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Bioengineering

骨再生生物材料的生物相容性曲线

doi: 10.3791/58077 Published: November 16, 2018

Summary

为修复大型骨病变而设计的新型生物材料的数量不断增加, 目的是加强骨愈合和克服与骨移植相关的并发症。在这里, 我们提出了一个多学科战略的临床前生物相容性测试的生物材料骨修复。

Abstract

大型非联合骨折是骨科手术中面临的一个重大挑战。虽然自体和同种异体骨移植是很好的治疗这种病变, 有潜在的并发症与他们的使用。因此, 材料科学家正在开发合成的、生物相容性的生物材料, 以克服这些问题。在这项研究中, 我们提出了一个多学科平台, 用于评估生物材料的骨修复。我们结合骨生物学和免疫学的专业知识, 开发了一个平台, 包括体外破骨细胞 (oc) 和成骨细胞 (ob) 检测, 以及体内小鼠的修复、免疫原性和过敏性模型。我们演示了如何进行实验, 总结结果, 并报告生物材料的生物相容性。特别是, 我们在β-磷酸三钙 (β-tcp) 磁盘的背景下测试了 ob 的活力、分化、矿化和 oc 的活力和分化。我们还测试了β-tcp/胶原蛋白 (β-tcpcp) 泡沫, 这是一种商业上可用的材料, 用于临床骨修复在一个临界大小的骨缺损小鼠模型, 以确定对骨愈合早期阶段的影响。在平行实验中, 我们评估了小鼠的免疫和过敏反应。我们的方法生成了骨生物材料的生物相容性配置文件, 并提供了一系列必要的参数, 用于预测用于患者骨愈合和修复的生物材料的生物相容性。

Introduction

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骨修复是一个复杂的过程, 从血肿的形成, 炎症, 愈伤组织的形成, 然后重塑1,2开始。然而, 骨再生潜力仅限于骨骨折的大小 1,3。例如, 创伤、癌症或骨质疏松症造成的大骨折可能无法愈合, 被称为非联合骨折。这些骨损伤往往需要治疗, 以促进健康的生理骨修复和再生。目前, 自体移植和同种异体骨移植是首选4的方法, 每年220万例骨置换术5例。虽然这些手术的成功率很高, 但可能会出现并发症, 例如骨骼供应有限、感染、供体部位发病率和排斥4。目前正在寻求新的骨组织工程替代品, 以应对这些挑战。

6. 基于天然或合成聚合物、生物陶瓷或金属与细胞和生物活性分子相结合生物材料的设计正在兴起。我们目前对生物材料背景下的生理骨愈合和愈合的理解取决于多种因素, 如机械性能和多种局部和系统因素, 包括来自循环和骨折部位的细胞7 ,8,9。用于骨再生的生物材料旨在促进成骨性和骨整合10 , 具有理想的生物相容性、可生物降解性和多孔性 (促进细胞迁移、氧气和营养物质)。它们还需要足够强, 以支持骨折部位缓解疼痛。此外, 需要炎症因素来启动愈合过程。然而, 如果生物材料引起过度炎症和过敏反应, 这可能会限制或抑制骨愈合11,12。因此, 有必要采取跨学科的方法来评估为修复骨骼而开发的生物材料。

在这项研究中, 我们提出了一个临床前评价的代表性材料, 1) 正天玻璃泡沫, 这是一种市售的松质骨移植替代品, 由纳米粒大小的纯β-三钙组成的磷酸三钙磷酸盐 (β-tcp) 颗粒和1型牛胶原蛋白 (c) (β-tcpe 泡沫) 和 2) β-tcp 磁盘。在这里, 我们说明了这些生物材料的生物相容性测试使用原代成骨细胞 (ob) 和破骨细胞 (oc) 检测, 一个体内模型的修复, 免疫学评估包括体外t 淋巴细胞增殖和细胞因子的产生,以及体内的免疫原性和过敏性, 如先前报道的 13

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Protocol

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这些程序是根据奥地利教育、科学和研究部关于实验室动物的护理和使用的所有准则对 balb我小鼠进行的, 并得到奥地利教育、科学部道德委员会的批准和研究。

1. 原生小鼠 ob 培养

  1. 酶消化对新生小鼠钙质 ob 的分离
    1. 通过斩首使1-2天的新生儿幼崽 (共 60只) 安乐死, 并将头放在培养皿中, 无菌1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。
    2. 抓住头部的脖子, 用无菌剪刀把皮肤剪掉。用一把剪刀刺穿小腿 (约 0.1–0.3 mm), 然后将其插入头骨底部后脑勺的小腿下方, 沿着从耳朵上方向后到前面的小腿边缘侧切, 然后将它切割成 above 鼻桥 (图 1)。
    3. 用8毫升过滤灭菌消化液 (300 unitsl 胶原酶 iv 型和 2.14 unitssml) 进行分离在37°c 的 50 ml 锥形管中溶解在α-最小必要介质 (α-mL) 中的分离酶 ii, 在200摇摇的情况下, 在晃动的孵化器中10分钟/米姆
    4. 丢弃第一剂上清液, 用8毫升的消化液重复消化过程三次。在每个消化步骤后收集含有细胞的上清液, 并将其添加到50毫升的锥形管中。将50毫升的锥形管与细胞一起存放在冰水浴中, 直到消化过程 (约 40分钟) 完成。
    5. 在4°c 条件下, 以 300 x g 的速度将细胞离心 5分钟, 吸入上清液 (将巴斯德移液器连接到真空泵上), 并在含有α-mL 的40毫升骨生长介质 (bovine) 中重新悬浮, 其中含有10% 的热灭活胎牛血清 (fbs) 和1%青霉素链霉素溶液。然后在4个组织培养板 (10 厘米) 中加入10毫升的细胞悬浮液。
    6. 在37°c 和5% 的 co2 下培养细胞 , 直到融合 (2-3天)。
    7. 在融合时, 吸气旧培养基, 用 1x pbs (37°c) 清洗一次组织培养板。然后吸入 pbs, 并在每10厘米的组织培养板上加入含有0.5% 乙二胺四乙酸 (edta) 的1x 胰蛋白酶溶液2毫升。
    8. 在37°c 和 5% co2 下培养4个培养基 5分钟, 然后用倒置光学显微镜检查这些培养基, 以确保细胞与塑料分离。然后将所有细胞悬浮液 (共8毫升) 转移到含有10毫升新鲜 bgm 的50毫升锥形管。用5毫升的新鲜 bgm 清洗每个板材, 并转移到相同的50毫升锥形管。
    9. 在4°c 条件下, 以 300 x g离心细胞 5分钟, 吸吸上清液, 并将细胞重新悬浮在16毫升的新鲜 bgm 中。准备16个新的10厘米组织培养板 (分裂 1: 4), 含有9毫升的 bgm。在每个板中加入1毫升的细胞悬浮液。
    10. 重复步骤1.1.6。1.1.8。
    11. 在4°c 条件下, 以 300 x g离心细胞 5分钟, 吸吸上清液, 并在10毫升的新鲜 bgm 中重新悬浮。计算细胞并计算细胞浓度。
      注: 此过程生成大约 7.5–8.3 x10 5 cellss/pup。
    12. 在4°c 条件下以 300 x g离心 5分钟, 吸入上清液并在含有10% 亚甲基亚硫酸盐 (dmso)、40% α-mem 和 50% fbs 的冷冻介质中重新悬浮。将细胞悬浮液的1.5 毫升转移到2毫升的冷冻体, 每个小瓶总共有 2 x10 6 个细胞
    13. 闪液将小瓶冷冻在液氮中, 以便长期存放在液氮罐中。在一年内使用单元格, 以确保完整的功能。使用这些主要的 ob 来评估生物材料存在的增殖 (步骤 1.2)、分化 (alp 检测: 1.4., 1.5.) 和矿化 (步骤 1.6.)。使用这些细胞在共培养中成熟骨骨髓源 oc 前体 (步骤 2.3)。
  2. ob 增殖分析
    1. 在添加初级 ob 之前, 在37°c 的24井悬浮培养板和为24小时的24小时内, 在 bgm 的1毫升中预先孵育14毫米直径β-tcp 磁盘. 使用标准组织培养板进行控制, 并将悬浮培养板用于生物材料样品, 以 避免细胞附着在塑料上。
    2. 吸收孵育前培养基, 然后在 bgm 中重新悬浮原代小鼠 obs。在24井悬浮培养板中的预孵育β-tcp 磁盘上加入 4.4 x 10 4 obscm 2, 并将对照组添加到24孔组织培养板 (1 ml/井) 中。ob 将附着在组织培养板或生物材料上。
    3. 在37°c 和 5% co2 下孵化 14天.在潜伏期内, 每2-3天更换一次培养基, 并在每口井中添加1毫升新鲜的 bgm。
    4. 为了评估 ob 增殖, 在第7天和第14天将β-tcp 磁盘转移到新井, 以排除悬浮培养板上生长的细胞中的信号。
    5. 吸入旧培养基, 加入 0.5 ml 的 bgm (37°c), 在37°c 和 5% co 2 下孵育培养板 30分钟.然后将55μl 的10倍细胞增殖试剂 (1:10 稀释) 直接加入培养良好。对于空白, 准备三口含有 0.5 ml bgm 和 55μl 10倍细胞增殖试剂的井。在37°c 和 5% co 2 下将所有板材加氢 30分钟.
    6. 将每口井的上清液提取并转移 150μl, 进入96孔黑色板, 并在560纳米处进行激发, 在 590 nm 处发射荧光。从样本读数中减去空白读数。
  3. ob 分化和矿化检测
    1. 在添加 ob 之前, 在37°c 的24井悬浮培养板和为24小时的 5四分之一 co 2 中, 在 bgm 的1毫升中预先孵育14毫米直径β-tcp 磁盘. 使用标准的组织培养板进行控制, 并为生物材料样品使用悬浮培养板, 以避免细胞附件到塑料。
    2. 吸收孵育前培养基, 然后在 bgm 中重新悬浮原代小鼠 obs。在24井悬浮培养板中的预孵育β-tcp 盘上加入 8.8 x 10 4 obscm 2, 并将对照组加入24孔组织培养板 (1 ml/井)。ob 将附着在组织培养板或生物材料样品上。
    3. 将 bgm 替换为含有 bgm 的成骨矿化培养基 (mm) 1 毫升, 在加入 bs 24小时后, 在37°c 和 5% co2 下孵育 14天.每2-3天更换一次介质, 每口井都有1毫升新鲜准备的 mm。
  4. 细胞裂解物碱性磷酸酶 (alp) 活性评估的 ob 分化
    1. 在添加 mm 后第7天测量 alp 活性, 从井中抽吸培养基, 然后用1毫升的无菌 1x pbs (37°c) 进行洗涤。小心吸气 pbs, 使附着的细胞保持在组织培养塑料或生物材料上, 并将板材冻结在-80°c。
    2. 24小时 (或 2周) 后, 在室温下解冻对照组织培养板和生物材料悬浮液培养板, 为 ob 裂解做准备。对于生物材料样品, 将β-tcp 磁盘转移到一个新的悬浮培养板中, 以排除附着在板上的细胞。在两个板材中加入 75μl, 每井为1x 细胞裂解缓冲液。在400摇秒的振动台上摇动板5分钟。
    3. 将细胞裂解液转移到 0.5 ml 的微离心管和离心机中, 在 rt 以 300 x g的速度进行 6分钟, 以去除碎片。将样品细胞裂解中的上清液加入50μl 到96孔黑色板上, 然后加入50μl 的溶液, 该溶液包括 200μm 6、8-二-甲基溴化物基 (difup) 荧光基板, 溶解在 2倍 alp 缓冲液 (ph 值 10) 中。设置两个空白井, 其中含有1倍细胞裂解缓冲液和 2x alp 缓冲液, 为1:1 溶液的100μl。
    4. 用 6, 8-7-羟基-4-甲基香豆素 (difmu) 制备8种参考标准, 在含有1:1 细胞裂解缓冲液和 2x alp 缓冲液的12:1 溶液中溶解0.5 至 200μm, 以生成标准参考曲线。
    5. 在37°c 下将黑色板培养 15分钟, 然后在 358 nm 处用激发和 455 nm 发射读荧光。从参考标准和样本读数中减去空白读数。
    6. 用比色法测定蛋白质浓度, 将 alp 酶活性从细胞裂解物正常化为蛋白质总量。在溶解在1x 细胞裂解缓冲液中的范围内, 制定牛血清白蛋白 (bsa) 蛋白参考标准, 以生成标准曲线。
    7. 准备样品细胞裂解物和 bsa 蛋白质标准的副本。在96孔板中加入5μl 样品细胞裂解液或 5μl bsa 蛋白标准, 然后加入25μl 试剂 a ' 和200μl 试剂 b. 设置两个空白井, 具有5μl 的1x 细胞裂解缓冲液。在 rt 中加完板 15分钟, 然后阅读690纳米的吸收率。从参考标准和样本读数中减去空白读数。
  5. 染色 alp 在细胞培养中的卵细胞分化
    1. 在对照组织培养板和悬浮培养板上的生物材料上加入 mm 后的第7天, 在培养的 obs 中染色 alp。
    2. 从井中吸收培养基, 用 0.5 ml 的 1x pbs (37°c) 代替培养基。在 rt 中对 pbs 进行吸收, 并将其孵育 0.5 ml, 即10% 缓冲福尔拉林, 以1分钟的时间固定细胞。
    3. 用一次性移液器吸动10% 缓冲福尔拉林, 并添加0.5 毫升的洗涤缓冲液 (1x pbs 中的 0.05% twen20)。
    4. 在超纯水和涡流中溶解一种 5-溴-4-氯-3-二-二甲酰磷酸盐-硝基四唑 (bcip/nbt) 底片, 直到完全溶解。解决方案必须受到保护, 不受光线的影响, 并在2小时内使用。
    5. 将洗涤缓冲液吸吸, 更换 0.5 ml 的 bcip/nbt 底物溶液, 并在黑暗中孵育 rt 上的板 10分钟, 吸吸染色溶液, 代之以 0.5 ml 的洗涤缓冲液。
    6. 将染色β-tcp 磁盘转移到新的井中, 并使用传统的平板扫描仪扫描 alp 染色板, 以记录 alp 染色。
  6. 用 Alizarin 红 s (ars) 染色法评价 ob 成矿作用
    1. 在加入 mm 14天后, 从含有初级 obs 的井中提取培养基, 并在 rt 用 0.5 ml 的 1x pbs 冲洗两次. 在 rt 中加入10% 缓冲福尔沙蛋白溶液中的 0.5 ml, 固定细胞10分钟。
    2. 用一次性的琵车吸动10% 缓冲福尔马林, 用0.5 毫升的超纯水清洗两次。
    3. 在固定 obs 中, 加入溶于超纯水的 40 mm ars 染色溶液 (ph 4.2) 的 0.25 ml, 并在 100 x/分钟的振动台上将板在 rt 孵育10分钟。
    4. 用一次性的移液器对染色溶液进行吸气, 并用1毫升的超纯水冲洗。重复此步骤5-10 次, 以删除非特定的染色。
      注: 冲洗溶液应没有颜色。
    5. 吸吸超纯水, 加入1毫升的冷 pbs。在 rt 将盘子在100摇/分钟的振动台上加拿10分钟。
    6. 吸收 pbs, 将染色β-tcp 磁盘转移到新的井中, 并用平板扫描仪扫描印版, 以记录矿化。
    7. 加入10% 的木质吡啶氯化物溶液0.25 毫升, 在100莎士比亚/桶的振动台上在 rt 孵育板 15分钟, 提取 ars 染料。
    8. 将上清液转移到 1.5 ml 管和离心机, 在 rt 以 17, 000 x的速度进行5分钟。
    9. 在稀释比为1:10–1:20 的萃取物中加入10% 的乙酰吡啶氯化物溶液, 并将样品 (300μl) 添加到96孔板中, 其中包括两个只有10% 的氯化乙基吡啶的空白井。
    10. 通过稀释 40 mm ars 染色溶液 (ph 4.2) 和10% 的乙酰吡啶氯化物溶液, 准备7种从4到400μm 的 ars 参考标准, 以生成标准曲线。
    11. 在96孔板上添加300μl 的参考标准的副本。
    12. 阅读520纳米的样品、空白和参考标准的吸收率。
    13. 从参考标准和样本读数中减去空白读数。

2. 小鼠 ob-oc 共培养, 以衍生成熟的 oc

  1. 牛皮质骨片的制备与灭菌
    1. 清洁周围组织中的骨头片段, 去除小梁骨和骨髓。
    2. 在50°c 下擦干骨头24小时。
    3. 用带有钻石刀片的低速锯片将骨骼切成更小的块, 并将其切割成切片 (约300-350μm 厚)。
    4. 将300–350微米的切片切割成二次盘 (1 厘米2)。
    5. 要清洁骨盘 (1 厘米2), 请将其放入可上锁的玻璃小瓶中, 然后加入蒸馏水。将填充的玻璃小瓶放入超声波浴缸中, 并发出 5分钟, 重复此步骤3次。
    6. 将蒸馏水倒出, 加入70% 的乙醇, 并将声纳倒出5分钟。
    7. 将70% 的乙醇倒出, 用100% 乙醇代替。
      注: 将骨片在4°c 下100% 乙醇中存放长达4周。
    8. 在无菌条件下, 用紫外线照射骨片, 每一侧15分钟。将消毒的骨片存放在 rt 的无菌培养板中, 直至进一步使用。
  2. 骨髓 oc 前体的分离
    1. 使用腹腔内注射 200 mg kg 的氯胺酮和 24 mg kg xylazine 溶液, 对8-12周的 balbp 小鼠进行安乐死。
    2. 从小鼠股骨和胫骨分离骨髓 oc 前体。
    3. 用无菌剪刀从髋关节离身体最近的地方取下腿部, 在膝盖和脚踝关节处割伤四肢, 用无菌手术刀和钳子切除软组织。剪掉附生植物。用 1ml bgm 冲洗骨髓, 并将其悬浮到6厘米无菌培养皿中, 使用连接在1ml 注射器上的27g 针, 以获得细胞悬浮液。
    4. 将细胞悬浮液加入50毫升锥形管, 用5毫升的 bgm 清洗6厘米的培养皿, 并转移到相同的 50 ml 锥形管。在4°c 下以 350 x g离心 5分钟. 在含有 bgm、1 nm1、25-(oh)2-维生素 d3 和1μm 前列腺素 e2 (1 mlwell) 的 oc 分化培养基 (dm) 中重新移植细胞。
      注: 一只 balb1 鼠标为一个24井培养板提供了足够数量的 oc 前体。
  3. 小鼠 ob-oc 与生物材料共培养的制备
    1. 在37°c 的24口悬浮培养板和25°c 的悬浮培养板中, 在添加细胞前, 在 bovine 1 毫升中预孵育14毫米直径β-tcp 盘或牛骨片 (1 厘米2)。
      注: 牛骨片是研究生物材料存在的 oc 分化的生理基板控制组。
    2. 在生物材料或控制骨上加入 8.8 x10 4 细胞 2, 悬浮在 bgm 中, 在24口悬浮培养板或24孔组织培养板上。在37°c 和 5% co2 下培养 24小时.
      注: ob 附着在塑料或生物材料或牛骨上。
    3. 在24小时培养的原发性 obs 中加入新鲜分离的骨髓 oc 前体, 在37°c 和 5% co 2 下培养5天。每隔一天将介质更换为新鲜制备的 oc dm。然后对 oc 进行抗酒石酸磷酸酶 (trap) 染色, 以评价 oc 的分化。
  4. 通过 trap 染色评估的 oc 分化
    1. 对成熟的多核 oc 进行表征, 从步骤2.3.3 中提取培养培养基, 从对照组织培养板和生物材料悬浮培养板中提取培养培养基, 加入 1x pbs (37°c)。在 rt 中将 pbs 和细胞孵育在1毫升的10% 缓冲福尔拉林溶液中固定10分钟。
    2. 用一次性的移液器吸气10% 缓冲福尔拉林溶液, 并在 rt 上添加1ml 的 1x pbs. 重复这一步, 然后吸气 pbs, 用1毫升的 trap 缓冲液 (ph 5) 代替, 在37°c 孵育板30分钟。
    3. 吸入 trap 缓冲液, 加入1毫升的1:1 丙酮和100% 乙醇。在 rt 中提取板 30秒. 用一次性管道快速吸气丙酮乙醇溶液, 并在 rt 完全干燥板。
    4. 对于 trap 染色溶液, 在 n、n-二甲基甲酰胺中制备 10 mgml 环酚-as-mx 磷酸盐库存溶液, 在 trap 缓冲液中溶解 0.0.6 mg/ml 快速红紫色盐, 并在快速红白盐10毫升中加入 0.1 ml 的环烷醇-as-mx 磷酸盐库存溶液。在 trap 缓冲区中。
    5. 加入1毫升的 trap 染色液, 在37°c 孵育板 10分钟, 然后吸入 trap 染色液, 加入1毫升超纯水以阻止反应。
    6. 将β-tcp 盘和牛骨片染色后转移到新井中, 用光镜观察红色染色的 ocs (放大倍率: 10倍), 并列举具有三个或三个以上细胞核的 trap + 成熟的 ocs。

3. 临界大小的小鼠钙质缺陷模型

  1. 注射 0.1 mg kg 丁丙诺非 (例如: c.) 到8周大的 balb1 小鼠中进行镇痛。
  2. 在整个过程中, 用 100 mgkg 的氯胺酮和 5 mgkg xylazine i. p. 的混合物对小鼠进行麻醉, 在眼睛上加入凝胶或软膏, 使其保持湿润, 并将鼠标放在37°c 的加热板上, 以防止体温过低。通过脚趾和尾巴夹紧来评估麻醉深度。
  3. 将毛擦在耳朵之间的头顶上, 用7.5% 的聚维酮碘溶液和70% 的乙醇清洗表面。
  4. 用无菌手术刀在头骨顶部做一个中线矢状切口, 用无菌手术刀暴露小腿, 用手术刀刮伤右顶骨上方的周周结缔组织。
  5. 在右顶骨上创建一个非常大的缺陷, 使用直径为4毫米 (2000 rpm) 的无菌牙线, 在正常的盐水不断灌溉下, 对右顶骨进行缺口, 并穿过大旋骨和一些内旋。
  6. 为了防止对硬脑膜的损害, 使用一个小的骨膜电梯突破剩余的内旋, 小心地抬起小腿骨, 并用钳子将其取出。由此产生的缺陷应该是圆形的, 直径约为3.5 毫米。
  7. 用钳子用预浸泡 (rt 为 1x pbs) β-tcpc 泡沫填充钙质缺损。
  8. 准备适当数量的年龄匹配, 假的负控件与空缺陷。
  9. 为了保持生物材料的位置, 将0.5 微米的组织粘合剂放在缺陷边缘的两个相对点。
  10. 用不可吸收的缝合线缝合皮肤。
  11. 在对麻醉小鼠进行下一次手术之前, 用冷消毒剂清洁所有手术器械, 以保持无菌状态。
  12. 手术后治疗, 将动物放在手术区37°c 的干燥清洁加热板上, 以便在恢复期间进行适当的监测。每10分钟监测粘膜和眼睛的呼吸速率、体温和颜色, 直到它们苏醒。
  13. 将作的有意识的老鼠转移到一个笼子里 , 将食物和水与其他动物分开 , 直到完全恢复。每天两次, 用于手术后镇痛治疗, 每次 0.1 mg kg 丁丙诺非, 每次 72小时, 将完全恢复的小鼠送回笼子。
  14. 为了确定生物材料的有效性, 用 200 mg/kg kg 的氯胺酮和 24 mg/kg xylazine 的溶液对小鼠进行安乐死。
  15. 在植入后 8-12周, 用锋利的剪刀将安乐死的老鼠斩首。
  16. 将斩首的小鼠头固定在30毫升的4.5% 缓冲福尔拉林溶液中 1-2周, 以保证固定剂完全渗透到组织中。
  17. 将头部转移到70% 乙醇中, 以便在4°c 下长期储存长达一年。
  18. 使用微型计算机断层扫描 (微 ct) 或标准化的无咖啡因组织学技术来评估骨再生。可以在2d 和3d 矢状和正面平面上使用高分辨率 (90千伏, 4分钟) 的尸检样本进行微 ct 扫描。
  19. 对于未脱钙的组织学, 在乙醇的升度中脱水头, 并嵌入甲基丙烯酸乙二醇中。
  20. 用金刚石锯切割乙二醇甲基丙烯酸甲酯嵌块, 并将切片磨成大约80–100μm 的厚度。
  21. 评估莱瓦拉茨科染色骨切片, 以确定新的骨形成14

4.体外免疫反应

  1. 安乐死天真的8周大 balb1 小鼠 ip. p. 与溶液 200 mg kg 氯胺酮和 24 mg kg xylazine。
  2. 将鼠标放在右侧, 将毛皮剃在左侧, 并用70% 乙醇清洁腹部左侧的皮肤。
  3. 用不育的剪刀在左侧的鼠标皮肤上做一个10毫米长和1毫米深的切口, 后继腹部肋骨。
  4. 打开皮肤, 然后露出腹膜。在无菌条件下, 用剪刀将10毫米长、小于1毫米的切口插入腹膜。
  5. 将胃推近部以暴露脾脏。
  6. 用无菌钳轻轻握住脾脏, 并通过切割其下面的组织和血管将其取出。
  7. 将完整的脾脏放入含有10毫升冷1x 无菌 pbs 的50毫升管中。
  8. 用2个无菌钳或2个无菌玻璃滑块切碎脾脏, 准备一个单细胞悬浮液。
  9. 使用1毫升注射器的柱塞, 用冷的 1x pbs 通过无菌40μm 的细胞过滤器, 清除碎片。
  10. 在50°c 的温度下, 在50毫升锥形管中离心以 300 x g 的单细胞悬浮液 10分钟, 吸气并丢弃上清液。然后在红细胞 (rbc) 裂解缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
  11. 在 rt 中培养细胞悬浮液 14分钟, 并通过添加45毫升的罗斯威尔公园纪念研究所 (rpmi) 培养基停止反应。
  12. 细胞在300xg 的温度下在4°c 下裂解 10分钟后离心细胞, 然后丢弃上清液。
  13. 在 rpmi 培养基中复制脾细胞, 含有10% 的热灭活 fbs、1% 的青霉素链霉素溶液、0.1% 的庆大霉素、0.2% 的 z-甲酰氯乙醇和1% 的非必需氨基酸。
  14. 在细胞播种前, 在含有 rpmi 培养基的96孔无菌培养基中预培养β-tcpcp 泡沫, 时间为 24小时, 为 5%
  15. 以滴定数字添加脾细胞,例如1.25 x 105、2.5 x 105和 5 x 10 5 井, 在含有 rpmi 培养基和添加剂的96孔组织培养板中, 有或没有预先孵育β-tcpcp 泡沫.
  16. 加入 10μgml concanavalin a (con a) 溶于培养基, 总共为 100μl·well, 然后在37°c 孵育, 在25°c 孵育 5% co 2, 时间为 72小时.
  17. 用溴脱氧尿碱 (brdu) 法测量细胞增殖。在48小时的细胞培养条件下加入10μl/井的 brdu 标记溶液, 然后再孵育板24小时。
  18. 72小时, 收集上清液并储存在-20°c, 直到进一步使用。
  19. 在每口井中加入200μl/井, 然后在 rt 孵育30分钟。加入100μl/井抗 brdu 抗体工作溶液, 孵育90分钟。
  20. 吸入抗体溶液, 用200–300μl 井的洗涤液冲洗水井三次, 并取出洗涤液。
  21. 加入100μl 的基板溶液, 在 rt 孵育 3-10分钟, 然后测量450纳米的吸收率。
  22. 使用标准 elisa 测量收集的上清液中白细胞介素-1β (il-1β)、白细胞介素-2 (il-2)、白细胞介素-4 (il-4) 和干扰素γ (ifn-γ)。

5. 高吞吐量腹膜内模型

  1. 对6-8 龄的 balb1 小鼠进行麻醉, 混合 100 mg kg 氯胺酮和 5 mg/kg xylazine i. p., 并在眼睛上添加凝胶或软膏, 使它们保持湿润, 并在整个防止体温过低的过程中将鼠标放在37°c 的加热板上。通过脚趾和尾巴夹紧来评估麻醉深度。
  2. 用7.5% 的聚维酮碘溶液和70% 的乙醇清洗腹部毛皮和清洁。
  3. 在沿着白纹的皮肤上做一个8毫米长的中线切口。用手术刀在腹膜做一个小切口。
  4. 将无菌 pbs 浸泡的β-tcpcp 泡沫移植物 (2x2x2 mm 3) 放入腹腔或不添加材料, 用于年龄匹配的假对照小鼠.
  5. 用可吸收和不可吸收的缝合线缝合腹膜和皮肤。
  6. 在对麻醉小鼠进行下一次手术之前, 用冷消毒剂清洁所有手术器械, 以保持无菌状态。
  7. 手术后治疗, 将动物放在手术区37°c 的干燥清洁加热板上, 以便在恢复期间进行适当的监测。每10分钟监测粘膜和眼睛的呼吸速率、体温和颜色, 直到它们苏醒。
  8. 将作的有意识的老鼠转移到一个笼子里 , 将食物和水与其他动物分开 , 直到完全恢复。将完全恢复的老鼠送回笼子。
    注: 此过程可导致最小的疼痛。手术后镇痛治疗通常是不必要的。如果作的动物表现出疼痛的迹象 , 注射 0 . 1 mg / kg 丁丙诺非 s . c . 或另一种适当的止痛药来缓解疼痛。
  9. 植入后7天对小鼠进行安乐死, 溶液为 200 mg/kg 的氯胺酮和 24 mg/kg 的 xylazine i. p。
  10. 在植入后 7天, 用带有25g 针的1毫升注射器清洗腹腔, 通过按住小鼠头, 将针头插入左下腹象限并近端瞄准, 共3毫升的冷 pbs。
    注: 腹腔液应不含红细胞。
  11. 在4°c 条件下, 以 300 x g离心腹膜灌洗液 5分钟, 并收集腹膜液, 在-20°c 下储存, 用于 elisa 测量 il-1β、il-2 和 il-4 细胞因子。
  12. 吸吸上清液, 在 pbs 1 毫升中重新悬浮细胞颗粒, 并在血细胞仪上使用色氨酸蓝计数腹膜细胞。
  13. 将细胞悬浮液以 5 x10 5细胞的速度离心到玻璃滑梯上, 使滑块干燥并染色以进行差异细胞计数。
  14. 使用光学显微镜, 总共至少计数300个细胞, 并区分巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。

6. 亚慢性皮下模型

  1. 对女性6-8周大的 balb1 小鼠进行麻醉, 混合 100 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg xylazine i. p., 在眼睛上添加凝胶或软膏, 以保持它们湿润, 并将鼠标放在 37 c 的加热板上, 在整个过程中防止低温。通过脚趾和尾巴夹紧来评估麻醉深度。
  2. 将鼠标放在背上, 刮掉腹部皮毛, 用7.5% 的聚维酮碘溶液和70% 的乙醇清洗剃须的表面。
  3. 用手术刀在腹部的边缘上做一个8毫米长的中线切口, 然后在皮肤下植入 pbs 浸泡的生物材料 (2x2x2 mm 3), 或者为年龄匹配的假控制小鼠添加任何材料。
  4. 用不可吸收的缝合线缝合皮肤。
  5. 在对麻醉小鼠进行下一次手术之前, 用冷消毒剂清洁所有手术器械, 以保持无菌状态。
  6. 手术后治疗, 将动物放在手术区37°c 的干燥清洁加热板上, 以便在恢复期间进行适当的监测。每10分钟监测粘膜和眼睛的呼吸速率、体温和颜色, 直到它们苏醒。
  7. 将作的有意识的老鼠转移到一个笼子里 , 将食物和水与其他动物分开 , 直到完全恢复。将完全恢复的老鼠送回笼子。
    注: 此过程可导致最小的疼痛。手术后镇痛治疗通常是不必要的。如果作的动物表现出疼痛的迹象 , 注射 0 . 1 mg / kg 丁丙诺非 s . c . 或另一种适当的镇痛药。
  8. 当准备检查植入部位时, 用 200 mggg/kg 的氯胺酮和 24 mg/kg xylazine 的溶液对小鼠进行安乐死。
  9. 植入后 8周, 用周围组织 (1 厘米2) 切除植入部位。
  10. 将组织固定在4.5% 缓冲福尔拉林溶液中一夜, 嵌入石蜡中, 切割成4μm 的切片。
  11. 用血红素和 eosin (h & amp; e) 染色4μm 石蜡包埋组织切片, 用于炎症或马森的三色肌, 用于胶原蛋白沉积和纤维化。

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Representative Results

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为了评估β-tcp 作为骨修复生物材料的有效性, 我们在体外体内使用了筛选方法。首先, 我们测量了与基线介质单独控制相比, 我们对β-tcp 磁盘的 ob 响应。图 2显示了在培养的7天和14天时对β-tcp 磁盘的响应的 ob 可行性。从培养井代谢活性细胞中测定的细胞活力与组织培养塑料中的培养基 obs 相同, 与β-tcp 磁盘的细胞活力相同, 这表明这种生物材料既不能增强也不能抑制 ob 增殖。

为了进一步评价 obs, 我们用定性和定量的方法测量了 alp 活性作为分化的标志。图 2显示了培养7天后培养井中 alp 酶的活性。仅培养基井中的 ob 具有基线 alp 活性, 而最佳矿化介质 (mm) ob 有强烈的 alp 染色, 反映了较高的 ob 分化水平。相反, 在β-tcp 磁盘上镀金的 ob 比 mm 中培养的 ob 分化较少。在定量分析中, 含有 mm 的井的 alp 浓度比单独的基线培养基高出 77%, 而在β-tcp 磁盘上培养的细胞中, alp 浓度比 mm 对照低40%。尽管这些结果表明, 生长在β-tcp 磁盘上的细胞的分化小于那些具有最佳条件的塑料 mm, 他们充分分化在生物材料上。

obs 的另一个关键特征是它们诱导矿化的能力, 这是骨愈合的一个重要步骤。我们在14天后用 ars 染色培养的 ob 细胞, 发现 mm 对照组的矿化程度高于培养基中培养的 ob 细胞和培养井中β-tcp 盘的矿化度 (图 2)。当我们测量 ars 浓度时, 我们发现 mm 控件比β-tcp 组高45% 以上。这些数据表明, 在 mm 存在的情况下, 在塑料上培养的 ob 比单独在培养基和β-tcp 磁盘上培养的 ob 成熟、分化和矿化效果更好。

为了确定 oc 对β-tcp 磁盘的反应, 我们使用了一种培养技术, 在这种技术中, ob 与骨髓 oc 前体共同培养, 然后对 oc 的形态进行检查。在5天的时间里观察到 ob-oc 共培养, 在塑料上生长的细胞与在骨片和β-tcp 上生长的细胞有很大的差异。在塑料上, oc 体积大, 分布广泛, 而生理底物上的 oc 较小, 分布较小, 形状不规则 (图 3)。为了对公司进行量化, 我们列举了 trap + oc, 发现与组织培养控制 (1140±157cm 半) 和骨片 (709±59cm 2) 一起孵育时, 使用β-tcp (1755±21.4 英寸) 孵育时, 数量较多, 提示提高了β-tcp 磁盘上的 oc 分化 (图 3)。

为了在体内确定一种市售的β-tcpcp 泡沫, 我们在小鼠身上使用了一个临界大小的钙质缺陷模型。我们显示了具有代表性的组织学切片处理与乙二醇甲基丙烯酸甲酯包埋和莱赛拉茨科染色的非脱钙组织学技术。显微 ct 和组织学可用于评估缺损区域内的新骨形成。在这里, 我们展示了一个图4中的组织学部分示例。当手术引起的骨缺损为空 (假) 时, 我们观察到一层薄薄的覆盖整个缺损, 但在术后12周内没有明显的骨形成, 证实了所造成的骨折的临界大小。相反, 当缺陷中含有β-tcpcp 泡沫时, 就会有β-tcpcp 泡沫残留物, 周围有密集的纤维组织, 包括一些血管和炎症细胞, 在没有骨形成证据的情况下连接缺损区域。

为了评估异物的反应, 我们使用体外检测评估了生物材料的免疫学和过敏反应。图 5表明, 当单纯的脾细胞单独或使用β-tcpp-4 泡沫孵育时, 天真的脾脏细胞不会通过增殖或产生白细胞介素-2、il-4 和 ifn-γ细胞因子而产生反应。相反, 在含有培养物的 cona 中, 除 il-1β外, 细胞增殖和细胞因子的产生增加。与仅使用 cona 相比, 与 cona 共培养的β-tcpac/中, 细胞反应不受影响, 表明β-tcpac·马培泡沫在体外反应既没有增加也没有减少。

为了确定β-tcpcp 泡沫是否引起体内免疫反应, 我们将其植入腹腔内, 并测量了腹膜灌洗液中的炎症细胞计数和细胞因子浓度, 并进行了皮下评估在植入部位的组织学部分的炎症和纤维化。在表 1中, 腹腔灌洗液中的细胞差异显示, β-tcpc 泡沫植入小鼠的炎症细胞总数明显高于假对照组。此外, 所有细胞类型的数量都有所增加。在图 6a中, β-tcpc 泡沫中的 il-1β、il-2 和 il-4 细胞因子浓度高于假对照。在β-tcpcpe 泡沫. c. 植入小鼠中, 我们观察到 h & amp; e 染色部分 (图 6b) 上的异物巨细胞的炎症反应, 以及马松的三叶草染色部分 (图 6B) 在8周时纤维化的证据。相反, 假对照的植入部位有最小的炎症和没有纤维化 (图 6c)。

Figure 1
图 1: 主 ob 细胞隔离图的 calvaria 去除.该图说明了如何使用弯曲的剪刀去除4个切口 (红色虚线) 的钙。第一个切口从 x1 垂直到右 (r) 眼窝从 x1 到 x2, 第二个切割垂直于左 (l) 眼窝从 x3 到 x4。第三个切口是将前面的小腿从 x4 分离到 x2, 第四个切口是将后面从 x3 分离到 x1。然后, 可以自由地将其取出。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:β-tcp 诱导的体外ob 分化和成熟.在第7天和第14天单独培养的细胞 (酒吧) 或β-tcp (开放条) (平均±sem; n启示 3) 的 ob 活力和增殖。alp 活性对细胞裂解物进行定量, 并对蛋白质含量进行归一化 (μm difmuμg 蛋白, 平均值±sem, n = 3), 具有代表性的图像, 说明从第7天开始 alp 染色的培养井。在第14天用具有代表性的 ars 染色培养井的 ars 浓度 (μm ars, 平均±sem, n = 3) 测定从 ars 染色培养物中进行成矿化。群体包括单纯的骨骼生长 (bgm);矿化介质 (mm);β-tcp。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:β-tcp 诱导的体外oc 分化.具有代表性的显微照片显示, 在共同培养小鼠 obs 和骨髓 oc 前体后的第5天, trap + mnc。trap + 多核细胞 (mnc) 端点分析显示了每个厘米 2 (平均±sem, n = 3) * * * p & lt;0.001 的 trap + mnc (≥3核) 的绝对计数 。群体包括 oc 分化培养基 (dm);骨头;β-tcp。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 在临界大小的钙质缺损模型中, β-tcpcp 泡沫骨移植的体内评价.在8周大的雌性 balbc得小鼠中使用4毫米齿状的非法尼产生的非愈合性钙化缺陷 (n = 3)。治疗组包括假对照 (空缺损) 和使用β-tcpcp 泡沫治疗的缺陷。植入后12周处准备的代表性组织学切片。用 levai laczko 染料染色的福尔马林固定组织乙二醇甲基丙烯酸甲酯嵌入切片 (80–100μm)。在低 (左) 和高 (右) 放大倍率下显示的显微照片。黑色三角形表示骨骼缺陷。黑色 * 表示骨组织, 白色 * 指β-tcpcp 泡沫。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:β-tcpcp 泡沫诱导的体外细胞增殖和细胞因子的产生.用β-tcpc 泡沫或 cona 单独培养的天真的 balb1 小鼠的分裂细胞。取代液细胞增殖 (brdu), 生产 il-1β、il-2、il-4 和 ifn-γ (单独中等, cona 0, β-tcpc 泡沫, β-tcpc 泡沫和 cona--)。扩散结果是 brdu 测定中三段样品 (od.±sem) 的平均值, 以及两个独立实验中细胞因子浓度的重复样品 (pg/ll±sem) 的平均值。*p & lt;0.05 被认为对生物材料与介质和生物材料以及 cona 对 cona 的单独有重要意义。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: β-tcpcp 泡沫骨移植在快速高通量和亚慢性小鼠模型中的免疫反应.(a) 雌性 balb1 小鼠用β-tcpc 泡沫或没有添加材料 (假) 植入 ip. p.。七天后, 腹膜灌洗分析了细胞因子浓度 (数据显示为平均细胞因子浓度 pg/l±sem)。这些数据代表了两个独立的实验 (n = 5)。*假的相比, p & lt;0.05 被认为是重要的。(b-c)雌性 balb1 小鼠 (n = 5) 植入β-tcpcp 泡沫或无添加材料 (假)。在植入后 8周, 植入部位的皮肤分别用 h & amp; e (b) 和马尾松的三叶草 (c) 染色, 以评估炎症和纤维化。请点击这里查看此图的较大版本.

维托什
细胞计数 x10 6 (占细胞总数的百分比)
巨 噬 细胞 1.240±0.051 (88.1) 3.262±0.380 (70.4) p & lt;0.001
嗜 酸性 粒 细胞 0.120±0.11 (8.5) 1.181±0.254 (25.5) p & lt;0.01
中性 粒 细胞 0.002±0.001 (0.2) 0.029±0.11岁 (0.6) Ns
淋巴细胞 0.048±0.02 (3.2) 0.148±0.041 (3.5) Ns
单元格总数 1.410 ±0.366 4.620±0.452 p & lt;0.001

表 1:在体内β-tcpcp 泡沫骨移植在快速高通量小鼠模型中的免疫反应.用β-tcpc 泡沫或无材料 (假) 植入雌性 balb1 小鼠。七天后, 获得腹膜灌洗, 并对炎症细胞数量和差异细胞计数进行分析 (数据以平均细胞计数± sem 的形式显示)。这些数据代表了两个独立的实验 (n = 5)。

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Discussion

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在这里, 我们展示了一个多学科的方法, 临床前评估的生物相容性的代表性生物材料开发的骨再生和修复。我们在小鼠的关键骨缺损模型中以及在体外体内免疫反应中测试了 ob、oc 和体内愈合反应。我们的目的是证明如何进行检测, 并总结从生物材料的检验中得出的数据和结论。我们表明, 我们的策略产生了一个有价值的配置文件的骨生物材料生物相容性。

原代细胞检测用于评价 ob 和 oc 功能。ob 负责骨骼形成和生理修复。它们必须保持活力、分化和诱导矿化。在这项研究中, 我们展示了如何进行细胞活力、alp 和 ars 的检测, 作为具有矿化能力的生理分化细胞的标记。检测的对照包括单独进行的, 它提供了一个基线和成骨矿化培养基 (mm), 优化了 obs 在塑料上的分化和矿化。后一对照组是生物材料的参考标准。为了 oc 评估, 我们共同培养了 ob 和骨髓衍生的 oc 前体, 将前体分化为多核细胞, 用 trap 染色, 一种广泛用于体外鉴定 oc 的破碎屑酶, 然后进行了统计使用光学显微镜的细胞。这些检测是最先进的, 不需要修改。然而, 我们注意到一个限制的质量孤立的主要 ob 矿化。保留的 ob 存储在液氮中, 并在一年内使用, 以获得最佳效果。

组织培养塑料的 ob 附着和活性高于β-tcp 磁盘测试。当我们评估 occ 时, 我们观察到了对塑料和骨骼的反应的预期差异, 骨是生理底物 16。相比之下, 骨和β-tcp 引起了类似的形态变化。对β-tcp 磁盘的眼中气道进行的 trap 检测计数表明, 骨片和β-tcp 的数量有显著差异。β-tcp 诱导比骨片分化更高的 oc。对于 oc 分化, trap 是一种成熟的检测方法。此方法没有必要进行重大修改。然而, 为了获得最佳的结果, 重要的是不要孵育细胞太久, 否则所有单核细胞来源的细胞将成为 trap 阳性。

为了解决体内反应, 我们使用β-tcpcyc 泡沫作为一种示范性生物材料, 因为它包含β-tcp, 用于体外检测和胶原蛋白, 并促进骨愈合13。虽然β-tcpcp 泡沫是商业上可用的, 并在临床上用于骨修复17,18, 它只是许多不同类型的材料, 将感兴趣的研究之一,例如, 双相磷酸钙 (在这些检测中, 羟基磷灰石β-tcp) 以及脱盐的人骨, 以确定材料之间的生物反应有何不同。为了在体内的反应, 我们植入β-tcpcp 泡沫到一个关键大小的小鼠骨缺损, 12周后评估组织学, 并显示出与假对照的差异。也可以用提供免费信息19的微 ct 来评估响应。假对照小鼠的缺损没有明显的骨形成, 如预期的那样, 而β-tcpcp 泡沫诱导炎症反应, 纤维化和血管生成, 这是骨形成早期阶段的证据。此方法以前已在 jove20 中演示过。然而, 我们的方法不同的是, 我们使用了一个修改的 "电梯" 技术与骨膜电梯, 以减少伤害硬脑膜的风险。我们推断, 硬脑膜在导致成骨细胞和骨诱导因子 3,21,22, 23愈合过程发挥着重要作用。值得注意的是, 植入的材料、缺陷的大小和产生缺陷的方法会影响钙质缺损的骨再生。该程序的另一个修改涉及稳定的生物材料在钙质缺陷与生物相容性组织胶, 通常用于临床用于伤口闭合。这种修改保证了缺陷区域中的材料在愈合过程中不会被移位。

炎症调节骨愈合的早期阶段, 但过多的炎症或过敏反应可能会减少修复11。对生物材料的理想免疫反应是启动一个炎症级联, 促进骨形成。然而, 某些生物材料可能会导致异物反应, 导致一系列炎症信号, 导致纤维化或过敏性过敏。在我们的研究中, 我们评估了β-tcpcp 泡沫的免疫反应, 发现它对天真的脾脏细胞无毒, 在与 cona 培养物中添加时不会干扰 t 淋巴细胞的扩张或功能 (细胞因子分泌)。在腹腔内实验中, β-tcpcp 泡沫引起炎症, 有一些证据表明嗜酸性粒细胞增多, 而 th1 型和 th2 型细胞因子也随之增加。在皮下注射实验中, β-tcpc 泡沫也会引起炎症, 但没有证据表明存在慢性、破坏性的炎症或过敏反应, 这表明β-tcpc 泡沫具有生物相容性。这些模型提供了有关生物材料的免疫反应的信息。首先,体外模型讨论了生物材料对存在丝分裂原的天真免疫细胞的影响, 以提供证据, 证明没有抑制生物材料引起的有丝分裂反应。其次, 腹腔内模型提供了一个快速7天读出的免疫反应的类型,例如, 过敏性和炎症, 观察到的炎症细胞浸润类型和细胞因子的轮廓。第三, 皮下, 亚慢性模型说明组织反应在一个较长的时期, 允许评估慢性炎症, 纤维化, 抗体滴度, 并可用于测试重复植入的免疫记忆反应。这些模型以前已经发布, 并显示在这里没有任何修改13。至关重要的是, 要对这些模式有适当的消极和积极的控制。我们建议执行所有三种模型, 以避免每种方法的局限性。虽然所显示的模型在免疫学的其他领域已经建立, 但生物材料的检测方法是最近才出现的。

总之, 骨骼和免疫检测提供了生物材料的生物相容性简介。对于骨骼, ob 和 oc 对生物材料的反应提供了在进行复杂和昂贵的动物实验之前所需的初步数据, 并坚持3Rs 原则。体外免疫学检测提供了有关抗原交叉反应性和细胞毒性的数据, 这也可能排除进一步的动物实验。快速高通量实验提供了炎症和细胞因子反应的结果 (例如, t 淋巴细胞反应的类型), 而亚慢性模型是有用的, 因为关于炎症持续时间和潜在的破坏性的数据纤维 化。这种新颖的跨学科方法包括骨骼和生物材料的免疫反应, 为未来在材料领域的应用提供了出色的临床前生物相容性评估。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

根据263363赠款协议, 该研究项目得到了欧洲联盟第七个框架方案 (fp任何作为 2007-2013年) 的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

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References

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骨再生生物材料的生物相容性曲线
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Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

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