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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.

Abstract

Fraturas de grandes não-união óssea são um desafio significativo em cirurgia ortopédica. Embora autoe enxertos ósseos alogênico são excelentes para a cura dessas lesões, existem complicações potenciais com a sua utilização. Assim, materiais cientistas estão desenvolvendo biomateriais sintéticos, biocompatíveis para superar esses problemas. Neste estudo, apresentamos uma plataforma multidisciplinar de avaliação de biomateriais para reparo ósseo. Nós combinamos conhecimentos de biologia óssea e Imunologia para desenvolver uma plataforma incluindo em vitro osteoclast (OC) e ensaios de osteoblastos (OB) e na vivo modelos de rato de reparação óssea, imunogenicidade e alergenicidade. Vamos demonstrar como realizar os experimentos, um resumo dos resultados e relatório sobre a biocompatibilidade de biomateriais. Em particular, nós testamos a viabilidade de OB, diferenciação, mineralização e viabilidade OC e diferenciação no contexto de discos de β-tricálcio fosfato (β-TCP). Nós também testamos uma β-TCP/colágeno (β-TCP/C) espuma, que é um material disponível comercialmente usado clinicamente para reparo ósseo em um modelo de mouse de defeito de tamanho crítico raspagem óssea para determinar os efeitos na fase inicial de consolidação óssea. Em experiências paralelas, avaliaram-se respostas imunes e alérgicas em ratos. Nossa abordagem gera um perfil de compatibilidade biológica de um biomaterial osso com uma gama de parâmetros necessários para prever a biocompatibilidade de biomateriais utilizados para consolidação óssea e reparação em pacientes.

Introduction

Reparo ósseo é um processo complexo que começa com a formação de hematoma, inflamação, formação e remodelação em seguida1,2de calos. No entanto, o potencial de regeneração óssea é limitada ao tamanho do osso fratura1,3. Por exemplo, grandes fraturas causadas por trauma, câncer ou osteoporose não podem curar e são chamadas de não-união óssea de fraturas. Estas lesões ósseas, muitas vezes, exigem tratamento para promover a regeneração e reparação óssea fisiológica saudável. Atualmente, o auto-enxerto e aloenxerto transplante ósseo é a abordagem de escolha4 com procedimentos de substituição óssea 2,2 milhões anualmente5. Embora esses procedimentos têm uma elevada taxa de sucesso, pode haver complicações, por exemplo, a limitada disponibilidade de osso, infecção, morbidade do sítio doador e rejeição4. Novas alternativas para a engenharia de tecido ósseo estão a ser procuradas para enfrentar estes desafios.

O design dos biomateriais baseados em polímeros naturais ou sintéticos, biocerâmicas ou metais em combinação com células e moléculas bioativas é sobre a ascensão de6. Nossa compreensão atual do osso fisiológico cura e cura no contexto de biomateriais depende de vários fatores, tais como propriedades mecânicas e múltiplos fatores locais e sistêmicos, incluindo células da circulação e o local da fratura7 ,8,9. Biomateriais para regeneração óssea visam promover osteogenicity e osseointegração10 e são idealmente biocompatível, biodegradável e porosa (promovendo a migração celular, oxigênio e nutrientes). Eles também precisam ser suficientemente fortes para suportar o local da fratura para aliviar a dor. Além disso, fatores inflamatórios são necessários para iniciar o processo de cicatrização. No entanto, se o biomaterial induz inflamação excessiva e respostas alérgicas, isso pode limitar ou inibir11,12de consolidação óssea. Assim, numa abordagem interdisciplinar é necessária avaliar biomateriais desenvolvidos para reparação óssea.

Neste estudo, apresentamos uma avaliação pré-clínica de materiais representativos, 1) Orthovita Vitoss espuma, que é o substituto de enxerto ósseo esponjoso comercialmente disponível, consistindo de fosfato tricálcico composta de nanômetros de tamanho puro β-tricálcio partículas de fosfato (β-TCP) e colágeno bovino tipo 1 (C) (β-TCP/C espuma) e 2) discos de β-TCP. Aqui, ilustramos teste de biocompatibilidade destes biomateriais usando primário osteoblastos (OB) e ensaios de osteoclasto (OC), um modelo in vivo de reparação óssea, avaliação imunológica, compreendendo em vitro proliferação dos linfócitos T e produção de citocinas e na vivo imunogenicidade e alergenicidade, como relatado anteriormente13.

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Protocol

Os procedimentos foram feitos com camundongos BALB/c, seguindo todas as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do Ministério da educação, ciência e pesquisa da Áustria e foram aprovados pela Comissão de ética do Ministério da educação, a ciência da Áustria e pesquisa.

1. principal do rato OB cultura

  1. Isolamento de OB de calvaria neonatal do mouse usando a digestão enzimática
    1. Eutanásia por decapitação em filhotes de 1 – 2 dia velho neonatal (60 no total) e coloque as cabeças em uma placa de Petri com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS).
    2. Segure a cabeça pela nuca do pescoço e cortar a pele usando uma tesoura esterilizada. Incise a calvária perfurando-lo (aproximadamente 0.1-0.3 mm) com um par de tesouras que são então inseridas por baixo a calvária nuca na base do crânio e corte ao longo da borda de raspagem lateralmente de trás para frente, acima das orelhas e, em seguida, supra e a ponte nasal (Figura 1).
    3. Incube calvaria dissecado com 8 mL de solução de digestão filtro esterilizado (300 unidades/mL colagenase tipo IV e dispase de unidades/mL 2.14 II dissolvido em α-mínima média essencial (α-MEM)) em um tubo cônico de 50 mL a 37 ° C por 10 min numa incubadora de agitação em 200 shakes / min.
    4. Descartar o sobrenadante primeiro e repita o procedimento de digestão três vezes com 8 mL de solução de digestão. Recolher o sobrenadante contendo as células após cada etapa de digestão e adicioná-lo para um tubo cónico de 50 mL. Armazene o tubo cónico de 50 mL com as células em um banho de água gelada até que seja concluído o processo de digestão (aproximadamente 40 min).
    5. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante (com uma pipeta Pasteur, ligada a uma bomba de vácuo) e ressuspender em 40 mL de meio de crescimento ósseo (BGM) contendo α-MEM com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução de penicilina-estreptomicina. Em seguida, adicione 10 mL de suspensão de células para 4 placas de cultura de tecidos (10 cm).
    6. Cultura de células em 37 ° C e 5% de CO2 até confluência (2 – 3 dias).
    7. Na confluência, Aspire o meio velho e lave as placas de cultura de tecidos, uma vez com PBS 1x (37 ° C). Em seguida, Aspire a PBS e adicionar 2 mL de solução de tripsina 1 x contendo 0,5% ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cada placa de cultura de tecido de 10 cm.
    8. Incubar as placas de 4 cultura em 37 ° C e 5% CO2 por 5 min e em seguida, verifique as placas com um microscópio invertido para garantir que as células são retiradas o plástico. Depois de transferir todas as suspensões celulares (total 8 mL) para um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de BGM fresco. Lave cada placa com 5 mL de fresco BGM e transferência para o mesmo tubo cónico de 50 mL.
    9. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 16 mL de BGM fresco. Prepare-se 16 cm 10 cultura do tecido placas novas (Divisão 1:4) contendo 9 mL de BGM. Adicione 1 mL de suspensão de célula para cada placa.
    10. Repita as etapas 1.1.6. a 1.1.8.
    11. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 mL de BGM fresco. Contar as células e calcular a concentração de células.
      Nota: Este procedimento gera aproximadamente 7.5 – 8,3 x 105 células/filhote de cachorro.
    12. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender em congelamento médio contendo 10% dimetilsulfóxido (DMSO), α-MEM de 40% e 50% FBS. Transferi 1,5 mL da suspensão celular para cryovials 2 mL para um total de 2 x 106 células por frasco.
    13. Flash congelar os frascos em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo em um tanque de nitrogênio líquido. Use as células dentro de um ano para garantir a funcionalidade completa. Use estas OBs primários para avaliar a proliferação (etapa 1.2), diferenciação (ensaios ALP: etapa 1.4., 1.5.) e mineralização (passo 1.6.) na presença de biomateriais. Use essas células para a maturação de medula óssea-derivados de precursores OC em co-cultura (passo 2.3).
  2. Ensaio de proliferação de OB
    1. Pre-incube discos de β-TCP de diâmetro de 14 mm em 1 mL de BGM em uma placa de cultura de suspensão 24-poço em 37 ° C e 5% CO2 para 24 h antes de adicionar placas de padrão de cultura de tecidos Obs uso primárias para controles e placas de cultura de suspensão para as amostras de material biológico para Evite a fixação da célula para o plástico.
    2. Aspire o meio de pré-incubação e então Resuspenda OBs principal do rato em BGM. Adicione 4.4 x 104 OBs/cm2 para os discos pré-incubado β-TCP em uma placa de cultura de suspensão 24-bem e para o grupo de controle, em uma placa de cultura de tecido de 24 poços (1 mL/poço). OBs irão anexar para a placa de cultura de tecidos ou o biomaterial.
    3. Incube durante 14 dias a 37 ° C e 5% de CO2. Durante o período de incubação, mudar o médio a cada 2-3 dias e adicione 1 mL de BGM fresco a cada poço.
    4. Para avaliar a proliferação de OB, transferi os discos de β-TCP nos dias 7 e 14 para novos poços para excluir os sinais das células cultivadas na placa de cultura de suspensão.
    5. Aspire o meio velho, adicionar 0,5 mL de BGM (37 ° C) e incubar as placas de cultura por 30 min a 37 ° C e 5% de CO2. Em seguida, adicione 55 µ l de reagente de proliferação celular de 10x (01:10 diluição) diretamente para a bem de cultura. Há espaços em branco, prepare três poços contendo 0,5 mL de BGM e 55 µ l de reagente de proliferação celular de 10x. Incube a todas as placas para 30 min a 37 ° C e 5% de CO2.
    6. Retirar e transferir 150 µ l do sobrenadante de cada poço em uma placa de 96 poços preta e ler fluorescência com excitação em 560 nm e emissão a 590 nm. Subtrai as leituras em branco desde as leituras de amostra.
  3. Ensaios de diferenciação e mineralização de OB
    1. Pre-incube discos de β-TCP de diâmetro de 14 mm em 1 mL de BGM em uma placa de cultura de suspensão 24-poço em 37 ° C e 5% CO2 para 24 h antes de adicionar as placas de cultura de tecido padrão Obs Use para controles e placas de cultura de suspensão para as amostras de material biológico evitar acessório de celular para o plástico.
    2. Aspire o meio de pré-incubação e então Resuspenda OBs principal do rato em BGM. Adicione 8,8 x 104 OBs/cm2 para os discos pré-incubado β-TCP em uma placa de cultura de suspensão 24-bem e para o grupo de controle, em uma placa de cultura de tecido de 24 poços (1 mL/poço). OBs irão anexar para a placa de cultura de tecido ou a amostra do biomaterial.
    3. Substituir o BGM com 1 mL de meio de mineralização osteogênica (MM) contendo BGM, 50 µ g/mL de ácido ascórbico e β-glicerofosfato de 5mm 24 h após a adição das OBs e incubar durante 14 dias a 37 ° C e 5% de CO2. Altere o meio cada 2-3 dias com 1 mL de MM recentemente preparada para cada poço.
  4. Diferenciação de OB avaliada pela atividade de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) de lisados celulares
    1. Para medir a atividade da ALP no dia 7 após a adição de MM, Aspire o meio de cultura de poços e em seguida lavar com 1 mL de PBS estéril 1x (37 ° C). Aspire cuidadosamente a PBS para permitir que as células anexadas manter-se na cultura de tecido plástico ou biomaterial e congelar as placas a-80 ° C.
    2. Após 24h (ou em até 2 semanas), descongelar o controle cultura de tecidos e biomateriais chapa de cultura de suspensão à temperatura ambiente (RT) para se preparar para lise de OB. Para as amostras de biomaterial, transferi os discos de β-TCP em uma nova placa de cultura de suspensão para excluir as células anexadas à placa. Adicione 75 µ l por bem do 1x tampão de lise celular para ambas as placas. Agite as placas por 5 min num agitador em 400 shakes/min.
    3. Transferi o lisado celular em um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL e centrifugar x g por 6 min em RT para remover os resíduos. Adicionar 50 µ l do sobrenadante lisado celular amostra para uma placa de 96 poços preta e em seguida adicionar 50 µ l de uma solução consistindo de 200 µM fosfato 6,8-diflúor-4-methylumbelliferyl (DiFMUP) fluorogenic substrato dissolvido em 2 x buffer de ALP (pH 10) por poço. Configure dois poços em branco com 100 µ l de uma solução de 1:1 contendo 1 x buffers de lise celular e 2 x ALP.
    4. Prepare 8 padrões de referência com 100 μL/poço com o 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) que variam de 0,5 a 200 μM dissolvido numa solução de 1:1 contendo 1 x celular do lysis e buffer de ALP x 2 para gerar uma curva de referência padrão.
    5. Incubar a 37 ° C por 15 min, a placa preta e depois lê a fluorescência com a excitação em 358 nm e emissão em 455 nm. Subtrai as leituras em branco desde os padrões de referência e leituras de amostra.
    6. Normalize a atividade de enzima ALP dos lisados celulares para a quantidade total de proteínas usando um ensaio colorimétrico para a concentração de proteína. Preparar a albumina de soro bovino padrões de referência de proteína (BSA) em um intervalo de 0,05 – 2,5 µ g / µ l dissolvido em tampão de lise celular para gerar uma curva padrão de 1x.
    7. Prepare os lisados celulares de amostra e padrões de proteína BSA em duplicatas. Adicionar 5 µ l do lisado celular de amostra ou 5 µ l de proteína BSA padrão para uma placa de 96 poços e, em seguida, adicione 25 µ l de Reagente A' e 200 µ l de reagente B. Set acima de dois poços em branco com 5 µ l de tampão de lise celular 1x. Incubar as placas em RT durante 15 minutos e em seguida, ler a absorvância a 690 nm. Subtrai as leituras em branco desde os padrões de referência e leituras de amostra.
  5. Diferenciação de OB avaliada pela coloração de ALP na cultura de pilha
    1. Mancha de ALP em OBs cultivadas no 7º dia após a adição do MM sobre uma placa de cultura de tecidos de controle e o biomaterial em uma placa de cultura de suspensão.
    2. Aspire o meio de cultura dos poços e substituí-lo com 0,5 mL de 1X PBS (37 ° C). Aspirar a PBS e consertar as células incubando-os em 0,5 mL de formol a 10% tamponada em RT por 1 min.
    3. Aspirar a formalina 10% tamponada com uma pipeta descartável e adicionar 0,5 mL de tampão de lavagem (0.05% Tween20 em 1X PBS).
    4. Dissolva um comprimido de substrato de tetrazólio (NBT/BCIP) fosfato 5-bromo-4-chloro-3-indolyl/nitro azul em 10 mL de água ultrapura e vórtice até dissolver completamente. A solução deve ser protegida da luz e usada até 2 horas.
    5. Aspire o tampão de lavagem e substitua com 0,5 mL de solução de substrato BCIP/NBT e incubar a placa no RT no escuro por 10 min. aspirar a solução de coloração e 0,5 mL de tampão de lavagem.
    6. Transferir os discos de β-TCP manchada em um novo poço e digitalizar as placas ALP-manchada com um scanner de mesa convencional para coloração de ALP recorde.
  6. Mineralização de OB avaliada pela coloração com alizarina Red S (ARS)
    1. Aspire o meio de cultura dos poços contendo primário OBs 14 dias após a adição de MM e lavar duas vezes com 0,5 mL de 1X PBS em RT. Aspire a PBS e reparar as células, adicionando 0,5 mL dos 10% em solução de formalina buffer em RT por 10 min.
    2. Aspirar a formalina 10% tamponada com uma pipeta descartável e lavar duas vezes com 0,5 mL de água ultrapura.
    3. Para os fixos OBs, adicione 0,25 mL de solução de 40mm ARS coloração (pH 4.2) dissolvido em água ultrapura e incube a placa na RT durante 10 minutos num agitador em shakes de 100/min.
    4. Aspirar a solução de coloração com uma pipeta descartável e enxaguar com 1 mL de água ultrapura. Repita este passo 5 – 10 vezes para remover inespecíficas de coloração.
      Nota: A solução de lavagem deve ser sem cor.
    5. Aspirar a água ultrapura e adicione 1 mL de PBS frio. Incube a placa na RT durante 10 minutos num agitador em shakes de 100/min.
    6. Aspirar a PBS, os discos de β-TCP manchada de transferência para um novo poço e digitalizar as placas com um scanner de mesa para registro da mineralização.
    7. Adicionar 0,25 mL de solução de cloreto de cetilpiridínio 10% e incube a placa na RT durante 15 minutos num agitador em shakes de 100/min para extrair o corante de ARS.
    8. Transferir os sobrenadantes para um tubo de 1,5 mL e centrifugar 17.000 x g por 5 min à RT
    9. Adicionar a solução de cloreto de cetilpiridínio 10% para os extratos com um factor de diluição de 01:10-01:20 e adicionar as amostras (300 µ l) em uma placa de 96 poços, incluindo dois poços em branco contendo apenas 10% de cloreto de cetilpiridínio.
    10. Prepare 7 padrões de referência de ARS variando de 4 a 400 µM, diluindo o ARS 40mm coloração solução (pH 4.2) com solução de cloreto de cetilpiridínio de 10% para gerar uma curva padrão.
    11. Adicione 300 µ l da norma de referência em duplicatas para a placa de 96 poços.
    12. Leia a absorvância das amostras, espaços em branco e referência a normas em 520 nm.
    13. Subtrai as leituras em branco desde os padrões de referência e leituras de amostra.

2. Mouse OB-OC co-cultura para derivar OCs maduro

  1. Preparação e esterilização de fatias de osso cortical bovino
    1. Segmentos do osso no tecido circundante de limpar e remover o osso trabecular e medula óssea.
    2. Seque o osso a 50 ° C por 24 h.
    3. Cortar o osso em pequenos pedaços e corte em fatias (aproximadamente 300 – 350 µm espessura) usando uma velocidade baixa serra com uma lâmina de diamante.
    4. Corte as fatias de 300 – 350 µm em discos quadráticos (1 cm2).
    5. Para limpar os discos de osso (1 cm2), colocá-los em um frasco de vidro com fechadura e encha com água destilada. Transferência do frasco de vidro enchido em um banho ultra-sônico e proceda à sonicação por 5 min. Repita este passo 3 vezes.
    6. Despeje a água destilada, adicionar etanol a 70% e proceda à sonicação por 5 min.
    7. Despeje o etanol a 70% e substituir com 100% de etanol.
      Nota: Guarde as fatias de osso em 100% de etanol a 4 ° C por até 4 semanas.
    8. Irradiar as fatias de osso com luz UV de 15 min cada lado sob condições estéreis. Armazene as fatias de osso esterilizados em uma placa de cultura estéril na RT até utilização posterior.
  2. Isolamento de precursores OC de medula óssea
    1. Eutanásia em ratos BALB/c de 8 – 12 semanas de idade ingênua usando uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
    2. Isole os precursores OC de medula óssea de fêmures de rato e tíbias.
    3. Remover as pernas com tesoura estéril do ponto mais próximo ao corpo na articulação do quadril, corte dos membros nas articulações do joelho e tornozelo e remover o tecido mole com bisturi estéril e fórceps. Corte as epífises. Eliminar e suspender a medula com 1ml BGM em um prato de Petri estéril da 6cm usando uma agulha 27G anexada a uma seringa de 1mL para obter uma suspensão de células.
    4. Adicionar a suspensão de células para um tubo cónico de 50 mL, lavar o tubo de ensaio com 5 mL de BGM e transferência para o mesmo tubo cónico de 50 mL de 6cm. Centrifugar a 350 x g a 4 ° C por 5 min. Ressuspender as células em meio de diferenciação de OC (DM) contendo BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 e 1 µM prostaglandina E2 (1 mL/poço).
      Nota: Um rato BALB/c fornece um número suficiente de precursores OC para uma placa de cultura de 24-bem.
  3. Preparação de co-cultura rato OB-OC com biomaterial
    1. Pre-incube discos de β-TCP de diâmetro de 14 mm ou osso bovino fatias (1 cm2) em 1 mL de BGM em uma placa de cultura de suspensão 24-poço em 37 ° C e 5% CO2 por 24h antes de adicionar as células.
      Nota: Fatias de osso bovino são um grupo de controle do substrato fisiológico para estudar a diferenciação de OC na presença de biomateriais.
    2. Adicione 8,8 x 104 células/cm2 de primários OBs suspenso em BGM sobre os biomateriais ou o osso de controle em uma placa de cultura de suspensão 24-poço ou de uma placa de cultura de tecidos de 24-bem. Incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 24 h.
      Nota: OBs anexam para o plástico ou o osso biomaterial ou bovina.
    3. Adicione recentemente isolado precursores da medula óssea OC a 24h cultivadas OBs primária e da cultura em 37 ° C e 5% de CO2 por 5 dias. Substitua o meio acabadas OC DM todos os dias. Então mancha OCs para fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) para avaliar a diferenciação de OC.
  4. Diferenciação de OC avaliada pela coloração de armadilha
    1. Para caracterizar o OCs multinucleadas maduro, obtido a partir da etapa 2.3.3, Aspire o meio de cultura de cultura de tecidos o controle e a chapa de cultura de suspensão biomaterial e adicione 1 mL de 1X PBS (37 ° C). Aspirar a PBS e consertar as células incubando-os em 1 mL de solução de formalina 10% tamponada a RT por 10 min.
    2. Aspirar a solução de formalina 10% tamponada com uma pipeta descartável e adicionar 1 mL de 1X PBS em RT. repetir esta etapa três vezes, então aspirar a PBS, substituir com 1 mL de tampão de armadilha (pH 5) e incubar as placas a 37 ° C por 30 min.
    3. Aspirar o buffer de armadilha e adicione 1 mL de 1:1 acetona e 100% de etanol. Incube a placa na RT por 30 s. rapidamente aspirado o etanol-acetona solução com uma pipeta de uso único e completamente seca as placas no RT
    4. Para a armadilha de solução de coloração, prepare um 10 mg/mL solução stock de fosfato de naftol-AS-MX dissolver N, N-dimetilformamida, 0,6 mg/mL de rápido vermelha violeta sal no buffer de armadilha e adicionar 0,1 mL de solução de fosfato de naftol-AS-MX a 10 mL de sal violeta rápido vermelho no buffer de armadilha.
    5. Adicionar 1 mL de armadilha solução de coloração incubar a placa a 37 ° C por 10 min, em seguida, Aspire a armadilha solução de coloração e adicionar 1 mL de água ultrapura para parar a reação.
    6. Transferir os discos de β-TCP e fatias de osso bovino após coloração em um novo poço, observar o vermelho manchado OCs usando um microscópio de luz (ampliação: 10x) e enumerar armadilha + OCs maduro com três ou mais núcleos.

3. crítica-tamanho do Mouse raspagem defeito modelo

  1. Injetar buprenorfina 0,1 mg/kg por via subcutânea (s.c.) em 8 - semana velhos camundongos BALB/c para analgesia.
  2. Anestesiar os ratos com uma mistura de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg i.p. de xilazina, adicionar um gel ou pomada para os olhos para mantê-los húmida e posicione o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Avalie a profundidade da anestesia por pitada do dedo do pé e cauda.
  3. Raspar o pelo no topo da cabeça entre as orelhas e limpe a superfície com 7,5% povidona iodo solução e 70% de etanol.
  4. Fazer uma incisão sagital na parte superior do crânio entre as orelhas com um bisturi estéril para expor a calvária e remover os tecidos conjuntivos de pericranium acima do osso parietal direito, raspando-o com um bisturi.
  5. Crie um defeito de tamanho crítico no osso parietal direito usando um trépano dental estéril com um diâmetro de 4 mm (2000 rpm) sob constante irrigação com solução salina normal para a fenda do osso parietal direito e cortar o ectocortex e alguns endocortex.
  6. Para evitar danos à dura-máter, use um pequeno elevador periosteal para romper o restante endocortex, cuidadosamente Levante o fragmento ósseo e removê-lo com pinça. O defeito resultante deve ser circular e cerca de 3,5 mm de diâmetro.
  7. Preencher o defeito raspagem com pre-encharcada (PBS 1x estéril em RT) β-TCP/C espuma usando fórceps.
  8. Prepare o número apropriado de controles negativos sham, idade-combinados com um defeito de vazio.
  9. Para manter o biomaterial no lugar, coloca 0,5 µ l de adesivo de tecido na borda do defeito em dois pontos opostos.
  10. Feche a pele com uma sutura não absorvível.
  11. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com frio esterilizante para manter condições estéreis antes de executar a próxima cirurgia em um mouse anestesiado.
  12. Para o tratamento pós-cirúrgico, coloque os animais em um prato de aquecimento seco e limpo a 37 ° C, na área de cirurgia para acompanhamento adequado durante o período de recuperação. Monitore a frequência respiratória, temperatura corporal e cor das membranas mucosas e os olhos a cada 10 min até que acordam.
  13. Transferi os ratos conscientes operados em uma gaiola com comida e água separados dos outros animais até a recuperação completa. Injetar buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. para terapia analgésica pós-cirúrgica, duas vezes por dia por 72 h. retorno totalmente recuperado ratos de suas gaiolas.
  14. Para determinar a eficácia do biomaterial, eutanásia o i.p. de ratos com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
  15. No pós-implantação de 8 a 12 semanas, decapitar o mouse euthanized com tesoura afiada.
  16. Fix a cabeça decapitada do mouse em 30 mL de 4,5% tamponada solução de formalina para 1-2 semanas para garantir a completa penetração do fixador no tecido.
  17. Transferi as cabeças em etanol a 70% para o armazenamento a longo prazo a 4 ° C por até um ano.
  18. Micro uso calculado de tomografia computadorizada (microCT) ou padronizadas undecalcified técnicas histológicas para avaliar a regeneração óssea. É possível usar microCT digitalização em amostras post-mortem em alta resolução (90 kV, 4 min) no 2D e 3D sagital e frontal aviões.
  19. Para histologia undecalcified, desidrata as cabeças em crescente notas de etanol e incorporar em glicol metacrilato de metila.
  20. Cortar blocos de glicol metacrilato de metila-incorporado com uma serra de diamante e moer as seções para uma espessura de aproximadamente 80 a 100 µm.
  21. Avalie Lauro Laczko manchado osso seções para identificar a formação de osso novo14.

4. in Vitro respostas imunes

  1. Eutanásia ingênuo 8 - semana velho i.p. de camundongos BALB/c com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
  2. Coloque o mouse sobre seu lado direito, raspar o pelo do lado esquerdo e limpar a pele sobre o lado esquerdo do abdômen com etanol a 70%.
  3. Faça um 10 milímetros de comprimento e incisão profunda de 1 mm na pele do rato do lado esquerdo, posteriormente, após as costelas sobre o estômago com uma tesoura esterilizada.
  4. Abrir a pele e então expor o peritônio. Fazer um de 10 mm de comprimento e menos de 1 mm de profundidade incisão para o peritônio usando tesouras em condições estéreis.
  5. Empurre o estômago proximal para expor o baço.
  6. Mantenha o baço suavemente com pinça estéril e removê-lo cortando o tecido e os vasos anexados abaixo dela.
  7. Coloque o baço intacto em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de frio 1X PBS estéril.
  8. Prepare uma suspensão de célula única por picagem do baço usando 2 Pinças esterilizadas ou 2 lâminas de vidro estéril.
  9. Remova detritos, passando-o através de um filtro de célula estéril 40 µm com PBS 1x frio usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL.
  10. Centrifugar a suspensão de célula única 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C, em um tubo cónico de 50 mL, aspirar e desprezar o sobrenadante. Depois Ressuspender as células em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC).
  11. Incube a suspensão de eritrócitos para 14 min no RT e pare a reação adicionando 45 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifugar as células após a lise celular a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante.
  13. Splenocytes Ressuspender em meio RPMI contendo 10% inactivadas pelo calor FBS, solução de penicilina-estreptomicina 1%, 0,1% gentamicina, ß-Mercaptoetanol de 0,2% e 1% não aminoácidos essenciais.
  14. Pre-incube β-TCP/C espuma em uma placa de 96 poços estéril cultura contendo meio RPMI por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2 antes da semeadura de célula.
  15. Adicionar splenocytes titulada números, por exemplo., 1,25 x 105, 2.5 x 105 e 5 x 105pois para poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio RPMI e aditivos, com ou sem espuma pré-incubado β-TCP/C.
  16. Adicionar 10 µ g/mL Concanavalina um (Con A) dissolvido em média para um total de 100 µ l/poço a poços apropriados e então incuba a 37 ° C e 5% CO2 por 72 h.
  17. Medir a proliferação celular, com um ensaio de bromodeoxyuridine (BrdU). Adicionar 10 µ l/poço de BrdU solução de etiquetagem em 48h de cultura celular e então incubar a placa para um adicional 24h.
  18. A 72 h, recolher o sobrenadante e armazenar a-20 ° C até utilização posterior.
  19. Adicionar 200 µ l/poço da solução de fixação a cada poço e então incubar durante 30 min em RT. aspirar a solução de fixação. Adicione 100 µ l/poço da solução de trabalho de anticorpo anti-BrdU e incubar durante 90 min.
  20. Aspirar a solução de anticorpo, lavar os poços três vezes com 200 – 300 µ l/poço de solução de lavagem e remover a solução de lavagem.
  21. Adicione 100 µ l de solução de substrato e incubar durante 3 a 10 min a RT e, em seguida, medir a absorvância a 450 nm.
  22. Medir a interleucina-1 β (IL-1 β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) e interferon-γ (IFN-γ) nos sobrenadantes coletados usando um ELISA padrão.

5. alto Throughput Intraperitoneal modelo

  1. Anestesiar a 6-8 semanas velho BALB/c camundongos fêmeas com uma mistura de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg i.p. de xilazina e adicionar um gel ou pomada para os olhos para mantê-los húmida e posicione o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Avalie a profundidade da anestesia por pitada do dedo do pé e cauda.
  2. Raspar a pele abdominal e limpe com 7,5% povidona iodo solução e 70% de etanol.
  3. Fazer uma incisão longa 8mm através da pele ao longo da linea alba. Faça uma pequena incisão no peritônio usando um bisturi.
  4. Lugar PBS estéril embebido enxertos de β-TCP/C espuma (2 x 2 x 2 mm3) na cavidade peritoneal ou sem adição de materiais para os ratos controle de Souza idade-combinadas.
  5. Suturar o peritônio e pele com sutura absorvível e não absorvível, respectivamente.
  6. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com frio esterilizante para manter condições estéreis antes de executar a próxima cirurgia em um mouse anestesiado.
  7. Para o tratamento pós-cirúrgico, coloque os animais em um prato de aquecimento seco e limpo a 37 ° C, na área de cirurgia para acompanhamento adequado durante o período de recuperação. Monitore a frequência respiratória, temperatura corporal e cor das membranas mucosas e os olhos a cada 10 min até que acordam.
  8. Transferi os ratos conscientes operados em uma gaiola com comida e água separados dos outros animais até a recuperação completa. Retorne os ratos se recuperou totalmente de suas gaiolas.
    Nota: Este procedimento induz dor mínima. Terapia analgésica pós-cirúrgica, geralmente não é necessária. Se o operado animais mostram sinais de dor, injetar buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. ou outra droga analgésica adequada para alívio da dor.
  9. Eutanásia de ratos 7 dias após a implantação, com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg i.p. de xilazina
  10. No pós-implantação de 7 dias, lavagem da cavidade peritoneal usando um 1 mL seringa com uma agulha de 25 G para um total de 3 mL de PBS frio, segurando a cabeça de rato e inserindo a agulha no quadrante abdominal inferior esquerdo e objectivo proximalmente.
    Nota: O fluido peritoneal deve ser livre de hemácias.
  11. Centrifugue o fluido de lavagem peritoneal a 300 x g por 5 min a 4 ° C e coletar o fluido peritoneal para armazenar a-20 ° C para medições de ELISA de citocinas IL-1 β, Il-2 e IL-4.
  12. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS contar as células peritoneais usando trypan azul em um hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge a suspensão de célula 5 x 105 células para lâminas de vidro, permitem que os slides secar e manchar a contagem diferencial de células.
  14. Usando um microscópio de luz, contar com um mínimo de 300 células no total e diferenciar entre macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos.

6. subcrónica modelo subcutâneo

  1. ANESTHETIZE camundongos BALB/c de feminino 6 – 8 semanas com uma mistura de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg i.p. de xilazina, adicione gel ou pomada para os olhos para mantê-los húmida e posicione o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Avalie a profundidade da anestesia por pitada do dedo do pé e cauda.
  2. Coloque o mouse em sua parte traseira, raspar a pele abdominal e limpe a superfície raspada com 7,5% povidona iodo solução e 70% de etanol.
  3. Fazer uma incisão de 8 mm longa através da pele ao longo da linea alba do abdômen usando um bisturi e em seguida implante PBS embebido biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) sob a pele ou não adicionar nenhum material para os ratos controle de Souza idade-combinadas.
  4. Sutura da pele com uma sutura não absorvível.
  5. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com frio esterilizante para manter condições estéreis antes de executar a próxima cirurgia em um mouse anestesiado.
  6. Para o tratamento pós-cirúrgico, coloque os animais em um prato de aquecimento seco e limpo a 37 ° C, na área de cirurgia para acompanhamento adequado durante o período de recuperação. Monitore a frequência respiratória, temperatura corporal e cor das membranas mucosas e os olhos a cada 10 min até que acordam.
  7. Transferi os ratos conscientes operados em uma gaiola com comida e água separados dos outros animais até a recuperação completa. Retorne os ratos se recuperou totalmente de suas gaiolas.
    Nota: Este procedimento induz dor mínima. Terapia analgésica pós-cirúrgica, geralmente não é necessária. Se o operado animais mostram sinais de dor, injetar buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. ou outro analgésico apropriado.
  8. Quando estiver pronto para examinar o local do implante, eutanásia o i.p. de ratos com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
  9. Pós-implantação de oito semanas, impostos especiais de consumo local do implante com tecido (1 cm2).
  10. Fixar o tecido na solução de formalina 4,5% tamponada durante a noite, incorporar em parafina e cortados em 4 seções de µm.
  11. Mancha de 4 secções de tecido parafina µm com hematoxilina e eosina (H & E) de inflamação ou de Masson tricromo para deposição de colágeno e fibrose.

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Representative Results

Para avaliar a β-TCP para sua eficácia como um biomaterial para reparo ósseo, usamos in vitro e em vivo métodos de triagem. Em primeiro lugar, Nós medimos as respostas de OB para os discos de β-TCP em comparação com controles sozinho médio de linha de base. A Figura 2 demonstra a viabilidade de OB em resposta aos discos de β-TCP em 7 a 14 dias de cultura. Viabilidade celular, medida a partir de células metabolicamente ativas dos poços de cultura foi o mesmo para OBs com meio de cultura de tecido plástico, bem como com discos de β-TCP, indicando que este biomaterial não é melhorar nem suprimir a proliferação de OB.

Para avaliar mais os OBs, medimos a atividade da ALP como marcador de diferenciação utilizando abordagens qualitativas e quantitativas. A Figura 2 ilustra a atividade de enzima ALP em poços de cultura após 7 dias de cultura. OBs em poços com o meio sozinho tinham atividade ALP de linha de base, enquanto na mineralização ideal médio (MM) OBs tiveram ALP intensa coloração, refletindo um elevado nível de diferenciação de OB. Em contraste, os OBs chapeado em discos de β-TCP diferenciados menos do que o OBs incubadas em MM. Em um ensaio quantitativo, concentração de ALP foi 77% maior para os poços contendo MM em comparação com a média de base sozinha, Considerando que a concentração de ALP foi 40% menor nas células cultivadas em discos de β-TCP, comparados aos controles MM. Embora estes resultados demonstram que as células cultivadas em discos de β-TCP diferenciados menos do que aqueles com condições óptimas de plástico com MM, elas suficientemente diferenciadas sobre os biomateriais.

Outra característica fundamental do OBs é sua capacidade de induzir a mineralização, que é um passo essencial na consolidação óssea. Nós manchado células cultivadas de OB com ARS após 14 dias e encontrei que essa mineralização foi maior para controles MM, em comparação com OBs cultivadas em meio sozinho e em discos de β-TCP em poços de cultura (Figura 2). Quando medimos a concentração de ARS, achamos que os controles MM foram mais de 45% mais elevado do que o grupo de β-TCP. Estes dados ilustram essa OBs cultivadas em plástico na presença de MM maduro, diferenciam e mineralize é melhor do que aqueles com meio sozinho e em discos de β-TCP.

Para determinar como o OCs responder aos discos de β-TCP, usamos uma tecnologia de cultivo em que OBs co são cultivadas com medula óssea precursores OC seguidos pelo exame da morfologia OC. OB-OC co culturas foram observadas em 5 dias e diferem substancialmente entre as células cultivadas em plástico com OC DM e as células cultivadas em fatias de osso e β-TCP. Em plástico, o OCs foram grande e generalizada, enquanto que o OCs em substratos fisiológicos foram menores, menos difundido para fora e irregulares (Figura 3). Para dosar o OCs, nós enumerado armadilha + OCs e descobriram que existiam os números mais altos quando incubadas com β-TCP (1755 ± 21.41/cm2), em comparação com controles de cultura de tecidos (1140 ± 15,71/cm2) e de fatias de osso (709 ± 59,69/cm2), sugerindo maior diferenciação de OC em discos de β-TCP (Figura 3).

Para determinar uma espuma de β-TCP/C comercialmente disponível na vivo, usamos um modelo de tamanho crítico raspagem defeito em ratos. Nós mostramos cortes histológicos representativos processados por uma undecalcified técnica histológica com glicol metacrilato de metilo incorporação e Levai Laczko coloração. MicroCT e histologia pode ser utilizado para avaliar a formação de osso novo, dentro da área do defeito. Aqui, mostramos um exemplo com cortes histológicos na Figura 4. Quando o defeito ósseo cirurgicamente induzida foi deixado vazio (sham), observamos uma camada fina, cobrindo o defeito todo, mas sem formação óssea significativa esteve presente na operação post 12 semanas, confirmando o tamanho crítico da fratura óssea criada. Em contraste, quando o defeito contido β-TCP/C espuma, havia restos de β-TCP/C espuma rodeados por tecido fibroso denso, incluindo alguns dos vasos sanguíneos e células inflamatórias, ponte da área do defeito sem evidência de formação óssea.

Para avaliar a resposta do corpo estranho, avaliamos a reações alérgicas e imunológicas para os biomateriais, usando um ensaio em vitro . A Figura 5 demonstra que quando ingênuo splenocytes foram incubadas com meio sozinho ou com espuma de β-TCP/C, as células de baço de ingênuo não respondeu por proliferando ou produção de Il-2, IL-4 e citocinas IFN-γ. Em contraste, na ConA contendo culturas, proliferação celular e produção de citocinas aumentada exceto para IL-1 β. Respostas celulares foram afetado quando co cultivadas com ConA e espuma de β-TCP/C comparado com ConA sozinho, o que indica essa espuma de β-TCP/C nem aumento nem diminuição na vitro respostas.

Para determinar se o β-TCP/C espuma induziu uma resposta imune na vivo , colocamos o implante 1) intraperitonealmente e células inflamatórias contagens e citocinas concentração no fluido de lavagem peritoneal e 2) por via subcutânea e avaliados inflamação e fibrose em cortes histológicos de local do implante. Na tabela 1, a célula diferencial no fluido de lavagem peritoneal revela que o número total de células inflamatórias foi significativamente maior nos ratos β-TCP/C espuma implantado em comparação com os controles de Souza. Além disso, houve aumento do número de todos os tipos de células. Na figura 6A, há maior concentração de citocinas IL-1 β, Il-2 e IL-4 na espuma β-TCP/C em comparação com os controles de Souza. Em ratos de β-TCP/C espuma s.c. implantado, observamos uma resposta inflamatória com corpo estranho células gigantes na H & manchadas E seções (Figura 6B) e evidência de fibrose na Masson Trichrome manchado seções (Figura 6) em 8 semanas. Em contraste, o site de implantação dos controles de Souza teve inflamação mínima e sem fibrose (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: remoção de Calvaria para principal diagrama de isolamento de célula de OB. O diagrama ilustra como remover a calvária com 4 cortes (tracejado vermelho) com uma tesoura curva. O primeiro corte é perpendicular à direita (R) olho perfurado de X1 x 2 e o segundo é perpendicular à esquerda (L) olho perfurado de X3 a X 4. O terceiro corte é separar a calvária na frente do X4 para X 2 e o quarto corte é separar a parte de trás da X3 para X 1. A calvária é livre para ser removido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: β-TCP-induzida em vitro OB diferenciação e maturação. Viabilidade de OB e proliferação nos dias 7 e 14 das células cultivadas no médias sozinhos (barras) ou β-TCP (barras abertas) (média ± SEM; n = 3). Quantificação de atividade ALP de lisados celulares e normalização para o teor de proteínas (µM DIFMU / µ g da proteína, média ± SEM, n = 3) com imagens representativas, ilustrando a poços de cultura ALP-manchadas do dia 7. Mineralização, quantificada de culturas ARS-manchado por um método de extração de cloreto de cetilpiridínio mostrado como a concentração de ARS (µM ARS, média ± SEM, n = 3) com poços de cultura representante manchadas de ARS, no dia 14. Os grupos incluem osso crescimento médio sozinho (BGM); Médio de mineralização (MM); Β-TCP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: β-TCP-induzida em vitro diferenciação OC. Fotomicrografias representante mostram armadilha + MNCs no dia 5 após cultivo co rato OBs e precursores OC de medula óssea. Análise de ponto de extremidade de armadilha + células multinucleadas (MNCs) demonstra a contagem absoluta de armadilha + MNCs (≥3 núcleos) por cm2 (quer dizer SEM ±, n = 3) * * *p < 0,001. Os grupos incluem diferenciação OC sozinho médio (DM); Óssea; Β-TCP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: avaliação In vivo do osso de β-TCP/C espuma enxertos em um modelo de tamanho crítico raspagem defeito. Non-cura defeitos raspagem criados na 8 semana de idade fêmea BALB/c (n = 3) ratos usando um trépano dental de 4 mm. Tratamento grupos controle incluído Souza (defeito vazio) e defeitos tratado com espuma de β-TCP/C. Cortes histológicos representativos preparados no pós-implantação de 12 semanas. Fixada em formol glicol metacrilato de metila-incorporado cortes histologicos (80-100 µm) corados com corante Levai Laczko. Fotomicrografias mostradas em baixo (à esquerda) e ampliação de alta (à direita). Triângulos pretos indicam o defeito ósseo. Black * denota o tecido ósseo e branco * refere-se a espuma de β-TCP/C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: β-TCP/C induzida por espuma em vitro celular proliferação cytokine produção e. Splenocytes de ingênuo BALB/c ratos cultivados em meio sozinho, com espuma de β-TCP/C ou ConA. Proliferação de células do sobrenadante (BrdU) e a produção de IL-1 β, Il-2, IFN-γ e IL-4 (média ● sozinho, ConA ○, ■ β-TCP/C espuma, espuma de β-TCP/C e ConA □). Resultados de proliferação apresentados como a média de amostras de três vias (OD ± SEM) no ensaio de BrdU e a média das amostras duplicadas (pg/mL ± SEM) para a concentração de citocinas de dois experimentos independentes. p < 0,05 é considerado de significativo para o biomaterial vs médio e biomaterial e ConA vs ConA a sós. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: No vivo resposta imune do osso de β-TCP/C espuma enxertos em um modelo de rato subcrónica e rápida alto throughput i.p.. (A) camundongos BALB/c feminino implantado i.p. com espuma de β-TCP/C ou sem adição de materiais (sham). Sete dias mais tarde, peritoneal lavagem analisado para concentrações de citocinas (dados apresentados como média cytokine concentrações pg/mL ± SEM). Estes dados são representativos de dois experimentos independentes (n = 5). p < 0,05 é considerada significativa em comparação com a farsa. (B-C) Camundongos BALB/c fêmeas (n = 5) implantado s.c. com espuma de β-TCP/C ou sem adição de materiais (sham). Em 8 semanas após o implante, pele de implantação sites corados com H & E (B) e de Masson tricromo (C) avaliar a inflamação e fibrose, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Souza Vitoss
Célula contagens x 106 (% de células totais)
Macrófagos 1.240 ± 0,051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70.4) p < 0,001
Eosinófilos 0.120 ± 0.011 (8,5) 1.181 ± 0.254 (25,5) p < 0,01
Neutrófilos 0,002 ± 0,001 (0,2) 0.029 ± 0.011 (0,6) NS
Linfócitos 0,048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0,041 (3.5) NS
Contagem total de células 1.410 ± 0,066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tabela 1: Na vivo a resposta imune do osso de β-TCP/C espuma enxertos em um modelo de mouse rápida alto throughput i.p.. Camundongos BALB/c fêmeas foram implantados i.p. com espuma de β-TCP/C ou sem materiais (sham). Sete dias mais tarde, lavagem peritoneal foi obtida e analisada para o número de células inflamatórias e diferencial celular conta (dados apresentados como média célula contagens ± SEM). Estes dados são representativos de dois experimentos independentes (n = 5).

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Discussion

Aqui, nós mostramos uma abordagem multidisciplinar para a avaliação pré-clínica de biocompatibilidade de biomateriais representativos desenvolvido para regeneração óssea e reparação. Nós testamos as respostas de OBs, OCs, e a resposta de cura em vivo em um defeito ósseo crítica do modelo em ratos, bem como em vitro e em vivo respostas imunes. Objetivo demonstrar como os ensaios funcionam e resumem os dados e as conclusões derivadas do exame dos biomateriais. Mostramos que nossa estratégia gera um perfil valioso de biocompatibilidade de biomateriais do osso.

Ensaios de célula primária foram usados para avaliar a função OB e OC. OBs são responsáveis pela formação óssea e reparação fisiológica. Eles devem permanecer viáveis, diferenciar e induzir a mineralização. Neste estudo, mostramos como executar ensaios de viabilidade celular, ALP e ARS como marcadores de células fisiologicamente diferenciadas com a capacidade de mineralização. Os controles para os ensaios incluíam meio sozinho, que fornece uma linha de base e meio de mineralização osteogênica (MM), que otimizado diferenciação e mineralização de OBs em plástico. O grupo de controle último era uma referência padrão para o biomaterial. Para avaliação de OC, nós co cultivadas OBs e precursores OC derivadas da medula óssea, diferenciados os precursores em células multinucleadas, manchado-los com armadilha, uma enzima osteoclástica amplamente utilizado para identificar o OCs em vitro15 e em seguida enumerados as células usando microscopia de luz. Estes ensaios são o estado-da-arte e não exigem modificações. No entanto, observamos uma limitação relacionada com a qualidade do isolado primários OBs a mineralize. OBs preservados são armazenadas em nitrogênio líquido e usados dentro de um ano para obter melhores resultados.

Atividade e OB anexo foram maiores na cultura do tecido plástico do que sobre os discos de β-TCP testado. Quando avaliamos o OCs, observamos as esperadas diferenças entre a resposta ao plástico e osso, que é o substrato fisiológico de16. Em comparação, osso e β-TCP induzido por alterações morfológicas similares. A enumeração de ensaio de armadilha do OCs em resposta aos discos β-TCP mostrou que os números eram significativamente diferentes entre fatias de osso e β-TCP. Β-TCP induzida maior diferenciação do OC do que fatias de osso. Para diferenciação de OC, a armadilha é um ensaio bem estabelecido. Não havia nenhuma modificação significativa necessárias neste método. No entanto, para obter os melhores resultados, é essencial para não Incube as celulas por muito tempo, ou todas as células de origem monocítica tornará armadilha-positivo.

Para lidar com a resposta na vivo , usamos β-TCP/C espuma como um biomaterial exemplar porque ele contém β-TCP, que foi utilizado nos ensaios em vitro e colágeno e promove a consolidação de13. Apesar de β-TCP/C espuma é comercialmente disponíveis e usados clinicamente para osso reparação17,18, é apenas um dos muitos tipos diferentes de materiais que seriam interessantes estudar, por exemplo., bifásica de fosfato de cálcio ( hidroxiapatita/β-TCP), bem como desmineralizado osso humano nestes ensaios para determinar as respostas como biológicas diferem entre materiais. Para a resposta na vivo , implantamos β-TCP/C espuma em um defeito de tamanho crítico fragmento ósseo em camundongos e 12 semanas depois avaliados histologia e mostrou diferenças em comparação com controles de Souza. Também é possível avaliar as respostas com microCT que fornece informações complementares19. O defeito nos ratos controle Souza não tinha nenhuma formação óssea significativa, como esperado, Considerando que a espuma de β-TCP/C induziu uma resposta inflamatória, fibrose e angiogênese, que é a prova da primeira fase de formação óssea. Este método foi demonstrado anteriormente em JOVE20. No entanto, a nossa abordagem diferia em que usamos uma técnica modificada "elevador" com um Descolador para reduzir o risco de ferir a dura-máter por trefina. Nós raciocinou que a dura-máter desempenha um papel significativo no processo de cura de raspagem defeitos através da produção de células osteogênicas e osteocondutiva fatores3,21,22,23. Notavelmente, o material implantado, o tamanho do defeito e método para criar o defeito influencia a regeneração óssea de defeitos de raspagem. Outra modificação no procedimento envolveu a estabilização do biomaterial no defeito de raspagem com uma cola de tecido biocompatível que é rotineiramente usada clinicamente para fechar ferimentos. Esta alteração garante que o material na área de defeito não pode ser separado durante a cicatrização.

Inflamação regula a fase inicial de consolidação óssea, mas muita inflamação ou respostas alérgicas podem reduzir reparação11. A resposta imune ideal para biomateriais é iniciar uma cascata inflamatória que promove a formação óssea. No entanto, certos biomateriais podem causar uma resposta de corpo estranho, levando a uma matriz de sinais inflamatórios que causam fibrose ou sensibilização alérgica. Em nossos estudos, tínhamos avaliado respostas imunes à β-TCP/C espuma e descobriu que não era tóxico para as células de baço de ingênuo e não interferir com a expansão dos linfócitos T ou função (secreção de citocinas) quando adicionado à culturas com ConA. Nos experimentos intraperitoneal, espuma de β-TCP/C induzida por inflamação, e houve algumas evidências de um aumento da eosinofilia e macrófagos com concomitante aumento de citocinas tipo Th1 e Th2. Nas experiências de implantação subcutânea, β-TCP/C espuma também induzida por inflamação, mas não havia nenhuma evidência para respostas inflamatórias ou alérgicas crônicas, destrutivas, que sugere que o β-TCP/C espuma é biocompatível. Esses modelos fornecem informações sobre a resposta imune à biomateriais. Em primeiro lugar, o modelo in vitro aborda o efeito do biomaterial em células imunes ingênuo na presença de um mitógeno que apresente provas de que não há nenhuma supressão da resposta mitogênico causada pelo biomaterial. Em segundo lugar, o modelo intraperitoneal fornece uma leitura rápida de 7 dias do tipo de resposta imune, por exemplo., alergia e inflamação, como observado pelo tipo de infiltração de células inflamatórias e o perfil de citocinas. Em terceiro lugar, o modelo subcutâneo, subcrónica ilustra a resposta do tecido por um longo período, permite a avaliação da inflamação crônica, fibrose, anticorpos e pode ser usado para testar a implantação repetida para respostas de memória imunológica. Estes modelos tenham sido publicados anteriormente e são mostrados aqui sem quaisquer modificações,13. É crucial que existem controles negativos e positivos apropriados para estes modelos. Sugerimos a realização de todos os três modelos para evitar as limitações de cada método. Enquanto os modelos apresentados estão bem estabelecidos em outras áreas da imunologia, a abordagem para o teste de biomateriais é recente.

Em resumo, ósseo e imunológico ensaios fornecem um perfil de compatibilidade biológica sobre um biomaterial. Para o osso, OB e OC respostas para o biomaterial fornecem dados preliminares necessários antes de realizar as experiências com animais complicadas e caras e aderir ao princípio dos 3R. Ensaios imunológicos em vitro fornecem dados sobre a reactividade cruzada do antigénio e citotoxicidade, que também pode impedir novas experiências em animais. As experiências de alta taxa de transferência rápida para oferecer resultados em inflamatória e resposta de citocinas (EG., tipo das respostas dos linfócitos T), enquanto o modelo subcrónica é útil por causa de dados sobre a duração da inflamação e o potencial para danificar fibrose. Esta nova abordagem interdisciplinar que inclui osso e respostas imunes para biomateriais oferece uma excelente avaliação pré-clínica de biocompatibilidade para futuras aplicações no campo de materiais.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este projeto de pesquisa recebeu financiamento do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob concessão acordo n. º 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

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References

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Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

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