Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения профилирования на изолированной перфузии мыши сердце Полисома. Мы описываем методы перфузия сердца, Полисома профилирования и анализа Полисома фракций в отношении мРНК, адаптивной и Полисома протеома.
Abstract
Исследования в динамических изменений в переводе белка требуют специальных методов. Здесь мы рассмотрели изменения в недавно синтезированных белков в ответ ишемии и реперфузии, используя изолированной перфузии мыши сердце, в сочетании с Полисома профилирования. Для более глубокого понимания динамических изменений в переводе белка, мы характеризуется мРНК, которые были загружены с цитозольной рибосом (полирибосомы или polysomes) и также восстановлены митохондриальной polysomes и сравнили мРНК и белка распределения в высокая эффективность дроби (многочисленные прилагается к мРНК рибосомы), низкий эффективность (меньше рибосомы прилагается) которая также включала митохондриальных polysomes и -перевод дробей. интерферирующим можно также связать с мРНК, которые переводятся, тем самым снижая эффективность перевода, мы исследовали распределение адаптивной различных фракций. Распределение мРНК, адаптивной и белков был рассмотрен условиях базальной перфузии, в конце 30 мин глобальной ишемии потока нет и после 30 минут реперфузии. Здесь мы представляем методы, используемые для выполнения такого анализа — в частности, не был описан подход к оптимизации добычи белка из сахарозы градиента, как это раньше — и предоставить некоторые представитель результаты.
Introduction
Сердце реагирует к ушибу ишемии (I) и реперфузии (R) в динамических моды. Однако есть меньшюю проницательность в острой изменения в синтезе белков во время ответа. Для решения этой проблемы, мы воспользовались устоявшихся метода профилирования1 для выявления изменений в изобилии белков, которые отражают перераспределение рибосомы и трансляционная регуляторные факторы от цитозоль для polysomes, Полисома и увеличение вновь синтезируемых белков (ПСУ). В обстановке я / R, увеличение синтеза новых белков происходит в сроки, что является несовместимым с транскрипцией новой мРНК2; Кроме того отсутствие согласованности между уровнями выражение mRNA и изобилие белка был сообщил3. По этим причинам мы решили проанализировать изменения в динамических протеома как отражение переводом белка. Чтобы сделать это, мы количественно мРНК в Полисома фракций и анализировать состав белка в Полисома фракции. Наконец, потому что микроРНК (Мирс) регулирования доступности мРНК для перевода и может мешать эффективности белка перевод4,5, мы исследовали распределение Мирс в Полисома фракций, сосредоточив внимание на ответ на я / R.
Мы решили использовать модель изолированных мыши Langendorff перфузии и заготовленной ткани в базальных условиях непрерывной перфузии, после 30 мин глобального потока нет ишемии и после 30 минут ишемии, следуют 30 мин реперфузии. Затем мы солюбилизирован ткани сердца и разделенные polysomes над градиентом сахарозы, следуют протеомного анализа и селективного выявления мРНК и адаптивной ПЦР и microarray дна, соответственно. Это сочетание методов представляет собой мощный подход к пониманию динамический протеом, позволяя одновременного обнаружения мРНК, Мирна, и Энни, а также перераспределения регуляторных белков, Мирна и мРНК nontranslating фракции, низкая эффективность polysomes и polysomes высокой эффективности (см. Рисунок 1). Понимание динамического регулирования этого процесса будет расширен путем дальнейшего анализа фосфорилирования ключевых регулирующих факторов, таких как eIF2α или mTOR. Теперь эти отдельные шаги описаны в деталях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были выполнены в соответствии с институциональных руководящих принципов и одобрены институциональный уход животных и использование Комитета медицинский центр Седарс-Синай.
1. Langendorff перфузия сердца мыши
-
Langendorff перфузия сердца мыши с ишемии и реперфузии
- Администрировать внутрибрюшинного Пентобарбитал натрия 70 мг/кг для взрослых мышь (8-недельных, мужчина, C57BL6/j). Подтвердите глубокий наркоз, отсутствие вывода до пят пинча.
- Anticoagulate с внутрибрюшинного гепарина 500 U/кг.
- Откройте сундук через грудной разрез. Открыть диафрагму и разрезать вдоль прибрежной границы передней подмышечной оси. Затем вырежьте оси передней подмышечной до передних конечностей, чтобы полностью открыть грудной клетки. После Визуализация сердца, зажим восходящей части аорты с щипцами и быстро акцизных сердце. Смерть обусловлена обескровливания. Место сердце в холодных Кребс (NaCl 6,9 г/Л, KCl 0,35 г/Л, NaHCO3 2.1 г/Л, KH2PO4 0,16 г/Л, MgSO4 0.141 г/Л, глюкозы 2 г/Л и CaCl2 0.373 г/Л).
- Иглу аорты с тупой кончик иглы и perfuse сердца retrogradely растворе Кребса в режиме постоянного давления.
- После периода стабилизации 15 мин подлежащих сердце глобального потока нет ишемии для 30 мин после реперфузии за 30 мин.
- Собирать сердца после перфузии базовых 15 мин, 30 мин ишемии или после реперфузии 30 мин. Обрезать предсердия и оснастки замораживания тканей в жидком азоте.
- Хранить при температуре-80 ° C до использования
2. ткани гомогенизации, солюбилизация и плотность сахарозы градиента осаждения
-
Градиент подготовка
- Готовить 2 решения (15% и 50%), 100 мл сахарозы, смешивания 4 мл NaCl 2,5 М;
0,8 мл MgCl2 1,25 М; 1 мл трис-HCl 1 M, рН 7,5; 15 g или 50 г сахарозы (15% и 50%, соответственно); сверхчистой воды до 100 мл; и cyanol (0,02 мг/мл) ксилол цвета раствор 15% - Фильтр для каждого решения (0.22 мкм фильтры)
- День, когда градиент будет использоваться, подготовить 40 мл каждого раствора сахарозы и добавьте циклогексимида каждого решения для достижения конечной концентрации 100 мкг/мл
- Используйте градиент чайник подготовить смесь между 15% и 50% сахарозы решения
- Заполнить левую отделение с 5 мл 15%-ая сахароза градиента
- Заполните правый отсек с 50%-ая сахароза градиента
- Откройте кран и включите насос, чтобы перемешать в два небольших отсеках с магнитной мешалкой
- Использование трубки связаны с второй нажмите Разрешить смешанных сахарозы решение поступать в ультра центрифугирования трубки с тонкими стенками. Окончательный объем будет около 10 мл.
- Сохранить градиенты на 4 ° C (на ночь, если это необходимо, но не более)
- Готовить 2 решения (15% и 50%), 100 мл сахарозы, смешивания 4 мл NaCl 2,5 М;
-
Гомогенизация ткани сердца
- Однородный свежие или замороженные сердце с Политрон отфильтрованных литического буфера (изменено для градиента фракционирование сахарозы) содержащий 100 мм KCl, 20 мм трис рН 7,5, 5 мм2MgCl 0,4% NP-40. Включать циклогексимида 100 мкг/мл для поддержания структуры Полисома, 0.1 битор РНКазы U и ингибитор протеазы коктейль (1 таблетка за 50 мл).
- Инкубировать lysate на льду 15 мин.
- Центрифуга на 18 000 х g 15 мин при температуре 4 ° C для удаления нерастворимых материалов и собирать супернатант.
- Заповедник 50 мкл для определения белков, РНК изоляции и анализ целостности РНК (см. Рисунок 2).
- Слой супернатант (500-100 мкл) поверх градиенты и сбалансировать трубки с буфера lysis.
-
Седиментации и сбора фракций
- Выполните ultracentrifugation для 120 мин на 37 000 об/мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора. По словам производителя это соответствует 228,000 x g на максимальный радиус.
- Собирать каждый градиент как 17 дроби (около 600 мкл фракция) microcentrifuge пробирки с непрерывный мониторинг поглощения в 254 Нм (254OD).
- Программа коллектор фракций следующим образом:
- Отбросить первые 3 мин коллекции (соответствующий жидкость, содержащуюся в трубы перед градиент)
- От 4 до 19 мин сбора фракций со скоростью 1 мл/мин в 17 фракций.
- Место фракций на льду, как только каждый собирается. Замораживание образцов при температуре-80 ° C, если они не обрабатываются немедленно. Типичный УФ денситометрических трассировки градиента как она собирается это показано на рисунке 1.
3. изоляция и анализ мРНК Полисома и Nontranslating фракций
-
Извлечение mRNA
- Оттепель дроби на льду, если они были флэш замороженные после сбора
- Передать свежие трубу 200 мкл каждой фракции
Примечание: На этом шаге, два или более последовательных фракций могут быть объединены вместе. Это должно быть сделано тщательно после анализа графа254 ОД, таким образом, чтобы не получить смешанные Полисома и не Полисома фракции. - Добавить 10 нг Люцифераза РНК как внутреннего контроля для каждого образца для нормализации цели.
Примечание: Люцифераза грунтовки должны использоваться в качестве внутреннего контроля нормализовать результаты. - Добавьте 700 мкл Реагента РНК добыча (монофазные раствор фенола и гуанидина Изотиоцианаты; см. Таблицу материалов) к каждой трубе. Хорошо перемешайте и инкубировать трубы для 5 мин на RT (комнатной температуры).
- Добавить 140 мкл хлороформе и вихрь для 15 s. инкубировать на 2-3 мин на RT.
- Центрифугуйте образцы на 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
- Тщательно передать новой трубки верхняя водной фазе.
- Так как РНК содержание фракций не высока, добавьте 10 мкг гликогена как несущая каждой трубы.
- Добавьте 350 мкл изопропанола в каждую пробирку. Хорошо перемешайте и инкубировать в-20 ° C в течение 1 ч для повышения урожайности.
- Центрифуги для 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
- Отменить супернатант и добавить 700 мкл этанол 75% чтобы помыть лепешка РНК.
- Центрифуги для 5 мин при 7,500 x g при 4 ° C.
- Удаление этанола и пусть Пелле воздух сухой для 10 – 15 мин.
Примечание: Чрезмерное сушки гранул РНК будет препятствовать его полной ПАВ в воде. - Ресуспензируйте Пелле РНК в 50 мкл бесплатно РНКазы сверхчистого H2O.
- Проинкубируйте образцы для 10 мин при температуре 55 ° C.
- Использовать 2 мкл каждого образца измеряют качество и количество извлеченных РНК и хранить остаток-80 ° c.
-
Обратная транскрипция и ПЦР
- Используйте 4 мкл синтеза cDNA обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалы) для 20 мкл реакции. Подготовьте Супермикс согласно количество выборок. Передавать необходимый объем каждой трубы и добавить 5 мкл ввода РНК в каждую пробирку. Этот объем может быть исправлено актуальны для ряда условий труда полимеразы Taq.
- Проинкубируйте труб в тепловая велосипедист с следующие программы, рекомендованные производителем: 5 мин при 25 ° C, 20 мин обратной транскрипции для 20 минут 46 ° C и обратная транскриптаза инактивации за 1 мин на 95 ° C.
- Запустите ПЦР с программой оптимизации для каждой пары праймеров.
Примечание: Чтобы обнаружить присутствие некоторых mRNAs в долях, равный объем от каждой фракции (из изолированных РНК) следует использовать для обратной транскрипции.
-
Анализ результатов
- Используйте значение Ct заинтересованных гена и Люцифераза для вычисления значения Дельта Ct
- Экспресс каждой фракции Дельта Ct значение в процентах от общей стоимости мРНК, содержащиеся во всех фракциях, для визуализации распределения мРНК через различных фракций (Таблица 1)
4. изоляция и анализ интерферирующим Полисома фракций и Nontranslating фракций
-
Извлечение mRNA и Мирна
Примечание: Этот протокол следует инструкциям производителя, с некоторыми изменениями.- Оттепель гликоген и Спайк в элемент управления. Держите на льду.
- Добавьте 700 мкл Реагента Мирна извлечения 200 мкл пуле образца.
- Добавить 1 мкг/мкл гликогена и однородности его с помощью пипетки. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
- 3.5 мкл 1.6 x 108 Спайк в управления и смешайте его.
- 200 мкл, хлороформе и вихревой его по крайней мере 15 сек.
- Инкубируйте 3 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга на 12000 x g 15 мин при 4 ° C.
- С помощью пипетки, супернатанта передать новой 1,5 мл трубки. Отказаться от среднего и нижнего фаз.
- Добавить 1,5 x объем 100% этанола в надосадке и смешайте его.
- Трансфер 700 мкл этой смеси в столбце извлечения Мирна и центрифуги на полной скорости для 15 s в RT и отмены потока через; Повторите этот шаг с любых оставшихся образца.
- 700 мкл буфера 1 в столбце и центрифуги на полной скорости для 15 s в РТ; отказаться от потока через.
- Добавьте 500 мкл буфера 2 столбца и центрифуги на полной скорости для 15 s в РТ; отказаться от потока через.
- Добавить 500 мкл 80% этанола в столбце и центрифуги на полной скорости на 2 мин на RT; отказаться от потока через.
- Передача в столбце для новой 2 мл контаминированных трубки, откройте крышку и центрифуги на RT на 5 минут на полной скорости; отказаться от потока через.
- Мкл 16 РНКазы свободной воды для столбца и центрифуги на полную скорость 1 мин в RT. держать элюата на льду или хранить при температуре-80 ° C для будущего анализа.
Примечание: Две микролитров каждый образец может использоваться для анализа ОД.
-
Обратная транскрипция
- Готовить на льду. Для каждого 20 мкл ПЦР-реакции добавьте 4 мкл буфера RT Мирна, 2 мкл нуклеиновых кислот, 9 мкл всего РНК, 2 мкл фермента и 3 мкл РНКазы свободной воды; смешать и спина его вниз кратко.
- Установите тепловой Cycler следующим образом:
37 ° C 60 мин;
95 ° C за 5 мин;
4 ° C провести. - Удаление трубы из тепловая велосипедист и 200 мкл РНКазы свободной воды. Хранить при температуре от-20 ° C или перейти к ПЦР в реальном времени.
-
ПЦР в реальном времени
Примечание: Этот протокол следует 96 формат хорошо пластины. Подготовьте смесь реакции на льду.- Подготовка смесь реакции PCR и добавить cDNA (от адаптивной выше) в соответствии с диапазоном, принят протокол. Несколько реакций могут быть подготовлены в пакете.
- Добавьте в общей сложности 25 мкл ПЦР микс + cDNA в каждой скважине.
- Уплотнение пластину с помощью оптические пластины печать.
- Центрифуга пластину за 1 мин на 1000 x g при комнатной температуре.
- Программа в реальном времени циклователь следующим образом:
Первоначальной активации шаг при 95 ° C 15 мин;
3-ступенчатый Велоспорт: Денатурация при 94 ° C 15 s; отжиг при температуре 55 ° C за 30 сек; расширение при 70 ° C за 30 s (выполнить сбор данных флуоресценции); добавить 40 циклов;
Плавки кривой по умолчанию cycler.
-
Сравнительный анализ
- Пример нормализации (см. таблицу 2):
- Вычислить минимальное значение SCM.
- Нормализовать все значения SCM этот минимум.
- Вычитание этого значения из значения Ct интерферирующим интерес (МВД) и ссылка гена (REF).
- Анализируйте данные с использованием формулы 2-ΔCt .
- Пример нормализации (см. таблицу 2):
5. протеомного анализа
-
Извлечение белков из Полисома фракции
- Объедините собранные сахарозы дроби на три фракции окончательный. Марк фракций как тяжелые (высокая эффективность polysomes в пуле фракций, 4, 5, 6 и 7 с самой высокой концентрацией сахарозы; нижней части градиента трубки), свет (низкая эффективность polysomes в пуле фракции 8, 9, 10 и 11; середины градиент трубки) и -перевод (пуле фракций 12, 13, 14 и 15 с низкой концентрацией сахарозы; верхней градиентной трубки). Выполните assay протеина на пуле фракций.
- Подготовка 100% запас трихлоруксусной кислоты (TCA) и хранить его на 4 ° C в темноте. Перемешать 0,5 мл пробы с 60 мкл, 100% ТСА и инкубировать при-20 ° C ночью в темноте.
Примечание: Используйте 1,5 мл низкопротеиновое крепления трубы (см. Таблицу материалы). - После ночи инкубации оттепель образца на льду и центрифуги на 15000 x g, 4 ° C на 30 мин удалить супернатант.
Примечание: 100 мкг общего белка в образце дает видимый белка Пелле в нижней части трубки. - Предварительно охладите ацетона в морозильной камере-20 ° С. Добавьте 0,5 мл холодного ацетона в Пелле белка и центрифуги на 15000 x g, 4 ° C на 15 мин удалить супернатант. Повторите этот шаг два раза.
- Воздух сухой гранулы. Ресуспензируйте гранулы в 360 мкл буфера Tris-HCl 50 мм (рН 8).
Примечание: При необходимости, используйте sonicator импульса для Ресуспензируйте гранулы. - 40 мкл 0,1 М Дитиотреитол (конечная концентрация 10 мм) и Инкубируйте на 55 ° C на шейкер для 45 мин добавьте 50 мкл 0,15 М iodoacetamide (конечная концентрация 17 мм) и инкубации при комнатной температуре на шейкер для 30 мин в темноте.
- Приготовляют раствор трипсина: Ресуспензируйте 20 мкг трипсина в 100 мкл бикарбонат аммония 50 мм. Добавить соответствующий объем раствора трипсина образца в 1:50 (w/w) соотношение трипсина: белка, убедитесь, что рН 8 и инкубировать на шейкер при 37 ° C на ночь.
Примечание: Добавьте 1 М бикарбонат аммония довести рН до 8. - После переваривания трипсином прохладный образца, центрифуги кратко в центрифуге скамейке, добавить 10% муравьиной кислоты рН 2-3 утолить активности трипсина, и перейти с образца обессоливания.
Примечание: Используйте µ элюции пластины для обессоливания образца. - Условие сорбента в лунках 96 также пластины с 200 мкл рабочего раствора метанола с помощью вакуума, следуют три раза в принадлежности по 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты в три раза. Загрузить образец и выполните пример мыть с помощью 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты в три раза. Элюировать дважды в низкопротеиновое удержания 0,5 мл пробирку образца с 100 мкл acetonitrile/0.1% 50% муравьиной кислоты.
Примечание: Элюировать образца медленно сначала с помощью гравитации последовали низким вакуума. - Испарится элюата образца к сухости, используя концентратор и либо непосредственно осуществлять анализ масс-спектрометрии или магазина-80 ° c до использования.
-
Масс-спектрометрия анализ
- Воссоздать каждый Пелле (состоящий из tryptic пептидов) в 50 – 100 мкл и залить 1 мкл в масс-спектрометр.
Примечание: Оптимизируйте растворения и инъекции томов для получения максимальной интенсивности сигнала LC/MS/MS. В нашем случае, максимальный сигнал (всего ионного тока; TIC) в самом сердце сканирования был в диапазоне от 1E8 до 2E9. - Используйте столбец ловушку C18 (300 мкм i.d. x 5 мм, 5 мкм, 100Å) следуют пептид разделения с помощью C18 столбца (75 мкм i.d. x 250 мм, 2 мкм, 100Å) с параметром скорость потока на 300 нл/мин набор капиллярных температуры нано источник до 275 ° C и спрей напряжения до 2 кв.
- Примените линейный градиент 5-35% B 90 мин, 35 – 95% B за 3 мин, держа на 95% B 7 мин и уравновешивания на 5% B 25 мин (A: 0.1% муравьиной кислоты/вода и B: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Приобрести MS2 спектры для 15 ионов высокой интенсивности от каждого сканирования MS1 режиме на CID. Используйте 3 реплицирует масс-спектрометрии для каждого образца, проанализированы.
Примечание: Оптимизировать и использовать экспериментальные условия и параметры, которые подходят для ваших образцов на инструменте частности масс-спектрометрии. Условия/параметры, упомянутые в разделе 5.2. были использованы и оптимизированы в нашей лаборатории.
- Воссоздать каждый Пелле (состоящий из tryptic пептидов) в 50 – 100 мкл и залить 1 мкл в масс-спектрометр.
-
Белка идентификации/количественный
- После анализа масс-спектрометрии конвертировать файлы raw спектры в совместимых mzXML файлов с помощью программного обеспечения MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Представить преобразованные файлы в SEQUEST поисковая система с критерии поиска, например, UniProtKB/Swiss-Prot мыши базы данных (последними канонические обзор); хэш полу фермента трипсина (после KR /-); с до 2 пропущенных разобщенности; прекурсоров массового диапазон: 400-4500 Аму; статический модификации: carbamidomethyl (C) 57.021465 Аму; пептид массового терпимости: 50 ppm; фрагмент массы типа: monoisotopic.
Примечание: Могут использоваться другие белка базы данных поиска двигатели и данных трубопроводов. При использовании базы данных для например крысу, которая является менее полным, чем базы данных для человека и мыши, может потребоваться поиск против мыши (или человека) баз данных для увеличения охвата протеома. В этом случае избыточности в белок имена нужно будет удалить. - Выполните анализ после поиска. Настроить фильтры для просмотра данных. Например значение вероятности минимального белка (белок порог) как 95% или 99%, то есть, будет отображаться только белки, для которых Статистический анализ подразумевает 95% или 99% вероятность присутствия в образце. Установите фильтр для пептида порога (например, 95%), т.е. минимальную вероятность, который будет использоваться при определении ли спектра идентифицирует пептид. Выберите минимальное количество пептидов, которые будет определять, если белок присутствует (рекомендуется 2 пептидов как минимум для идентификации белков).
- Оценка выявленных белков для качества/количества. Убедитесь, что proteotypic пептидов, используются для количественной оценки. Если выявлено изоформы убедитесь, что это баз на наблюдении за tryptic пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, уникальные для конкретных изоформы. Любой «подобный» или гипотетических белков должен пройти сравнения, чтобы увидеть, если наблюдаемые пептиды соответствуют известным белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
анализ мРНК
мРНК результаты могут быть выражены как распределение конкретных мРНК в каждой фракции (Рисунок 3А); для количественной оценки объединить polyribosomal перевод дробей и сравните-перевод дроби (рис. 3B), представляя соотношение мРНК изобилия в переводе на nontranslating фракции. Дополнительная информация получается путем изучения высокую эффективность Полисома фракций отдельно от низкой эффективности Полисома фракции (и отдельно от nontranslating фракций). Это особенно важно при анализе адаптивной, обогативший в низкой эффективности фракций (где они мешают с переводом их целевых мРНК белка).
Представитель результаты для конкретной мРНК, что изменения, его распределение по переводу и nontranslating фракции после сердца мыши были подвергнуты ишемии и ишемии/реперфузии по сравнению с липовые показаны на рисунке 4.
Мирна массив анализ
Представитель результаты анализа массива Мирна показаны на рисунке 5. Здесь подмножество интерферирующим (специально массив Латы) были проанализированы в пуле тяжелых фракций, указав, что 22 интерферирующим были связаны с polysomes во время ишемии, 9 интерферирующим во время ишемии и реперфузии, с 7, которые являются общими для обоих условий. Это показывает, что ассоциация адаптивной динамических в ответ на подчеркивает ишемии и реперфузии.
Протеомного анализа
Анализ тяжелых, легких и -перевод фракций образца Шам (управления):
881 суммарных белков были определены по масс-спектрометрии; 3, 46 и 208 белков всего были уникальными для тяжелых, свет и не транс фракций, в соответственно (рис. 6A). Большинство (88%) митохондриальной рибосомных белков (28S и 39S) были определены в легкой фракции (36 из 41) и большинство (88%) цитозольной рибосомных белков (40 и 60) были определены обычно в тяжелых и легких фракций (53 из 60) подтверждающие эффективное разделение и протеомных способность выявленных тяжелее цитозольной против легче рибосомных митохондриальных протеинов. Подмножества определенных белков митохондриальных и цитозольной рибосомных показан на рисунке 6B.
Рисунок 1: типичный УФ поглощения профиль Полисома фракций на сахарозу градиент. Первые три дроби представляют недействительным громкости в трубке. Высокая эффективность (высокой молекулярной массой, HMW) фракций собираются в долях 4-7, низкая эффективность (низкий молекулярный вес, LMW) фракций в 8-11 и не перевод (и остальные цитозольной материал) собирается в долях 12-15 ( nontranslating, NTR). Красная линия указывает проводимости, а синий след УФ поглощения в 254 Нм. Справа — мультфильм в пробирку с сахарозой градиента, показаны распределения polysomes после осаждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: анализ контроля целостности РНК на Bioanalyzer. РНК целостности количество (Рин) всего РНК, изолированные от сердца всего lysate. Рин рассчитывается согласно 18S и 28S пиков. Рин диапазон: 1-10 и RIN = 10 представляет очень хорошо целостности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель профиль распределения мРНК в градиенте сахарозы. Сердца были подвергнуты базальной Langendorff перфузии или ишемии и реперфузии (I / R). (A) сердце лизатов были решены на сахарозу градиента и мРНК контента для GAPDH (слева) и COX4 (справа) были определены в каждой фракции. Диаграмма показывает относительное изобилие мРНК в каждой фракции (фракция номер на оси x) для базальной перфузии (Шам, красная линия и алмазы) и ишемии/реперфузии (I / R, голубой линии и квадраты). Накладывается на участке, УФ поглощения указанием всего мРНК контента (светло серые кривая) и проводимости (прямо серая наклонная линия). Прямоугольники указывают, как фракций были объединены. (B) участок Гистограмма показывает соотношение мРНК изобилия в переводе (polysomes) против nontranslating (NT) фракций для GAPDH (слева) и COX4 (справа) мРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: результаты представитель мРНК. Количественный одной мРНК в пуле фракций (HMW, LMW, NTR) показаны изменения в соответствии с экспериментальной группы. Фракционирование Полисома сердца мыши были выполнены после Langendorff перфузии. Результаты выводятся в % от общего мРНК (Верхняя панель) и как отношение polysomes (HMW + LMW) nontranslating фракции (НТР). Планки погрешностей представляют результаты от 5 сердец каждой группы (Шам, ишемии или я / R). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: результаты представитель miRNA. Диаграмма Венна пути сосредоточены анализ Мирна, показывая вверх и downregulated интерферирующим в бассейнах тяжелые фракции мышей образцов после сердце ишемии или ишемии и реперфузии. Порогового значения: 1,5 раза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: белки, выявленных по масс-спектрометрии. (A) Венна белков общие и уникальные для тяжелых, свет и не транс фракций. (B) подмножество рибосомных белков митохондриальных и цитозольной определены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: тестирование схемы рабочих процессов для методов извлечения белков. Методы извлечения белков были проверены с использованием образца Шам (контроль) и тяжелых (высокая эффективность polysomes) фракция с высоким содержанием сахарозы. Цифры в красном указывают количество белков, которые были определены по масс-спектрометрии; там, где указаны два числа, они из двух отдельных экспериментов. Подробное описание приводится в тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| ФРАКЦИИ | Джин Ct | ЛЮЦИФЕРАЗА Ct | ΔCt | 2ΔCt | СУММА ВСЕХ ФРАКЦИЙ | % ОТ КАЖДОЙ ФРАКЦИИ | Соотношение Полисома/НТР |
| Высокая эффективность (HMW) | 28,75 | 22.79 | 5.96 | 0,016 | 0,046 | 34.64 | 2.77 |
| Низкая эффективность (LMW) | 28.43 | 22.63 | 5.80 | 0,018 | 38.81 | ||
| Без перевода (НТР) | 29.12 | 22.77 | 6.35 | 0,012 | 26.55 | ||
| Соотношение Полисома/NTR = (HMW + LMW) / НТР |
Таблица 1: Анализа мРНК. Метод анализа одной мРНК показывается для объединения различных фракций (HMW, LMW, NTR) после количественного PCR. ΔCt = гена Ct - Люцифераза Ct, и 2ΔCt-2ΔCt.
| Вычислить минимальное значение SCM: 22.77 | |||
| Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | |
| CT MOI | 22,92 | 22.36 | 22.58 |
| CT SCM | 22.81 | 22.77 | 22,9 |
| CT REF | 23.27 | 23.55 | 23.19 |
| Нормализовать все значения SCM этот минимум | |||
| Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | |
| CT SCM | 0.05 | 0 | 0,13 |
| Необходимо вычитать эти значения из значения Ct MOI и REF | |||
| Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 | |
| CT MOI | 22.87 | 22.36 | 22.45 |
| CT REF | 23.22 | 23.55 | 23.06 |
Таблица 2: пример реального времени PCR расчет для Мирна выражение сравнения в Полисома и nontranslating фракций. интерферирующим интерес (МВД) и ссылка гена (REF) были проанализированы в пуле тяжелых фракций мышей после ишемии или ишемии/реперфузии. Ct, которую значения сначала были нормализованы к Спайк в значение элемента управления (СКМ) Ct, затем формула 2-ΔCt был использован для сравнения Мирна выражение.
| Метод | Объем образца [мл] | # белков, выявленных | Комментарии |
| ОВПБ | 1 | 227 | Основная часть сахарозы на фильтр |
| Ацетон осадков | 0.6 | 372 | вязкого ила сахарозы в нижней части трубки; 4:1 (Реагент: образец) томов; без видимых белка Пелле |
| хлороформ/метанола осадков | 0,32 | 389 | вязкого ила сахарозы в нижней части трубки; 8:1 (Реагент: образец) томов; без видимых белка Пелле |
| TCA осадков (при 4 ° C) | 0.5 | 405, 415 | без осадков сахарозы; тома 0.12:1 (Реагент: образец); видны гранулы в нижней части трубки |
| повторное осадков | 85, 60 | дополнительные высыпания TCA надосадке после того, как были собраны первые гранулы | |
| TCA осадков (при-20 ° C) | 0.5 | 440, 430 | без осадков сахарозы; тома 0.12:1 (Реагент: образец); видны гранулы в нижней части трубки |
| повторное осадков | 81, 55 | дополнительные высыпания TCA надосадке после того, как были собраны первые гранулы |
Таблица 3: Сравнение методов извлечения белков. Были оценены ОВПБ, осадков ацетон, хлороформ/метанола осадков и ТСА осадков на 4 ° C до -20 ° C. Цель – увеличить количество белков, определены. TCA осадков были оценены на второй партии материала для подтверждения воспроизводимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Полисома профиль анализ позволяет для изучения белков перевода, анализируя состояние трансляционная конкретные мРНК или весь транскриптом6,7. Это также большую помощь, когда местные перевода необходимо изучить такие синаптосомах8. Традиционно этот метод предполагает разделение моно - и полирибосомы и связанные mRNAs на градиент сахарозы, который может быть в сочетании с геномной или proteomic методы для получения желаемых результатов6,9. Например недавние исследования, проведенного нашей группы показал post-transcriptional механизм регулирования, выполненные в самом сердце пациентов, перенесших КПБ, который имитирует ишемии/реперфузии травмы. Воспользовавшись Полисома профиль анализа, мы показали увеличение в переводе-кодировке митохондриальных протеинов в сердце после процедуры КПБ2.
Динамических протеома polyribosomal профилирования представленный здесь подход может выявить изменения в составе населения мРНК, связанные с полирибосомы и белки, которые активно переводятся. Как перевод mRNAs частично регулируется адаптивной, анализ интерферирующим в эти фракции может выявить дополнительные идеи. В самом деле некоторые исследования изменен этот метод и доказал это подходящим и надежным подходом к расследованию Мирна режим правил10,11.
Многие исследования были проведены в последние десятилетия delving в роли адаптивной, учитывая их важное значение в различных биологических функций12,13. С адаптивной действовать через базу сопряжения с коллегой мРНК с тем, чтобы пометить их деградации, анализ профилей Полисома была выполнена и показано, что интерферирующим фактически находятся в Полисома фракций, ориентация перевода mRNAs14, 15 , 16. мир-21 является хорошим примером, где это связано с низкой репрессий и слабой polysomes привязки в нормальных клеток, в то время как в раковых клетках, увеличивается ассоциации с polysomes и репрессивной эффект гораздо сильнее17.
В этом исследовании был проведен анализ ПЦР в реальном времени с использованием значений Ct интерферирующим интерес (МВД), значения КТ шип в контролировать микроРНК (SCM) для уменьшения технических вариантов и Ct значение ссылка ген или микроРНК (REF), которая является стабильным среди образцов. Первым шагом было нормализовать значения Ct МВД и REF в Ct значения SCM. Затем там был второй шаг нормализации МВД к REF и полученное значение используется для вычисления формулы 2-ΔCt . Эти значения или фолд изменение значения может использоваться для демонстрации различий между группами.
Поскольку добыча белки трудно от Полисома фракций, большинство исследований, выполненных до сих пор, использовали фракции непосредственно для Западный анализ помаркой. Они просто отложений содержание белка каждой фракции и смешайте его с SDS-загрузки буфера для использования для анализа SDS-PAGE8,18. Здесь мы разработали метод, который позволяет нам не только экстракт мРНК и адаптивной после фракционирования, но и для получения пептидов и белков с высоким качеством, чтобы продолжить с анализом масс-спектрометрии.
Этот подход может быть продлен дополнительно активно измерения заново синтезированные протеины с помощью метаболических маркировки как дрозофила гомолога биортогональный аминокислоты, такие как azidohomoalanine (AHA) для метионина19,20. AHA следуют химии нажмите включение позволяет для включения тега биотина, следуют стрептавидина очистки всех белков, которые включены AHA. Это позволяет окончательной идентификации вновь синтезируемых белков — с другой частью динамического протеома. Обнаружение адаптивной, распространять среди перевода и nontranslating фракций в ответ на раздражитель (здесь с I / R) позволяет допроса динамического регулирования белка перевода. Однако факторы, которые вербуют интерферирующим в близости мРНК рибосомы прыгните по-прежнему необходимо выявлять и систематически проводятся расследования.
В нашем исследовании, в дополнение к ГТС осадков, мы проверили три других методов для извлечения белков из Полисома фракции:21i) ОВПБ (фильтр aided пробоподготовки), ii) ацетона осадков и осадков iii) хлороформ/метанола. Пригодность методов оценивалась на основе как способность обрабатывать фракций с высокой концентрацией сахарозы (до 50%) и количество белков, выявленных по масс-спектрометрии (рис. 7 и Таблица 3).
Для метода ОВПБ мы следовали протокол пробоподготовки, предоставленные ОВПБ переваривания белка комплект, который занятых ультрафильтрации блок с относительной молекулярной массы отсечения 30 кДа. Этот фильтр служил в качестве инструмента для моющего средства удаления, буфер обмена, переваривание белков и пептида элюирование с способность удерживать высокий молекулярный вес веществ (белков и ДНК), которые бы в противном случае вмешиваться с последующим пептид разделения 21. Вкратце, образец был смешан с мочевины содержащих буфер и загружен на спин фильтр с вращением шаги как iodoacetamide раствор, раствор трипсина и раствора хлорида натрия (элюции) были впоследствии добавлены. Окончательный фильтрат содержащий переваривается пептиды подкисленное TFA, обессоленной и сохраняются для анализа масс-спектрометрии. С помощью этого метода, однако, основная часть осажденный сахарозы неуклонно накопленных на вершине фильтр, рендеринга центрифугирования и мытье трудные шаги.
Для ацетона осадков и хлороформе/метанола осадков несколько томов растворителей необходимо осадок белков от одного объема выборки. Это ограничивает размер образца тома при осадков была исполнена в 1,5 мл пробирок (белок низкой сохранение трубы). Также вязкого ила сахарозы накапливается в нижней части трубы после осадков для обоих методов и там были не видны гранулы в нижней части трубы и в интерфейсе жидкости после осадков ацетоне и хлороформе/метанола осадков, соответственно.
Таблица 3 и Рисунок 7 Показать сравнение четырех методов извлечения белков, которые мы использовали для оптимизации нашего экспериментального рабочего процесса. Красные цифры, приведенные в каждом методе (рис. 7) представляют количество белков, которые были определены по масс-спектрометрии (см. раздел 5.2 и 5.3). Хотя образец томах, используемых для каждого метода были разные, хлороформ/метанола и ТСА осадков привело к наибольшее количество белков, которые определены. Однако из-за недостатков, упомянутых выше (ограничение объема выборки и сахароза осадков), мы выбрали TCA осадков для последующих экспериментов.
Чтобы найти оптимальные условия для обработки образца, TCA осадков была проведена при различных температурах и ТСА концентрации22,23,24. Таким образом, мы провели осадков с 10,7% ГТС на 4 ° C до -20 ° C и далее осаждают supernatants с дополнительные 60 мкл TCA (окончательный 19,4% TCA) после того, как были собраны в гранулы. Это привело к четыре гранулы, которые были проанализированы разделенных масс-спектрометрии. Кроме того мы повторили весь протокол дважды, чтобы обеспечить воспроизводимость полученных результатов. Рабочий процесс и количество белков, определенных в гранулы на 4 ° C и -20 ° C условиях с двумя неоднократные эксперименты показаны на рис. 7 (цифры в красном). Хотя анализ гранул, полученных от supernatants дали дополнительное количество белков (85 и 60 на 4 ° C; 81 и 55-20 ° c); Большинство белков уже были определены в первые окатыши и таким образом, мы решили использовать 10,7% ГТС для всех последующих экспериментов. Хотя хлороформ/метанола осадков привела к такое же количество белков, которые определены по сравнению с TCA осадков, мы предпочли TCA осадков из-за ряда преимуществ: я) небольшой объем растворителя, необходимых для осаждения белков (60 мкл ГТС против 1,28 мл хлороформа/метанол/воды) позволяет использовать более крупных объемов выборки, если необходимо в то время как удобно с помощью 1.5 мл пробирок для осадков, ii) видимость окатышей, трубки внизу, и iii) не накопление сахарозы во время высыпание шаги.
Несмотря на предлагая углубленного функциональных информацию о состоянии поступательное, основным недостатком этого метода является необходимость свежие и большие исходного материала. Многие исследования попытались оптимизировать условия с использованием небольшого количества клеток или тканей или добавить шаги для повышения эффективности извлечения РНК и белки25. Тем не менее, тканей, полученных из различных животных на тех же условиях экспериментальных может быть вытащил вместе, если необходимо.
В заключение этот протокол позволяет для одновременного анализа мРНК, Мирна и белка от фракции, полученные от Полисома, профилирование для изучения нормативных механизмов, занимающихся ишемии/реперфузии. Однако дальнейшие исследования необходимы ли перевод mRNAs наведены после ишемии и реперфузии и если они будут отключены после снятия стресса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
P01 низ HL112730 (тряпка, JVE), низ R01 HL132075 (тряпка, JVE), центр сердца женщин Барбра Стрейзанд (тряпка, JVE), Дороти и э. Филипп Лион стул в молекулярной кардиологии (ветошь), Эрика Глейзер наделены стул в женском здоровье сердца (JVE) и Чешской академии наук Институциональная поддержка РВО: 68081715 (МС).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
