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Bioengineering

뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필

doi: 10.3791/58077 Published: November 16, 2018

Summary

큰 뼈 장애 복구에 대 한 설계 새로운 생체 재료의 수는 지속적으로 뼈 이식 수술과 관련 된 합병증을 극복 하 고 뼈 치유 향상을 목표로 확장 됩니다. 여기, 우리는 뼈 수리에 대 한 생체의 전 임상 생체 적합성 테스트를 위한 종합 전략을 제시.

Abstract

큰 비-연합 뼈 골절은 정형 외과 수술에 중요 한 도전입니다. 자동-및 수용자 뼈 이식 같은 병 변 치유를 위한 훌륭한 있지만, 그들의 사용을 가진 잠재적인 합병증이 있다. 따라서, 물자 과학자는 이러한 문제를 극복 하기 위해 합성, 생체 바이오 소재 개발 하 고 있다. 이 연구에서 우리는 뼈 수리에 대 한 생체 재료를 평가 하기 위한 종합 플랫폼 제시. 우리는 뼈 생물학 및 면역학 생체 외에서 osteoclast (OC)와 osteoblast (OB) 분석 실험 및 뼈 수리, immunogenicity, 및 allergenicity의 마우스 모델 vivo에서 포함 하는 플랫폼을 개발 하는 전문성을 결합. 실험을 수행, 결과 요약 및 생체 적합성 소재에 보고 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 테스트 산부인과 생존, 차별화, 그리고 강화 작용 및 OC 생존 및 차별화 β tricalcium 인산 (β-TCP) 디스크의 맥락에서. 우리는 또한 뼈 치료의 초기 단계에 대 한 효과 결정 하기 위해 뼈 수리 calvarial 뼈 크기의 중요 한 결함 마우스 모델에 대 한 임상 사용 상용 물자 인 β-TCP/콜라겐 (β-TCP/C) 거품을 테스트. 병렬 실험에서 우리는 쥐의 면역 및 알레르기 반응을 평가. 우리의 접근 방식은 다양 한 매개 변수 뼈 치유 및 복구 환자에 사용 하는 생체 재료의 생체 적합성 예측에 필요한 뼈 소재의 생물학 호환성 프로 파일을 생성 합니다.

Introduction

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뼈 수리 혈 종 형성, 염증으로 시작 하는 복잡 한 과정, callus 형성 및1,2를 개장 하는 다음. 그러나, 뼈 재생 잠재적인 뼈 골절1,3의 크기로 제한 됩니다. 예를 들어, 큰 뼈 골절 외상, 암이 나 골다공증으로 인 한 치유 되지 않을 수 있습니다 그리고 비 연합 뼈 골절을 불린다. 이러한 뼈 병 변은 종종 건강 한 생리 뼈 수리 및 재생을 촉진 하는 치료를 필요로 합니다. 현재, autograft와 이식 뼈 이식 선택4 2.2 백만 뼈 대체 절차의 접근은 매년5. 비록 이러한 절차 높은 성공률을가지고, 합병증, 예를 들어 제한 된 가용성 뼈, 감염, 기증자 사이트 사망률, 그리고 거부4의 있을 수 있습니다. 뼈 조직 공학에 대 한 새로운 대안 이러한 과제를 해결 하기 위해 모색 되 고 있다.

천연 또는 합성 고분자, bioceramics 또는 세포 및 생리 활성 분자와 함께 금속 기반 생체 재료의 설계는 상승6에. 생리 뼈 치유와 생체의 맥락에서 치유의 우리의 현재 이해 기계적 특성 등 여러 요인 및 순환 및 골절 사이트7에서 셀을 포함 하 여 여러 로컬 및 조직 요인에 따라 달라 집니다. ,,89. 뼈 재생을 위한 바이오 osteogenicity 및 osseointegration10 홍보 하는 것을 목표로 고 이상적으로 생체, 생 분해성, 다공성 (추진 셀 마이그레이션, 산소, 영양분) 이다. 그들은 또한 고통을 구호 하 골절 사이트를 지원 하기 위해 충분히 강할 필요가. 또한, 선 동적인 요인 치유 과정을 시작 하려면 필요 합니다. 그러나, 경우는 소재는 과도 한 염증 및 알레르기 성 응답을 유도, 제한 하거나 뼈11,12치유를 억제 수 있습니다이. 따라서, 학 제 적인 접근은 뼈 수리를 위해 개발 하는 바이오 소재를 평가 하는 데 필요한.

이 연구에서는 거품 tricalcium 인산 염으로 구성 된 상용 수가 뼈 이식 대용품 이다 나노미터 크기의 순수한 β tricalcium 구성 1) Orthovita Vitoss 대표 물질의 전 임상 평가 소개 인산 (β-TCP) 입자와 유형 1 소 콜라겐 (C) (β-TCP/C 거품)과 2) β-TCP 디스크. 여기, 우리는 기본 osteoblast (OB)를 사용 하 여 이러한 생체 재료의 생체 적합성 테스트 설명 및 osteoclast (OC) 분석 실험, 뼈 복구, T 림프 구 확산 체 외에서 구성 된 면역학 평가의 vivo에서 모델 및 cytokine 생산, 그리고 vivo에서 immunogenicity allergenicity, 이전에 보고 된13.

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Protocol

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절차는 BALB/c 마우스 관심과 오스트리아 정부 교육, 과학 및 연구의 실험 동물의 사용에 대 한 모든 지침을 끝내 고 오스트리아 교육부, 과학의 윤리학에 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 연구입니다.

1. 기본 마우스 산부인과 문화

  1. 산부인과에서 신생아 마우스 calvaria 소화 효소를 사용 하 여 격리
    1. 1-2 일 된 신생아 강아지 (총에서 60) 잘린 여 euthanize 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1 페 트리 접시에 머리를 배치.
    2. 머리, 목의 목 덜 미를 잡고 하 고 떨어져 살 균가 위를 사용 하 여 피부를 잘라. 그것은 피어 싱으로 calvarium incise (약 0.1-0.3 m m) 그 다음은 두개골의 기지에서 머리 뒤쪽 calvarium 아래 삽입 되 고 귀 그리고 어 보 브의 위 앞 옆에서 다시 calvarial 가장자리를 잘라가 위를 전자 코 다리 (그림 1).
    3. 살 균 필터 소화 솔루션의 8 mL와 해 부 calvaria 품 어 (α-최소 필수 매체 (α-MEM) 300 단위/mL 콜라 유형 IV와 2.14 단위/mL dispase II 해산) 200 쉐이크에 떨고 인큐베이터에서 10 분 동안 37 ° C에서 50 mL 원뿔 튜브에 /min입니다.
    4. 첫 번째 상쾌한 무시 고 소화 프로시저 소화 솔루션의 8 mL를 세 번 반복 합니다. 셀을 포함 하는 각 소화 단계 후 상쾌한 수집 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 추가. 소화 절차 (약 40 분) 완료 될 때까지 얼음 물 목욕에 셀으로 50 mL 원뿔 튜브를 저장 합니다.
    5. 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 (진공 펌프에 연결 된 파스퇴르 피 펫)와 상쾌한 발음 하 고 뼈 성장 매체 (BGM)의 α-MEM 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 포함 된 40 ml resuspend 페니실린-스 솔루션입니다. 4 조직 문화 접시 (10 cm)에 세포 현 탁 액 10 mL를 추가 합니다.
    6. 37 ° C, 5% CO2 셀 합류 (2-3 일)까지 문화.
    7. 합류에서 오래 된 매체를 발음 하 고 조직 문화 접시 1 x PBS (37 ° C)와 한 번 씻어. PBS를 발음 그리고 각 10cm 조직 문화 접시에 0.5 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 포함 하는 1 x trypsin 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
    8. 5 분 동안 37 ° C, 5% CO2 4 문화 접시를 품 어 고 플라스틱에서 셀 분리는 되도록 거꾸로 가벼운 현미경으로 번호판을 확인 합니다. 다음 모든 셀 정지 (총 8 mL) 신선한 BGM의 10 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브 전송. 각 판 5 mL 신선한 BGM과 같은 50 mL 원뿔 튜브에 씻는 다.
    9. 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심는 상쾌한 발음 하 고, 16 ml 신선한 BGM의 셀 resuspend. 16 새로운 10cm 조직 문화 접시 (분할 1:4) 포함 된 BGM의 9 mL를 준비 합니다. 각 접시에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 합니다.
    10. 1.1.6 단계를 반복 합니다. 1.1.8 하.
    11. 300 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심는 상쾌한 발음 하 고, 신선한 BGM의 10 mL에 resuspend. 셀을 계산 하 고 셀 농도 계산.
      참고:이 절차는 약 7.5-8.3 105 셀/강아지 x를 생성합니다.
    12. 4 ° C에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심은 상쾌한 발음 하 고 중간 포함 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 40% α-MEM 및 50%에 resuspend FBS. 세포 현 탁 액의 1.5 mL 유리병 당 2 × 106 세포의 총 2 mL cryovials 전송.
    13. 플래시는 액체 질소 탱크에서 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 고정 합니다. 1 년 이내 셀을 사용 하 여 전체 기능을 보장. 이러한 기본 OBs를 사용 하 여 확산 (1.2 단계), 차별화를 평가 하기 위한 (ALP 분석: 단계 1.4., 1.5.)와 생체 재료의 강화 (1.6 단계.). 이러한 세포를 사용 하 여 공동 문화 (2.3 단계) OC 선구자 뼈 골 수 유래의 성숙에 대 한.
  2. 산부인과 확산 분석 결과
    1. 전 37 ° C, 5% CO2 컨트롤에 대 한 기본 OBs. 사용 표준 조직 배양 배지를 추가 하기 전에 24 시간에서 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시 및 소재 샘플을 위한 서 스 펜 션 문화 판에 BGM의 1 mL에 14 m m 직경 β-TCP 디스크를 품 어 플라스틱에 셀 첨부를 하지 마십시오.
    2. 발음 사전 인큐베이션 매체 및 다음 기본 마우스 OBs BGM에 resuspend. 24-잘 조직 배양 플레이트 (1 mL/음)에 4.4 x 104 OBs/cm2 미리 incubated β-TCP 디스크에 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에서와 컨트롤 그룹에 대 한 추가 합니다. OBs는 조직 배양 플레이트 나는 소재에 연결 됩니다.
    3. 37 ° C, 5% CO2에 14 일에 품 어. 인큐베이션 기간 동안 매체 2-3 일 마다 변경 하 고 각 우물에 신선한 BGM의 1 mL를 추가 합니다.
    4. 산부인과 확산을 평가 하기 위해 전송 β-TCP 디스크 7-14 일에 현 탁 액 문화 접시에 성장 하는 세포에서 신호를 제외 하려면 새로운 우물.
    5. 오래 된 매체를 발음, BGM (37 ° C)의 0.5 mL을 추가 하 고 30 분에서 37 ° C, 5% CO2배양 배지를 품 어. 다음 셀 확산 시 약 x 10의 55 µ L를 추가 (1시 10분 희석) 잘 문화에 직접. 공백, 3 웰 스 BGM의 0.5 mL 및 55 µ L 10 x 셀 확산 시 약의 준비. 37 ° C, 5% CO2에서 30 분 동안 모든 접시를 품 어.
    6. 철회 및 검은 96 잘 접시에는 상쾌한의 150 µ L 각 우물에서 전송 및 560 nm에서 여기와 590에서 방출 형광을 읽고 nm. 샘플 수치에서 빈 수치를 뺍니다.
  3. 산부인과 차별화 및 강화 분석 실험
    1. 전 37 ° C, 5% CO2 컨트롤에 대 한 OBs. 사용 표준 조직 배양 배지를 추가 하기 전에 24 시간에서 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시와을 피하기 위해 소재 샘플에 대 한 서 스 펜 션 문화 판에 BGM의 1 mL에 14 m m 직경 β-TCP 디스크를 품 어 플라스틱을 셀 첨부 합니다.
    2. 발음 사전 인큐베이션 매체 및 다음 기본 마우스 OBs BGM에 resuspend. 24-잘 조직 배양 플레이트 (1 mL/음)으로 미리 incubated β-TCP 디스크에 104 OBs/cm2 x 8.8 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에서와 컨트롤 그룹에 대 한 추가 합니다. OBs는 조직 배양 플레이트 또는 소재 샘플에 연결 됩니다.
    3. 포함 된 BGM, 50 µ g/mL ascorbic 산 5 m m β-glycerophosphate 24 h는 OBs의 추가 후 osteogenic 강화 매체 (MM)의 1 mL와 BGM을 장착 하 고 37 ° C, 5% CO2에 14 일에 품 어. 각 잘 갓된 m M의 1 mL와 함께 2-3 일 마다 매체를 변경 합니다.
  4. 산부인과 분화 세포 lysates에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 활동에 의해 평가
    1. 하루 7 m M의 추가 후에 높은 산 활동을 측정 하는 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 살 균 1 x PBS (37 ° C)의 1 mL로 씻어. 조심 스럽게-80 ° c.에 플레이트를 고정 하 고 조직 문화 플라스틱이 나 소재에 유지 하는 연결 된 셀 수 있도록 PBS 발음
    2. 24 시간 후 (또는 최대 2 주), 제어 조직 문화 접시와 실내 온도 (RT) 산부인과 세포에 대 한 준비 하에 소재 현 탁 액 문화 접시를 녹여. 소재 샘플에 대 한 β-TCP 디스크 접시에 연결 된 셀을 제외 하는 새로운 서 스 펜 션 문화 접시에 전송 합니다. 두 접시를 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 당 75 µ L를 추가 합니다. 400 쉐이크/분 통에 5 분 동안 접시를 흔들어.
    3. 0.5 mL microcentrifuge 튜브 및 파편을 제거 하는 RT에 6 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에 세포 lysate를 전송할. 검은 96 잘 접시에 샘플 세포 lysate 상쾌한의 50 µ L을 추가 하 고 50 µ L 200 µ M 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl 인산 염 (DiFMUP) fluorogenic 기판 ALP 버퍼 (pH 10) 잘 당 x 2에 녹아 구성 된 솔루션의 추가. 1 x 세포 세포의 용 해 버퍼와 2 x ALP 버퍼를 포함 하는 1:1 솔루션의 100 µ L로 두 빈 우물을 설정 합니다.
    4. 8 기준 100 μ/는 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU)까지 0.5에서 1 x 세포 세포의 용 해 버퍼 및 표준 참조 커브를 생성 하는 2 x ALP 버퍼를 포함 하는 1:1 솔루션에 녹아 200 μ M와 잘 준비 합니다.
    5. 15 분 동안 37 ° C에서 검은 접시를 품 어 하 고 다음 읽기 358 nm에서 여기와 455에서 방출 형광 nm. 참조 표준에서 빈 읽기와 샘플 수치를 뺍니다.
    6. 단백질 농도 대 한 색도계 분석 실험을 사용 하 여 단백질의 총 금액을 세포 lysates에서 ALP 효소 활동을 정상화. 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 단백질 기준 범위 0.05-2.5에서 µ g / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위해 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1에 녹아.
    7. 샘플 세포 lysates 및 BSA 단백질 표준 중복을 준비 합니다. 96 잘 접시에 샘플 세포 lysate의 5 µ L 또는 표준 BSA 단백질의 5 µ L을 추가 하 고 다음 시 A 약의 25 µ L을 추가 ' 및 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 5 µ L로 두 빈 우물을 시 나 설정의 200 µ L. 15 분에 대 한 실시간에 번호판을 품 어 고 690에서 흡 광도 읽고 다음 nm. 참조 표준에서 빈 읽기와 샘플 수치를 뺍니다.
  5. 세포 배양에서 ALP를 얼룩에 의해 평가 하는 OB 차별화
    1. 하루 7 제어 조직 문화 접시에 현 탁 액 문화 접시에 소재 m M의 추가 후에 교양된 OBs에서 ALP를 얼룩.
    2. 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 1x PBS (37 ° C)의 0.5 mL와 함께 그것을 대체. PBS를 발음 하 고 1 분 동안 RT에서 버퍼링 하는 10% 포 르 말린의 0.5 mL에 그들을 배양 하 여 세포를 수정.
    3. 단일 사용 피펫으로와 버퍼링 10% 포 르 말린을 발음 하 고 워시 버퍼 (0.05% Tween20 1 x PBS에) 0.5 mL를 추가 합니다.
    4. 1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl 인산 염/니트로 블루 tetrazolium (BCIP/NBT) 기판 태블릿 초순과 완전히 해산 때까지 소용돌이의 10 mL에 용 해. 솔루션 빛에서 보호 하 고 2 시간 이내에 사용 해야 합니다.
    5. 워시 버퍼를 발음 하 고 BCIP/NBT 기판 솔루션의 0.5 mL를 바꿉니다 및 RT에 접시 10 분 Aspirate에 대 한 어둠 속에 얼룩 솔루션을 품 어 워시 버퍼의 0.5 mL를 바꿉니다.
    6. 새로운 우물으로 얼룩진된 β-TCP 디스크 전송 및 ALP 묻은 접시 기록 ALP 얼룩을 기존의 평판 스캐너로 스캔.
  6. 오늘 강화 알리자린 레드 S (ARS)와 얼룩에 의해 평가
    1. M M의 추가 후 기본 OBs 14 일을 포함 하는 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 린스 두 번 실시간 Aspirate에서 1 x PBS의 0.5 mL PBS 0.5 mL 10%의 10 분에 대 한 실시간에 말린 솔루션을 버퍼링 추가 하 여 셀을 해결.
    2. 단일 사용 피펫으로와 버퍼링 10% 포 르 말린을 발음 하 고 초순의 0.5 mL로 두 번 씻어.
    3. 고정된 OBs 40mm ARS 얼룩 솔루션 (pH 4.2)의 0.25 mL 초순에 녹이 고 100 쉐이크/분 통에 10 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어 추가 합니다.
    4. 단일 사용 피펫으로 얼룩 솔루션을 발음 하 고 초순 물 1 mL로 씻어. 난다 제거 하려면이 시간 5-10 단계 반복 얼룩.
      참고: 헹 구는 솔루션 색 이어야 한다.
    5. 초순 수를 발음 하 고 차가운 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 100 쉐이크/분 통에 10 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어.
    6. PBS를 발음 하 고 새로운 우물을 스테인드 β-TCP 디스크 전송 판 기록 강화를 평판 스캐너로 스캔.
    7. 10 %cetylpyridinium 염화 솔루션의 0.25 mL을 추가 하 고 분 100 쉐이크/ARS 염료를 추출 하는 통에 15 분 동안 RT에 접시를 품 어.
    8. 1.5 mL 튜브를 실시간에 5 분 동안 17000 x g 에서 원심 분리기는 supernatants 전송
    9. 희석 비율 1시 10분-1: 20의 추출 물에 10 %cetylpyridinium 염화 솔루션을 추가 하 고 샘플 (300 µ L)만 10 %cetylpyridinium 염화를 포함 하는 두 개의 빈 우물을 포함 하 여 96 잘 접시에 추가.
    10. 7 ARS 기준 표준 곡선을 생성 하기 위해 40mm ARS 솔루션 (pH 4.2) 10 %cetylpyridinium 염화 솔루션 얼룩을 diluting 하 여 400 µ M 4에서 배열 준비.
    11. 중복에 96 잘 접시 참조 표준의 300 µ L를 추가 합니다.
    12. 공백, 샘플의 흡 광도 읽었고 520에서 표준 참조 nm.
    13. 참조 표준에서 빈 읽기와 샘플 수치를 뺍니다.

2. 마우스 오브 OC 공동 문화 성숙 OCs 파생

  1. 준비 및 소 외피 뼈 조각의 살 균
    1. 주변 조직에서 뼈의 세그먼트를 청소 하 고 배수 뼈와 골 수를 제거.
    2. 24 h 50 ° C에서 뼈를 건조.
    3. 더 작은 조각으로 뼈를 슬라이스 하 고 조각 (약 300-350 µ m 두께)으로 잘라 다이아몬드 블레이드를 보았다 낮은 속도 사용 하 여.
    4. 2 차 디스크 (1 c m2)에 300-350 µ m 조각 잘라.
    5. 청소 하려면 뼈 디스크 (1 c m2), 잠금식 유리 유리병 및 채우기 증류수에 넣어. 초음파 목욕으로 채워진된 유리 제 작은 유리병을 전송 하 고 sonicate 5 분 세 번이이 단계를 반복 하는 동안.
    6. 증류수는 떨어져 따르십시오, 70% 에탄올을 추가 하 고 5 분 동안 sonicate.
    7. 70% 에탄올을 부 어와 100% 에탄올을 바꿉니다.
      참고: 최대 4 주까지 4 ° C에서 100% 에탄올에 뼈 조각을 저장 합니다.
    8. 무 균 조건 하에서 각 측에 15 분 동안 자외선과 뼈 조각을 비추는합니다 추가 사용까지 소독된 뼈 조각 RT에서 메 마른 문화 접시에 저장 합니다.
  2. 골 수 OC 선구자의 분리
    1. 순진한 8-12 주 오래 된 BALB/c 마우스의 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine 솔루션의 복 (i.p.) 주사를 사용 하 여 안락사
    2. 마우스 화관과 경골에서 골 수 OC 전 격리 합니다.
    3. 엉덩이 관절에 신체에 가장 가까운 지점에서 멸 균가 위로 다리를 제거 하 고 무릎과 발목 관절에 팔 다리를 잘라 살 균 메스와 집게 부드러운 조직을 제거. epiphyses를 잘라. 제거 하 고 세포 현 탁 액을 얻기 위해 1 mL 주사기에 부착 된 27 G 바늘을 사용 하 여 6 cm 멸 균 페 트리 접시에 1 mL BGM으로 골 수를 일시 중단.
    4. 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 추가, 6 cm의 BGM과 같은 50 mL 원뿔 튜브에 5 mL를 페 트리 접시를 씻어. 5 분에 대 한 350 x g 4 ° c에서 원심 분리기 Resuspend BGM, 1 nM 1,25-(OH)2포함 된 OC 차별화 매체 (DM)에 셀-비타민 d 3와 1 µ M 스타 글란 딘 E2 (1 mL/음).
      참고: 하나의 BALB/c 마우스는 한 24-잘 문화 접시 OC 선구자의 충분 한 숫자를 제공합니다.
  3. 마우스 오브 OC 소재 공동 문화의 준비
    1. 전 품 어 14 m m 직경 β-TCP 디스크 또는 소 뼈 조각 (1 c m2) 1 mL에 BGM의 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에 셀을 추가 하기 전에.
      참고: 소 뼈 조각은 physiologic 기판 제어 생체 존재 OC 차별화를 공부.
    2. 8.8 x 기본 OBs는 생체 또는 제어 뼈는 24-잘 서 스 펜 션 문화 접시에서 또는 24-잘 조직 문화 접시에 BGM에 정지의 104 셀/c m2 를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.
      참고: OBs는 플라스틱이 나 소재 또는 소 뼈를 연결합니다.
    3. 갓 절연 24 h 골 수 OC 전 5 일 동안 37 ° C, 5% CO2 주 문화와 OBs 교양 추가 합니다. 매일 갓 OC dm 매체를 교체 합니다. 다음에 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (트랩) OC 차별화를 평가 하기 위해 OCs 얼룩.
  4. OC 차별화 트랩 얼룩에 의해 평가
    1. 성숙한 multinucleated OCs, 단계, 2.3.3에서에서 얻은 특성 제어 조직 문화 접시와 소재 현 탁 액 문화 접시에서 배양을 발음 하 고 1x PBS (37 ° C)의 1 mL를 추가 합니다. PBS를 발음 하 고 10 분 RT에서 버퍼링 하는 10% 포 르 말린 용액 1 mL에 그들을 배양 하 여 세포를 고치십시오.
    2. 단일 사용 피펫으로 버퍼링 10% 포 르 말린 솔루션 발음 및 1 x PBS의 1 mL에 추가 실시간 반복이이 단계 세 번, PBS 발음, 트랩 버퍼 (pH 5)의 1 mL를 바꿉니다 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
    3. 트랩 버퍼를 발음 하 고 1:1 100% 아세톤과 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 30에 대 한 단일 사용 피펫으로 aspirate 아세톤-에탄올 솔루션을 신속 하 게 s. 완전히 실시간에 접시를 건조 RT에서 접시를 품 어
    4. 솔루션 얼룩 트랩에 대 한 준비는 10 mg/mL N, N-dimethylformamide 디졸브 0.6 mg/mL 빠른 붉은 보라색의 트랩 버퍼에 소금과 빠른 붉은 보라 빛 소금 10 mL 0.1 mL naphthol-AS-MX 인산 재고 솔루션의 추가에 naphthol-AS-MX 인산 재고 솔루션 트랩 버퍼에서.
    5. 트랩 솔루션 얼룩의 1 mL를 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어 다음 얼룩이 솔루션, 트랩을 발음 하 고 반응을 중지를 초순의 1 mL를 추가.
    6. 가벼운 현미경을 사용 하 여 빨간색 스테인드 OCs 관찰 새로운 우물으로 얼룩 후 β-TCP 디스크 및 소 뼈 조각을 전송 (배율: 10 배) 트랩 + 3 개 이상의 핵으로 성숙한 OCs를 열거 하 고.

3. 중요 한 크기의 마우스 Calvarial 결함 모델

  1. 0.1 mg/kg buprenorphine를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) 진통에 대 한 8 주 오래 된 BALB/c 마우스에.
  2. 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine i.p.의 혼합물으로 마우스를 anesthetize, 그들을 축축한 유지와 저체온증을 방지 하기 위해 전체 절차 동안 37 ° C에서 난방 장치 플레이트에 마우스를 놓고 눈에 젤 이나 연 고를 추가 합니다. 발가락과 꼬리 핀치에 의해 마 취 깊이 평가 합니다.
  3. 귀 사이의 머리 위에 모피를 면도 하 고 7.5 %povidone 요오드 솔루션 및 70% 에탄올으로 표면 청소.
  4. 노출 하는 calvarium 고 메스로 근 근 의해 오른쪽 정수 리 뼈 위에 pericranium 결합 조직 제거 살 균 메스와 귀 사이 두개골 상단 화살 절 개를 중간 확인 합니다.
  5. 단계에서 오른쪽 정수 리 뼈는 ectocortex와 일부 endocortex 극복을 정상적인 염 분 해결책으로 일정 한 관개에서 직경 4 mm (2000 rpm)와 살 균 치과 판형을 사용 하 여 오른쪽 정수 리 뼈의 중요 한 크기의 결함을 만듭니다.
  6. Dura mater의 손상을 방지 하려면 나머지 endocortex를 돌파, 신중 하 게 calvarial 뼈를 들어올려 고 집게로 제거 작은 periosteal 엘리베이터를 사용 합니다. 결과 결함 직경에서 약 3.5 m m 원형 이어야 한다.
  7. 채워 calvarial 결함 미리 젖 (RT에서 살 균 1 x PBS) 집게를 사용 하 여 β-TCP/C 거품.
  8. 일치 하는 나이, 가짜 빈 결함 부정적인 컨트롤의 적절 한 수를 준비 합니다.
  9. 자리에는 소재를 유지, 두 반대 지점에서 결함의 가장자리에 조직 접착제의 0.5 µ L를 넣어.
  10. 비 흡수 성 봉합 사를 피부를 닫습니다.
  11. 마 취 마우스에 다음 수술을 수행 하기 전에 멸 균 상태를 유지 하기 위해 찬 sterilant와 모든 수술 기구를 청소.
  12. 수술 후 치료에 대 한 동물을 복구 기간 동안 적절 한 모니터링을 위한 수술 영역에서 37 ° C에서 건조 하 고 깨끗 한 난방 접시에 놓습니다. 그들은 일어날 때까지 호흡 속도, 온도 및 점 막 및 눈 마다 10 분의 색상을 모니터링 합니다.
  13. 음식과 물 전체 복구까지 다른 동물에서 분리와 함께 케이지에 운영된 의식 쥐를 전송 합니다. 0.1 mg/kg buprenorphine 주사 72 h. 반환에 대 한 하루에 두 번 수술 후 진통 치료에 대 한 사우스 캐롤라이나 완 그들의 감 금 소를 마우스.
  14. 소재의 효과 확인 하려면 200 밀리 그램/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine의 솔루션 마우스 i.p. 안락사.
  15. 8-12 주 후 이식에 안락사 마우스 날카로운가 위로 목을 벨.
  16. 수정 4.5 %30 mL에 잘린된 마우스 머리 버퍼링 조직에는 정착 액의 완전 침투 되도록 1-2 주 동안 말린 솔루션.
  17. 최대 1 년에 4 ° C에서 장기 저장을 위한 70% 에탄올으로 머리를 전송.
  18. 사용 하 여 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT) 또는 뼈 재생을 평가 하기 위해 표준화 된 undecalcified 조직학 기술 계산. MicroCT 높은 해상도에서 사후 샘플에 대 한 검색을 사용 하 여 가능 하다 (90 k v, 4 분) 2D 및 3D 화살 및 정면 비행기에서.
  19. Undecalcified의 조직학에 대 한 에탄올의 성적 오름차순에서 머리를 탈수 하 고 글리콜 메 틸 메타 크 릴 산에 포함 합니다.
  20. 다이아몬드 톱으로 글리콜 메 틸 메타 크 릴 산 포함 된 블록을 잘라내어 약 80-100 µ m의 두께로 섹션을 갈기.
  21. Levai Laczko 뼈 섹션 스테인드 새로운 뼈 형성14식별을 평가 합니다.

4. 면역 반응 생체 외에서

  1. 순진한 8 주 오래 된 BALB/c 마우스 i.p. 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine의 솔루션으로 안락사
  2. 마우스의 오른쪽에, 왼쪽에 모피를 면도 놓고 70% 에탄올과 복 부의 왼쪽에는 피부를 청소 합니다.
  3. 뒤로 살 균가 위를 사용 하 여 복 부에 갈비뼈를 따라 왼쪽에 마우스의 피부에는 길이가 10 mm이 고 1mm 깊은 절 개를 확인 합니다.
  4. 피부를 열고 후 복 막에 노출 합니다. 10 m m 길고 무 균 조건 하에서 위를 사용 하 여 복 막으로 1mm 깊은 절 개 보다는 더 적은 확인 합니다.
  5. 비장을 proximally 위를 밀어.
  6. 비장의 살 균 겸 부드럽게 잡고 고 조직과 그것을 아래에 첨부 하는 혈관을 절단 하 여 제거 합니다.
  7. 차가운 1x 살 균 PBS의 10 mL를 포함 하는 50 mL 튜브에 그대로 비장을 놓습니다.
  8. 2 살 균 겸 자 또는 2 살 균 유리 슬라이드를 사용 하 여 비장을 닦지에 의해 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
  9. 1 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 차가운 1 x PBS를 가진 불 임 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 하 여 파편을 제거 합니다.
  10. 단일 세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브에 4 ° C에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 발음 하 고, 삭제는 상쾌한. 다음에 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
  11. RT에서 14 분 세포 현 탁 액을 품 어 고 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체의 45 mL를 추가 하 여 반응을 중지.
  12. 4 ° C에서 10 분 동안 300 x g 에서 세포 세포의 용 해 한 후 세포를 원심 고는 상쾌한 다음 삭제.
  13. Resuspend splenocytes 10% 포함 된 RPMI 매체에 열-비활성화 FBS, 1% 페니실린 스 솔루션, 0.1 %gentamicin, 0.2% ß-mercaptoethanol, 및 1% 비 본질적인 아미노산.
  14. 전 셀 뿌리기 전에 37 ° C, 5% CO2 에서 24 h RPMI 매체를 포함 하는 96-잘 메 마른 문화 접시에 있는 β-TCP/C 거품을 품 어.
  15. 적정 한 숫자, 예를 들어splenocytes을 추가. 1.25 x 10,5, 2.5 x 105 와 5 x 105포함 된 RPMI 매체 및 첨가제, 또는 미리 incubated β-TCP/C 거품 없이 96-잘 조직 배양 플레이트에 웰 스 /well.
  16. 추가 10 µ g/mL concanavalin (Con A) 100 µ L/잘 적절 한 우물의 총에 대 한 매체에 녹이 고 다음 37 ° C, 5% CO2 72 h에 품 어.
  17. Bromodeoxyuridine (BrdU) 분석 결과와 세포 증식을 측정 합니다. 세포 배양의 48 h에 BrdU 라벨 솔루션의 10 µ L/잘 추가 하 고 추가 24 h에 대 한 접시를 품 어.
  18. 72 h에는 상쾌한을 수집 하 고 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 합니다.
  19. 200 µ L/잘 고정 솔루션의 각 음을 추가 하 고에 실시간 Aspirate에서 30 분 동안 고정 솔루션 품 어. 100 µ L/잘 안티 BrdU 항 체 작업 솔루션을 추가 하 고 90 분 동안 품 어.
  20. 항 체 솔루션 발음, 세 번으로 200-300 µ L/잘 세척 솔루션의 웰 스를 헹 구 고 세척 솔루션을 제거.
  21. 100 µ L 기판 솔루션의 추가 RT에서 3-10 분 동안 품 어 다음 450에서 흡 광도 측정 nm.
  22. 인터 루 킨-1β (IL 1β), interleukin-2 (일리노이-2), 인터 루 킨-4 (IL-4) 및 인터페론-γ를 (IFN-γ) 수집된 supernatants 표준 ELISA를 사용 하 여 측정 합니다.

5. 높은 처리량 복 모델

  1. 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine i.p.의 혼합물으로 여성 6 8 주 오래 된 BALB/c 마우스를 anesthetize 하 고 그들을 축축한 유지 하 고 저체온증을 방지 하기 위해 전체 절차 동안 37 ° C에서 난방 장치 플레이트에 마우스를 배치 하는 눈에 젤 이나 연 고를 추가 합니다. 발가락과 꼬리 핀치에 의해 마 취 깊이 평가 합니다.
  2. 복 부 털을 면도 하 고 7.5 %povidone 요오드 솔루션 및 70% 에탄올으로 청소.
  3. 교육을 따라 피부를 통해 8 m m 긴 중간 절 개 알바. 메스를 사용 하 여 복 막에 작은 절 개를 확인 합니다.
  4. 장소 살 균 PBS 복 막 구멍으로 β-TCP/C 거품 이식 (2 x 2 x 2 m m3) 젖 었 또는 없이 나이 일치 하는 가짜 통제 쥐에 대 한 자료를 추가 합니다.
  5. 복을 봉합 하 고 각각 흡수 성 및 비 흡수 성 봉합 사를 피부.
  6. 마 취 마우스에 다음 수술을 수행 하기 전에 멸 균 상태를 유지 하기 위해 찬 sterilant와 모든 수술 기구를 청소.
  7. 수술 후 치료에 대 한 동물을 복구 기간 동안 적절 한 모니터링을 위한 수술 영역에서 37 ° C에서 건조 하 고 깨끗 한 난방 접시에 놓습니다. 그들은 일어날 때까지 호흡 속도, 온도 및 점 막 및 눈 마다 10 분의 색상을 모니터링 합니다.
  8. 음식과 물 전체 복구까지 다른 동물에서 분리와 함께 케이지에 운영된 의식 쥐를 전송 합니다. 그들의 감 금 소를 완벽 하 게 복구 된 쥐를 반환 합니다.
    참고:이 절차는 최소한의 고통을 유도 한다. 수술 후 진통 요법 일반적으로 필요 하지 않습니다. 운영 0.1 mg/kg buprenorphine 주사 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 사우스 캐롤라이나 또는 통증에 대 한 다른 적절 한 진통 약물.
  9. 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine i.p. 솔루션 마우스 7 일 후 이식 안락사
  10. 7 일 후 이식에 게 1 mL를 사용 하 여 복 막 구멍 마우스 머리를 잡고 왼쪽된 낮은 복 부의 사분면에 바늘을 삽입 하 여 차가운 PBS의 3 mL의 총 25 G 바늘 주사 통 그리고 proximally 목표로.
    참고: 복 막 액체 RBCs의 무료 되어야 합니다.
  11. 4 ° C에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 복 막 게 유체 원심 고 IL 1β, 일리노이-2, 및 IL-4 cytokines의 ELISA 측정-20 ° C에서 저장 하는 복 막 액체를 수집 합니다.
  12. 발음은 상쾌한, 셀 펠 릿 1 ml의 PBS, resuspend 및 복 막 세포는 hemocytometer에 trypan 블루를 사용 하 여.
  13. Cytocentrifuge 유리 슬라이드에 5 x 105 세포에 세포 현 탁 액 건조 하 고 차동 셀 개수에 대 한 얼룩 슬라이드 수 있습니다.
  14. 가벼운 현미경을 사용 하 여, 총에서 300 셀의 최소를 계산 하 고 대 식 세포, 호 산 구는, 호 중구, 림프 톨 사이 차별화 합니다.

6. 아민 피하 모델

  1. 100 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine i.p.의 혼합물으로 여성 6-8 주 오래 된 BALB/c 마우스를 anesthetize, 그들을 축축한 유지와 저체온증을 방지 하기 위해 전체 절차 동안 37 ° C에서 난방 장치 플레이트에 마우스를 놓고 눈에 젤 이나 연 고를 추가 합니다. 발가락과 꼬리 핀치에 의해 마 취 깊이 평가 합니다.
  2. 마우스의 뒷면에, 복 부 털을 면도 놓고 7.5 %povidone 요오드 솔루션 및 70% 에탄올과 면도 표면을 청소 합니다.
  3. 8 m m 긴 중간 절 개는 교육을 따라 피부를 통해 알바 메스 그리고 이식 PBS를 사용 하 여 복 부의 피부 아래 소재 (2 x 2 x 2 m m3) 젖 었 또는 아무 자료 나이 일치 하는 가짜 통제 쥐에 대 한 추가.
  4. 비 흡수 성 봉합 사로 봉합은 피부.
  5. 마 취 마우스에 다음 수술을 수행 하기 전에 멸 균 상태를 유지 하기 위해 찬 sterilant와 모든 수술 기구를 청소.
  6. 수술 후 치료에 대 한 동물을 복구 기간 동안 적절 한 모니터링을 위한 수술 영역에서 37 ° C에서 건조 하 고 깨끗 한 난방 접시에 놓습니다. 그들은 일어날 때까지 호흡 속도, 온도 및 점 막 및 눈 마다 10 분의 색상을 모니터링 합니다.
  7. 음식과 물 전체 복구까지 다른 동물에서 분리와 함께 케이지에 운영된 의식 쥐를 전송 합니다. 그들의 감 금 소를 완벽 하 게 복구 된 쥐를 반환 합니다.
    참고:이 절차는 최소한의 고통을 유도 한다. 수술 후 진통 요법 일반적으로 필요 하지 않습니다. 운영 0.1 mg/kg buprenorphine 주사 동물 고통의 흔적을 표시 하는 경우 사우스 캐롤라이나 또는 다른 적절 한 진통제.
  8. 때 이식 사이트 검토 준비, 200 mg/kg 케 타 민 및 24 mg/kg xylazine의 솔루션 마우스 i.p. 안락사.
  9. 8 주 후 주입, 주입 사이트 주위 조직 (1 c m2)을 삭제할.
  10. 버퍼링 4.5% 포 르 말린 용액에 하룻밤 조직을 해결 하 고 파라핀에 포함 한 4 µ m 섹션으로 잘라.
  11. 염증 또는 Masson의 콜라겐 증 착 및 섬유 증 trichrome Hematoxylin와 오신 (H & E) 4 µ m 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면도 착 색.

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Representative Results

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Β-TCP 뼈 수리에 대 한 소재로 그것의 효과 대 한 평가, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 심사 방법 사용. 첫째, 우리는 초기 중간 혼자 컨트롤에 비해 β-TCP 디스크에 산부인과 응답 측정. 그림 2 문화의 7 및 14 일 OB 생존 β-TCP 디스크에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Β-TCP 디스크는이 소재는 강화도 산부인과 확산 억제를 나타내는 뿐만 아니라 조직 문화 플라스틱에서 매체와 문화 스에서 metabolically 활성 셀에서 측정 하는 세포 생존 능력 OBs에 대 한 동일 했다.

더 평가 OBs, 질적 및 양적 방법을 사용 하 여 차별화의 감 적으로 알프 활동을 측정 했습니다. 그림 2 는 문화의 7 일 후 문화 우물에서 ALP 효소 활동을 보여 줍니다. 혼자 매체와 우물에 OBs 최적의 강화에서 매체 (MM) OBs 강렬한 ALP 얼룩, 산부인과 차별화의 높은 수준을 반영 했다 기준선 ALP 활동을 했다. 반면, OBs는 OBs m M에서 incubated 보다 덜 분화 하는 β-TCP 디스크에 도금. 양적 분석 결과에서 ALP 농도 ALP 농도 m M 컨트롤에 비해 β-TCP 디스크에 경작 하는 세포에 40% 더 낮은 반면, 기준선 매체와 비교 하는 m M를 포함 하는 웰 스에 대 한 높은 77% 이었다. 이러한 결과 β-TCP 디스크 m m 플라스틱의 최적의 조건에 그들 보다 덜 분화에 성장 하는 세포를 보여, 하지만 그들은 충분히는 생체에 분화 했다.

OBs의 또 다른 중요 한 특징은 그들의 능력을 유도 강화, 뼈 치유에 필수적인 단계입니다. 우리는 14 일 후 ARS와 교양된 산부인과 세포를 얼룩이 고 그 강화 했다 m M 컨트롤 OBs 혼자와 문화 우물 (그림 2)에서 β-TCP 디스크 매체에 경작에 비해 더 높은 발견. ARS 농도 측정 하 고, 우리는 m M 컨트롤 β-TCP 그룹 보다 45% 이상 했다 발견. 이러한 데이터는 OBs 성숙 m M의 플라스틱에 경작을 설명 하 고 차별화 혼자 매체와 β-TCP 디스크에 그 보다 더 나은 형성할.

OCs β-TCP 디스크에 대처 하는 방법을 확인 하려면 우리는 OBs 공동 교양 골 수 OC 전 OC 형태학의 검사 다음으로 자란 기술 사용. 산부인과-OC 공동 문화 5 일에서 관찰 되었고 OC dm 플라스틱에 성장 하는 세포와 뼈 조각 및 β-TCP에 성장 하는 세포 사이 크게 달랐다. 플라스틱, OCs 했다 크고 광범위 한 반면 생리 기판에 OCs 작은, 밖으로 덜 확산 되었고 불규칙 모양 (그림 3). OCs quantitate, 하 우리는 트랩 + OCs를 열거 하 고 발견 하는 β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) 조직 문화 컨트롤 (1140 ± 15.71/cm2) 및 뼈 조각 (709 ± 59.69/cm2), 비교와 함께 알을 품을 때 더 높은 숫자를 했다 제안 β-TCP 디스크 (그림 3)에 향상 된 OC 차별화.

확인 하려면를 상업적으로 사용할 수 있는 β-TCP/C 거품에서 vivo에서, 우리 쥐에 calvarial 결함 크기의 중요 한 모델을 사용. 우리는 글리콜 메 틸 메타 크 릴 산 포함와 얼룩 Levai Laczko undecalcified 조직학 기술에 의해 처리 하는 대표적인 조직학 섹션을 보여줍니다. MicroCT 및 조직학 결함 영역 내에서 새로운 뼈 형성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 그림 4에 조직학 단면도 예를 보여줍니다. 뼈 수술 유도 결함 했다를 떠날 때 빈 (가짜), 우리 전체 결함을 다루는 얇은 층을 관찰 했지만 전혀 중요 한 뼈 형성 12 주 post 작업 확인 만든된 뼈 골절의 중요 한 크기에. 대조적으로, β-TCP/C 거품을 포함 하는 결함 때 β-TCP/C 거품 잔해 일부 혈관과 뼈 형성의 증거 없이 결함 영역을 브리지 하는 염증 세포를 포함 하 여 조밀한 섬유 조직으로 둘러싸여 있었다.

이물질 응답을 평가 하려면 우리는 생체 면역 및 알레르기 반응을 시험관에서 분석 결과 사용 하 여 평가. 그림 5 에 순진한 splenocytes 매체 혼자 또는 β-TCP/C 거품 incubated 했다 때 순진한 비장 세포 응답 하지 않았습니다 확산 또는 일리노이-2를 생산 하는 방법을 보여 줍니다 및 IFN-γ cytokines 일리노이-4. 반면, ConA에 포함 된 문화, 세포 증식 및 cytokine 생산 IL 1β을 제외 하면 증가. 세포 응답은 영향을 받지 때 공동 경작 ConA와 β-TCP/C 거품 ConA 혼자, 그 β-TCP/C 거품을 나타내는 비교도 증가 감소 생체 외에서 응답 되었다.

Β-TCP/C 거품 vivo에서 면역 반응을 유발 여부를 확인 하려면 우리는 그것을 이식 1) intraperitoneally 및 염증 세포 및 사이토카인 농도 2) 피하 및 복 막 게 액체에서 측정 및 평가 염증 그리고 섬유 증 주입 사이트의 조직학 단면도에. 표 1, 복 막 게 액체에서 차동 셀 염증 세포의 총 수는 가짜 컨트롤에 비해 β-TCP/C 거품 이식 마우스에 상당히 높은 보여준다. 또한, 모든 종류의 세포 증가 숫자 했다. 그림 6A, 가짜 컨트롤에 비해 β-TCP/C 거품에 IL 1β, 일리노이-2, 및 IL-4 cytokines의 높은 농도가 있다. Β-TCP/C 거품 사우스 캐롤라이나 이식 생쥐에서 우리는 외국 기관과 염증 반응을 H & E 스테인드 (그림 6B) 섹션과 섹션 (그림 6 c) 8 주에 얼룩진 Masson의 Trichrome에 섬유 증의 증거에 거 대 한 셀을 관찰 했다. 반면, 가짜 컨트롤의 이식 사이트 최소한의 염증 및 아무 섬유 증 (그림 6 c) 했다.

Figure 1
그림 1: 기본 산부인과 셀 격리 다이어그램에 대 한 Calvaria 제거. 다이어그램에서는 곡선된가 위를 사용 하 여 4 컷 (빨간색 파선)와 calvarium를 제거 하는 방법을 보여 줍니다. 첫 번째 컷은 X에 X1에서 오른쪽 (R) 눈을 수직 2, 그리고 두 번째는 x X3에서 왼쪽 (L) 눈을 수직 4. 세 번째 컷 x X4에서 앞에 calvarium를 분리 하는 2, 및 4 컷 x X3에서 뒷면을 분리는 1. calvarium 제거 다음 자유롭다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: β-TCP 유도 체 외에 OB 분화 및 성숙. 오늘 생존 및 7 및 14 일 중간 혼자 (막대) 또는 β-TCP (오픈 바) 경작 하는 셀에 대 한 확산 (평균 ± SEM; n = 3). ALP 활동 정량화 세포 lysates의 단백질 콘텐츠를 정규화 (µ M DIFMU / µ g 단백질, 평균 ± SEM, n = 3) 하루 7에서에서 웰 스 ALP 얼룩진 문화를 보여주는 대표 이미지와 함께. 강화 ARS 농도 표시 cetylpyridinium 염화 추출 방법에 의해 ARS 스테인드 문화에서 계량 (µ M ARS, 평균 ± SEM, n = 3) 당일 14 대표 ARS 스테인드 문화 웰 스와. 뼈 성장 매체 혼자 (BGM);를 포함 하는 그룹 강화 작용 매체 (MM); Β-TCP입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 체 외에서 β-TCP 유도 OC 차별화. 대표 photomicrographs 마우스 OBs와 골 수 OC 전 공동 배양 후 5 일에서 트랩 + MNCs를 보여줍니다. 끝점 분석의 함정 + multinucleated 셀 (MNCs) c m2 당 트랩 + MNCs (≥3 핵)의 절대 수를 보여 줍니다 (± sem의 의미 n = 3) * * *p < 0.001. 그룹 포함 OC 차별화 중간 혼자 (DM); 뼈; Β-TCP입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 평가 vivo에서 β-TCP/C 거품 뼈의 중요 한 크기 calvarial 결함 모델에 이식. 8 주 오래 된 여성 BALB/c에서 만든 비 치유 calvarial 결함 (n = 3) 4mm 치과 판형을 사용 하 여 마우스. 치료 포함된 가짜 제어 (빈 결함)를 그룹화 하 고 β-TCP/C 거품 처리 결함. 12 주 후 주입에서 대표적인 조직학 섹션입니다. 포 르 말린 고정 조직을 글리콜 메 틸 메타 크 릴 산 포함 섹션 (80-100 µ m) Levai Laczko 염료와 스테인드. Photomicrographs 낮은 (왼쪽)와 높은 (오른쪽) 확대에 표시. 검은 삼각형 뼈의 결함을 나타냅니다. 블랙 * 뼈 조직과 화이트 나타냅니다 * β-TCP/C 거품을 말합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: β-TCP/C 거품 유발 체 외에서 세포 확산 및 cytokine 생산. 순진한 BALB/c 마우스 혼자, β-TCP/C 거품 또는 ConA 매체에 경작에서 Splenocytes. 표면에 뜨는 세포 증식 (BrdU), 그리고 일리노이-2, IL 1β의 생산 일리노이-4와 IFN-γ (중간 혼자 ●, ○ ConA, β-TCP/C 거품 ■, β-TCP/C 거품과 ConA □). 확산 결과 triplicate 샘플 (마약과 ± SEM) BrdU 분석 결과에서 평균 및 중복 샘플 (pg/mL ± SEM) 두 독립적인 실험에서 사이토카인 농도 평균으로. p < 0.05는 중요 하 게 고려 대 매체와 소재 및 ConA 대 ConA 소재에 대 한 혼자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 빠른 높은 처리량 i.p. 및 아민 마우스 모델에서 β-TCP/C 거품 뼈의 면역 반응 생체 내에 이식. (A) 여성 BALB/c 마우스 β-TCP/C 거품 i.p. 이식 또는 없이 추가 자료 (가짜). 7 일 후, 복 막 게 농도 cytokine (사이토카인 농도 pg/mL ± sem의 의미를 제시 하는 데이터)에 대 한 분석. 이러한 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 대표 (n = 5). p < 0.05 가짜에 비해 중요 한 여겨진다. (B-C) 여성 BALB/c 마우스 (n = 5) β-TCP/C 거품을 가진 사우스 캐롤라이나를 이식 또는 없이 추가 자료 (가짜). 이식 후 8 주, H & E (B)과 Masson의 Trichrome (C) 각각 염증과 섬유 증, 평가로 얼룩진 이식 사이트에서 피부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

가짜 Vitoss
셀 카운트 x 106 (총 세포의 %)
대 식 세포 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70.4) p < 0.001
호 산 구는 0.120 ± 0.011 (8.5) 1.181 ± 0.254 (25.5) p < 0.01
호 중구 0.002 ± 0.001 (0.2) 0.029 ± 0.011 (0.6) ns
림프 톨 0.048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0.041 (3.5) ns
총 세포 수 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0.001

표 1: Vivo에서 빠른 높은 처리량 i.p. 마우스 모델에서 면역 반응을 β-TCP/C 거품 뼈의 이식. 여성 BALB/c 마우스 이식된 i.p. β-TCP/C 거품 또는 자료 (가짜) 없이 했다. 7 일 후, 복 막 게 했다 얻은 염증 세포 수에 대 한 분석 및 차동 셀 계산 (데이터 셀 카운트 ± SEM을 의미). 이러한 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 대표 (n = 5).

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Discussion

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여기, 우리가 대표적인 바이오 뼈 재생 및 복구에 대 한 개발에 대 한 생체 적합성의 전 임상 평가 대 한 다양 한 접근 방식을 보여줍니다. 우리 OBs, OCs의 응답을 테스트 하 고 중요 한 뼈의 결함의 에 비보 치유 응답 모델 쥐 뿐만 아니라 에 체 외 그리고 vivo에서 면역 반응. 우리는 분석 작업과 데이터와는 생체 재료의 시험에서 파생 된 결론을 요약 설명 목적입니다. 우리는 우리의 전략 뼈 소재 생체 적합성의 귀중 한 프로필 생성을 보여줍니다.

1 차 셀 분석 OB와 OC 기능을 평가 하기 위해 사용 되었다. OBs는 뼈 형성과 생리 수리 하는 일을 담당 합니다. 그들은 가능한 유지, 차별화, 고 강화를 유도 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 형성할 수 있는 능력으로 순수 차별화 된 세포의 표식으로 세포 생존 능력, ALP, 및 ARS에 대 한 분석을 수행 하는 방법을 보여줍니다. 분석에 대 한 컨트롤 포함 매체, 기준선을 제공 하 osteogenic 강화 매체 (MM), 최적화 된 차별화 및 플라스틱에 OBs의 강화 작용. 후자의 제어 그룹 참조는 소재에 대 한 표준 이었다. OC 평가 대 한 우리 공동 경작 OBs와 골 파생 OC 선구자, 트랩, 체 외에서OCs15 를 식별 하는 데 널리 고 다음 열거 한 osteoclastic 효소와 스테인드 multinucleated 셀에 선구자를 분화 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀입니다. 이 분석 실험-의 상태--예술 고 수정 요구 하지 않았다. 그러나, 우리가 지적 형성할에 고립 된 기본 OBs의 품질에 관련 된 제한. 보존 된 OBs는 액체 질소에 저장 하 고 최적의 결과 위해 1 년 이내 사용.

오늘 첨부 파일 및 활동 테스트 β-TCP 디스크 보다 조직 문화 플라스틱에 높은 했다. 때 우리 OCs 평가, 플라스틱에 대 한 응답은 생리 기판16뼈의 예상된 차이점 관찰 합니다. 비교에서는, 뼈 및 β-TCP 유사한 형태학 상 변화를 유도 한다. Β-TCP 디스크에 대 한 응답에서 OCs의 트랩 분석 결과 열거는 숫자 크게 다른 뼈 조각 및 β-TCP는 나타났다. Β-TCP는 뼈 조각에 보다 높은 OC 차별화를 유도 한다. OC 차별화, 트랩 확고 분석 결과 이다. 이 방법에 필요한 아니 상당한 수정 했다. 그러나, 최상의 결과 얻으려면, 그것은 너무 오랫동안 셀을 품 어 필수적 또는 monocytic 근원의 모든 셀이 될 것입니다 트랩 양성.

비보에 응답, 해결 하기 위해 우리 β-TCP/C 거품으로 사용 모범 소재는 생체 외에서 분석 실험과 콜라겐에 사용 된 뼈13치유 촉진 β-TCP를 포함 하기 때문에. Β-TCP/C 거품은 상업적으로 사용할 수 있으며 임상 뼈 수리17,18에 대 한 사용, 그것이 공부 하 고, 예를 들어재미 있을 것 이다 재료의 다양 한 종류의 단 하나., 복 형 칼슘 인산 염 ( 어떻게 생물학 응답을 결정 하기 위해 이러한 분석에서 hydroxyapatite/β-TCP) 뿐만 아니라 광된 인간의 뼈 물자 사이 다. Vivo에서 응답에 대 한 우리 쥐 중요 한 크기의 calvarial 뼈 결함으로 β-TCP/C 거품을 이식 하 고 12 주 후 조직학 평가 가짜 컨트롤에 비해 차이 보였다. 그것은 또한 microCT19무료 정보 제공과 답변을 평가 가능입니다. 가짜 통제 쥐에 있는 결함이 했다 아무 중요 한 뼈 형성, 예상 했던 대로, 반면에 β-TCP/C 거품 유발 염증 반응, 섬유 증, 그리고 신생 골 형성의 초기 단계의 증거입니다. 이 방법은 이전 정돈20에 입증 되었습니다. 그러나, 우리의 접근 방법에서 다릅니다 우리가 dura mater는 판형으로 상처의 위험을 줄이기 위해 periosteal 엘리베이터가 수정된 "엘리베이터" 기법을 사용. 우리 권유 dura mater osteogenic 셀과 osteoinductive 요인3,21,,2223생산 하 여 calvarial 결함의 치유 과정에서 중요 한 역할 놀이. 특히, 이식, 재료 결함, 결함을 만들기 위한 방법의 크기는 calvarial 결함의 뼈 재생 영향. 다른 수정 절차에 참여 정기적으로 상처 폐쇄에 대 한 임상적으로 사용 되는 생체 조직 접착제 calvarial 결함에 소재의 안정화. 이 수정에서 결함 영역에 치유 하는 동안 전치 될 것 이라고 보장 합니다.

염증 뼈 치유의 초기 단계를 조절 하지만 너무 많은 염증이 나 알레르기 응답 수리11을 줄일 수 있습니다. 이상적인 면역 반응 생체 뼈 형성을 촉진 하는 염증 성 폭포를 시작 것입니다. 그러나, 특정 바이오 섬유 증 또는 알레르기 성 민감 화를 일으키는 원인이 되는 염증 신호 배열에 선도 이물질 응답을 발생할 수 있습니다. 우리의 연구에 우리 β-TCP/C 거품 면역 응답을 평가 하 고 순진한 비장 세포 독성이 없음을 발견 및 하지 T 림프 구 확장을 방해 않았거나 때 (cytokine 분 비)를 작동 ConA 문화에 추가. 복 실험에서 β-TCP/C 거품 유발 염증, 그리고 Th1 및 Th2 유형 cytokines에 수 반하는 증가와 eosinophilia 및 대 식 세포에 있는 증가의 증거 했다. 피하 이식 실험에서 β-TCP/C 거품 또한 염증을 유발 하지만 β-TCP/C 거품은 생체 만성, 파괴적인 염증 또는 알레르기 반응에 대 한 증거가 없었다. 이러한 모델은 생체의 면역 반응에 정보를 제공. 첫째, 생체 외에서 모델 순진한 면역 세포는 소재에 기인한 mitogenic 응답의 아무 억제는 증거를 제공 하는 물질의 존재에 소재에의 영향을 해결 합니다. 둘째, 복 모델 유형의 면역 반응, 의 빠른 7 일 판독을 제공., 알레르기 및 염증으로 선 동적인 세포 침투와 cytokine 프로 파일의 형식에 의해 관찰. 셋째, 피하, 아민 모델 긴 기간 동안 조직 응답을 보여줍니다, 그리고 만성 염증, 섬유 증, 항 체 titers 평가 가능 하며 반복된 이식 면역학 메모리 응답을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델 이전에 게시 되었습니다 하 고 어떤 수정13없이 여기 표시 됩니다. 그것은이 모델에 대 한 적절 한 부정적이 고 긍정적인 통제는 중요 합니다. 각 방법의 한계를 피하기 위해 모든 3 개의 모델을 실행 하는 것이 좋습니다. 표시 된 모델은 면역학의 다른 지역에서 잘 설립, 생체 재료를 테스트 하기 위한 접근은 최근.

요약, 뼈, 면역 분석은 소재에 생물학 호환성 프로 파일을 제공합니다. 뼈, OB와 OC는 소재 응답 3Rs 원칙을 준수 하며 복잡 하 고 비싼 동물 실험을 수행 하기 전에 필요한 예비 데이터를 제공 합니다. 면역학 시험관에서 분석 항 원 분 및 세포 독성, 더 배제 또한 수 있습니다 동물 실험 데이터를 제공 합니다. 염증에 대 한 결과 제공 하는 빠른 높은 처리량 실험 및 cytokine 응답 (., T 림프 톨 응답의 종류), 아민 모델 유용 하지만 데이터 손상에 대 한 염증과 잠재력의 기간에 섬유 증입니다. 뼈와 생체 면역 응답을 포함 하이 새로운 학 제 적인 접근 방식을 재료 분야에서 미래의 응용 프로그램에 대 한 생체 적합성의 우수한 전 임상 평가 제공 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구 프로젝트 부여 계약 번호 263363 아래 유럽 연합의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에서 자금을 받고 있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

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References

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뼈 재생을 위해 생체에서 생물학적 호환성 프로필
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Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).More

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