oluşumu14tanımlamak için Levai Laczko kemik bölümleri lekeli değerlendirin.

4. Vitro bağışıklık yanıtı

  1. Saf 8 - hafta eski BALB/c fare ı.p. 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine bir çözümle ötenazi.
  2. Onun sağ tarafında fareyi getirin, sol tarafında kürk tıraş ve sol tarafındaki % 70 etanol ile karın üzerinde deri temiz.
  3. Fareyi üzerinde sol tarafında özafagusu kaburga steril makas kullanırken mide üzerinde aşağıdaki deri bir 10 mm uzunluğunda ve 1 mm derin kesik olun.
  4. Cilt açın ve karın zarını sunarsınız. 10 mm uzun yapmak ve daha az 1 mm derin Karın zarını kullanarak kesi steril koşullarda makas.
  5. Mide proksimale dalak ortaya çıkarmak için itin.
  6. Dalak yavaşça steril forseps ile tutun ve doku ve altında bağlı gemiler keserek çıkarın.
  7. Sağlam dalak soğuk 1 steril PBS x 10 mL içeren bir 50 mL tüp içine koyun.
  8. Bir tek hücre süspansiyon 2 steril forseps veya 2 steril cam slayt kullanarak dalak kıyma tarafından hazırlayın.
  9. Enkaz 1 mL şırınga pistonu kullanarak soğuk 1 x PBS ile steril 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçirerek kaldırın.
  10. Tek hücre süspansiyon vasıl 300 x g 50 mL konik tüp içinde 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi, Aspire edin ve süpernatant atın. Sonra hücre Pelet kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek 5 mL resuspend.
  11. Hücre süspansiyon RT, 14 dk için kuluçkaya ve reaksiyon Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 45 mL ekleyerek durdurmak.
  12. Hücreleri hücre lizis vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika sonra santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  13. Resuspend splenocytes % 10 içeren RPMI orta ısı-FBS, % 1 penisilin-streptomisin çözüm, %0.1 gentamisin, % 0,2 β-mercaptoethanol ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler inaktive olur.
  14. β-TCP/C köpük hücre tohum önce RPMI orta 24 h 37 ° C ve % 5 CO2 için içeren bir 96-şey steril kültür plaka önceden kuluçkaya.
  15. Splenocytes titre sayılarında e.gekleyin., 1,25 x 105, 2.5 x 105 ve 5 x 105kuyu RPMI orta ve katkı maddeleri, ya da önceden inkübe β-TCP/C köpük olmadan içeren bir 96-iyi doku kültürü plaka için /well.
  16. 10 eklemek bir (Con A) 100 µL/iyi uygun wells için toplam ortamda çözünmüş ve 37 ° C ve % 5 CO2 72 h için kuluçkaya µg/mL concanavalin.
  17. Hücre çoğalması ile bir bromodeoxyuridine (BrdU) tahlil ölçmek. Hücre kültürü 48 h 10 µL/iyi BrdU etiketleme çözüm ekleyin ve sonra ek bir 24 h plaka kuluçkaya.
  18. 72 h, süpernatant toplamak ve -20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
  19. Her şey için 200 µL/iyi fiksasyon çözüm ekleyin ve sonra 30 dk RT. aspiratı az için fiksasyon çözüm kuluçkaya. 100 µL/iyi anti-BrdU antikor çalışma çözüm ekleyin ve 90 dk için kuluçkaya.
  20. Antikor çözüm Aspire edin, wells üç kez ile 200 – 300 µL/iyi, Çözüm yıkama durulama ve yıkama çözüm kaldırın.
  21. 100 µL substrat çözeltisi ekleyin ve 3 – 10 dk RT, kuluçkaya sonra 450 absorbans ölçmek nm.
  22. İnterlökin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interlökin-4 (IL-4) ve interferon-γ (IFN-γ) içinde bir standart ELISA kullanarak toplanan supernatants ölçmek.

5. yüksek işlem hacmi mayi modeli

  1. Kadın 6-8 haftalık eski BALB/c fare 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine ı.p. karışımı ile anestezi ve onları nemli tutmak ve hipotermi önlemek için tüm işlem sırasında 37 ° C'de bir ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin gözlere bir jel veya merhem ekleyin. Anestezi derinliği ayak ve Kuyruk tutam tarafından değerlendirmek.
  2. Karın kürk tıraş ve % 7.5 povidone iyot çözüm ve % 70 etanol ile temiz.
  3. Bir 8 mm uzun ensizyon linea boyunca deri yoluyla yapmak alba. Bir neşter kullanarak periton içine küçük bir kesi yapmak.
  4. Yer steril PBS β-TCP/C köpük Greftler (2 x 2 x 2 mm3) periton boşluğuna batırılmış veya olmadan malzeme yaş eşlemeli sham kontrol fareler için eklendi.
  5. Karın zarını dikiş ve sırasıyla absorbe ve absorbe olmayan sütür ile cilt.
  6. Tüm cerrahi aletler Steril koşullar imzalat bir fare sonraki ameliyat gerçekleştirmeden önce korumak için soğuk sterilant ile temizleyin.
  7. Sonrası cerrahi tedavi için bir kuru ve temiz ısıtma yüzeyi uygun iyileşme döneminde izlemek için cerrahi alanında 37 ° C'de hayvanlar koyun. Onlar uyanmak kadar solunum hızı, vücut ısısı ve müköz membranlar ve gözleri her 10 min rengini izleyin.
  8. İşletilen bilinçli fareler yiyecek ve su kadar tam kurtarma diğer hayvanlardan ayrı bir kafes içine aktarın. Tam olarak kurtarılan fareler için onların kafes dönmek.
    Not: Bu yordam en az ağrı neden olmaktadır. Ameliyat sonrası analjezik tedavi genellikle gerekli değildir. Eğer işletilen hayvan göstermek işaret-in acı, 0.1 mg/kg buprenorfin enjekte s.c. veya başka bir uygun analjezik ilaç ağrı için.
  9. Fareler 7 gün sonrası implantasyonu, 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine ı.p. bir çözümle ötenazi
  10. 7 gün sonrası implantasyonu, lavaj 1 mL kullanarak periton boşluğuna fare kafa tutup sol alt karın kadranda iğne ekleme ile soğuk PBS 3 mL olmak üzere toplam 25G iğne şırınga ve proksimale nişan al.
    Not: Periton sıvısı RBCs özgür olmalıdır.
  11. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de periton lavaj sıvı santrifüj kapasitesi ve IL-1β, IL-2 ve Il-4 sitokinler ELISA ölçümleri için-20 ° C'de depolamak için periton sıvısı toplamak.
  12. Süpernatant Aspire edin, hücre pelet 1 mL PBS resuspend ve trypan mavi bir hemasitometre kullanarak periton hücreleri saymak.
  13. Cytocentrifuge üstünde-e doğru cam slaytlar, 5 x 105 hücreleri, hücre süspansiyon izin kuru ve farklı hücre sayısı için leke slaytlar.
  14. Hafif bir mikroskop kullanarak, toplam 300 hücreleri en az say ve makrofajlar, eozinofil, nötrofil ve lenfositler arasında ayırt etmek.

6. Subkronik subkutan modeli

  1. Kadın 6 – 8 hafta eski BALB/c fare 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine ı.p. karışımı ile anestezi, jel veya merhem onları nemli tutmak ve hipotermi önlemek için tüm işlem sırasında 37 ° C'de bir ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin gözler ekleyin. Anestezi derinliği ayak ve Kuyruk tutam tarafından değerlendirmek.
  2. Sırtında fareyi getirin, karın kürk tıraş ve % 7.5 povidone iyot çözüm ve % 70 etanol ile tıraş yüzeyi temizleyin.
  3. Bir 8 mm uzun ensizyon yapmak linea boyunca deri yoluyla alba bir neşter ve sonra implant PBS kullanarak karın biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) deri altında batırılmış veya hiçbir malzeme yaş eşlemeli sham kontrol fareler için ekleyin.
  4. Cilt ile absorbe olmayan dikiş dikiş.
  5. Tüm cerrahi aletler Steril koşullar imzalat bir fare sonraki ameliyat gerçekleştirmeden önce korumak için soğuk sterilant ile temizleyin.
  6. Sonrası cerrahi tedavi için bir kuru ve temiz ısıtma yüzeyi uygun iyileşme döneminde izlemek için cerrahi alanında 37 ° C'de hayvanlar koyun. Onlar uyanmak kadar solunum hızı, vücut ısısı ve müköz membranlar ve gözleri her 10 min rengini izleyin.
  7. İşletilen bilinçli fareler yiyecek ve su kadar tam kurtarma diğer hayvanlardan ayrı bir kafes içine aktarın. Tam olarak kurtarılan fareler için onların kafes dönmek.
    Not: Bu yordam en az ağrı neden olmaktadır. Ameliyat sonrası analjezik tedavi genellikle gerekli değildir. Eğer işletilen hayvan göstermek işaret-in acı, 0.1 mg/kg buprenorfin enjekte s.c. veya başka bir uygun ağrı kesici.
  8. İmplantasyon sitesini incelemek hazır olduğunuzda 200 mg/kg ketamin ve 24 mg/kg xylazine bir çözüm ile fareler ı.p. ötenazi.
  9. Sekiz hafta sonrası implantasyonu, doku (1 cm2) çevreleyen ile implantasyon sitesi tüketim.
  10. Doku arabelleğe alınan % 4.5 formalin çözümde gecede düzeltmek, parafin içinde katıştırmak ve 4 µm bölümlere kesti.
  11. 4 µm parafin gömülü doku bölümlerini hematoksilen eozin (H & E) ile inflamasyon veya Masson'ın kollajen birikimi ve fibrozis trichrome için leke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

β-TCP için kemik tamir için bir biomaterial olarak etkinliğini değerlendirmek için vitro ve in vivo Yöntemler eleme kullanılır. İlk olarak, temel orta yalnız denetimleri ile karşılaştırıldığında β-TCP diskleri OB yanıtlarını şiddetindeydi. Şekil 2 yanıt β-TCP disklere OB canlılığı kültürünün 7 ve 14 gün gösterir. Hücre canlılığı kültür Wells metabolik olarak aktif hücrelerden ölçülen OBs için doku kültürü plastik ortamda yanı sıra bu biomaterial ne artırılması ne OB yayılması engelleniyor gösteren β-TCP diskler ile aynıydı.

Daha fazla OBs değerlendirmek için ALP etkinlik bir işareti farklılaşma nitel ve nicel yaklaşımları kullanarak olarak ölçülür. Şekil 2 ALP enzim aktivitesi kültür Wells kültür 7 gün sonra göstermektedir. En iyi Qafqaz boyama, OB farklılaşma yüksek düzeyde yansıtan yoğun ALP Orta (MM) OBs varken OBs Wells yalnız orta ile temel ALP etkinlik, vardı. Buna ek olarak, OBs MM inkübe OBs daha az farklılaşmış β-TCP disklerdeki kaplama. Bir nicel tahlil, ALP konsantrasyonu % 77 MM ALP konsantrasyonu % 40 MM kontrollere göre β-TCP disklerdeki kültürlü hücreleri daha düşük olduğunu, ancak tek başına, temel orta ile karşılaştırıldığında içeren kuyuları için daha yüksek oldu. Bu sonuçlar bu plastik MM ile optimal koşullar ile daha az farklılaşmış β-TCP disklerdeki yetiştirilen hücreleri göstermek rağmen yeterince Biyomalzeme tanır.

Başka bir kritik OBs Qafqaz, kemik iyileşmesinde önemli bir adım olduğu ikna etmek için kapasitelerini özelliğidir. ARS kültürlü OB hücrelerle 14 gün sonra lekeli ve o Qafqaz ortamda yalnız ve kültür Wells (Şekil 2) β-TCP disklerdeki kültürlü OBs göre MM denetimler için daha yüksek bulundu. ARS konsantrasyon şiddetindeydi MM denetimleri % 45'den fazla β-TCP grubu daha yüksek olduğunu bulduk. Bu veriler üzerinde plastik huzurunda MM olgun kültürlü o OBs göstermek, ayırt etmek ve orta yalnız ve β-TCP disklerdeki daha iyi mineralize.

Nasıl OCs β-TCP disklere yanıt belirlemek için hangi OBs kemik iliği OC öncüleri OC morfoloji incelenmesi tarafından takip ile birlikte kültürlü bir kodlamayla teknolojisi kullanılır. OB-OC ortak kültür 5 gün gözlenen ve önemli ölçüde OC DM ile plastik üzerinde yetiştirilen hücreleri ve kemik dilimleri ve β-TCP üzerinde yetiştirilen hücreler arasındaki farklılık. Plastiğin üzerinde OCs büyük ve yaygın Oysa OCs fizyolojik yüzeyler üzerinde daha küçük, daha az-yaymak ve düzensiz şekilli (Şekil 3). OCs quantitate için tuzak + OCs numaralandırılan ve orada yüksek sayılar β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) doku kültürü denetimleri (1140 ± 15.71/cm2) ve kemik dilimleri (709 ± 59.69/cm2), ile karşılaştırıldığında ile inkübe edildi öne bulundu Gelişmiş OC farklılaşma β-TCP disklere (Şekil 3).

Piyasada bulunan β-TCP/C köpük vivobelirlemek için farelerde grefti kusur kritik ölçekli modeli kullandık. Glikol Metil metakrilat gömme ve Levai boyama Laczko ile bir undecalcified histolojik tekniği ile işlenen temsilcisi histolojik kesitler gösteriyoruz. MicroCT ve histoloji yeni kemik oluşumu defekt alanı içinde değerlendirmek için kullanılabilir. İşte, Şekil 4' te histolojik bölümleri ile bir örnek göstermektedir. Cerrahi olarak kaynaklı kemik defekti boş (sahte) giderken, biz tüm kusur kapsayan ince bir tabaka gözlenen ama hiçbir önemli kemik oluşumu, 12 hafta sonrası işlem oluşturulan kemik kırığı kritik boyutunu teyit mevcuttu. Buna ek olarak, kusur β-TCP/C köpük içerdiği zaman, bazı kan damarları ve inflamatuar hücreler kemik oluşumunu kanıtı olmadan kusur alana köprü oluşturma dahil olmak üzere yoğun fibröz doku ile çevrili β-TCP/C köpük kalıntıları vardı.

Yabancı cisim yanıt değerlendirmek için biz bir vitro tahlil kullanarak immünolojik ve alerjik reaksiyonlara Biyomalzeme için tabi. Şekil 5 gösterir saf splenocytes orta yalnız veya β-TCP/C köpük ile inkübe zaman, saf dalak hücreleri Proliferasyona veya IL-2, üreten yanıtlamadı Il-4 ve IFN γ sitokinler. Buna ek olarak, içinde ConA kültürler, hücre çoğalması ve IL-1β dışında Artan sitokin üretim içeren. Hücre yanıt etkilenmemiş ne zaman ben de artan ya da azalan vitro yanıt-e doğru Co ConA ve β-TCP/C köpük tek başına, o β-TCP/C köpük gösteren ConA ile karşılaştırıldığında kültürlü olduğunu.

β-TCP/C köpük vivo içinde bağışıklık yanıtının bağlı olup olmadığını belirlemek için o implante 1) intraperitoneally ve inflamatuar hücre sayımları ve sitokin konsantrasyonları peritoneal lavaj sıvı ve 2) subkutan ölçülen ve değerlendirilmesi inflamasyon ve fibrozis implantasyon sitesinin histolojik bölümlerinde. Tablo 1' de, inflamatuar hücrelerin toplam sayısı önemli ölçüde sahte denetimleri ile karşılaştırıldığında implante β-TCP/C köpük farelerde yüksek hücre peritoneal lavaj sıvı fark ortaya koymaktadır. Ayrıca, tüm hücre tiplerinin artan numaraları vardı. Şekil 6Aiçinde sham denetimleri ile karşılaştırıldığında β-TCP/C köpük IL-1β, IL-2 ve Il-4 sitokinler daha yüksek konsantrasyonları vardır. β-TCP/C köpük implante SC farelerde bir enflamatuar yanıt yabancı cisim ile H & E lekeli bölümler (Şekil 6B) ve kanıt fibrozis Masson'ın Trichrome bölümler (Şekil 6C) 8 haftalıkken lekeli üzerinde dev hücreler görülmektedir. Buna ek olarak, sham denetimleri implantasyon sitenin en az iltihap ve hiçbir fibrozis (Şekil 6C) vardı.

Figure 1
Şekil 1: Calvaria kaldırılması için birincil OB hücre izolasyon diyagramı. Diyagram eğri makas kullanırken hasta 4 kesim (kırmızı kesikli çizgi) ile kaldırmak üzere verilmektedir. İlk payın dik doğru (R) göz çukuru için gelen X1 x 2 ve ikinci sol (L) göz çukuru için dik gelen X3 x 4. Hasta ön X4 X için ayırmak için üçüncü payın 2 ve dördüncü kesim olduğunu arka X3 X için ayırmak için 1. Hasta o zaman var olmak çıkarmak ücretsizdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: β-TCP-indüklenen vitro OB farklılaşma ve olgunlaşma. OB canlılığı ve yayılması orta yalnız (çubuk) veya β-TCP (açık bar) kültürlü hücreler için 7 ve 14 gün (ortalama ± SEM; n = 3). ALP etkinlik miktar hücre lysates ve protein içeriği için normalleştirme (µM DIFMU/µg protein, ortalama ± SEM, n = 3) 7 gün ALP lekeli kültür kuyulardan gösteren temsili resimlerle. Qafqaz ARS konsantrasyon gösterilen bir cetylpyridinium klorür ayıklama yöntemi tarafından ARS lekeli kültürler sayılabilir (µM ARS, ortalama ± SEM, n = 3) gün 14 temsilcisi ARS lekeli kültür wells ile. Gruplarını dahil et kemik büyüme orta yalnız (BGM); Qafqaz Orta (MM); β-TCP. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: β-TCP-indüklenen vitro OC farklılaşma. Temsilcisi photomicrographs tuzak + ÇUŞ 'un fare OBs ve kemik iliği OC öncüleri ortak kültür sonra 5 gün göstermek. Bitiş noktası analizi tuzak + multinucleated hücreleri (ÇUŞ 'un) gösterir cm2 başına tuzak + çok uluslu şirketler (≥3 çekirdeği) mutlak sayısı (± SEM, yani n = 3) ***p < 0,001. Gruplar OC farklılaşma orta yalnız (DM); içerir. Kemik; β-TCP. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: vivo içinde değerlendirilmesi β-TCP/C köpük kemik greft grefti kusur kritik ölçekli modeli. Grefti kusurları Sigara şifa 8 - hafta eski kadın BALB/C'de oluşturduğunuz (n = 3) 4 mm diş trephine kullanarak fare. Tedavi dahil sahte denetim (boş bozukluk) grupları ve β-TCP/C köpük ile tedavi kusurları. 12 hafta sonrası implantasyonu hazırlanan temsilcisi histolojik kesitler. Formalin sabit doku Glikol Metil metakrilat gömülü bölümleri (80-100 µm) Levai Laczko boya ile lekeli. Düşük (solda) ve yüksek (sağda) büyütme gösterilen photomicrographs. Siyah üçgenler kemik defekti belirtir. Siyah * kemik dokusu ve beyaz gösterir * β-TCP/C köpük için anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: β-TCP/C köpük kaynaklı vitro hücre çoğalması ve sitokin üretim. Splenocytes orta β-TCP/C köpük veya ConA ile yalnız kültürlü saf BALB/c fare üzerinden. Süpernatant hücre çoğalması (BrdU) ve üretim IL-1β, IL-2, IL-4 ve IFN γ (orta yalnız ●, ConA ○, β-TCP/C köpük ■, β-TCP/C köpük ve ConA □). Nükleer silahların yayılmasına karşı sonuçları onaylatılacak örnekleri (OD ± SEM) BrdU tahlil ortalaması, sitokin yoğunlaşması iki bağımsız deney üzerinden yinelenen örnekleri (pg/mL ± SEM) ortalaması olarak sunulan. p < 0.05 olarak kabul edilir önemli biomaterial orta ve biomaterial ve ConA ConA vs için yalnız. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: In vivo bağışıklık yanıtı β-TCP/C köpük kemik greft hızlı yüksek işlem hacmi ı.p. ve subkronik fare modeli. (A)kadın BALB/c fare ı.p. β-TCP/C köpük ile implante veya olmadan malzemeleri (sahte) eklendi. Yedi gün sonra görüşürüz, peritoneal lavaj sitokin konsantrasyonları (sitokin konsantrasyonları pg/mL ± SEM demek olarak sunulan veri) için analiz. Bu veriler iki bağımsız deney temsilcisi vardır (n = 5). p < 0.05 olarak kabul edilir önemli sham için karşılaştırıldığında. (B-C) Kadın BALB/c fare (n = 5) β-TCP/C köpükle SC implante veya olmadan malzemeleri (sahte) eklendi. İnflamasyon ve fibrozis, sırasıyla değerlendirmek için H & E (B) ve Masson'ın Trichrome (C) ile lekeli implantasyon sitelerden implantasyonu sonrası 8 hafta cilt. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sham Vitoss
Hücre sayımları x 106 (% Toplam hücre)
Makrofajlar 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70,4) p < 0,001
Eozinofiller 0.120 ± 0.011 (8,5) 1.181 ± 0.254 (25,5) p < 0,01
Nötrofil 0.002 ± 0.001 (0,2) 0,029 ± 0.011 (0,6) NS
Lenfositler 0,048 ± 0.020 (3,2) 0,148 ± 0.041 (3,5) NS
Toplam hücre sayısı 1.410 ± 0,066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tablo 1: Vivo immün yanıt β-TCP/C köpük kemik greft bir hızlı yüksek işlem hacmi ı.p. fare modeli. Kadın BALB/c fare implante ı.p. β-TCP/C köpük veya malzeme (sahte) olmadan edildi. Yedi gün sonra peritoneal lavaj elde edilen ve inflamatuar hücre sayısı için analiz ve farklı hücre (hücre sayımları ± SEM demek olarak sunulan veri) sayar. Bu veriler iki bağımsız deney temsilcisi vardır (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İşte, biyouyumluluk temsilcisi Biyomalzeme kemik rejenerasyon ve onarım için geliştirilmiş için preklinik değerlendirilmesi için çok disiplinli bir yaklaşım göstermektedir. OBs, OCs, yanıt test ettik ve bir kritik kemik defekti içinde vivo şifa yanıtta model fare gibi içinde in vitro ve in vivo bağışıklık yanıtı. Nasıl deneyleri çalışma ve veri ve biyomalzeme muayene elde edilen sonuçları özetlemek göstermek amaçlanmıştır. Biz bizim strateji kemik biomaterial biyouyumluluk değerli bir profil oluşturur gösterir.

Birincil hücre deneyleri OB ve OC fonksiyonun değerlendirildiği için kullanıldı. OBs kemik oluşumu ve fizyolojik onarım için sorumludur. Onlar uygun kalır gerekir ayırt etmek ve Qafqaz ikna etmek. Bu çalışmada, biz deneyleri hücre canlılığı, ALP ve ARS için mineralize kapasitesi ile fizyolojik farklılaştırılmış hücrelerin işaretleyici olarak nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Kontrol deneyleri için bir temel sağlar orta yalnız ve osteojenik Qafqaz Orta (MM), farklılaşma ve OBs Qafqaz plastik üzerinde en iyi duruma getirilmiş dahil. İkinci kontrol grubu biomaterial için standart bir başvuru olduğunu. OC değerlendirme için biz OBs ve OC öncüleri, kemik iliği elde edilen ortak kültürlü onlara tuzak, OCs vitro15 tanımlamak için yaygın olarak kullanılan ve sonra numaralandırılan mediatörlerin bir enzim ile lekeli multinucleated hücrelere öncüleri farklılaşmış ışık mikroskobu kullanarak hücreleri. Bu deneyleri state-of--art ve değişiklikler gerek yoktu. Ancak, biz izole birincil OBs mineralize kalitesi ile ilgili bir sınırlama kaydetti. Korunmuş OBs sıvı azot içinde saklanır ve en iyi sonuçlar için bir yıl içinde kullanılır.

OB eki ve etkinliğini test β-TCP disklerdeki çok doku kültürü plastik üzerinde yüksekti. OCs değerlendirirken, plastik yanıtı ve fizyolojik substrat16yaşında kemik arasında beklenen farklılıklar görülmektedir. Buna karşılık, kemik ve β-TCP benzer morfolojik değişiklikler indüklenen. OCs tuzak tahlil numaralandırma yanıt β-TCP disklere sayıları kemik dilimleri ve β-TCP arasında önemli ölçüde farklı olduğunu gösterdi. Β-TCP kemik dilimleri üzerinde daha yüksek OC farklılaşma indüklenen. OC farklılaşma için köklü bir tahlil tuzağı. Bu yöntemde gerekli hiçbir önemli değişiklik vardı. Ancak, en iyi sonuçları elde etmek için bu hücreleri uzun süre kuluçkaya değil esastır veya Monositik kökenli tüm hücreleri olacak tuzak-pozitif.

β-TCP, vitro deneyleri ve kollajen kullanıldı ve kemik13şifa teşvik içerdiğinden vivo içinde yanıt adrese, β-TCP/C köpük örnek bir biomaterial kullandık. β-TCP/C köpük ticari olarak kullanılabilir ve klinik olarak kemik onarım17,18için kullanılmış olsa da, sadece eğitim için Örneğinilginç olabilir malzeme birçok farklı türde biri., bifazik kalsiyum fosfat () Hidroksiapatit/β-TCP), nasıl biyolojik yanıt belirlemek için bu deneyleri kemiğin de demineralize insan farklı malzemeler arasında. Vivo yanıt için β-TCP/C köpük fareler bir kritik ölçekli kemik grefti üründe içine implante ve 12 hafta sonra Histoloji değerlendirildi ve sham denetimleri ile karşılaştırıldığında fark gösterdi. Ücretsiz bilgi19sağlayan microCT ile yanıtları değerlendirmek mümkündür. β-TCP/C köpük bir enflamatuar yanıt, fibrozis ve kemik oluşumunu erken aşaması kanıtı angiogenez indüklenen sham kontrol fareler üründe önemli kemik oluşumu, beklendiği gibi bulunuyordu. Bu yöntem daha önce Jüpiter20dakika sonra göstermiştir. Ancak, biz bir değiştirilmiş "Asansör" teknik periosteal Asansör ile dura mater trephine tarafından zarar riskini azaltmak için kullanılan bu yaklaşımımız farklıydı. Dura mater önemli bir rol grefti kusurları iyileşme sürecinde osteojenik hücreleri ve osteoindüktif faktörler3,21,22,23üreterek çalış gerekçeli. Özellikle, kemik rejenerasyon grefti kusurların implante, malzeme kusur ve kusur oluşturmak için yöntem boyutunu etkiler. Bir başka değişiklik yordamda rutin klinik olarak yara kapatma için kullanılır bir biyouyumlu doku yapıştırıcı ile grefti kusur biomaterial sabitleme dahil. Bu değişiklik garanti defekt alanında malzeme şifa sırasında yerinden değil ki.

İltihap kemik iyileşme erken faz düzenleyen, ama çok fazla iltihap veya alerjik yanıt onarım11azaltabilir. Biyomalzeme ideal bağışıklık yanıtı kemik oluşumunu teşvik inflamatuar bir cascade başlatmak etmektir. Ancak, bazı Biyomalzeme fibrozis veya alerjik Sensitizasyonu neden inflamatuar sinyalleri bir dizi için önde gelen bir yabancı cisim yanıt neden olabilir. Çalışmalarımız, biz β-TCP/C köpük için bağışıklık yanıtı değerlendirildi ve saf dalak hücrelere zehirli değildi bulundu ve değil T lenfosit genişleme ile müdahale mi (sitokin salgısının) ne zaman işlev ConA kültürlerle ekledi. Mayi deneyler, β-TCP/C köpük iltihap indüklenen ve granülom ve makrofajlar artış Th1 ve Th2 türü sitokinler eşlik eden artış ile bazı kanıtı oldu. Subkutan implantasyon deneyler, β-TCP/C köpük aynı zamanda iltihabı indüklenen ama β-TCP/C köpük biyouyumlu olduğunu göstermektedir hiçbir kanıt kronik, yıkıcı enflamatuar veya alerjik tepkiler için. Bu modeller Biyomalzeme bağışıklık yanıtı hakkında bilgi vermek. İlk olarak, vitro modeli saf bağışıklık hücreleri tarafından biomaterial neden mitogenic yanıt yok bastırılması olduğunu kanıtları sağlamak için bir mitojenle huzurunda biomaterial etkisini giderir. İkinci olarak, bir hızlı 7 günlük okuma, bağışıklık yanıtı, e.gtip mayi modeli sağlar., Alerjik ve inflamatuar hücre infiltrasyonu ve sitokin profil türü tarafından gözlemlediği gibi iltihap. Üçüncü olarak, subkutan, Subkronik modeli uzun bir süre içinde doku tepki gösterir, kronik inflamasyon, fibrozis, antikor titreleri değerlendirilmesi için sağlar ve tekrarlayan implantasyon immünolojik bellek yanıtlarını sınamak için kullanılan. Bu modeller daha önce yayınlandı ve burada herhangi bir değişiklik13gösterilir. Bu modeller için uygun negatif ve pozitif denetimleri vardır çok önemlidir. Biz her yöntemi sınırlamaları önlemek için her üç model gerçekleştirme öneririz. Gösterilen modelleri İmmünoloji diğer alanlarında iyi kurulmuş olmakla birlikte, Biyomalzemeler test etmek için son yaklaşımdır.

Özetle, kemik ve bağışıklık deneyleri bir biomaterial biyolojik uyumluluk profili sağlar. Kemik için karmaşık ve pahalı hayvan deneyleri gerçekleştirmeden önce ve 3Rs ilkesine bağlı kalmak için gerekli ön veriler OB ve OC yanıt-e doğru biomaterial sağlar. İmmünolojik vitro deneyleri antijen olan ve aynı zamanda daha fazla hayvan deneyleri engel sitotoksisite veriler sağlar. İnflamatuar sonuçlarına hızlı yüksek işlem hacmi deneyler teklif ve sitokin yanıt (Örn., T lenfosit yanıt türünü), Subkronik modeli verileri nedeniyle zarar için süresi inflamasyon ve potansiyeli hakkında yararlı iken fibrozis. Kemik ve biyomalzeme bağışıklık yanıtlarını içeren bu yeni disiplinlerarası yaklaşımın biyouyumluluk malzemeleri alanında gelecekteki uygulamaları için mükemmel bir önceden klinik değerlendirme sunuyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma projesi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) fon Hibe Sözleşmesi No 263363 altında aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

Biyomühendislik sayı: 141 rejeneratif tıp Biyomalzemeler iskelet doku onarımı immünojenisite yabancı cisim reaksiyonu tüp bebek içinde vivo
Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter