Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

Il numero di nuovi biomateriali ingegnerizzati per la riparazione di lesioni dell'osso grande è in continua espansione con l'obiettivo di migliorare la guarigione ossea e superare le complicazioni connesse con trapianto osseo. Qui, presentiamo una strategia multidisciplinare per test di biocompatibilità pre-clinico di biomateriali per riparazione ossea.

Abstract

Grande pseudoartrosi fratture sono una sfida significativa nell'ambulatorio ortopedico. Anche se auto - e gli innesti dell'osso allogenico sono eccellenti per la guarigione di tali lesioni, esistono potenziali complicazioni con il loro uso. Così, scienziati dei materiali sono lo sviluppo di biomateriali sintetici, biocompatibili per superare questi problemi. In questo studio, presentiamo una piattaforma multidisciplinare per la valutazione di biomateriali per riparazione ossea. Abbiamo unito le competenze da biologia dell'osso e immunologia per sviluppare una piattaforma incluso in vitro degli osteoclasti (OC) e le analisi degli osteoblasti (OB) e in vivo modelli murini di riparazione ossea, immunogenicità e allergenicità. Dimostriamo come eseguire gli esperimenti, riepilogare i risultati e relazione sulla biocompatibilità di biomateriale. In particolare, abbiamo testato la vitalità di OB, differenziazione e mineralizzazione e redditività OC e differenziazione nel contesto dei dischi di β-tricalcio fosfato (β-TCP). Abbiamo provato anche una schiuma di β-TCP/collagene (β-TCP/C) che è un materiale commercialmente disponibile usato clinicamente per la riparazione dell'osso in un modello murino di difetto critico dimensioni osso calvarial per determinare gli effetti sulle prime fasi di guarigione ossea. In esperimenti paralleli, abbiamo valutato le risposte immunitarie e allergiche nei topi. Il nostro approccio genera un profilo di compatibilità biologica di un biomateriale osseo con una gamma di parametri necessari per la predizione della biocompatibilità dei biomateriali utilizzati per la guarigione dell'osso e riparazione nei pazienti.

Introduction

Riparazione dell'osso è un processo complesso che inizia con la formazione dell'ematoma, infiammazione, callo formazione e rimodellamento quindi1,2. Tuttavia, potenziale di rigenerazione dell'osso è limitata alla dimensione dell'osso frattura1,3. Per esempio, grandi fratture causate da traumi, cancro o l'osteoporosi non possono guarire e sono denominate fratture ossee non sindacale. Queste lesioni ossee richiedono spesso il trattamento per promuovere la rigenerazione e riparazione dell'osso fisiologico sano. Attualmente, il trapianto di osso autologo e allogenico è l'approccio di scelta4 con procedure di sostituzione ossea 2,2 milioni annualmente5. Se queste procedure hanno un alto tasso di successo, ci possono essere complicazioni, ad esempio, la disponibilità limitata di osso, infezione, morbilità del sito donatore e rifiuto4. Nuove alternative per l'ingegneria tissutale ossea vengono ricercate per affrontare queste sfide.

La progettazione di biomateriali basati su polimeri naturali o sintetici, bioceramics o metalli in combinazione con le cellule e molecole bioattive è il luogo6. Nostra attuale comprensione dell'osso fisiologica guarigione e guarigione nel contesto dei biomateriali dipende da molteplici fattori come proprietà meccaniche e molteplici fattori locali e sistematici, compreso le cellule dalla circolazione e luogo di frattura7 ,8,9. Biomateriali per la rigenerazione ossea mirano a promuovere osteogenicity e osteointegrazione10 e sono idealmente biocompatibile, biodegradabile e poroso (promuovere la migrazione cellulare, ossigeno e sostanze nutritive). Hanno anche bisogno di essere sufficientemente forte da sostenere il sito di frattura per alleviare il dolore. Inoltre, fattori infiammatori sono tenuti ad avviare il processo di guarigione. Tuttavia, se il biomateriale induce eccessiva infiammazione e risposte allergiche, questo potrebbe limitare o inibire11,12di guarigione ossea. Così, un approccio interdisciplinare è necessario valutare biomateriali sviluppati per riparazione ossea.

In questo studio, presentiamo una valutazione pre-clinica di materiali rappresentativi, 1) Orthovita Vitoss schiuma che è un sostituto di innesto di osso spongioso commercialmente disponibile composto da fosfato tricalcico composto di dimensioni nanometriche puro β-tricalcio particelle di fosfato (β-TCP) e collagene bovino di tipo 1 (C) (β-TCP/C schiuma) e 2) dischi di β-TCP. Qui illustriamo test di biocompatibilità di questi biomateriali utilizzando primario degli osteoblasti (OB) e dosaggi degli osteoclasti (OC), un modello in vivo di riparazione ossea, una valutazione immunologica che comprende in vitro la proliferazione dei linfociti T e produzione di citochine e in vivo l'immunogenicità e allergenicità, come precedentemente segnalato13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le procedure sono state fatte con topi BALB/c seguendo tutte le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e ricerca e sono state approvate dal Comitato per l'etica del Ministero austriaco dell'educazione, scienza e della ricerca.

1. principale del Mouse OB cultura

  1. Isolamento di OB da calvaria neonatale del mouse tramite digestione enzimatica
    1. Eutanasia neonatale cuccioli di 1 – 2 giorno vecchio (60 in totale) per decapitazione e posizionate le testine in una capsula di Petri con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS).
    2. Tenere la testa per la nuca del collo e tagliare la pelle via con forbici sterili. Incise il calvarium forando esso (circa 0,1 – 0,3 mm) con un paio di forbici che vengono poi inseriti sotto la volta cranica alla nuca alla base del cranio e tagliare lungo il bordo calvarial lateralmente dalla parte posteriore a anteriore sopra le orecchie e quindi abov e il ponte nasale (Figura 1).
    3. Incubare la calvaria dissecata con 8 mL di soluzione di digestione filtro sterilizzato (300 unità/mL collagenasi tipo IV e 2.14 dispase unità/mL II disciolti in α-minimo indispensabile mezzo (α-MEM)) in una provetta conica da 50 mL a 37 ° C per 10 min in un incubatore d'agitazione a 200 scuote / min.
    4. Scartare il surnatante primo e ripetere la procedura di digestione tre volte con 8 mL di soluzione di digestione. Raccogliere il surnatante contenente le celle dopo ogni fase di digestione e aggiungerlo a una provetta conica da 50 mL. Conservare la provetta conica da 50 mL con le cellule in acqua e ghiaccio fino al completamento della procedura di digestione (circa 40 min).
    5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante (con una pipetta di Pasteur attaccata ad una pompa di vuoto) e risospendere in 40 mL di mezzo di crescita ossea (BGM) contenente α-MEM con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e l'1% soluzione di penicillina-streptomicina. Quindi aggiungere 10 mL della sospensione delle cellule a 4 piastre di coltura tissutale (10 cm).
    6. Fino alla confluenza (2 – 3 giorni) della coltura le cellule a 37 ° C e 5% CO2 .
    7. Punto di confluenza, il vecchio mezzo di aspirare e lavare le piastre di coltura del tessuto una volta con PBS 1X (37 ° C). Poi aspirare il PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina 1x contenente 0,5% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per ciascuna piastra di coltura del tessuto di 10 cm.
    8. Incubare le piastre 4 coltura a 37 ° C e 5% di CO2 per 5 min e quindi controllare le piastre con un microscopio invertito luce per garantire che le cellule si staccano dalla plastica. Quindi è possibile trasferire tutte le sospensioni cellulari (Totale 8 mL) in una provetta conica 50 mL contenente 10 mL di BGM fresco. Lavare ogni piatto con 5 mL di fresco BGM e trasferimento alla stessa provetta conica 50 mL.
    9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 16 mL di BGM fresco. Preparare 16 nuovi 10cm coltura tissutale piastre (divisione 1:4) contenente 9 mL di BGM. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare per ogni piatto.
    10. Ripetere i passaggi da 1.1.6. a 1.1.8.
    11. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere in 10 mL di BGM fresco. Contare le celle e calcolare la concentrazione cellulare.
      Nota: Questa procedura genera circa 7,5 – 8,3 x 105 cellule/pup.
    12. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere in congelamento medio contenente 10% dimetilsolfossido (DMSO), α-MEM di 40% e 50% FBS. Trasferire 1,5 mL di sospensione cellulare per cryovials mL 2 per un totale di 2 x 106 cellule per flaconcino.
    13. Flash congelare le fiale in azoto liquido per stoccaggio a lungo termine in un serbatoio di azoto liquido. Utilizzare le celle all'interno di un anno per garantire la piena funzionalità. Utilizzare questi OB primari per la valutazione di proliferazione (punto 1.2), differenziazione (saggi di ALP: passo 1.4., 1.5.) e la mineralizzazione (passo 1.6.) in presenza di biomateriali. Utilizzare queste cellule per la maturazione dei precursori OC osso-zucchino-derivate in co-coltura (punto 2.3).
  2. Analisi di proliferazione di OB
    1. Pre-Incubare dischi di β-TCP di diametro 14 mm in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h prima aggiunta di piastre di coltura del tessuto standard OBS. uso primari per i controlli e piastre di coltura di sospensione per gli esempi di biomateriali per evitare di adesione delle cellule alla plastica.
    2. Aspirare il mezzo di pre-incubazione e quindi risospendere primario del mouse OBs in BGM. Aggiungere 4.4 x 104 OBs/cm2 sui dischi pre-incubate β-TCP in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti e per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). OBs attribuirà la piastra di coltura del tessuto o il biomateriale.
    3. Incubare per 14 giorni a 37 ° C e 5% CO2. Durante il periodo di incubazione, cambiare il mezzo ogni 2 – 3 giorni e aggiungere 1 mL di BGM fresco ad ogni pozzetto.
    4. Per valutare la proliferazione di OB, trasferire i dischi di β-TCP nei giorni 7 e 14 nuovi pozzi per escludere i segnali dalle cellule coltivate sulla piastra di coltura di sospensione.
    5. Aspirare il vecchio mezzo, aggiungere 0,5 mL di BGM (37 ° C) e incubare le piastre di coltura per 30 min a 37 ° C e 5% CO2. Quindi 55 µ l di reagente di proliferazione cellulare: 10x (01:10 diluizione) direttamente nella cultura ben. Per gli spazii in bianco, preparare tre pozzetti contenenti 0,5 mL di BGM e 55 µ l del reagente di proliferazione delle cellule di 10x. Incubare tutte le piastre per 30 min a 37 ° C e 5% CO2.
    6. Prelevare e trasferire 150 µ l del surnatante da pozzetti in una piastra 96 pozzetti nera e leggere fluorescenza con eccitazione a 560 nm ed emissione a 590 nm. Sottrarre le letture in bianco dalle letture del campione.
  3. Saggi di differenziazione e mineralizzazione di OB
    1. Pre-Incubare dischi di β-TCP di diametro 14 mm in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h prima di aggiungere le piastre di coltura del tessuto standard OBS. uso per controlli e piastre di coltura di sospensione per gli esempi di biomateriali per evitare adesione delle cellule alla plastica.
    2. Aspirare il mezzo di pre-incubazione e quindi risospendere primario del mouse OBs in BGM. Aggiungere 8,8 x 104 OBs/cm2 sui dischi pre-incubate β-TCP in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti e per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). OBs attribuirà la piastra di coltura del tessuto o del campione di biomateriale.
    3. Sostituire il RGB con 1 mL di terreno di mineralizzazione osteogenica (MM) contenente BGM, 50 µ g/mL di acido ascorbico e β-glicerofosfato di 5 mM 24 h dopo l'aggiunta del ob di e incubare per 14 giorni a 37 ° C e 5% CO2. Modificare il mezzo ogni 2 – 3 giorni con 1 mL di MM preparata in ciascun pozzetto.
  4. Differenziazione di OB valutata dall'attività della fosfatasi alcalina (ALP) da lisati cellulari
    1. Per misurare l'attività del ALP il giorno 7 dopo l'aggiunta del MM, aspirare il terreno di coltura dai pozzi e poi lavare con 1 mL di PBS 1X sterile (37 ° C). Aspirare accuratamente il PBS per consentire le cellule allegate a rimanere sulla coltura del tessuto plastica o biomateriale e congelare le piastre a-80 ° C.
    2. Dopo 24 h (o fino a 2 settimane), scongelare la piastra di coltura del tessuto e piastra di coltura di sospensione di biomateriale a temperatura ambiente (TA) per preparare per la lisi di OB. Per gli esempi di biomateriali, trasferire i dischi di β-TCP in una nuova piastra di coltura sospensione per escludere le cellule fissate alla piastra. Aggiungere 75 µ l di 1x buffer di lisi delle cellule di entrambe le piastre. Agitare le piastre per 5 minuti su un agitatore a 400 frullati/min.
    3. Trasferire il lysate delle cellule in una microcentrifuga 0,5 mL e centrifugare a 300 x g per 6 min a RT per rimuovere i detriti. Aggiungere 50 µ l del surnatante lisato cellulare del campione ad una piastra 96 pozzetti nera e quindi aggiungere 50 µ l di una soluzione composta da 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfato (DiFMUP) substrato fluorogenico disciolto in 2 x tampone ALP (pH 10) per pozzetto. Impostare due pozzetti del bianco con 100 µ l di una soluzione di 1:1 contenente 1 tampone di lisi delle cellule di x e 2 x ALP buffer.
    4. Preparare 8 norme di riferimento con 100 μL/pozzetto con la (DiFMU) 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin che vanno da 0,5 a 200 μM sciolto in soluzione di 1:1 contenente 1 tampone di lisi delle cellule di x e 2 x ALP buffer per generare una curva standard di riferimento.
    5. Incubare la piastra nera a 37 ° C per 15 min e poi leggere la fluorescenza con l'eccitazione a 358 nm ed emissione a 455 nm. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.
    6. Normalizzare l'attività enzimatica ALP dai lisati cellulari alla quantità totale di proteina usando un'analisi colorimetrica per la concentrazione di proteina. Preparare albumina di siero bovino (BSA) tra gli standard con il proteina riferimento a un intervallo compreso tra 0,05 – 2,5 µ g / µ l disciolto in 1x tampone di lisi delle cellule per generare una curva standard.
    7. Preparare il campione lisati cellulari e gli standard di proteina di BSA in duplicati. Aggiungere 5 µ l di cella campione lisata o 5 µ l di proteina BSA standard in una piastra a 96 pozzetti e quindi aggiungere 25 µ l di reagente A' e 200 µ l di reagente B. Set up due pozzetti del bianco con 5 µ l di tampone di lisi delle cellule: 1x. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 15 min e poi leggere l'assorbanza a 690 nm. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.
  5. Differenziazione di OB valutata dalla macchiatura ALP nella coltura delle cellule
    1. Macchia ALP in OBs coltivate il giorno 7 dopo l'aggiunta di MM su una piastra di coltura del tessuto di controllo e il biomateriale in una piastra di coltura di sospensione.
    2. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti e sostituirlo con 0,5 mL di PBS 1X (37 ° C). Aspirare il PBS e fissare le cellule di incubarle in 0,5 mL di formalina 10% tamponata a temperatura ambiente per 1 min.
    3. Aspirare la formalina 10% tamponata con una pipetta monouso e aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio (0.05% Tween20 in PBS 1X).
    4. Sciogliere una tavoletta di substrato del (BCIP/NBT) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato/nitro blu in 10 mL di acqua ultrapura e agitare fino a completa dissoluzione. La soluzione deve essere protetto dalla luce e utilizzata entro 2 h.
    5. Aspirare il tampone di lavaggio e sostituire con 0,5 mL di soluzione di substrato BCIP/NBT e incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 10 min. aspirare la soluzione colorante e con 0,5 mL di tampone di lavaggio.
    6. Trasferire i dischi macchiato β-TCP in un nuovo pozzo e le piastre di ALP-macchiato la scansione con uno scanner piano convenzionale alla macchiatura di ALP record.
  6. Mineralizzazione OB valutata mediante colorazione con Alizarin Red S (ARS)
    1. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti contenenti primario OBs 14 giorni dopo l'aggiunta di MM e lavare due volte con 0,5 mL di PBS 1X a RT. aspirato il PBS e fissare le cellule con l'aggiunta di 0,5 mL del 10% formalina soluzione tamponata a temperatura ambiente per 10 min.
    2. Formalina 10% tamponata con una pipetta monouso di aspirare e lavare due volte con 0,5 mL di acqua ultrapura.
    3. Per gli OB fissi, aggiungere 0,25 mL di soluzione colorante ARS di 40 mM (pH 4.2) dissolto in acqua ultrapura e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti su un agitatore a frullati 100/min.
    4. Aspirare la soluzione colorante con una pipetta monouso e risciacquare con 1 mL di acqua ultrapura. Ripetere questo passo 5 – 10 volte per rimuovere aspecifici di colorazione.
      Nota: La soluzione di risciacquo deve essere senza colore.
    5. Aspirare l'acqua ultrapura e aggiungere 1 mL di PBS freddo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti su un agitatore a frullati 100/min.
    6. Aspirare il PBS, trasferire i dischi macchiato β-TCP per un nuovo pozzo e scansione le piastre con uno scanner piano per mineralizzazione record.
    7. Aggiungere 0,25 mL di soluzione di cloruro di cetylpyridinium 10% e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 100 frullati/min per estrarre la tintura di ARS.
    8. Trasferire i surnatanti in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a TA.
    9. 10% cetilpiridinio cloruro soluzione agli estratti con un rapporto di diluizione di 01:10-01:20 ed aggiungere i campioni (300 µ l) in una piastra a 96 pozzetti inclusi due pozzi a vuoti contenente solo 10% cloruro di cetylpyridinium.
    10. Preparare 7 ARS norme di riferimento che vanno da 4 a 400 µM diluendo l'ARS 40 mM colorazione con soluzione di cloruro di cetylpyridinium 10% di soluzione (pH 4.2) per generare una curva standard.
    11. Aggiungere 300 µ l di standard di riferimento in duplicati per la piastra a 96 pozzetti.
    12. Leggere l'assorbanza dei campioni, gli spazii in bianco e fanno riferimento a norme a 520 nm.
    13. Sottrarre le letture in bianco da standard di riferimento e letture campione.

2. Mouse OB-OC co-coltura per derivare maturo OCs

  1. Preparazione e sterilizzazione delle fette di osso corticale bovino
    1. Segmenti dell'osso dal tessuto circostante di pulire e rimuovere il trabecular dell'osso e del midollo osseo.
    2. Asciugare l'osso a 50 ° C per 24 h.
    3. Tagliare l'osso in blocchi più piccoli e tagliatelo a fette (circa 300 – 350 µm di spessore) utilizzando una bassa velocità sega con una lama di diamante.
    4. Tagliare le fette di 300 – 350 µm in dischi quadratici (1 cm2).
    5. Per pulire i dischi di osso (1 cm2), metterle in un flaconcino di vetro chiudibili a chiave e riempire con acqua distillata. Trasferire il flaconcino di vetro riempito in un bagno ad ultrasuoni e Sonicare per 5 min. Ripetere questa operazione tre volte.
    6. Versare l'acqua distillata, aggiungere etanolo al 70% e Sonicare per 5 min.
    7. Versare fuori l'etanolo al 70% e sostituire con etanolo al 100%.
      Nota: Conservare le fette di osso in etanolo al 100% a 4 ° C fino a 4 settimane.
    8. Irradiare le fette di osso con luce UV per 15 minuti su ogni lato in condizioni sterili. Conservare le fette di osso sterilizzato in una piastra di coltura sterile a temperatura ambiente fino all'ulteriore utilizzo.
  2. Isolamento dei precursori del midollo osseo OC
    1. Eutanasia ingenuo topi BALB/c di 8 – 12 settimane vecchio usando un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
    2. Isolare i precursori OC del midollo osseo da mouse femori e le tibie.
    3. Rimuovere le gambe con forbici sterili dal punto più vicino al corpo all'articolazione dell'anca, tagliare le membra alle articolazioni del ginocchio e della caviglia e rimuovere i tessuti molli con bisturi sterile ed il forcipe. Tagliare l'epifisi. Scovare e sospendere il midollo con 1mL BGM in un piatto di Petri sterili cm 6 utilizzando un ago 27G attaccato ad una siringa da 1mL per ottenere una sospensione cellulare.
    4. Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta conica 50 mL, lavare i 6 cm di Petri con 5 mL di BGM e trasferimento alla stessa provetta conica 50 mL. Centrifuga a 350 x g a 4 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in mezzo di differenziazione di OC (DM) contenente BGM, 1 nanometro 1,252-vitamina D3 e 1 µM della prostaglandina E2 (1 mL/pozzetto).
      Nota: Un mouse BALB/c fornisce un numero sufficiente di precursori OC per una piastra di coltura 24 pozzetti.
  3. Preparazione di co-coltura del mouse OB-OC con biomateriale
    1. Pre-Incubare 14 mm diametro β-TCP dischi o fette di osso bovino (1 cm2) in 1 mL di BGM in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h prima di aggiungere le celle.
      Nota: Fette di osso bovino sono un gruppo di controllo di substrato fisiologico per studiare la differenziazione di OC in presenza di biomateriali.
    2. Aggiungere 8,8 x 104 cellule/cm2 di primaria OBs sospesa in BGM su biomateriali o l'osso di controllo in una piastra di coltura di sospensione 24 pozzetti o ad una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 24 h.
      Nota: OBs allegare per la plastica o l'osso di biomateriale o bovina.
    3. Aggiungere appena isolato precursori OC del midollo osseo per la 24h in coltura primaria OBs e coltura a 37 ° C e 5% CO2 per 5 giorni. Sostituire il mezzo con preparati OC DM ogni altro giorno. Quindi macchiare OCs per fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) per valutare la differenziazione di OC.
  4. Valutato da trappola che macchia la differenziazione OC
    1. Per caratterizzare maturo OCs multinucleated, ottenuta dal punto 2.3.3, aspirare il terreno di coltura dalla piastra di coltura del tessuto e la piastra di coltura di sospensione biomateriale e aggiungere 1 mL di PBS 1X (37 ° C). Aspirare il PBS e fissare le cellule di incubarle in 1 mL di soluzione di formalina 10% tamponata a temperatura ambiente per 10 min.
    2. Aspirare la soluzione di formalina 10% tamponata con una pipetta monouso e aggiungere 1 mL di PBS 1X a RT. Ripetere questo passaggio tre volte, quindi aspirare il PBS, sostituire con 1 mL di tampone TRAP (pH 5) e incubare le piastre a 37 ° C per 30 min.
    3. Aspirare il buffer di trappola e aggiungere 1 mL di 1:1 di acetone e 100% di etanolo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 s. rapidamente aspirato l'acetone-etanolo soluzione con una pipetta monouso e asciugare completamente le piastre a TA.
    4. Per la trappola soluzione di colorazione, preparare un 10 mg/mL soluzione di riserva di fosfato naftolo-AS-MX in dissolvenza di N, N-dimetilformammide, 0,6 mg/mL di viola rosso veloce sale nel buffer di trappola e aggiungere 0,1 mL di soluzione di riserva di fosfato naftolo-AS-MX a 10 mL di sale veloce rosso viola nel buffer di trappola.
    5. Aggiungere 1 mL di trappola macchiatura soluzione Incubare la piastra a 37 ° C per 10 min, poi aspirare la trappola macchiatura soluzione e aggiungere 1 mL di acqua ultrapura per arrestare la reazione.
    6. Trasferire i dischi di β-TCP e fette di osso bovino dopo colorazione in un nuovo pozzo, osservare OCs macchiato rosso utilizzando un microscopio ottico (ingrandimento: 10x) ed enumerare TRAP + maturo OCs con tre o più nuclei.

3. dimensioni critiche Mouse difetto Calvarial modello

  1. Iniettare la buprenorfina 0,1 mg/kg per via sottocutanea (s.c.) in topi BALB/c 8 - settimana-vecchi per analgesia.
  2. Anestetizzare i topi con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina, aggiungere un gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
  3. Radere il pelo sulla sommità della testa tra le orecchie e pulire la superficie con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
  4. Fare un'incisione sagittale mediana sulla parte superiore del cranio tra le orecchie con un bisturi sterile per esporre il calvarium e rimuovere il tessuto connettivo pericranium sopra l'osso parietale destra raschiando con un bisturi.
  5. Creare un difetto critico dimensioni nell'osso parietale destra utilizzando un trapano dentale sterile con un diametro di 4 mm (2000rpm) sotto costante irrigazione con soluzione salina normale per intaccare l'osso parietale destro e tagliare attraverso il ectocortex e qualche endocortex.
  6. Per evitare danni al mater di dura, è necessario utilizzare un piccolo ascensore periosteal per sfondare il rimanente endocortex, sollevare l'osso calvarial delicatamente e rimuovere con il forcipe. Il difetto risultante deve essere circolare e circa 3,5 mm di diametro.
  7. Riempire il difetto calvarial con pre-impregnati (sterile in 1X PBS a TA) β-TCP/C schiuma usando il forcipe.
  8. Preparare il numero appropriato di pari età, sham controlli negativi con un difetto vuoto.
  9. Per mantenere il biomateriale in luogo, mettere 0,5 µ l di adesivo del tessuto al bordo del difetto in due punti opposti.
  10. Chiudere la pelle con una sutura non assorbibile.
  11. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
  12. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
  13. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Iniettare la buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. per terapia analgesica post-chirurgica due volte al giorno per 72 h. ritorno completamente recuperato topi nelle loro gabbie.
  14. Per determinare l'efficacia del biomateriale, eutanasia il i.p. di topi con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
  15. Presso post-l'impianto di 8 – 12 settimane, decapitare il mouse eutanasizzato con forbici affilate.
  16. Correzione la testa decapitata del mouse in 30 mL di 4,5% formalina tamponata per 1-2 settimane garantire piena penetrazione del fissativo nel tessuto.
  17. Trasferire le teste in etanolo al 70% per l'archiviazione a lungo termine a 4 ° C fino ad un anno.
  18. Uso micro la tomografia computerizzata (microCT) o tecniche istologiche undecalcified standardizzati per valutare la rigenerazione ossea. È possibile utilizzare microCT scansione su campioni post mortem ad alta risoluzione (90 kV, 4 min) in 2D e 3D sagittale e frontale aerei.
  19. Per istologia undecalcified, disidratare le teste in crescente gradi di etanolo e incorporare in metacrilato di metile glicole.
  20. Tagliare i blocchi di metacrilato di metile-incastonato di glicole con una sega di diamante e macinare le sezioni ad uno spessore di circa 80 – 100 µm.
  21. Valutare Levai Laczko macchiato le sezioni dell'osso per identificare per la formazione di osso nuovo14.

4. in Vitro le risposte immunitarie

  1. Eutanasia ingenuo 8 - settimana-vecchio i.p. di topi BALB/c con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
  2. Posizionare il mouse sul suo lato destro, radere il pelo sul lato sinistro e pulire la pelle sopra la parte sinistra dell'addome con etanolo al 70%.
  3. Fare un 10 mm lunga e profonda incisione 1 mm nella pelle del mouse sul lato sinistro, posteriormente seguendo le costole sopra lo stomaco usando forbici sterili.
  4. Aprire la pelle e quindi esporre il peritoneo. Fare un 10 mm di lunghezza e meno di 1 mm di profondità incisione nel peritoneo con forbici in condizioni sterili.
  5. Spingere lo stomaco prossimale per esporre la milza.
  6. Tenere la milza delicatamente con pinze sterili e rimuoverlo dal taglio tessuti e vasi attaccati di sotto di esso.
  7. Posizionare la milza intatta in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di freddo 1X PBS sterile.
  8. Preparare una sospensione unicellulare di sminuzzare la milza usando 2 pinze sterili o 2 lastre di vetro sterile.
  9. Rimuovere i detriti passandolo attraverso un colino di cella 40 µm sterile con PBS 1X freddo utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 mL.
  10. Centrifugare la sospensione unicellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C in una provetta conica da 50 mL, aspirare e scartare il surnatante. Quindi risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC).
  11. Incubare la sospensione cellulare per 14 min a RT e interrompere la reazione aggiungendo 45 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifugare le cellule dopo la lisi cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C e quindi scartare il surnatante.
  13. Risospendere splenocytes in medium RPMI contenente 10% calore-inattivati FBS, soluzione di penicillina-streptomicina 1%, 0,1% gentamicina, 0,2% ß-mercaptoetanolo e gli amminoacidi non essenziali di 1%.
  14. Pre-Incubare β-TCP/C schiuma in una piastra di coltura sterile 96 pozzetti contenenti medium RPMI per 24 h a 37 ° C e 5% CO2 prima della semina delle cellule.
  15. Aggiungere splenocytes titolato numeri, ad es., 1,25 x 105, 2.5 x 105 e 5 x 105/well per pozzetti in una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti contenenti medium RPMI e additivi, con o senza la schiuma di β-TCP/C pre-incubata.
  16. Aggiungere 10 µ g/mL concanavalina A (raggiro A) disciolti in mezzo per un totale di 100 µ l/pozzetto di appositi pozzetti e poi incubazione a 37 ° C e 5% di CO2 per 72 h.
  17. Misurare la proliferazione delle cellule con un saggio di bromodeossiuridina (BrdU). Aggiungere 10 µ l/pozzetto di soluzione di etichettatura di BrdU a 48 h della coltura delle cellule e quindi incubare la piastra per altre 24 h.
  18. A 72 h, raccogliere il surnatante e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
  19. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di soluzione di fissazione ad ogni pozzetto e incubare per 30 min a RT. aspirare la soluzione di fissaggio. Aggiungere 100 µ l/pozzetto della soluzione di lavoro di anticorpo anti-BrdU e incubare per 90 min.
  20. Aspirare la soluzione di anticorpo, lavare i pozzetti tre volte con 200 – 300 µ l/pozzetto di soluzione di lavaggio e rimuovere la soluzione di lavaggio.
  21. Aggiungere 100 µ l di soluzione substrato e incubare per 3 – 10 min a RT, quindi misurare l'assorbanza a 450 nm.
  22. Misura dell'interleuchina-1 β (IL-1 β), l'interleuchina 2 (il-2), interleuchina-4 (IL-4) e l'interferone-γ (IFN-γ) nei surnatanti raccolti usando una ELISA standard.

5. high Throughput intraperitoneale modello

  1. Anestetizzare femmina 6-8 settimane vecchi topi BALB/c con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina e aggiungere un gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
  2. Radere il pelo addominale e pulire con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
  3. Fare un'incisione del midline lungo 8 mm attraverso la pelle lungo la linea alba. Praticare una piccola incisione nel peritoneo usando un bisturi.
  4. PBS sterile luogo intriso di innesti di β-TCP/C schiuma (2 x 2 x 2 mm3) nella cavità peritoneale o senza aggiunto materiali per i topi di controllo di pari età sham.
  5. Sutura del peritoneo e della pelle con il suturare assorbibili e non assorbibili, rispettivamente.
  6. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
  7. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
  8. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Tornare topi completamente recuperati alla loro gabbie.
    Nota: Questa procedura induce dolore minimo. Terapia analgesica post-chirurgica non è solitamente necessaria. Se l'azionamento animali mostrano segni di dolore, inietta buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. o un altro farmaco analgesico appropriato per alleviare il dolore.
  9. post-L'impianto 7 giorni di topi, con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg i.p. xilazina di eutanasia
  10. Presso post-l'impianto di 7 giorni, il lavaggio della cavità peritoneale con un 1 mL siringa con un ago da 25 G per un totale di 3 mL di PBS freddo tenendo premuto il mouse testa e inserire l'ago nel quadrante addominale inferiore sinistro e mirare prossimalmente.
    Nota: Il liquido peritoneale deve essere libero di RBCs.
  11. Centrifugare il liquido di lavaggio peritoneale a 300 x g per 5 min a 4 ° C e raccogliere il liquido peritoneale per conservare a-20 ° C per misure in ELISA di citochine IL-1 β, il-2 e IL-4.
  12. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS contare le cellule peritoneali utilizzando trypan blu su un emocitometro.
  13. Citocentrifuga sospensione delle cellule alle cellule5 5 x 10 a vetrini, lasciare i vetrini asciugare e macchia per un conteggio differenziale delle cellule.
  14. Utilizzando un microscopio ottico, contare un minimo di 300 celle in totale e distinguere tra macrofagi, eosinofili, neutrofili e linfociti.

6. subcronica modello sottocutaneo

  1. Anestetizzare topi BALB/c femmina 6 – 8 settimane vecchio con una miscela di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg i.p. xilazina, aggiungere gel o pomata per gli occhi per tenerli umidi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'intera procedura per prevenire l'ipotermia. Valutare la profondità di anestesia di pizzico di punta e coda.
  2. Posizionare il mouse sul dorso, radere il pelo addominale e pulire la superficie rasata con 7,5% povidone iodio soluzione e 70% di etanolo.
  3. Fare un'incisione del midline lungo 8 mm attraverso la pelle lungo la linea alba dell'addome usando un bisturi e poi impianto PBS imbevuto biomateriale (2 x 2 x 2 mm3) sotto la pelle o non aggiungere nessun materiali per i topi di controllo di pari età sham.
  4. Suturare la pelle con una sutura non assorbibile.
  5. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con freddo sterilizzante per mantenere condizioni di sterilità prima di eseguire il prossimo intervento chirurgico su un mouse anestetizzato.
  6. Per il trattamento post-chirurgico, collocare gli animali su un piatto di riscaldamento pulito e asciutto a 37 ° C nella zona di chirurgia per monitoraggio appropriato durante il periodo di recupero. Monitorare la frequenza respiratoria, la temperatura corporea e il colore delle mucose e occhi ogni 10 min fino a quando si svegliano.
  7. Trasferire i topi coscienti operati in una gabbia con cibo e acqua separati dagli altri animali fino al completo recupero. Tornare topi completamente recuperati alla loro gabbie.
    Nota: Questa procedura induce dolore minimo. Terapia analgesica post-chirurgica non è solitamente necessaria. Se l'azionamento animali mostrano segni di dolore, inietta buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. o un altro analgesico appropriato.
  8. Al momento di esaminare il sito di impianto, eutanasia il i.p. di topi con una soluzione di 200 mg/kg ketamina e 24 mg/kg xylazina.
  9. post-L'impianto otto settimane, asportare il sito di impianto con circostante tessuto (1 cm2).
  10. Fissare il tessuto nella soluzione di formalina al 4,5% tamponato durante la notte, incorporare in paraffina e tagliati in 4 sezioni di µm.
  11. Macchia di 4 sezioni di tessuto paraffina-incastonato µm con ematossilina ed eosina (H & E) per infiammazione o di Masson tricromica per fibrosi e deposizione di collagene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per valutare la β-TCP per la sua efficacia come un biomateriale per riparazione ossea, abbiamo usato in vitro e in vivo i metodi di screening. In primo luogo, abbiamo misurato le risposte di OB per i dischi di β-TCP rispetto ai comandi da solo medio della linea di base. Nella figura 2 viene illustrato l'attuabilità di OB in risposta ai dischi di β-TCP alle 7 e 14 giorni di cultura. Attuabilità delle cellule misurata da cellule metabolicamente attive nei pozzetti cultura era lo stesso per OBs con supporto in plastica di coltura del tessuto così come con dischi di β-TCP che indica che questo biomateriale è valorizzare né sopprimere la proliferazione di OB.

Per valutare ulteriormente l'OBs, abbiamo misurato ALP attività come indicatore di differenziazione mediante approcci qualitativi e quantitativi. La figura 2 illustra l'attività dell'enzima ALP in pozzi di cultura dopo 7 giorni di cultura. OBs nei pozzetti con il mezzo da solo aveva attività ALP di base, mentre nella mineralizzazione ottimale medio (MM) OBs aveva ALP intensa colorazione, che riflettono un alto livello di differenziazione di OB. Al contrario, gli OB placcato su dischi di β-TCP differenziati meno di OBs incubati in MM. In un'analisi quantitativa, ALP concentrazione era 77% più alto per i pozzetti contenenti MM rispetto con il mezzo della linea di base da solo, mentre la concentrazione di ALP era 40% più basso nelle cellule coltivate su dischi di β-TCP rispetto ai controlli MM. Sebbene questi risultati dimostrano che le cellule coltivate su dischi di β-TCP differenziati meno rispetto a quelli con condizioni ottimali di plastica con MM, sono sufficientemente differenziate su biomateriali.

Un'altra caratteristica fondamentale di OBs è la loro capacità di indurre la mineralizzazione, che è un passaggio fondamentale nella guarigione ossea. Abbiamo macchiato le cellule coltivate di OB con ARS dopo 14 giorni e abbiamo trovato che quel mineralizzazione era più alto per i controlli MM rispetto al OBs coltivate in medium da solo e nei dischi di β-TCP in pozzi di cultura (Figura 2). Quando abbiamo misurato la concentrazione di ARS, abbiamo scoperto che i controlli MM erano più del 45% superiore al gruppo di β-TCP. Questi dati illustrano che OBs coltivate su plastica in presenza di MM maturo, differenziano e mineralizzano meglio di quelli con il mezzo da solo e su dischi di β-TCP.

Per determinare come OCs rispondere ai dischi di β-TCP, abbiamo utilizzato una tecnologia di coltura in cui OBs sono co-coltivate con precursori OC del midollo osseo seguiti dall'esame della morfologia OC. OB-OC co-culture sono state osservate in 5 giorni e hanno differito da sostanzialmente fra le cellule coltivate su plastica con OC DM e le cellule coltivate su fette di osso e β-TCP. Sulla plastica, l'OCs erano grande e diffusa mentre l'OCs su substrati fisiologici erano più piccole, meno-sparsi e irregolari (Figura 3). Per quantificare l'OCs, abbiamo enumerato TRAP + OCs e scoperto che c'erano i numeri più alti quando incubati con β-TCP (1755 ± 21,41/cm2) rispetto ai controlli di coltura tissutale (1140 ± 15,71/cm2) e fette di osso (709 ± 59.69/cm2), suggerendo una maggiore differenziazione di OC su dischi di β-TCP (Figura 3).

Per determinare una schiuma di β-TCP/C disponibili in commercio in vivo, abbiamo usato un modello di dimensioni critiche difetto calvarial nei topi. Vi mostriamo le sezioni istologiche rappresentante elaborate da una tecnica istologica undecalcified con glicole metil metacrilato incorporamento e Levai Laczko macchiatura. MicroCT e l'istologia può essere utilizzati per valutare la nuova formazione dell'osso all'interno dell'area di difetto. Qui, vi mostriamo un esempio con sezioni istologiche nella Figura 4. Quando il difetto osseo indotta chirurgicamente è stato lasciato vuoto (falsità), abbiamo osservato un sottile strato che copre l'intero difetto, ma nessuna formazione significativa dell'osso era presente alle 12 settimane post operazione conferma la dimensione critica della frattura dell'osso creato. Al contrario, quando il difetto contenute β-TCP/C schiuma, c'erano resti di β-TCP/C schiuma circondati da tessuto fibroso denso, tra cui alcuni vasi sanguigni e cellule infiammatorie colmare l'area di difetto senza prova di formazione dell'osso.

Per valutare la reazione da corpo estraneo, abbiamo valutato reazioni allergiche e immunologiche di biomateriali, usando un'analisi in vitro . Figura 5 viene illustrato che, quando ingenuo splenocytes sono state incubate con il mezzo da solo o con schiuma di β-TCP/C, le cellule di milza ingenuo non hanno risposto di proliferazione o la produzione del-2, IL-4 e citochine IFN-γ. Al contrario, in ConA contenente culture, proliferazione delle cellule e la produzione di citochina aumentato ad eccezione di IL-1 β. Le risposte delle cellule erano inalterato quando co-coltivate con ConA e schiuma di β-TCP/C rispetto a ConA da solo, che indica quella schiuma di β-TCP/C né risposte aumento né in diminuzione in vitro .

Per determinare se β-TCP/C schiuma ha indotto una risposta immunitaria in vivo , abbiamo impiantato 1) intraperitonealmente e misurato le concentrazioni di conteggi e citochina infiammatoria delle cellule nel liquido di lavaggio peritoneale e 2) per via sottocutanea e valutati infiammazione e fibrosi su sezioni istologiche del sito di impianto. Nella tabella 1, la cella differenziale nel liquido di lavaggio peritoneale rivela che il numero totale di cellule infiammatorie era significativamente più alto nei topi β-TCP/C schiuma impiantato rispetto ai comandi falsità. Inoltre, c'erano numeri aumentati di tutti i tipi di cellule. In Figura 6A, ci sono le più alte concentrazioni di citochine IL-1 β, il-2 e IL-4 nella schiuma β-TCP/C rispetto ai comandi falsità. Nei topi di β-TCP/C schiuma s.c. impiantato, abbiamo osservato una risposta infiammatoria con corpo estraneo cellule giganti su H & sezioni colorate con EE (Figura 6B) e prove di fibrosi su Trichrome di Masson macchiato sezioni (Figura 6) a 8 settimane. Al contrario, il sito di impianto dei controlli sham ha avuto infiammazione minima e nessuna fibrosi (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: rimozione di Calvaria per lo schema primario di isolamento di cella OB. Il diagramma illustra come rimuovere il calvarium con 4 tagli (linea rossa tratteggiata) utilizzando forbici curve. Il primo taglio è perpendicolare alla presa dell'occhio di destra (R) da X1 a X 2 e il secondo è perpendicolare alla presa dell'occhio di sinistra (L) da X3 a X 4. Il terzo taglio è quello di separare la volta cranica nella parte anteriore da X4 a X 2 e il quarto taglio consiste nel separare la parte posteriore da X3 a X 1. Calvarium è quindi libero di essere rimosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: β-TCP-indotta in vitro OB differenziamento e maturazione. OB vitalità e proliferazione nei giorni 7 e 14 per le cellule coltivate in media da solo (barre) o β-TCP (bar aperto) (media ± SEM; n = 3). Quantificazione di attività ALP dei lisati cellulari e la normalizzazione del contenuto di proteina (µM DIFMU / µ g proteine, media ± SEM, n = 3) con immagini rappresentative che illustrano la wells cultura ALP-macchiato dal giorno 7. Mineralizzazione quantificati da culture ARS-macchiato da un metodo di estrazione di cloruro di cetylpyridinium dimostrato come la concentrazione di ARS (µM ARS, media ± SEM, n = 3) con pozzi rappresentante cultura ARS-macchiato il giorno 14. I gruppi includono da solo mezzo di crescita ossea (BGM); Medio di mineralizzazione (MM); Β-TCP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: β-TCP-indotta in vitro differenziazione OC. Rappresentante microfotografie mostrano TRAP + MNCs giorno 5 dopo la co-coltura del mouse OBs e precursori OC del midollo osseo. Analisi di punto finale di TRAP + multinucleate (MNCs) dimostra il conteggio assoluto dei TRAP + MNC (≥ 3 nuclei) per cm2 (media ± SEM, n = 3) * * *p < 0,001. I gruppi comprendono differenziazione OC solo media (DM); Dell'osso; Β-TCP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: valutazione In vivo dell'osso di β-TCP/C schiuma innesti in un modello di dimensioni critiche difetto calvarial. Non-guarigione calvarial difetti creati in 8 - settimana-vecchio femmina BALB/c (n = 3) topi utilizzando un trapano dentale di 4 mm. Trattamento gruppi controllo sham incluso (difetto di vuoto) e difetti trattato con schiuma di β-TCP/C. Sezioni istologiche rappresentante preparate al post-impianto di 12 settimane. Sezioni di tessuto formalina-fisso glicole metil metacrilato-incastonate (80 – 100 µm) macchiato con colorante Levai Laczko. Microfotografie mostrati a bassa (a sinistra) e alto (a destra) ingrandimento. Triangoli neri indicano il difetto osseo. Nero * denota il tessuto osseo e bianco * si riferisce alla schiuma di β-TCP/C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: β-TCP/C schiuma-indotta in vitro delle cellule proliferazione produzione di citochina e. Splenocytes dai topi BALB/c ingenuo coltivati in medium da solo, con β-TCP/C schiuma o ConA. Proliferazione cellulare surnatante (BrdU) e produzione di IL-1 β, il-2, IL-4 e IFN-γ (medie solo ●, ○ ConA, schiuma di β-TCP/C ■, β-TCP/C schiuma e ConA □). Risultati di proliferazione presentati come la media dei campioni triplici (O.D. ± SEM) nell'analisi della BrdU e la media dei campioni duplicati (pg/mL ± SEM) per concentrazione di citochina da due esperimenti indipendenti. p < 0,05 è considerato significativo per biomateriale vs medio e biomateriale e ConA vs ConA da solo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: In vivo risposta immunitaria dell'osso di β-TCP/C schiuma innesti in un veloce throughput elevato i.p. e modello murino subcronica. (A) femmina BALB/c hanno impiantato i.p. con β-TCP/C schiuma o senza aggiunto materiali (falsità). Sette giorni più tardi, peritoneale il lavaggio analizzati per concentrazioni di citochina (dati presentati come media ± SEM di citochina concentrazioni pg/mL). Questi dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti (n = 5). p < 0,05 è considerato significativo rispetto al sham. (B-C) I topi femminili di BALB/c (n = 5) impiantato s.c. con β-TCP/C schiuma o senza aggiunto materiali (falsità). A 8 settimane dopo l'impianto, la pelle dai siti di impianto macchiati con H & E (B) e di Masson tricromica (C) per valutare l'infiammazione e fibrosi, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sham Vitoss
Cella conteggi x 106 (% delle cellule totali)
Macrofagi 1.240 ± 0,051 (88.1) 3.262 ± 0,380 (70,4) p < 0,001
Eosinofilo 0,120 ± 0,011 (8,5) 1.181 ± 0,254 (25,5) p < 0.01
Neutrofili ± 0.002 0.001 (0,2) 0,029 ± 0,011 (0,6) NS
Linfociti 0,048 ± 0,020 (3,2) 0,148 ± 0,041 (3,5) NS
Conteggio totale delle cellule 1.410 ± 0.066 4,620 ± 0.452 p < 0,001

Tabella 1: In vivo risposta immunitaria dell'osso di β-TCP/C schiuma innesti in un modello di topo i.p. rapida elevato throughput. Topi BALB/c femminili sono stati impiantati i.p. con β-TCP/C schiuma o senza materiali (falsità). Sette giorni più tardi, lavaggio peritoneale è stato ottenuto e analizzato per numero di cellule infiammatorie e conta cellulare differenziale (dati presentati come media delle cellule conteggi ± SEM). Questi dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui, ci mostrano un approccio multidisciplinare per la valutazione preclinica di biocompatibilità per biomateriali rappresentante sviluppato per la riparazione e rigenerazione ossea. Abbiamo testato le risposte di OBs, OCs, e la risposta di guarigione in vivo in un difetto critico dell'osso modello in topi come pure in vitro e in vivo le risposte immunitarie. Abbiamo mirato a dimostrare come le analisi lavoro e riepilogare i dati e le conclusioni derivate dall'esame dei biomateriali. Mostriamo che la nostra strategia genera un prezioso profilo della biocompatibilità di biomateriale osseo.

Analisi cellulari primarie sono state usate per valutare la funzione OB e OC. OBs sono responsabili della formazione dell'osso e una riparazione fisiologica. Devono rimanere vitali, differenziare e indurre la mineralizzazione. In questo studio, mostriamo come eseguire le analisi di attuabilità delle cellule, ALP e ARS come marcatori di cellule fisiologicamente differenziate con la capacità di mineralizzare. I controlli per i saggi inclusi medio da solo, che fornisce una previsione e osteogenica mineralizzazione medio (MM), che ottimizzato differenziazione e mineralizzazione di OBs su plastica. Il gruppo di controllo di quest'ultimo era un riferimento standard per il biomateriale. Per la valutazione di OC, abbiamo co-colture OBs e derivate da midollo osseo OC precursori, i precursori differenziate nelle cellule multinucleate, li macchiato con trappola, un enzima osteoclastic ampiamente utilizzato per identificare OCs in vitro15 e quindi enumerate le celle utilizzando la microscopia chiara. Queste analisi sono state-of-the-art e non richiede modifiche. Tuttavia, abbiamo notato una limitazione relazionata alla qualità di primario isolato OBs a mineralizzare. OBs conservati sono conservati nell'azoto liquido e utilizzato entro un anno per ottenere risultati ottimali.

Attività e allegati OB erano più alti sulla coltura del tessuto di plastica sui dischi β-TCP testato. Quando abbiamo valutato OCs, abbiamo osservato le differenze previste tra la risposta alla plastica e osso, che è il substrato fisiologico16. In confronto, osso e β-TCP indotto cambiamenti morfologici simili. L'enumerazione di dosaggio di trappola di OCs in risposta ai dischi del β-TCP ha mostrato che i numeri erano significativamente differenti tra fette di osso e β-TCP. Β-TCP ha indotto la differenziazione di OC superiore rispetto su fette di osso. Per la differenziazione di OC, trappola è un dosaggio ben consolidato. Non c'erano modifiche significative necessarie in questo metodo. Tuttavia, per ottenere i migliori risultati, è essenziale non Incubare le cellule per troppo tempo, o tutte le celle di origine monocytic diventerà TRAP-positivi.

Indirizzare la risposta in vivo , abbiamo usato il β-TCP/C schiuma come un biomateriale esemplare perché contiene β-TCP, che è stato utilizzato nel test in vitro e collagene e promuove13di guarigione ossea. Anche se β-TCP/C schiuma è commercialmente disponibile ed usata clinicamente per osso riparazione17,18, è solo uno dei diversi tipi di materiali che sarebbero interessanti studiare, ad es., (calcio fosfato bifasico idrossiapatite/β-TCP) anche come demineralizzato dell'osso umano in queste analisi per determinare le risposte biologiche come differiscono tra materiali. Per la risposta in vivo , abbiamo impiantato β-TCP/C schiuma in un difetto critico dimensioni osso calvarial in topi e 12 settimane più successivamente valutata istologia ed hanno evidenziato differenze rispetto ai comandi finti. È anche possibile valutare le risposte con microCT che fornisce informazioni gratuiti19. Il difetto nei topi di controllo sham ha avuto nessuna formazione significativa dell'osso, come previsto, mentre β-TCP/C schiuma ha indotto una risposta infiammatoria, la fibrosi e l'angiogenesi, che è la prova della fase in anticipo di formazione dell'osso. Questo metodo è stato dimostrato in precedenza in JOVE20. Tuttavia, il nostro approccio ha differito da in quanto abbiamo usato una tecnica modificata "ascensore" con un scollaperiostio per ridurre il rischio di ferire il mater di dura dal trephine. Abbiamo ragionato che il mater di dura svolge un ruolo significativo nel processo di guarigione dei difetti calvarial producendo cellule osteogeniche e osteoinduttive fattori3,21,22,23. In particolare, il materiale impiantato, le dimensioni del difetto e metodo per la creazione del difetto influenza la rigenerazione ossea di calvarial difetti. Un'altra modifica nella procedura ha coinvolto la stabilizzazione del biomateriale nel difetto calvarial con una colla di tessuto biocompatibile che ordinariamente è usato clinicamente per la chiusura della ferita. Questa modifica garantisce che il materiale nella zona di difetto non sarebbe essere spostato durante la guarigione.

L'infiammazione regola la fase iniziale di guarigione ossea, ma troppo infiammazione o risposte allergiche possono ridurre riparazione11. La risposta immunitaria ideale a biomateriali consiste nell'avviare una cascata infiammatoria che promuove la formazione ossea. Tuttavia, alcuni biomateriali potrebbero causare una reazione da corpo estraneo che conduce a una matrice dei segnali infiammatori che provocano fibrosi o sensibilizzazione allergica. Nei nostri studi, valutate le risposte immunitarie al β-TCP/C schiuma e trovato che non era tossico per le cellule di milza di ingenuo e non abbiamo interferire con l'espansione dei linfociti T o funzione (secrezione di citochine) quando aggiunto a culture con ConA. Negli esperimenti intraperitoneali, β-TCP/C schiuma indotto da infiammazione, e c'era qualche evidenza di un aumento dell'eosinofilia e macrofagi con concomitanti aumenti in citochine di tipo Th1 e Th2. Negli esperimenti l'impianto sottocutaneo, β-TCP/C schiuma inoltre ha indotto l'infiammazione, ma non ci era prova per le risposte infiammatorie o allergiche croniche, distruttive, che suggerisce che il β-TCP/C schiuma è biocompatibile. Questi modelli forniscono informazioni sulla risposta immunitaria a biomateriali. In primo luogo, il modello in vitro risolve l'effetto del biomateriale sulle cellule immuni ingenuo in presenza di un mitogeno per fornire la prova che non esiste nessuna soppressione della risposta mitogenica causata dal biomateriale. In secondo luogo, il modello intraperitoneale consente una lettura veloce 7 giorni del tipo di risposta immunitaria, ad es., allergiche e infiammazione come osservato dal tipo di infiltrazione delle cellule infiammatorie e il profilo di citochina. In terzo luogo, il modello sottocutaneo, subcronico illustra la risposta del tessuto su un periodo più lungo, permette per la valutazione dell'infiammazione cronica, fibrosi, i titoli dell'anticorpo e può essere utilizzato per verificare la ripetuta l'impianto per le risposte di memoria immunologica. Questi modelli sono stati precedentemente pubblicati e sono mostrati qui senza eventuali modifiche13. È fondamentale che ci sono opportuni controlli positivi e negativi per questi modelli. Suggeriamo di eseguire tutti i tre modelli per evitare le limitazioni di ciascun metodo. Mentre i modelli illustrati sono ben consolidati in altri settori dell'immunologia, l'approccio per testare biomateriali è recente.

In sintesi, osseo e immunitario saggi forniscono un profilo di compatibilità biologica su un biomateriale. Per l'osso, OB e OC risposte al biomateriale forniscono dati preliminari necessari prima di eseguire gli esperimenti sugli animali complicati e costosi e a rispettare il principio di 3Rs. Saggi immunologici in vitro forniscono dati sulla reattività crociata dell'antigene e citotossicità, che potrebbe anche precludere ulteriori esperimenti sugli animali. Gli esperimenti di throughput elevato rapida offrono risultati su infiammatoria e la risposta di citochina (ad es., tipo di risposte del linfocita T), mentre il modello subcronico è utile a causa di dati sulla durata dell'infiammazione e del potenziale per danneggiare fibrosi. Questo nuovo approccio interdisciplinare che comprende l'osso e le risposte immunitarie ai biomateriali offre un'eccellente valutazione pre-clinica di biocompatibilità per future applicazioni nel campo dei materiali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo progetto di ricerca ha ricevuto finanziamenti settimo programma dell'Unione europea quadro (FP7/2007-2013) sotto la concessione contratto n. 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

Bioingegneria problema 141 medicina rigenerativa biomateriali riparazione del tessuto scheletrico immunogenicità reazione da corpo estraneo in vitro in vivo
Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter