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Bioengineering

जैव भौतिक हड्डी पुनर्जनन के लिए सामग्री पर संगतता प्रोफ़ाइल

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

बड़े हड्डी घावों की मरंमत के लिए इंजीनियर के उपंयास की संख्या लगातार हड्डी चिकित्सा बढ़ाने और अस्थि प्रत्यारोपण के साथ जुड़े जटिलताओं को दूर करने के उद्देश्य के साथ विस्तार हो रहा है । यहां, हम अस्थि की मरंमत के लिए पूर्व नैदानिक के लिए एक multidisciplinary रणनीति के साथ-साथ गैर-चिकित्सीय असंगति परीक्षण प्रस्तुत करता है ।

Abstract

बड़े गैर संघ अस्थि भंग आर्थोपेडिक सर्जरी में एक महत्वपूर्ण चुनौती है । हालांकि ऑटो और allogeneic हड्डी भ्रष्टाचार इस तरह के घावों के उपचार के लिए उत्कृष्ट हैं, उनके उपयोग के साथ संभावित जटिलताओं हैं । इस प्रकार, सामग्री वैज्ञानिक इन समस्याओं को दूर करने के लिए सिंथेटिक, संगत सामग्री विकसित कर रहे हैं । इस अध्ययन में, हम हड्डी की मरंमत के लिए एक multidisciplinary मंच के मूल्यांकन के लिए सामग्री प्रस्तुत करते हैं । हम अस्थि जीवविज्ञान और इम्यूनोलॉजी से विशेषज्ञता संयुक्त करने के लिए सहित इन विट्रो अस्थिशोषक (OC) और osteoblast (ओबी) परख में एक मंच विकसित करने के लिए और vivo में हड्डी की मरंमत के माउस मॉडल, immunogenicity, और allergenicity । हम प्रदर्शन कैसे प्रयोग करने के लिए, परिणाम संक्षेप, और पर रिपोर्ट करने के लिए सामग्री विशेष रूप से, हम β-tricalcium फॉस्फेट (β-TCP) डिस्क के संदर्भ में ओबी व्यवहार्यता, विभेद, और mineralization और ओसी व्यवहार्यता और भेदभाव का परीक्षण किया । हम यह भी परीक्षण एक β-tcp/कोलेजन (β-tcp/C) फोम जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हड्डी की मरंमत के लिए नैदानिक एक महत्वपूर्ण आकार calvarial हड्डी दोष माउस मॉडल में अस्थि चिकित्सा के प्रारंभिक चरण पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया सामग्री है । समानांतर प्रयोगों में, हम प्रतिरक्षा और चूहों में एलर्जी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया. हमारे दृष्टिकोण अस्थि चिकित्सा और रोगियों में मरंमत के लिए इस्तेमाल किया जैव सामग्री की असंगति की भविष्यवाणी के लिए आवश्यक मानकों की एक सीमा के साथ एक हड्डी के एक जैविक अनुकूलता प्रोफ़ाइल उत्पंन करता है ।

Introduction

अस्थि मरंमत एक जटिल प्रक्रिया है कि रक्तगुल्म गठन, सूजन, घट्टा गठन के साथ शुरू होता है और फिर remodeling1,2है । हालांकि, अस्थि पुनर्जनन क्षमता हड्डी फ्रैक्चर1,3के आकार तक ही सीमित है । उदाहरण के लिए, आघात, कैंसर या ऑस्टियोपोरोसिस की वजह से बड़ी हड्डी फ्रैक्चर ठीक नहीं हो सकता है और गैर संघ हड्डी भंग हो जाता है । इन अस्थि घावों अक्सर उपचार की आवश्यकता को बढ़ावा देने के लिए स्वस्थ शारीरिक हड्डी की मरंमत और पुनर्जनन । वर्तमान में, भ्रष्टाचार और allograft हड्डी ट्रांसप्लांटेशन5की २,२००,००० अस्थि प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के साथ पसंद4 के दृष्टिकोण है । हालांकि इन प्रक्रियाओं को एक उच्च सफलता दर है, वहां जटिलताओं हो सकता है, उदाहरण के लिए, अस्थि की सीमित उपलब्धता, संक्रमण, दाता साइट रुग्णता, और अस्वीकृति4. अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए नए विकल्प इन चुनौतियों का पता मांगा जा रहा है ।

प्राकृतिक या सिंथेटिक पॉलिमर, चीनी मिट्टी की चीज़ें या कोशिकाओं और सक्रिय अणुओं के साथ संयोजन में धातुओं के आधार पर सामग्री के डिजाइन वृद्धि6पर है । हमारे शारीरिक हड्डी हीलिंग और भौतिक चिकित्सा के संदर्भ में उपचार के वर्तमान समझ यांत्रिक गुणों और कई स्थानीय और संचलन और फ्रैक्चर साइट 7 से कोशिकाओं सहित प्रणालीगत कारकों के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है ,8,9. अस्थि पुनर्जनन उद्देश्य के लिए osteogenicity और osseointegration10 को बढ़ावा देने के लिए और आदर्श रूप से, संगत biodegradable, और छिद्रित (सेल प्रवास, ऑक्सीजन को बढ़ावा देने, और पोषक तत्वों) । वे भी दर्द को राहत देने के लिए फ्रैक्चर साइट का समर्थन करने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत होने की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, भड़काऊ कारकों चिकित्सा प्रक्रिया शुरू करने के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, अगर अत्यधिक सूजन और एलर्जी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं, यह सीमा या अस्थि चिकित्सा बाधित11,12हो सकता है । इस प्रकार, एक अनुशासनात्मक दृष्टिकोण के लिए अस्थि की मरंमत के लिए विकसित की है कि भौतिक मूल्यांकन आवश्यक है ।

इस अध्ययन में, हम एक पूर्व प्रतिनिधि सामग्री के नैदानिक मूल्यांकन, 1) Orthovita Vitoss फोम जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रद्द हड्डी भ्रष्टाचार tricalcium फॉस्फेट नैनोमीटर की रचना से मिलकर विकल्प है-शुद्ध β-tricalcium फॉस्फेट (β-tcp) कणों और प्रकार 1 गोजातीय कोलेजन (c) (β-tcp/c फोम) और 2) β-tcp डिस्क. यहां, हम इन के लिए प्राथमिक osteoblast (ओबी) और अस्थिशोषक (OC) परख, का उपयोग कर इन भौतिकता की संगतता परीक्षण उदाहरण देकर स्पष्ट करना, एक vivo में हड्डी की मरंमत के मॉडल, एक प्रतिरक्षा आकलन में शामिल इन विट्रो टी लिम्फोसाइट प्रसार और cytokine उत्पादन, और vivo immunogenicity और allergenicity में, के रूप में पहले13की रिपोर्ट ।

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Protocol

प्रक्रियाओं बालब के साथ किया गया/सी चूहों की देखभाल और ऑस्ट्रिया के शिक्षा, विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय के पशुओं के उपयोग के लिए सभी दिशा निर्देशों का पालन और ऑस्ट्रिया के शिक्षा मंत्रालय, विज्ञान की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित और अनुसंधान ।

1. प्राथमिक माउस ओबी संस्कृति

  1. एंजाइमी पाचन का उपयोग नवजात माउस calvaria से ओबी अलगाव
    1. Euthanize 1-2 दिन पुराने नवजात पिल्ले (६० कुल में) decapitation द्वारा और बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ एक पेट्री डिश में सिर जगह है ।
    2. गर्दन के पार्श् द्वारा सिर पकड़ो, और त्वचा को दूर बाँझ कैंची का उपयोग काट । Incise calvarium यह (लगभग 0.1-0.3 mm) कैंची की एक जोड़ी है कि फिर खोपड़ी के आधार पर सिर के पीछे में calvarium के नीचे डाला जाता है और बाद में वापस से कान के ऊपर सामने से calvarial बढ़त के साथ काट के साथ भेदी द्वारा और फिर एबोव ई नाक ब्रिज (चित्रा 1) ।
    3. फिल्टर के 8 मिलीलीटर निष्फल पाचन समाधान (३०० इकाइयों/एमएल collagenase प्रकार चतुर्थ और २.१४ इकाइयों/एमएल dispase द्वितीय में भंग के साथ calvariaing विदारक α-न्यूनतम आवश्यक माध्यम (α-मेम)) में एक ५० एमएल शंकु ट्यूब में ३७ ° c एक मिलाते हुए मशीन में 10 मिनट के लिए २०० पर हिलाता है लैंडलाइंस.
    4. पहले supernatant को छोड़ें और पाचन प्रक्रिया को तीन बार 8 मिलीलीटर पाचन समाधान के साथ दोहराएं । प्रत्येक पाचन चरण के बाद कोशिकाओं से युक्त supernatant लीजिए और इसे एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जोड़ें । पाचन प्रक्रिया (लगभग ४० मिनट) पूरा हो गया है जब तक एक बर्फ जल स्नान में कोशिकाओं के साथ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब की दुकान ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant (एक वैक्यूम पंप से जुड़ी एक पाश्चर पिपेट के साथ) और हड्डी विकास मध्यम (BGM) युक्त α-मेम के साथ 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1% के ४० मिलीलीटर में resuspend पेनिसिलिन-streptomycin समाधान । फिर 4 टिशू कल्चर प्लेट्स (10 सेमी) के लिए सेल सस्पेंशन की 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह संगम (2-3 दिन) तक2 पर कोशिकाओं ।
    7. संगम पर, पुराने मीडियम को महाप्राण करें और 1x पंजाबियों (३७ डिग्री सेल्सियस) के साथ टिशू कल्चर प्लेट्स को एक बार धो लें । फिर पंजाबियों महाप्राण और प्रत्येक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट के लिए ०.५% ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त 1x trypsin समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    8. 5 मिनट के लिए ३७ ° c और 5% CO2 में 4 संस्कृति प्लेटें और फिर एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ प्लेटों की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को प्लास्टिक से अलग कर रहे हैं । इसके बाद सभी सेल सस्पेंशन (कुल 8 एमएल) को ५० एमएल शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर कर 10 मिलीलीटर ताजा BGM । प्रत्येक प्लेट को ताजे BGM के 5 मिलीलीटर के साथ धोएं और उसी ५० एमएल शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant और ताजा BGM के 16 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । 16 नए 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट (विभाजन 1:4) BGM के 9 मिलीलीटर युक्त तैयार करें । प्रत्येक प्लेट में सेल सस्पेंशन की 1 मिलीलीटर डालें ।
    10. दोहराएँ चरण 1.1.6. ते 1.1.8.
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant और ताजा BGM के 10 मिलीलीटर में resuspend । कोशिकाओं गिनती और सेल एकाग्रता की गणना ।
      नोट: यह प्रक्रिया लगभग 7.5 – 8.3 x 105 कोशिकाओं/पिल्ला उत्पंन करता है ।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant और 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), ४०% α-मेम और ५०% FBS युक्त मध्यम ठंड में resuspend । सेल सस्पेंशन के १.५ एमएल को 2 एमएल cryovials के लिए कुल 2 x 106 कोशिकाओं प्रति शीशी के लिए स्थानांतरण ।
    13. फ्लैश एक तरल नाइट्रोजन टैंक में लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में शीशियों फ्रीज । पूर्ण कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए एक वर्ष के भीतर कक्षों का उपयोग करें । प्रसार के मूल्यांकन के लिए इन प्राथमिक OBs का प्रयोग करें (चरण १.२), विभेद (ALP परख: चरण १.४., १.५.) और mineralization (चरण १.६.) की उपस्थिति में । अस्थि मज्जा की परिपक्वता के लिए इन कोशिकाओं का प्रयोग करें-सह-संस्कृति में OC पुरोगामी व्युत्पंन (चरण २.३) ।
  2. ओबी प्रसार परख
    1. पूर्व-गर्मी 14 मिमी व्यास β-BGM के 1 मिलीलीटर में एक 24-well निलंबन संस्कृति प्लेट में ३७ ° c और 5% सह प्राथमिक OBs जोड़ने से पहले 24 ज के लिए2 % CO. का उपयोग करें मानक ऊतक संस्कृति प्लेटें के लिए नियंत्रण और निलंबन संस्कृति प्लेटें के लिए प्लास्टिक के लिए सेल लगाव से बचें ।
    2. महाप्राण पूर्व-मशीन मध्यम और उसके बाद BGM में प्राथमिक माउस OBs resuspend । जोड़ें ४.४ x 104 OBs/सेमी2 पर पूर्व-मशीन्ड β-TCP डिस्क में 24-well suspension कल्चर प्लेट और नियंत्रण समूह के लिए, एक 24-well टिशू कल्चर प्लेट में (1 मिलीलीटर/ OBs ऊतक संस्कृति थाली या सामग्री के लिए संलग्न करेंगे ।
    3. ३७ ° c और 5% सह2पर 14 दिनों के लिए मशीन । मशीन अवधि के दौरान, मध्यम हर 2-3 दिन में परिवर्तन और एक अच्छी तरह से ताजा BGM के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. ओबी प्रसार का आकलन करने के लिए, 7 और 14 दिनों पर β-TCP डिस्क स्थानांतरित करने के लिए नए कुओं निलंबन संस्कृति प्लेट पर उगाया कोशिकाओं से संकेतों को बाहर करने के लिए.
    5. पुराने माध्यम महाप्राण, BGM (३७ डिग्री सेल्सियस) के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर 30 मिनट के लिए संस्कृति प्लेटें । फिर सीधे संस्कृति में अच्छी तरह से 10x सेल प्रसार एजेंट (1:10 कमजोर पड़ने) के ५५ µ एल जोड़ें । रिक्तियों के लिए, BGM के ०.५ मिलीलीटर और 10x कोशिका प्रसार रिएजेंट के ५५ µ एल युक्त तीन कुओं तैयार करते हैं । ३७ ° c और 5% CO2पर 30 मिनट के लिए सभी प्लेट्स की मशीन ।
    6. वापस लेने और एक अच्छी तरह से काले रंग की थाली में हर तरह से supernatant के १५० µ एल हस्तांतरण और ५६० एनएम और ५९० एनएम में उत्सर्जन पर उत्तेजना के साथ प्रतिदीप्ति पढ़ें । नमूना रीडिंग से रिक्त रीडिंग घटाना.
  3. ओबी विभेद और mineralization की परख
    1. पूर्व-मशीन 14 मिमी व्यास β-BGM के 1 मिलीलीटर में एक 24-well निलंबन संस्कृति की थाली में ३७ ° c और 5% सह OBs जोड़ने से पहले 24 ज के लिए2 % CO. का उपयोग करें मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों के लिए नियंत्रण और निलंबन संस्कृति प्लेटें से बचने के लिए सेल लगाव प्लास्टिक के लिए ।
    2. महाप्राण पूर्व-मशीन मध्यम और उसके बाद BGM में प्राथमिक माउस OBs resuspend । जोड़ें ८.८ x 104 OBs/सेमी2 पर पूर्व-मशीन्ड β-TCP डिस्क में 24-well suspension कल्चर प्लेट और नियंत्रण समूह के लिए, एक 24-well टिशू कल्चर प्लेट में (1 मिलीलीटर/ OBs टिशू कल्चर प्लेट या फिर रिमटेरियल सैंपल को अटैच करेंगे ।
    3. BGM की 1 मिलीलीटर के साथ बदलें osteogenic mineralization मध्यम (मिमी) युक्त BGM, ५० µ जी/एमएल ascorbic एसिड और 5 मिमी β-glycerophosphate के अलावा के बाद 24 ज OBs और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर 14 दिनों के लिए मशीन । प्रत्येक कुआं को 1 मिलीलीटर के साथ हर 2-3 दिन में मध्यम रूप से तैयार करें ।
  4. lysates कक्ष से क्षारीय फॉस्फेट (ALP) गतिविधि द्वारा मूल्यांकन ओबी विभेदन
    1. मिमी के अलावा 7 दिन पर ALP गतिविधि को मापने के लिए, कुओं से संस्कृति माध्यम महाप्राण और फिर बाँझ 1x पंजाबियों (३७ डिग्री सेल्सियस) की 1 मिलीलीटर से धो लो । ध्यान रहे कि पंजाबियों को टिशू कल्चर प्लास्टिक या महाप्राण पर रहने के लिए संलग्न कोशिकाओं की अनुमति दें और-८० डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें फ्रीज करें ।
    2. 24 घंटे (या 2 सप्ताह तक) के बाद, गल कंट्रोल टिशू कल्चर प्लेट और lysis के लिए तैयार करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर एक भौतिक निलंबन संस्कृति प्लेट । इस सामग्री के नमूनों के लिए, β-TCP डिस्क एक नया निलंबन संस्कृति प्लेट में प्लेट से जुड़ी कोशिकाओं को बाहर करने के लिए स्थानांतरण । दोनों प्लेटों के लिए 1x सेल lysis बफर के प्रति अच्छी तरह से ७५ µ एल जोड़ें । ४०० में एक शेखर पर 5 मिनट के लिए प्लेट हिला हिलाता है/
    3. एक ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सेल lysate स्थानांतरण और 6 मिनट के लिए RT पर ३०० x g पर मलबे को हटाने के लिए केंद्रापसारक । एक ९६-अच्छी तरह से काली प्लेट के लिए नमूना सेल lysate supernatant के ५० µ एल जोड़ें और फिर २०० µ एम 6, 8-difluoro-4-methylumbelliferyl फॉस्फेट (DiFMUP) fluorogenic सब्सट्रेट 2x ALP बफर में भंग (पीएच 10) के प्रति अच्छी तरह से मिलकर एक समाधान के ५० µ एल जोड़ें । एक 1:1 1x सेल lysis बफर और 2x ALP बफर युक्त समाधान के १०० µ एल के साथ दो खाली कुओं की स्थापना की ।
    4. 6, 8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) ०.५ से २०० माइक्रोन के साथ १०० μL के साथ 8 संदर्भ मानकों तैयार 1x सेल lysis बफर और 2x ALP बफर युक्त समाधान में भंग एक मानक संदर्भ वक्र उत्पंन करने के लिए ।
    5. 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर काली प्लेट की मशीन और फिर ३५८ एनएम और ४५५ एनएम में उत्सर्जन पर उत्तेजना के साथ प्रतिदीप्ति पढ़ें । संदर्भ मानकों और नमूना रीडिंग से रिक्त रीडिंग घटाना.
    6. सामांय प्रोटीन एकाग्रता के लिए एक वर्णमिति परख का उपयोग कर की कुल राशि के लिए सेल lysates से ALP एंजाइम गतिविधि । एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए 1x सीरम एल्ब्युमिन (BSA) प्रोटीन संदर्भ मानकों को 0.05 – 2.5 µ g/µ l से एक सीमा में विच्छेदित करें ।
    7. नमूना सेल lysates और BSA प्रोटीन मानकों को डुप्लिकेट में तैयार करें । नमूना सेल lysate के 5 µ एल जोड़ें या BSA प्रोटीन मानक के 5 µ एल एक ९६-अच्छी तरह से थाली में जोड़ें और फिर एक एजेंट के 25 µ एल जोड़ने के लिए एक ' और २०० µ एल के एजेंट B. 1x सेल µ बफर के 5 lysis एल के साथ दो खाली कुओं की स्थापना की । 15 मिनट के लिए आरटी पर प्लेटें और फिर ६९० एनएम पर अवशोषक पढ़ें । संदर्भ मानकों और नमूना रीडिंग से रिक्त रीडिंग घटाना.
  5. ओबी अंतर सेल संस्कृति में धुंधला ALP द्वारा मूल्यांकन
    1. एक नियंत्रण ऊतक संस्कृति की थाली पर मिमी के अलावा और एक निलंबन संस्कृति की थाली में सामग्री के बाद 7 दिन पर कल्चरल OBs में दाग ALP ।
    2. संस्कृति माध्यम को कुओं से महाप्राण और 1x पंजाबियों (३७ डिग्री सेल्सियस) की ०.५ मिलीलीटर से प्रतिस्थापित करें । पंजाबियों महाप्राण और उंहें 10% की ०.५ मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए आर टी पर formalin बफर में गर्मी से कोशिकाओं को ठीक ।
    3. महाप्राण एक एकल उपयोग प्लास्टिक के साथ 10% बफर formalin और धो बफर की ०.५ मिलीलीटर (1x पंजाब में ०.०५% Tween20) जोड़ें ।
    4. एक भंग 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl फॉस्फेट/नाइट्रो ब्लू tetrazolium (BCIP/एनबीटी) पूरी तरह से भंग जब तक ultrapure पानी और भंवर के 10 मिलीलीटर में सब्सट्रेट गोली । समाधान प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए और 2 एच के भीतर इस्तेमाल किया ।
    5. धोने बफर महाप्राण और BCIP/एनबीटी सब्सट्रेट समाधान के ०.५ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें और 10 min. महाप्राण धुंधला समाधान के लिए अंधेरे में आर टी पर थाली मशीन और धोने बफर के ०.५ मिलीलीटर के साथ बदलें ।
    6. एक नया अच्छी तरह से में सना हुआ β-TCP डिस्क स्थानांतरण और ALP दाग रिकॉर्ड करने के लिए एक पारंपरिक flatbed स्कैनर के साथ ALP-सना हुआ प्लेटों को स्कैन ।
  6. ओबी mineralization Alizarin रेड एस (ARS) के साथ दाग द्वारा मूल्यांकन
    1. महाप्राण प्राथमिक OBs 14 दिन मिमी के अलावा के साथ कुओं से संस्कृति मध्यम और दो बार महाप्राण पर 1x पंजाबियों के ०.५ मिलीलीटर के साथ कुल्ला पंजाबियों और आरटी पर 10% buffered formalin समाधान के ०.५ मिलीलीटर 10 मिनट के लिए जोड़कर कोशिकाओं को ठीक ।
    2. महाप्राण 10% एक एकल उपयोग प्लास्टिक के साथ formalin बफर और दो बार ultrapure पानी की ०.५ मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    3. निश्चित OBs करने के लिए, ४० mM ARS धुंधला समाधान (पीएच ४.२) ultrapure पानी में भंग और आर सी पर 10 मिनट के लिए आरटी में प्लेट मशीन के ०.२५ मिलीलीटर जोड़ देता है/
    4. एक एकल उपयोग प्लास्टिक और ultrapure पानी की 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला के साथ धुंधला समाधान महाप्राण । इस चरण को दोहराएं 5-10 बार हटाने के लिए विशिष्ट धुंधला ।
      नोट: कुल्ला समाधान रंग के बिना होना चाहिए ।
    5. ultrapure पानी महाप्राण और ठंडे पंजाबियों के 1 मिलीलीटर जोड़ें । १०० में एक शेखर पर 10 मिनट के लिए आरटी पर थाली मशीन हिलाता/
    6. पंजाबियों महाप्राण, एक नया अच्छी तरह से दाग β-टीसीपी डिस्क हस्तांतरण और mineralization रिकॉर्ड करने के लिए एक flatbed स्कैनर के साथ प्लेटों को स्कैन ।
    7. 10% cetylpyridinium क्लोराइड समाधान के ०.२५ मिलीलीटर जोड़ें और 15 मिनट के लिए आर टी पर एक शेखर पर थाली मशीन हिलाता है/ARS डाई निकालने के लिए मिनट/
    8. एक १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए supernatants स्थानांतरण और आरटी पर 5 मिनट के लिए १७,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    9. 1:10-1:20 के एक कमजोर पड़ने के अनुपात के साथ अर्क के 10% cetylpyridinium क्लोराइड समाधान जोड़ें और नमूने (३०० µ l) को एक ९६-well प्लेट में जोड़ें जिसमें केवल 10% cetylpyridinium क्लोराइड युक्त दो खाली कुओं को शामिल करें ।
    10. 7 ARS संदर्भ 4 से ४०० µ मीटर से लेकर कमजोर ४० mM ARS धुंधला समाधान (पीएच ४.२) 10% cetylpyridinium क्लोराइड समाधान के साथ एक मानक वक्र उत्पंन करने के लिए तैयार ।
    11. ९६-well प्लेट करने के लिए डुप्लिकेट में संदर्भ मानक के ३०० µ एल जोड़ें ।
    12. ५२० एनएम पर नमूनों, रिक्तियों, और संदर्भ मानकों के अवशोषण पढ़ें ।
    13. संदर्भ मानकों और नमूना रीडिंग से रिक्त रीडिंग घटाना.

2. माउस ओबी-ओसी सह संस्कृति प्राप्त करने के लिए परिपक्व OCs

  1. गोजातीय cortical अस्थि स्लाइस की तैयारी और नसबंदी
    1. आसपास के ऊतकों से हड्डी की साफ क्षेत्रों और trabecular हड्डी और अस्थि मज्जा को दूर.
    2. 24 घंटे के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर हड्डी सूखी ।
    3. छोटे हिस्से में हड्डी स्लाइस और यह स्लाइस में कटौती (लगभग 300-350 µm मोटी) एक कम गति का उपयोग कर एक हीरे की ब्लेड के साथ देखा ।
    4. द्विघात डिस्क (1 सेमी2) में 300-350 µm स्लाइस काटें ।
    5. हड्डी डिस्क (1 सेमी2) को साफ करने के लिए, उन्हें एक lockable कांच की शीशी में डाल दें और आसुत जल से भरें । एक अल्ट्रासोनिक स्नान में भरा कांच की शीशी हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए sonicate इस चरण को तीन बार दोहराएँ ।
    6. आसुत जल डालो, ७०% इथेनॉल जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए sonicate ।
    7. ७०% इथेनॉल बंद डालो और १००% इथेनॉल के साथ की जगह ।
      नोट: 4 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १००% इथेनॉल में अस्थि स्लाइस की दुकान ।
    8. विकीर्ण 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ अस्थि स्लाइसें बाँझ शर्तों के तहत प्रत्येक पक्ष पर । आगे उपयोग तक आरटी में एक बाँझ संस्कृति प्लेट में निष्फल हड्डी स्लाइस की दुकान ।
  2. अस्थि मज्जा के अलगाव OC पुरोगामी
    1. Euthanize भोली 8 – 12 सप्ताह पुरानी बालब/एक intraperitoneal (आईएफसआई) के एक समाधान के इंजेक्शन का उपयोग चूहों २०० मिलीग्राम/किग्रा ketamine और 24 mg/
    2. अलग से अस्थि मज्जा OC पुरोगामी माउस femurs और tibiae से ।
    3. कूल्हे पर शरीर के लिए निकटतम बिंदु से बाँझ कैंची के साथ पैर निकालें, घुटने और टखने के जोड़ों में अंगों में कटौती और बाँझ स्केलपेल और संदंश के साथ नरम ऊतक हटाने. epiphyses को काट लें । बाहर फ्लश और एक 6 सेमी बाँझ पेट्री पकवान एक 27G एक 1mL सिरिंज से जुड़ी एक सेल निलंबन प्राप्त सुई का उपयोग करने में 1mL BGM के साथ मज्जा निलंबित ।
    4. सेल सस्पेंशन को एक ५० एमएल शंकु ट्यूब में डालें, 6 सेमी पेट्री डिश को 5 मिलीलीटर BGM के साथ धो लें और उसी ५० एमएल शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर करें । 5 मिनट के लिए 4 ° c पर ३५० x g पर केंद्रापसारक । BGM युक्त OC विभेद माध्यम (डीएम) में कोशिकाओं को पुनः निलंबित, 1 एनएम 1, 25-(OH)2-विटामिन डी 3 और 1 µ एम प्रोस्टाग्लैंडीन ई2 (1 मिलीलीटर/
      नोट: एक बालब/सी माउस १ २४-well कल्चर प्लेट के लिए OC पुरोगामी की पर्याप्त संख्या प्रदान करता है ।
  3. माउस ओबी की तैयारी-OC सह संस्कृति के साथ सामग्री
    1. पूर्व-गर्मी 14 मिमी व्यास β-TCP डिस्क या गोजातीय अस्थि स्लाइसें (1 सेमी2) में BGM के 1 मिलीलीटर में 24-well suspension कल्चर प्लेट ३७ ° c और 5% सह2 में 24 h के लिए कक्षों को जोड़ने से पहले ।
      नोट: गोजातीय हड्डी स्लाइस के लिए एक शारीरिक सब्सट्रेट नियंत्रण समूह है, जो की उपस्थिति में OC विभेद का अध्ययन करने के लिए ।
    2. जोड़ें ८.८ x 104 कोशिकाओं/प्राथमिक OBs के2 BGM में एक 24 अच्छी तरह से निलंबन संस्कृति की थाली या 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में या नियंत्रण हड्डी पर निलंबित कर दिया । ३७ ° c और 5% CO2 में 24 घंटे के लिए मशीन ।
      नोट: OBs प्लास्टिक या सामग्री या गोजातीय की हड्डी के लिए देते हैं ।
    3. ३७ ° c और 5% सह2 पर 5 दिनों के लिए 24 ज कल्चरल प्राथमिक OBs और संस्कृति के लिए हौसले से पृथक अस्थि मज्जा OC पुरोगामी जोड़ें । नए सिरे से तैयार ओसी डीएम के साथ मीडियम को हर दूसरे दिन बदलें । फिर tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (जाल) के लिए OCs दाग OC विभेद का मूल्यांकन ।
  4. ओसी विभेदन ट्रैप धुंधला द्वारा मूल्यांकन
    1. परिपक्व multinucleated OCs, कदम 2.3.3 से प्राप्त की विशेषता के लिए, नियंत्रण ऊतक संस्कृति की थाली से संस्कृति माध्यम महाप्राण और सामग्री निलंबन संस्कृति प्लेट और 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर (३७ डिग्री सेल्सियस) जोड़ें । महाप्राण और 10 मिनट के लिए RT पर 10% बफ़र्ड formalin समाधान के 1 मिलीलीटर में उन्हें मशीन द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें ।
    2. महाप्राण एक एकल उपयोग प्लास्टिक के साथ 10% बफर formalin समाधान और आरटी पर 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ने के इस कदम को तीन बार दोहराएँ, तो पंजाबियों महाप्राण, जाल बफर की 1 मिलीलीटर (पीएच 5) के साथ प्रतिस्थापित करें और 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर प्लेटें मशीन ।
    3. महाप्राण जाल बफर और 1:1 एसीटोन और १००% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 30 एस के लिए आरटी पर थाली मशीन जल्दी से एक एकल उपयोग प्लास्टिक के साथ एसीटोन इथेनॉल समाधान महाप्राण और आर टी पर पूरी तरह से सूखी प्लेटें ।
    4. जाल धुंधला समाधान के लिए, एक 10 मिलीग्राम/एमएल naphthol-एन, एन dimethylformamide में एमएक्स फॉस्फेट स्टॉक समाधान तैयार, जाल बफर में तेजी से लाल वायलेट नमक की ०.६ मिलीग्राम/मिलीलीटर, और naphthol के रूप में एमएक्स फॉस्फेट स्टॉक समाधान के ०.१ मिलीलीटर जोड़ें फास्ट रेड वायलेट नमक की 10 मिलीलीटर ट्रैप बफ़र में ।
    5. जाल धुंधला समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर थाली मशीन, तो जाल धुंधला समाधान महाप्राण, और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ultrapure पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. β-TCP डिस्क और एक नया कुआं में धुंधला होने के बाद गोजातीय हड्डी स्लाइस स्थानांतरण, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (आवर्धन: 10x) का उपयोग कर लाल दाग ocs का पालन करें और तीन या अधिक नाभिक के साथ जाल परिपक्व ocs की गणना ।

3. महत्वपूर्ण-माउस Calvarial दोष मॉडल आकार

  1. analgesia के लिए 8-सप्ताह पुराने बालब/सी चूहों में ०.१ मिलीग्राम/kg buprenorphine (एस॰सी॰) इंजेक्ट ।
  2. चूहों को Anesthetize के मिश्रण से १०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 5 मिलीग्राम/xylazine आईएफसआई, आंखों के लिए एक जेल या मरहम जोड़ने के लिए उंहें नम रखने के लिए और पूरी प्रक्रिया के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर माउस जगह हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए । पैर की अंगुली और पूंछ चुटकी द्वारा संज्ञाहरण गहराई का आकलन करें ।
  3. कान के बीच सिर के शीर्ष पर फर दाढ़ी और ७.५% povidone आयोडीन समाधान और ७०% इथेनॉल के साथ सतह को साफ ।
  4. एक बाँझ स्केलपेल के साथ कान के बीच खोपड़ी के शीर्ष पर एक midline sagittal चीरा बनाओ calvarium बेनकाब और यह एक pericranium के साथ परिमार्जन द्वारा सही पार्श्विका हड्डी के ऊपर स्केलपेल संयोजी ऊतकों को दूर.
  5. सही पार्श्विका हड्डी में एक गंभीर आकार दोष बनाने के लिए सामांय खारा समाधान के साथ लगातार सिंचाई के तहत 4 मिमी (२००० rpm) के व्यास के साथ एक बाँझ दंत trephine का उपयोग सही पार्श्विका हड्डी पायदान और ectocortex और कुछ endocortex के माध्यम से कटौती ।
  6. बाडी मेटर को नुकसान को रोकने के लिए, एक छोटी सी periosteal लिफ्ट का उपयोग करने के लिए शेष endocortex के माध्यम से तोड़, ध्यान से calvarial हड्डी ऊपर उठा और इसे संदंश के साथ हटा दें । परिणामस्वरूप दोष परिपत्र और व्यास में लगभग ३.५ मिमी होना चाहिए.
  7. पूर्व लथपथ के साथ calvarial दोष भरें (आरटी पर बाँझ 1x पंजाबियों) β-TCP/सी फोम संदंश का उपयोग कर ।
  8. खाली दोष के साथ आयु-कृतित्व, अन्तर्वासना निगेटिव नियंत्रणों की उपयुक्त संख्या तैयार करें.
  9. रखने के लिए जगह में, दो विपरीत बिंदुओं पर दोष की बढ़त पर ऊतक चिपकने वाला के ०.५ µ एल डाल ।
  10. एक गैर अवशोषित टांका के साथ त्वचा को बंद करें ।
  11. एक anesthetized माउस पर अगले सर्जरी प्रदर्शन करने से पहले बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए ठंड बाँझ के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों को साफ करें ।
  12. शल्य चिकित्सा उपचार के लिए, एक सूखी और स्वच्छ हीटिंग प्लेट पर पशुओं को ३७ डिग्री सेल्सियस में सर्जरी क्षेत्र में उचित निगरानी के लिए वसूली की अवधि के दौरान जगह है । सांस की दर, शरीर का तापमान और श्लेष्मा झिल्ली और आंखों के रंग हर 10 मिनट की निगरानी जब तक वे जगा ।
  13. भोजन और पूर्ण वसूली जब तक अंय जानवरों से अलग पानी के साथ एक पिंजरे में संचालित जागरूक चूहों स्थानांतरण । ०.१ मिलीग्राम/किलो buprenorphine एस॰सी॰ के बाद सर्जिकल एनाल्जेसिक चिकित्सा के लिए दिन में दो बार ७२ h. Return के लिए पूरी तरह से उनके पिंजरों को बरामद चूहों ।
  14. euthanize की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए, चूहों आईएफसआई के समाधान के साथ २०० मिलीग्राम/kg ketamine और 24 मिलीग्राम/kg xylazine.
  15. 8-12 हफ्तों के बाद आरोपण, तेज कैंची के साथ euthanized माउस decapitate ।
  16. ४.५% के 30 मिलीलीटर में decapitated माउस सिर ठीक 1-2 सप्ताह के लिए बफर formalin समाधान के लिए एक ऊतक में निर्धारण के पूर्ण प्रवेश की गारंटी ।
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक वर्ष के लिए ७०% इथेनॉल में सिर हस्तांतरण ।
  18. अस्थि पुनर्जनन का मूल्यांकन करने के लिए माइक्रो गणना टोमोग्राफी (microCT) या मानकीकृत undecalcified ऊतकवैज्ञानिक तकनीक का उपयोग करें । यह उच्च संकल्प पर गुजाइश नमूनों पर microCT स्कैनिंग का उपयोग करने के लिए संभव है (९० केवी, 4 मिन) 2d और 3 डी sagittal और ललाट विमानों में.
  19. undecalcified प्रोटोकॉल के लिए, इथेनॉल के आरोही ग्रेड में सिर निर्जलीकरण और ग्लाइकोल मिथाइल methacrylate में एंबेड ।
  20. कट ग्लाइकोल मिथाइल methacrylate-एक हीरे के साथ एंबेडेड ब्लॉक देखा और लगभग 80 की मोटाई के लिए वर्गों पीसने-100 µm ।
  21. नई हड्डी गठन14की पहचान करने के लिए लेवै Laczko सना हुआ अस्थि वर्गों का मूल्यांकन करें ।

4. इन विट्रो में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं

  1. Euthanize भोली 8 सप्ताह पुरानी बालब/सी चूहों के समाधान के साथ आईएफसआई २०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 24 मिलीग्राम/xylazine ।
  2. इसके दाईं ओर माउस प्लेस, बाईं ओर फर दाढ़ी और ७०% इथेनॉल के साथ पेट के बाईं ओर त्वचा को साफ ।
  3. छोड़ दिया पक्ष पर माउस की त्वचा में एक 10 मिमी लंबे और 1 मिमी गहरी चीरा पीछे बाँझ कैंची का उपयोग पेट पर पसलियों के बाद कर.
  4. त्वचा खोलो और फिर आँख का पर्दाफाश । एक 10 मिमी लंबे और से कम 1 मिमी गहरे चीरा के तहत एक कर रहे हैं, जो बाँझ शर्तों के तहत कैंची का उपयोग कर.
  5. तिल्ली को बेनकाब करने के लिए समीपस्थ पेट पुश.
  6. तिल्ली को बाँझ संदंश के साथ धीरे से पकड़ें और इसे नीचे संलग्न ऊतक और जहाजों को काटने से निकाल दें ।
  7. एक ५० मिलीलीटर ठंड 1x बाँझ पंजाबियों के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में बरकरार तिल्ली रखें ।
  8. 2 बाँझ संदंश या 2 बाँझ कांच स्लाइड का उपयोग कर तिल्ली नख़रेबाज़ द्वारा एक एकल सेल निलंबन तैयार करें ।
  9. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग कोल्ड 1x पंजाबियों के साथ एक बाँझ ४० µm सेल छलनी के माध्यम से इसे पारित करके मलबे निकालें ।
  10. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर एकल सेल निलंबन, महाप्राण और supernatant त्यागें । फिर 5 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर में सेल गोली resuspend ।
  11. आरटी में 14 मिनट के लिए सेल निलंबन और रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) के माध्यम से ४५ मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो ।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल lysis के बाद कोशिकाओं को केंद्रापसारक और फिर supernatant त्यागें ।
  13. RPMI मध्यम से 10% ताप-निष्क्रिय FBS, 1% पेनिसिलिन-streptomycin समाधान, ०.१% gentamicin, ०.२% ß-mercaptoethanol, और 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड युक्त splenocytes में पुनर्स्थगित ।
  14. पूर्व-मशीन β-TCP/सी फोम में एक ९६-अच्छी तरह से बाँझ संस्कृति RPMI माध्यम युक्त प्लेट 24 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और सेल बोने से पहले 5% सह2 .
  15. titrated संख्या पर splenocytes जोड़ें, उदा, १.२५ x 10 5, २.५ x 10 5 और 5 x 105/well कुओं के लिए एक ९६-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति RPMI मध्यम और additives युक्त प्लेट में, के साथ या बिना पूर्व-गर्मी β-TCP/
  16. जोड़ें 10 µ g/एमएल concanavalin एक (कांग्रेस एक) १०० µ एल के कुल के लिए माध्यम में भंग/अच्छी तरह से उपयुक्त कुओं के लिए और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 ७२ एच के लिए में मशीन ।
  17. एक bromodeoxyuridine (BrdU) परख के साथ सेल प्रसार उपाय । जोड़ें 10 µ l/BrdU लेबलिंग समाधान के ४८ एच पर सेल संस्कृति के और फिर एक अतिरिक्त 24 एच के लिए थाली मशीन ।
  18. ७२ ज पर, supernatant और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग तक इकट्ठा ।
  19. जोड़ें २०० µ एक अच्छी तरह से निर्धारण समाधान के एल/और फिर आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन महाप्राण निर्धारण समाधान । जोड़ें १०० µ एल/अच्छी तरह से विरोधी BrdU एंटीबॉडी काम समाधान और ९० मिनट के लिए मशीन ।
  20. महाप्राण एंटीबॉडी हल, कुओं कुल्ला 200 के साथ तीन बार-300 µ एल/धोने समाधान के ठीक है और धोने समाधान निकालें ।
  21. जोड़ें १०० µ सब्सट्रेट समाधान और 3 के लिए मशीन-आरटी में 10 मिनट, तो ४५० एनएम पर अवशोषित उपाय ।
  22. नाप interleukin-1β (il-1β), interleukin-2 (il-2), interleukin-4 (il-4) और इंटरफेरॉन-γ (IFN-γ) में एक मानक एलिसा का उपयोग कर एकत्र supernatants ।

5. उच्च प्रवाह Intraperitoneal मॉडल

  1. Anesthetize महिला 6-8-सप्ताह पुरानी बालब/सी चूहों के मिश्रण के साथ १०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 5 मिलीग्राम/xylazine आईएफसआई और उन्हें नम रखने के लिए आंखों के लिए एक जेल या मरहम जोड़ने और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर माउस जगह है । पैर की अंगुली और पूंछ चुटकी द्वारा संज्ञाहरण गहराई का आकलन करें ।
  2. पेट फर दाढ़ी और ७.५% povidone आयोडीन समाधान और ७०% इथेनॉल के साथ साफ ।
  3. लीनिया अल्बा के साथ त्वचा के माध्यम से एक 8 मिमी लंबे midline चीरा बनाओ । एक स्केलपेल का उपयोग कर एक छोटी सी में चीरा ।
  4. जगह बाँझ पंजाबियों लथपथ β-टीसीपी/सी फोम भ्रष्टाचार (2x2x2 mm3) पेरिटोनियल गुहा में या उम्र के लिए जोड़ा सामग्री के बिना मिलान अन्तर्वासना नियंत्रण चूहों.
  5. क्रमशः और अवशोषित और गैर अवशोषित टांका के साथ योनि और त्वचा टांका ।
  6. एक anesthetized माउस पर अगले सर्जरी प्रदर्शन करने से पहले बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए ठंड बाँझ के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों को साफ करें ।
  7. शल्य चिकित्सा उपचार के लिए, एक सूखी और स्वच्छ हीटिंग प्लेट पर पशुओं को ३७ डिग्री सेल्सियस में सर्जरी क्षेत्र में उचित निगरानी के लिए वसूली की अवधि के दौरान जगह है । सांस की दर, शरीर का तापमान और श्लेष्मा झिल्ली और आंखों के रंग हर 10 मिनट की निगरानी जब तक वे जगा ।
  8. भोजन और पूर्ण वसूली जब तक अंय जानवरों से अलग पानी के साथ एक पिंजरे में संचालित जागरूक चूहों स्थानांतरण । वापसी पूरी तरह से उनके पिंजरों चूहों को बरामद किया ।
    नोट: यह प्रक्रिया कम दर्द लाती है । सर्जिकल एनाल्जेसिक थेरेपी के बाद आमतौर पर आवश्यक नहीं है । यदि संचालित पशुओं दर्द के लक्षण दिखाने के लिए, ०.१ मिलीग्राम/kg buprenorphine एस॰सी॰ या दर्द से राहत के लिए एक और उचित एनाल्जेसिक दवा सुई ।
  9. Euthanize चूहों 7 दिनों के बाद आरोपण, के समाधान के साथ २०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 24 मिलीग्राम/xylazine आईएफसआई
  10. 7 दिनों के बाद आरोपण, लेवेज पेरिटोनियल गुहा माउस सिर नीचे पकड़ और बाएँ निचले उदर चक्र में सुई डालने और समीपस्थ उद्देश्य के द्वारा ठंडे पंजाबियों के 3 मिलीलीटर की कुल के लिए एक 25G सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर ।
    नोट: पेरिटोनियल द्रव RBCs से मुक्त होना चाहिए ।
  11. 4 ° c में 5 मिनट के लिए ३०० x g पर पेरिटोनियल लेवेज द्रव केंद्रापसारक और पेरिटोनियल द्रव इकट्ठा करने के लिए पर स्टोर करने के लिए-20 ° c il-1β, आईएल-2, और आईएल-4 साइटोकिंस की एलिसा माप के लिए ।
  12. महाप्राण supernatant, पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और एक hemocytometer पर trypan ब्लू का उपयोग कर पेरिटोनियल कोशिकाओं की गिनती ।
  13. Cytocentrifuge सेल निलंबन 5 x 105 कोशिकाओं पर कांच स्लाइड पर, एक अंतर कोशिका गिनती के लिए सूखी और दाग के लिए स्लाइड की अनुमति दें ।
  14. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का प्रयोग, कुल में ३०० कोशिकाओं की एक ंयूनतम गिनती और मैक्रोफेज, इयोस्नोफिल्स, न्यूट्रोफिल, और लिम्फोसाइटों के बीच अंतर ।

6. उपजीर्ण चमड़े के नीचे मॉडल

  1. Anesthetize महिला 6-8 सप्ताह पुराने बालब/१०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 5 मिलीग्राम/xylazine आईएफसआई के मिश्रण के साथ चूहों, आंखों के लिए जेल या मरहम जोड़ने के लिए उन्हें नम रखने के लिए और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर माउस जगह है । पैर की अंगुली और पूंछ चुटकी द्वारा संज्ञाहरण गहराई का आकलन करें ।
  2. अपनी पीठ पर माउस प्लेस, पेट फर दाढ़ी, और ७.५% povidone आयोडीन समाधान और ७०% इथेनॉल के साथ मुंडा सतह साफ ।
  3. एक स्केलपेल का उपयोग कर पेट के लीनिया अल्बा के साथ त्वचा के माध्यम से एक 8 मिमी लंबे समय midline चीरा बनाओ और फिर प्रत्यारोपण पंजाबियों भिगोया (2x2x2 mm3) त्वचा के नीचे या आयु मिलान अन्तर्वासना नियंत्रण चूहों के लिए कोई सामग्री जोड़ें ।
  4. एक गैर अवशोषित टांका के साथ त्वचा टांका ।
  5. एक anesthetized माउस पर अगले सर्जरी प्रदर्शन करने से पहले बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए ठंड बाँझ के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों को साफ करें ।
  6. शल्य चिकित्सा उपचार के लिए, एक सूखी और स्वच्छ हीटिंग प्लेट पर पशुओं को ३७ डिग्री सेल्सियस में सर्जरी क्षेत्र में उचित निगरानी के लिए वसूली की अवधि के दौरान जगह है । सांस की दर, शरीर का तापमान और श्लेष्मा झिल्ली और आंखों के रंग हर 10 मिनट की निगरानी जब तक वे जगा ।
  7. भोजन और पूर्ण वसूली जब तक अंय जानवरों से अलग पानी के साथ एक पिंजरे में संचालित जागरूक चूहों स्थानांतरण । वापसी पूरी तरह से उनके पिंजरों चूहों को बरामद किया ।
    नोट: यह प्रक्रिया कम दर्द लाती है । सर्जिकल एनाल्जेसिक थेरेपी के बाद आमतौर पर आवश्यक नहीं है । यदि संचालित पशुओं के दर्द के लक्षण दिखाने के लिए, ०.१ मिलीग्राम/किलो buprenorphine एस॰सी॰ या किसी अंय उचित एनाल्जेसिक सुई ।
  8. जब आरोपण स्थल की जांच करने के लिए तैयार है, euthanize चूहों आईएफसआई के समाधान के साथ २०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 24 मिलीग्राम/kg xylazine ।
  9. आठ सप्ताह के बाद आरोपण, उत्पाद के आसपास के ऊतकों (1 सेमी2) के साथ आरोपण साइट ।
  10. ४.५% बफर formalin समाधान रातोंरात में ऊतक ठीक, तेल में एंबेड और 4 µm वर्गों में कटौती ।
  11. दाग 4 µm आयल-Hematoxylin और Eosin के साथ ऊतक वर्गों एंबेडेड (एच एंड ई) कोलेजन जमाव और फाइब्रोसिस के लिए सूजन या Masson trichrome के लिए ।

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Representative Results

की हड्डी की मरंमत के लिए एक सामग्री के रूप में अपनी प्रभावशीलता के लिए β-टीसीपी का आकलन करने के लिए, हम इन विट्रो में और vivo स्क्रीनिंग तरीकों का इस्तेमाल किया । सबसे पहले, हम आधारभूत मध्यम अकेले नियंत्रण के साथ तुलना में β-TCP डिस्क के लिए ओबी प्रतिक्रियाओं मापा. आकृति 2 में β-TCP डिस्क पर 7 और 14 दिनों की संस्कृति के प्रत्युत्तर में ओबी व्यवहार्यता प्रदर्शित करता है । संस्कृति कुओं में चयापचय सक्रिय कोशिकाओं से मापा सेल व्यवहार्यता टिशू कल्चर प्लास्टिक में मध्यम के साथ ही OBs के लिए था साथ ही β-टीसीपी डिस्क का संकेत है कि इस सामग्री न तो बढ़ाने और न ही दबा रहा है ओबी प्रसार.

आगे OBs का मूल्यांकन करने के लिए, हम गुणात्मक और मात्रात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर भेदभाव के एक मार्कर के रूप में ALP गतिविधि मापा । चित्रा 2 संस्कृति के 7 दिनों के बाद संस्कृति कुओं में ALP एंजाइम गतिविधि दिखाता है । अकेले माध्यम के साथ कुओं में OBs आधारभूत ALP गतिविधि थी, जबकि इष्टतम mineralization मध्यम (मिमी) OBs तीव्र ALP धुंधला था, ओबी भेदभाव के एक उच्च स्तर को दर्शाती है । इसके विपरीत, β-TCP डिस्क पर चढ़ाया OBs मिमी में गर्मी OBs से कम विभेदित. एक मात्रात्मक परख में, ALP एकाग्रता ७७% अकेले आधार रेखा के साथ की तुलना में मिमी युक्त कुओं के लिए उच्च था, जबकि ALP एकाग्रता ४०% से कम हो गया था पर कल्चरित की कोशिकाओं में β-TCP डिस्क मिमी नियंत्रण की तुलना में. इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि कोशिकाओं पर β-TCP डिस्क के साथ प्लास्टिक की इष्टतम शर्तों के साथ उन से कम विभेदित मिमी, वे पर्याप्त रूप से पर विभेदित.

OBs की एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि अस्थि चिकित्सा में एक आवश्यक कदम है, जो mineralization प्रेरित करने के लिए उनकी क्षमता है । हम 14 दिनों के बाद ARS के साथ प्रसंस्कृत ओबी कोशिकाओं दाग और पाया कि mineralization के लिए उच्च था MM नियंत्रण के लिए की तुलना में अकेले में OBs कल्चरित और β पर संस्कृति वेल्स में TCP डिस्क (चित्रा 2). जब हम ARS एकाग्रता मापा जाता है, हमने पाया कि मिमी नियंत्रण अधिक से अधिक ४५% β-TCP समूह से अधिक थे । इन आंकड़ों कि OBs MM परिपक्व की उपस्थिति में प्लास्टिक पर, अंतर और अकेले मध्यम और पर β-TCP डिस्क के साथ उन से बेहतर mineralize वर्णन ।

यह निर्धारित करने के लिए कि OCs का प्रतिसाद कैसे करें β-TCP डिस्क, हमने एक संवर्धन तकनीक का उपयोग किया जिसमें OBs अस्थि मज्जा के साथ सह-कल्चरल हैं oc पूर्ववर्ती oc आकृति विज्ञान की परीक्षा के बाद. ओबी-oc सह संस्कृतियों 5 दिनों में मनाया गया और ओसी डीएम और हड्डी स्लाइस और β-टीसीपी पर हो कोशिकाओं के साथ प्लास्टिक पर हो कोशिकाओं के बीच काफी अलग हो गया. प्लास्टिक पर, ocs बड़े और व्यापक थे, जबकि शारीरिक सब्सट्रेट पर ocs छोटे थे, कम-बाहर फैल गया और अनियमित आकार (चित्रा 3). ocs quantitate करने के लिए, हम ट्रैप + ocs की गणना की और पाया कि उच्च संख्या जब β-TCP (१७५५ ± 21.41/सेमी2) ऊतक संस्कृति नियंत्रण (११४० ± 15.71/cm2) और अस्थि स्लाइस (७०९ ± 59.69/cm 2) की तुलना में, सुझाव β-TCP डिस्क (चित्रा 3) पर बेहतर OC विभेद ।

एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध β-TCP/सी फोम vivo मेंनिर्धारित करने के लिए, हम चूहों में एक महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष मॉडल का इस्तेमाल किया । हम प्रतिनिधि ऊतकवैज्ञानिक ग्लाइकोल मिथाइल methacrylate embedding और लेवै Laczko धुंधला के साथ एक undecalcified ऊतकवैज्ञानिक तकनीक द्वारा संसाधित वर्गों दिखाते हैं । MicroCT और प्रोटोकॉल दोष क्षेत्र के भीतर नए अस्थि गठन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम चित्रा 4में ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के साथ एक उदाहरण दिखाते हैं । जब शल्य चिकित्सा प्रेरित अस्थि दोष खाली छोड़ दिया गया था (अन्तर्वासना), हम एक पतली पूरी दोष को कवर परत मनाया, लेकिन कोई महत्वपूर्ण हड्डी गठन 12 सप्ताह के बाद बनाया अस्थि भंग के महत्वपूर्ण आकार की पुष्टि आपरेशन में मौजूद था । इसके विपरीत, जब दोष β-tcp/सी फोम निहित, वहां थे β-tcp/सी फोम कुछ रक्त वाहिकाओं और भड़काऊ अस्थि गठन के सबूत के बिना दोष क्षेत्र को पाटने कोशिकाओं सहित घने रेशेदार ऊतकों से घिरा अवशेष ।

विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, हम प्रतिरक्षा और एलर्जी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, एक इन विट्रो परख का उपयोग कर । चित्र 5 दर्शाता है कि जब भोली एसplenocytes अकेले या β-TCP/सी फोम के साथ मशीन थे, भोली तिल्ली कोशिकाओं proliferating द्वारा जवाब नहीं था या il-2, il-4, और IFN-γ साइटोकिंस उत्पादन । इसके विपरीत, ConA युक्त संस्कृतियों में, कोशिका प्रसार और cytokine उत्पादन IL-1β के अलावा वृद्धि हुई है । ConA और β-tcp/सी फोम के साथ अकेले ConA के साथ तुलना में जब कक्ष प्रतिसाद अप्रभावित थे, यह दर्शाता है कि β-tcp/C फोम न तो बढ़ा और न ही इन विट्रो प्रतिक्रियाओं में कमी आई ।

यह निर्धारित करने के लिए कि β-TCP/सी फोम vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक प्रेरित, हम इसे प्रत्यारोपित 1) intraperitoneally और मापा भड़काऊ कोशिका गिनती और पेरिटोनियल लेवेज द्रव में cytokine सांद्रता और 2) चमड़े के नीचे और मूल्यांकन प्रत्यारोपण साइट के ऊतकवैज्ञानिक वर्गों पर सूजन और फाइब्रोसिस । 1 तालिकामें, पेरिटोनियल लेवेज द्रव में कोशिका अंतर पता चलता है कि भड़काऊ कोशिकाओं की कुल संख्या β-TCP/सी फोम प्रत्यारोपित चूहों में काफी अधिक था अन्तर्वासना नियंत्रण के साथ तुलना में । इसके अलावा, वहां सभी प्रकार के सेल की संख्या में वृद्धि की गई । चित्रा 6Aमें, इसमें आईएल-1β, आईएल-2, और आईएल-4 साइटोकिंस की उच्च सांद्रता होती है, जो कि β-TCP/ में β-TCP/C फोम एस॰सी॰ प्रत्यारोपित चूहों, हम पर विदेशी शरीर विशाल कोशिकाओं के साथ एक भड़काऊ प्रतिक्रिया मनाया एच & ई-सना हुआ वर्गों (चित्रा घमण्ड) और Masson के Trichrome सना हुआ वर्गों पर फाइब्रोसिस का सबूत (चित्रा 6C) पर 8 सप्ताह. इसके विपरीत, शम नियंत्रण के आरोपण स्थल में न्यूनतम शोथ था और कोई फाइब्रोसिस (फिगर 6C) नहीं था.

Figure 1
चित्र 1: प्राथमिक ओबी कक्ष आइसोलेशन आरेख के लिए Calvaria निकालना. आरेख 4 कटौती (लाल डैश्ड रेखा) घुमावदार कैंची का उपयोग कर के साथ calvarium को दूर करने के लिए कैसे समझाती है । पहली कटौती सही करने के लिए सीधा है (R) X1 से X2 के लिए आंख गर्तिका, और दूसरा सीधा है X3 से (एल) आंख गर्तिका X4 को छोड़ दिया है । तीसरी कटौती के मोर्चे पर calvarium को X4 से X2 के लिए अलग है, और चौथी कटौती को X3 से X1 के लिए वापस अलग है । इसके बाद calvarium को मुक्त कर दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: β-TCP-प्रेरित इन विट्रो ओबी विभेद और परिपक्वता. ओबी व्यवहार्यता और प्रसार की कोशिकाओं के लिए 7 दिन और 14 पर मध्यम अकेले में प्रसंस्कृत (सलाखों) या β-TCP (ओपन बार्स) (± SEM; n = 3) । ALP गतिविधि ठहराव सेल lysates और सामान्यीकरण प्रोटीन सामग्री के लिए (µ m DIFMU/µ ग्राम प्रोटीन, मतलब ± SEM, n = 3) प्रतिनिधि छवियों के साथ 7 दिन से ALP-सना हुआ संस्कृति वेल्स illustrating । Mineralization quantified ARS से सना हुआ संस्कृतियों एक cetylpyridinium क्लोराइड निष्कर्षण विधि ARS की एकाग्रता के रूप में दिखाया (µ एम ARS, मतलब ± SEM, n = 3) प्रतिनिधि ARS के साथ 14 दिन पर संस्कृति वेल्स सना हुआ । समूह में शामिल है अस्थि विकास अकेले मध्यम (BGM); Mineralization मध्यम (मिमी); β-TCP. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: β-TCP-प्रेरित इन विट्रो OC विभेद । प्रतिनिधि photomicrographs शो ट्रैप + 5 दिन में MNCs के बाद सह संवर्धन माउस OBs और अस्थि मज्जा OC पुरोगामी. ट्रैप + multinucleated कोशिकाओं (MNCs) का समापन बिंदु विश्लेषण ट्रैप की निरपेक्ष गिनती + MNCs (≥ 3 नाभिक) प्रति cm2 (मतलब ± SEM, n = 3) * * *p < 0.001 दर्शाता है । समूह में OC विभेद मध्यम अकेले (डीएम) शामिल हैं; प्रमाणात β-TCP. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष मॉडल में β-TCP/सी फोम की हड्डी भ्रष्टाचार में vivo मूल्यांकन में । गैर चिकित्सा calvarial 8 सप्ताह पुरानी महिला बालब/सी में बनाया दोष (एन = 3) चूहों एक 4 मिमी दंत trephine का उपयोग कर. उपचार समूहों में शामिल है शम नियंत्रण (खाली दोष) और दोष β-TCP/सी फोम के साथ इलाज किया । प्रतिनिधि ऊतकवैज्ञानिक वर्गों 12 सप्ताह के बाद में तैयार आरोपण । Formalin-फिक्स्ड ऊतक ग्लाइकोल मिथाइल methacrylate-एंबेडेड वर्गों (80-100 µm) लेवै Laczko डाई के साथ सना हुआ । Photomicrographs कम पर दिखाया (बाएं) और उच्च (सही) आवर्धन । काला त्रिकोण अस्थि दोष का संकेत देता है । काले * अस्थि ऊतक और सफेद नोट * β-TCP/सी फोम को संदर्भित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: β-TCP/C फोम-प्रेरित इन विट्रो सेल प्रसार और cytokine उत्पादन. Splenocytes से भोली बालब/c अकेले में संस्कृत चूहों, β-TCP/सी फोम या ConA के साथ. Supernatant सेल प्रसार (BrdU), और आईएल-1β, आईएल-2, आईएल-4, और IFN-γ (अकेले मध्यम ●, ConA ○, β-tcp/सी फोम ■, β-tcp/सी फोम और ConA □) का उत्पादन । प्रसार परिणाम BrdU परख में तपसिल नमूनों (ओडी ± sem) के अर्थ के रूप में प्रस्तुत किया और दो स्वतंत्र प्रयोगों से cytokine एकाग्रता के लिए डुप्लिकेट नमूनों (स्नातकोत्तर/एमएल ± sem) का मतलब है । *p < 0.05 के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, जो कि मध् यम और भौतिक और ConA बनाम ConA अकेले है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक तेजी से उच्च प्रवाह आईएफसआई और पुरानी माउस मॉडल में vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में β-TCP/सी फोम की हड्डी भ्रष्टाचार । (A) मादा बालब/c चूहों को β-TCP/c फोम के साथ या जोड़े गए सामग्रियों (अन्तर्वासना) के बिना प्रत्यारोपित आईएफसआई । सात दिन बाद, पेरिटोनियल लेवेज cytokine सांद्रता के लिए विश्लेषण (मतलब के रूप में प्रस्तुत डेटा cytokine सांद्रता स्नातकोत्तर/एमएल ± SEM) । इन आंकड़ों के दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि है (n = 5) । *p < 0.05 को अन्तर्वासना की तुलना में भरपुर माना जाता है । (बी-सी) मादा बालब/सी चूहों (n = 5) एस॰सी॰-TCP/सी फोम के साथ या जोड़ा सामग्री (अन्तर्वासना) के बिना प्रत्यारोपित । प्रत्यारोपण के बाद 8 सप्ताह से कम, प्रत्यारोपण साइटों से दाग एच एंड ई (बी) और है Masson Trichrome (सी) सूजन और फाइब्रोसिस का मूल्यांकन करने के लिए क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नकली Vitoss
सेल गणना x 106 (कुल कोशिकाओं का%)
Macrophages १.२४० ± ०.०५१ (८८.१) ३.२६२ ± ०.३८० (७०.४) p < 0.001
इयोस्नोफिल्स ०.१२० ± ०.०११ (८.५) १.१८१ ± ०.२५४ (२५.५) p < 0.01
न्यूट्रोफिल ०.००२ ± ०.००१ (०.२) ०.०२९ ± ०.०११ (०.६) एन एस
लिम्फोसाइटों ०.०४८ ± ०.०२० (३.२) ०.१४८ ± ०.०४१ (३.५) एन एस
कुल कक्ष संख्या १.४१० ± ०.०६६ ४.६२० ± ०.४५२ p < 0.001

तालिका 1: वीवो में एक तेजी से उच्च प्रवाह आईएफसआई माउस मॉडल में β-TCP/सी फोम हड्डी भ्रष्टाचार की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया । मादा बालब/सी चूहों β-TCP/सी फोम या बिना सामग्री (अन्तर्वासना) के साथ आईएफसआई प्रत्यारोपित किया गया । सात दिन बाद, पेरिटोनियल लेवेज और प्राप्त भड़काऊ कोशिका संख्या और अंतर कोशिका गिनती के लिए विश्लेषण किया गया था (के रूप में प्रस्तुत डेटा मतलब कोशिका गिनती ± SEM) । इन आंकड़ों के दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि है (n = 5) ।

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Discussion

यहां, हम अस्थि पुनर्जनन और मरंमत के लिए विकसित प्रतिनिधि के लिए एक multidisciplinary दृष्टिकोण के लिए प्रतिसंगत है । हम OBs, OCs की प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया, और में vivo उपचार प्रतिक्रिया में चूहों में एक महत्वपूर्ण हड्डी दोष मॉडल के रूप में अच्छी तरह के रूप में इन विट्रो में और vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में . हम प्रदर्शन कैसे परख काम करते है और डेटा और इस सामग्री की परीक्षा से व्युत्पंन निष्कर्ष संक्षेप का उद्देश्य है । हम बताते है कि हमारी रणनीति हड्डी के एक मूल्यवान प्रोफ़ाइल को उत्पंन करता है ।

प्राथमिक कक्ष की परख ओबी और ओसी फंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया. OBs हड्डी गठन और शारीरिक मरंमत के लिए जिंमेदार हैं । वे व्यवहार्य, अंतर रहना चाहिए, और प्रेरित mineralization । इस अध्ययन में, हम कैसे सेल व्यवहार्यता, ALP, और mineralize करने की क्षमता के साथ शारीरिक विभेदित कोशिकाओं के मार्कर के रूप में ARS के लिए परख प्रदर्शन करने के लिए दिखाते हैं । परख के लिए नियंत्रण अकेले मध्यम, जो एक आधार रेखा और osteogenic mineralization मध्यम (मिमी), जो अनुकूलित भेदभाव और प्लास्टिक पर OBs के mineralization प्रदान करता है शामिल थे । उत्तरार्द्ध नियंत्रण समूह के लिए एक संदर्भ मानक था सामग्री । ओसी मूल्यांकन के लिए, हम सह-कल्चर्ड OBs और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न OC पुरोगामी, multinucleated कोशिकाओं में पूर्ववर्ती विभेदित, उन्हें जाल के साथ दाग, एक osteoclastic एंजाइम व्यापक रूप से इन विट्रो15 में OCs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया और फिर गणना की प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं. इन परख राज्य के-कला रहे है और संशोधनों की आवश्यकता नहीं थी । हालांकि, हम mineralize करने के लिए पृथक प्राथमिक OBs की गुणवत्ता से संबंधित एक सीमा का उल्लेख किया । संरक्षित OBs तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत और इष्टतम परिणामों के लिए एक वर्ष के भीतर इस्तेमाल किया जाता है ।

ओबी अनुलग्नक और गतिविधि का परीक्षण β-TCP डिस्क पर की तुलना में ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर उच्च थे. जब हम OCs का मूल्यांकन, हम प्लास्टिक और हड्डी, जो शारीरिक सब्सट्रेट16है की प्रतिक्रिया के बीच की उंमीद मतभेद मनाया । इसकी तुलना में, हड्डी और β-टीसीपी समान रूपात्मक परिवर्तन प्रेरित । के जवाब में OCs के ट्रैप परख गणन β-tcp डिस्क से पता चला कि संख्या काफी हड्डी स्लाइस और β-tcp के बीच अलग थे । β-TCP हड्डी स्लाइस पर की तुलना में उच्च OC विभेद प्रेरित । OC विभेद के लिए, जाल एक अच्छी तरह से स्थापित की परख है । कोई महत्वपूर्ण संशोधन इस विधि में आवश्यक थे । हालांकि, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह बहुत लंबे समय के लिए कोशिकाओं को गर्मी, या monocytic मूल के सभी कोशिकाओं जाल सकारात्मक हो जाएगा आवश्यक नहीं है ।

vivo प्रतिक्रिया में पता करने के लिए, हम एक अनुकरणीय सामग्री के रूप में β-tcp/सी फोम का इस्तेमाल किया, क्योंकि यह β-tcp, जो इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया था और कोलेजन और अस्थि चिकित्सा13को बढ़ावा देता है । हालांकि β-TCP/सी फोम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और अस्थि मरंमत17,18के लिए चिकित्सकीय प्रयोग किया जाता है, यह केवल कई विभिंन प्रकार की सामग्री है कि अध्ययन करने के लिए दिलचस्प होगा में से एक है, जैसे, biphasic कैल्शियम फॉस्फेट ( hydroxyapatite/β-TCP) के रूप में अच्छी तरह से इन परख में मानव हड्डी के रूप में यह निर्धारित करने के लिए कैसे जैविक प्रतिक्रियाओं सामग्री के बीच अलग । के लिए vivo में प्रतिक्रिया, हम प्रत्यारोपित β-TCP/सी फोम में एक महत्वपूर्ण calvarial हड्डी दोष आकार में चूहों और 12 सप्ताह बाद प्रोटोकॉल मूल्यांकन और दिखाया मतभेद के साथ तुलना में अन्तर्वासना नियंत्रण. यह भी microCT जो मानार्थ जानकारी प्रदान करता है के साथ प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए संभव है19। दोष में अन्तर्वासना नियंत्रण चूहों कोई महत्वपूर्ण हड्डी गठन किया था, के रूप में उम्मीद है, जबकि β-TCP/सी फोम एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रेरित, फाइब्रोसिस, और angiogenesis, जो हड्डी गठन के प्रारंभिक चरण का सबूत है. यह विधि पहले जौव20में प्रदर्शित किया गया है । हालांकि, हमारे दृष्टिकोण में मतभेद है कि हम एक periosteal लिफ्ट के साथ एक संशोधित "लिफ्ट" तकनीक का इस्तेमाल किया trephine द्वारा बाडी मेटर घायल होने के जोखिम को कम करने के लिए । हम कारण है कि बाडी मेटर osteogenic कोशिकाओं और osteoinductive कारकों3,21,22,23उत्पादन द्वारा calvarial दोषों की चिकित्सा प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । विशेष रूप से, सामग्री प्रत्यारोपित, दोष के आकार, और दोष बनाने के लिए विधि calvarial दोषों के अस्थि पुनर्जनन प्रभावित करता है । प्रक्रिया में एक और संशोधन है कि नियमित रूप से घाव बंद करने के लिए चिकित्सकीय प्रयोग किया जाता है एक संगत ऊतक गोंद के साथ calvarial दोष में एक भौतिक चिकित्सा के स्थिरीकरण शामिल है । इस संशोधन की गारंटी है कि दोष क्षेत्र में सामग्री चिकित्सा के दौरान विस्थापित नहीं किया जाएगा ।

सूजन हड्डी उपचार के प्रारंभिक चरण को नियंत्रित करता है, लेकिन बहुत अधिक सूजन या एलर्जी प्रतिक्रियाओं11मरंमत कम हो सकती है । आदर्श प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया करने के लिए एक भड़काऊ झरना है कि अस्थि गठन को बढ़ावा देता है शुरू करने के लिए । हालांकि, कुछ सामग्री के कारण हो सकता है एक विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया भड़काऊ संकेतों की एक सरणी के लिए अग्रणी है कि कारण फाइब्रोसिस या एलर्जी संवेदीकरण । हमारे अध्ययन में, हम β-TCP/सी फोम के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन और पाया कि यह भोली तिल्ली कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं था और टी लिम्फोसाइट विस्तार या समारोह (cytokine स्राव) के साथ हस्तक्षेप नहीं किया था जब ConA के साथ संस्कृतियों को जोड़ा. intraperitoneal प्रयोगों में, β-TCP/सी फोम प्रेरित सूजन, और Th1 में सहवर्ती वृद्धि के साथ eosinophilia और मैक्रोफेज में वृद्धि के कुछ सबूत था-और Th2-प्रकार साइटोकिंस । चमड़े के नीचे आरोपण प्रयोगों में, β-tcp/c फोम भी सूजन प्रेरित है, लेकिन जीर्ण, विनाशकारी भड़काऊ या एलर्जी प्रतिक्रियाओं के लिए कोई सबूत नहीं था, जो पता चलता है कि β-TCP/ इन मॉडलों को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । सबसे पहले, इन इन विट्रो मॉडल एक mitogen की उपस्थिति में भोली प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर सामग्री के प्रभाव का पता सबूत है कि वहां mitogenic के कारण की प्रतिक्रिया का कोई दमन नहीं है प्रदान करने के लिए । दूसरे, intraperitoneal मॉडल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रकार के एक तेजी से 7 दिन readout प्रदान करता है, उदाहरणके लिए, एलर्जी और सूजन के रूप में भड़काऊ सेल घुसपैठ और cytokine प्रोफ़ाइल के प्रकार से मनाया । तीसरे, चमड़े के नीचे, पुरानी मॉडल एक लंबी अवधि में ऊतक प्रतिक्रिया दिखाता है, पुरानी सूजन, फाइब्रोसिस, एंटीबॉडी titers के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, और प्रतिरक्षा स्मृति प्रतिक्रियाओं के लिए दोहराया आरोपण परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन मॉडलों को पहले से प्रकाशित किया गया है और यहां किसी भी संशोधन13के बिना दिखाए जाते हैं । यह महत्वपूर्ण है कि इन मॉडलों के लिए उचित नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं । हम प्रत्येक विधि की सीमाओं से बचने के लिए सभी तीन मॉडल का प्रदर्शन करने का सुझाव देते हैं । जबकि दिखाया मॉडल अच्छी तरह से इम्यूनोलॉजी के अंय क्षेत्रों में स्थापित कर रहे हैं, परीक्षण के लिए दृष्टिकोण के लिए सामग्री का हाल है ।

सारांश में, अस्थि और प्रतिरक्षा परख एक जैव सामग्री पर एक जैविक अनुकूलता प्रोफ़ाइल प्रदान करते हैं । हड्डी के लिए, ओबी और OC प्रतिक्रियाओं के लिए सामग्री जटिल और महंगे पशु प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले आवश्यक प्रारंभिक डेटा प्रदान करते हैं और 3Rs सिद्धांत का पालन करने के लिए. प्रतिरक्षा में इन विट्रो परख प्रतिजन पार-जेट और cytotoxicity, जो भी आगे पशु प्रयोग बाधा सकता है पर डेटा प्रदान करते हैं । तीव्र उच्च प्रवाह प्रयोगों भड़काऊ और cytokine प्रतिक्रिया (जैसे, टी लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं के प्रकार) पर परिणाम प्रदान करते हैं, जबकि उपजीर्ण मॉडल सूजन की अवधि और हानिकारक के लिए संभावित पर डेटा की वजह से उपयोगी है फाइब्रोसिस. इस उपंयास अनुशासनात्मक दृष्टिकोण है जो हड्डी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को शामिल करने के लिए सामग्री क्षेत्र में एक उत्कृष्ट पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए और अधिक से अधिक अनुकूलता प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान परियोजना को अनुदान समझौता सं २६३३६३ के तहत यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त हुआ है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

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References

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Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

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