Summary
Qui presentiamo un protocollo per eseguire polisoma profilatura sul cuore isolato e perfuso del mouse. Descriviamo i metodi per aspersione di cuore, polisoma profiling e l'analisi delle frazioni polisoma rispetto al mRNA, Mirna e il proteoma polisoma.
Abstract
Gli studi in cambiamenti dinamici nella traduzione della proteina richiedono metodi specializzati. Qui abbiamo esaminato i cambiamenti in proteine appena sintetizzate in risposta all'ischemia e riperfusione usando il cuore isolato e perfuso del mouse accoppiato con profilatura polisoma. Per capire meglio i cambiamenti dinamici nella traduzione della proteina, abbiamo caratterizzato i mRNAs che sono stati caricati con i ribosomi citosolici (poliribosomi o polisomi) e anche recuperato polisomi mitocondriale e rispetto distribuzione mRNA e proteina nella le frazioni ad alta efficienza (numerosi ribosomi attaccati al mRNA), basso-efficienza (meno ribosomi allegati) che comprendeva anche polisomi mitocondriale e le frazioni non tradurre. Mirna possono anche associare mRNAs che vengono tradotti, riducendo così l'efficienza della traduzione, abbiamo esaminato la distribuzione dei miRNA attraverso le frazioni. La distribuzione dei mRNAs, Mirna e proteine è stata esaminata in condizioni basali irrorate, alla fine di 30 min di ischemia globale no-flusso e dopo 30 min di riperfusione. Qui presentiamo i metodi utilizzati per realizzare questa analisi — in particolare, l'approccio all'ottimizzazione dell'estrazione di proteine dal gradiente di saccarosio, come questo non è stato descritto prima — e fornire alcuni risultati rappresentativi.
Introduction
Il cuore risponde al pregiudizio di ischemia (I) e di riperfusione (R) in modo dinamico. Tuttavia, non esiste una visione poco in cambiamenti acuti nella sintesi delle proteine durante la risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo approfittato del metodo consolidato di polisoma profilatura1 per identificare le modifiche in abbondanza di proteine che riflettono la ridistribuzione dei ribosomi e fattori di regolazione traduzionale dal citosol di polisomi, e la aumento di proteine recentemente sintetizzati (NSP). Nell'impostazione di I / R, l'aumento nella sintesi di nuove proteine avviene in un lasso di tempo che non è coerente con la trascrizione di mRNA nuovo2; Inoltre, discordanza tra i livelli di espressione di mRNA e proteina abbondanza è stato segnalato3. Per queste ragioni, abbiamo scelto di analizzare i cambiamenti nel proteoma dinamico come riflesso dalla traduzione della proteina. Per fare questo, abbiamo quantificare mRNA nelle frazioni polisoma e analizzare la composizione della proteina nelle frazioni polisoma. Infine, perché i microRNA (miRs) regolano la disponibilità dei mRNAs per traduzione e possono interferire con l'efficienza di proteina traduzione4,5, abbiamo esaminato la distribuzione di Mir nelle frazioni polisoma, concentrandosi sulla risposta a I / r.
Abbiamo scelto di utilizzare il modello di aspersione di isolato mouse Langendorff e tessuto raccolto in condizioni basali della perfusione continua, dopo ischemia globale di no--flusso 30 min e dopo 30 min di ischemia seguita da 30 min di riperfusione. Abbiamo poi solubilizzato il tessuto cardiaco e separato polisomi sopra un gradiente di saccarosio, seguita da analisi proteomica e rivelazione selettiva del mRNA e Mirna mediante PCR e microarray, rispettivamente. Questa combinazione di metodi rappresenta un approccio potente per comprendere il proteoma dinamico, consentendo la rilevazione simultanea di mRNA, miRNA e NSP, così come la ridistribuzione delle proteine regolatrici, miRNA e mRNA tra le frazioni di nontranslating, bassa efficienza polisomi e ad alta efficienza polisomi (Vedi Figura 1). Intuizioni la regolazione dinamica di questo processo saranno esteso da un'ulteriore analisi della fosforilazione di fattori regolatori chiave quali eIF2α o mTOR. Questi singoli passi ora sono descritti dettagliatamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità alle linee guida istituzionali e approvati dalla istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato del Cedars-Sinai Medical Center.
1. Langendorff aspersione del Mouse cuore
-
Aspersione di Langendorff del cuore del topo con ischemia e riperfusione
- Amministrare intraperitoneale sodio pentobarbital 70 mg/kg per il topo adulto (8-settimana-vecchio, Maschio, C57BL6/j). Confermare l'anestesia profonda mancanza di recesso alla punta pizzico.
- Anticoagulate con eparina intraperitoneale 500 U/kg.
- Aprire lo scrigno via incisione sternale. Aprire il diaframma e tagliare lungo il bordo costiero all'asse ascellare anteriore. Quindi, tagliare l'asse ascellare anteriore fino alla zampa anteriore di aprire completamente la gabbia toracica. Dopo, visualizzando il cuore, morsetto dell'aorta ascendente con il forcipe e asportare rapidamente il cuore. La morte è a causa del dissanguamento. Mettere il cuore in freddo Krebs (NaCl, KCl, 6,9 g/L 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glucosio 2G/L e CaCl2 0,373 g/L).
- Incannulare l'aorta con un ago smussato-punta e irrorare il cuore retrogradely con soluzione di Krebs in modalità pressione costante.
- Dopo un periodo di stabilizzazione di 15 min, sottoporre il cuore a una ischemia globale no-flusso per 30 min seguita da riperfusione per 30 min.
- Raccogliere cuori dopo perfusione basale 15 min, dopo 30 min di ischemia o dopo 30 min di riperfusione. Tagliare gli atri e il tessuto snap-congelamento in azoto liquido.
- Conservare a-80 ° C fino all'utilizzo
2. tessuto omogeneizzazione, solubilizzazione e saccarosio densità gradiente sedimentazione
-
Preparazione di gradiente
- Preparare 2 soluzioni (15% e 50%) di saccarosio 100ml, miscelazione 4 mL di NaCl 2.5 M;
0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL di Tris-HCl 1 M, pH 7.5; 15 g o 50 g di saccarosio (15% e 50%, rispettivamente); acqua ultrapura per raggiungere 100 mL; e xilene cianolo (0,02 mg/mL) di soluzione al 15% di colore - Filtrare ogni soluzione (0,22 µm filtri)
- Il giorno che il gradiente deve essere utilizzato, preparare 40 mL di ciascuna soluzione di saccarosio e aggiungere cicloesimmide a ogni soluzione per ottenere la concentrazione finale di 100 µ g/mL
- Utilizzare un creatore di gradiente per preparare un mix tra le soluzioni di saccarosio 15% e 50%
- Riempire il vano sinistro con 5 mL del gradiente di saccarosio 15%
- Riempire il vano destro con il gradiente di saccarosio al 50%
- Aprire il rubinetto e accendere la pompa per mescolare i due piccoli vani con agitatore magnetico
- Uso un tubo collegato al rubinetto secondo per consentire la soluzione di saccarosio misto a fluire in un ultra-centrifugazione tubo con pareti sottili. Volume finale sarà circa 10 mL.
- Conservare le pendenze a 4 ° C (durante la notte se necessario, ma non di più)
- Preparare 2 soluzioni (15% e 50%) di saccarosio 100ml, miscelazione 4 mL di NaCl 2.5 M;
-
Omogeneizzazione del tessuto del cuore
- Omogeneizzare il cuore fresco o congelato con un polytron in tampone di lisi filtrata (modificato per il frazionamento di gradiente di saccarosio) contenente 100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Sono cicloesimmide 100 µ g/mL per mantenere la struttura polisoma, 0.1 U RNasi inibitore e inibitore della proteasi cocktail (1 compressa per 50 mL).
- Incubare il lisato di ghiaccio in 15 min.
- Centrifugare a 18.000 x g per 15 min a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile e raccogliere il surnatante.
- Riserva 50 µ l per la determinazione della proteina, isolamento del RNA e analisi di integrità di RNA (Vedi Figura 2).
- Il surnatante (500 – 100 µ l) di strato in cima le pendenze e bilanciare i tubi con tampone di lisi.
-
Sedimentazione e raccolta delle frazioni
- Eseguire ultracentrifugazione per 120 min a 37.000 giri/min a 4 ° C in un rotore oscillante. Secondo il costruttore, corrisponde a 228.000 x g a raggio massimo.
- Raccogliere ogni sfumatura come 17 frazioni (frazione di circa 600 µ l ciascuna) in microcentrifuga con monitoraggio continuo dell'assorbanza a 254 nm (OD254).
- Programma il collettore di frazione come segue:
- Scartare i primi 3 min della collezione (corrispondente al liquido contenuto nelle provette prima il gradiente)
- Da 4 a 19 min, raccogliere le frazioni alla velocità di 1 mL/min in 17 frazioni.
- Mettere le frazioni sul ghiaccio appena ognuno è raccolto. Congelare i campioni a-80 ° C, se non vengono elaborati immediatamente. Una tipica analisi densitometrica UV della sfumatura come sono stati raccolti è illustrato nella Figura 1.
3. isolamento ed analisi di mRNA da polisoma e frazioni Nontranslating
-
Estrazione del mRNA
- Scongelare le frazioni sul ghiaccio, se fossero flash-congelato dopo la raccolta
- 200 µ l di ciascuna frazione di trasferimento in una nuova provetta
Nota: A questo punto, due o più frazioni consecutive possono essere riunite insieme. Dovrebbe essere fatto con attenzione dopo aver analizzato il grafico di254 OD in modo che non si mescolano frazioni polisoma e non-polisoma. - Aggiungere 10 ng di luciferasi RNA come controllo interno per ogni campione per scopo di normalizzazione.
Nota: Gli iniettori Luciferase dovrebbero essere utilizzati come controllo interno per normalizzare i risultati. - Aggiungere 700 µ l di reagente di estrazione RNA (monofasica soluzione di fenolo e guanidina isotiocianato; Vedi Tabella materiali) in ogni provetta. Mescolare bene e incubare le provette per 5 min a RT (temperatura ambiente).
- Aggiungere 140 µ l cloroformio e vortex per 15 s. Incubare per 2-3 minuti a TA.
- Centrifugare i campioni per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
- Trasferire con cautela la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo.
- Poiché il contenuto di RNA delle frazioni non è elevato, è possibile aggiungere 10 µ g di glicogeno come elemento portante ad ogni provetta.
- Aggiungere 350 µ l isopropanolo in ogni provetta. Mescolare bene e incubare a-20 ° C per 1 h aumentare il rendimento.
- Centrifuga per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
- Scartare il surnatante ed aggiungere 700 µ l di etanolo 75% per lavare la pallina del RNA.
- Centrifugare per 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
- Eliminare l'etanolo e lasciare asciugare per 10 – 15 min l'aria di pellet.
Nota: Sovra il pellet di RNA impedirà la sua completa solubilizzazione in acqua. - Risospendere il pellet di RNA in 50 μL di RNAsi-libera ultrapura H2O.
- Incubare i campioni per 10 min a 55 ° C.
- Utilizzare 2 µ l di ogni campione per misurare la qualità e la quantità di RNA estratto e memorizzare il resto a-80 ° C.
-
QPCR e trascrizione d'inversione
- Utilizzare 4 μL di sintesi del cDNA di trascrizione inversa kit (Vedi Tabella materiali) per una reazione di 20 μL. Preparare il supermix secondo il numero di campioni. Trasferire il volume richiesto in ogni provetta e aggiungere 5 μL di input RNA in ogni provetta. Questo volume può essere corretto per essere rilevanti per la gamma delle condizioni di lavoro della polimerasi di Taq.
- Incubare le provette in un termociclatore con il seguente programma consigliato dal fabbricante: 5 min a 25 ° C, 20 min trascrizione inversa per 20 min a 46 ° C e l'inattivazione della trascrittasi inversa per 1 min a 95 ° C.
- Eseguire qPCR con il programma ottimizzato per ogni coppia di primers.
Nota: Per rilevare la presenza di alcuni mRNA in frazioni, volume uguale da ogni frazione (del RNA isolato) dovrebbe essere usato per trascrizione inversa.
-
Analisi dei risultati
- Utilizzare il valore di Ct del gene interessato e la luciferasi per calcolare i valori di Ct di delta
- Esprimere ogni delta frazione valore Ct in percentuale del valore totale mRNA contenuta in tutte le frazioni per visualizzare la distribuzione del mRNA attraverso le diverse frazioni (tabella 1)
4. isolamento ed analisi di Mirna da polisoma frazioni e frazioni Nontranslating
-
Estrazione del mRNA e miRNA
Nota: Questo protocollo segue le istruzioni del produttore, con poche modifiche.- Scongelare il glicogeno e il controllo di spike. Tenere il ghiaccio.
- Aggiungere 700 µ l di reagente di estrazione di miRNA a 200 µ l di campione.
- Aggiungere 1 µ g / µ l di glicogeno e omogeneizzare utilizzando la pipetta. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 3,5 µ l di 1,6 x 108 spike-in controllo e mescolare.
- Aggiungere 200 µ l di cloroformio e vortex per almeno 15 sec.
- Incubare per 3 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Utilizzando una pipetta, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL. Scartare le fasi medio e inferiore.
- Aggiungere 1,5 x volume di etanolo al 100% il surnatante e mescolare.
- Trasferire 700 µ l di questa miscela la colonna di estrazione di miRNA e centrifugare esso a tutta velocità per 15 s a RT e scartare il flusso continuo; Ripetere questo passaggio con qualsiasi campione rimanente.
- Aggiungere 700 µ l di tampone 1 nella colonna ed e centrifugare a piena velocità per 15 s a RT; scartare il flusso continuo.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di 2 nella colonna ed e centrifugare a piena velocità per 15 s a RT; scartare il flusso continuo.
- Aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% nella colonna ed e centrifugare a piena velocità per 2 min a RT; scartare il flusso continuo.
- Trasferire la colonna per tubo un nuovo mL 2 scoperchiata, aprire il coperchio ed e centrifugare a RT per 5 min a pieno regime; scartare il flusso continuo.
- Aggiungere 16 µ l di acqua RNAsi-libera per la colonna e la centrifuga e a piena velocità per 1 minuto al RT. tenere l'eluato sul ghiaccio o conservare a-80 ° C per le analisi future.
Nota: Due microlitri di ogni campione possono essere utilizzati per l'analisi di OD.
-
Trascrizione inversa
- Preparare il ghiaccio. Per ogni reazione di RT-PCR di 20 µ l, aggiungere 4 µ l di buffer di RT di miRNA, 2 µ l di acidi nucleici, 9 µ l di RNA totale, 2 µ l di enzima e 3 µ l di acqua RNAsi-libera; mescolare e rallentare brevemente.
- Impostare il termociclatore come segue:
37 ° C per 60 min;
95 ° C per 5 min;
Tenere premuto 4 ° C. - Togliere le provette dal termociclatore e aggiungere 200 µ l di acqua RNAsi-libera. Conservare a-20 ° C o procedere per la PCR in tempo reale.
-
PCR in tempo reale
Nota: Questo protocollo segue 96 piastra ben formato. Preparare la miscela di reazione sul ghiaccio.- Preparare la miscela di reazione PCR e aggiungere cDNA (da Mirna sopra) secondo l'intervallo accettato dal protocollo. Le reazioni multiple possono essere preparate in batch.
- Aggiunta di un totale di 25 µ l di miscela di PCR + cDNA in ciascun pozzetto.
- Sigillare la piastra con un sigillo di piatto ottico.
- Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
- Programma il ciclatore in tempo reale come segue:
Gradino di attivazione iniziale a 95 ° C per 15 min;
3-passo ciclismo: denaturazione a 94 ° C per 15 s; ricottura a 55 ° C per 30 s; estensione a 70 ° C per 30 s (eseguire la raccolta di dati di fluorescenza); aggiungere 40 cicli;
Curva di fusione secondo predefinito cycler.
-
Analisi comparativa
- Esempio di normalizzazione (Vedi tabella 2):
- Trovare il valore minimo di SCM.
- Normalizzare tutti i valori SCM per questo minimo.
- Sottrarre questo valore dai valori Ct di Mirna di interesse (MOI) e gene di riferimento (REF).
- Analizzare i dati utilizzando la formula di 2-ΔCt .
- Esempio di normalizzazione (Vedi tabella 2):
5. analisi proteomica
-
Estrazione di proteine da frazioni polisoma
- Combinare le frazioni di saccarosio raccolti in tre frazioni finale. Contrassegnare le frazioni pesanti (polisomi ad alta efficienza in frazioni raccolte, 4, 5, 6 e 7 con la più alta concentrazione di saccarosio; fondo della provetta del gradiente), luce (polisomi bassa efficienza in frazione Pool 8, 9, 10 e 11; metà della tubo di gradiente) e non-tradurre (frazioni raccolte 12, 13, 14 e 15 con la più bassa concentrazione di saccarosio; superiore del tubo gradiente). Eseguire analisi della proteina di frazioni raccolte.
- Stock di 100% di acido tricloroacetico (TCA) di preparare e conservare a 4 ° C nel buio. Mescolare 0,5 mL di campione con 60 µ l di 100% TCA e incubare a-20 ° C durante la notte al buio.
Nota: Utilizzare tubi di ritenzione proteica basso 1.5 mL (Vedi Tabella materiali). - Dopo l'incubazione overnight, scongelare il campione sul ghiaccio e centrifugare a 15.000 x g, 4 ° C per 30 min. Discard surnatante.
Nota: 100 µ g di proteina totale nel campione dà a pellet proteina visibile nella parte inferiore del tubo. - Pre-chill acetone nel congelatore a-20 ° C. Aggiungere 0,5 mL di acetone freddo al pellet di proteina e centrifugare a 15.000 x g, 4 ° C per 15 min. Discard surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.
- Asciugare all'aria il pellet. Risospendere il pellet in 360 µ l di tampone di 50 mM Tris-HCl (pH 8).
Nota: Se necessario, utilizzare un sonicatore impulso per risospendere il pellet. - Aggiungere 40 µ l di ditiotreitolo 0,1 M (concentrazione finale 10 mM) e incubare a 55 ° C su agitatore per 45 min. aggiungere 50 µ l di 0.15 M iodoacetamide (concentrazione finale 17 mM) e incubare a temperatura ambiente su agitatore per 30 min nel buio.
- Preparare la soluzione di tripsina: risospendere 20 µ g di tripsina in 100 µ l di bicarbonato di ammonio di 50 mM. Aggiungere il corrispondente volume di soluzione di tripsina al campione alle 01:50 (w/w) rapporto di tripsina: proteine, assicurarsi che il pH è 8 e incubare su agitatore a 37 ° C durante la notte.
Nota: Aggiungere il bicarbonato di ammonio 1 M per portare il pH a 8. - Dopo digestione della tripsina, raffreddare il campione, centrifugare brevemente nella centrifuga panca, aggiungere 10% acido formico a pH 2 – 3 per placare l'attività della tripsina e procedere con il campione di desalificazione.
Nota: Utilizzare µ-eluizione piastra per esempio desalificazione. - Condizione l'assorbente nei pozzetti della piastra ben 96 con 200 µ l di metanolo utilizzando vuoto tre volte seguito da condizionata da 200 µ l di acido formico 0.1% tre volte. Esempio di caricare ed eseguire un lavaggio di esempio utilizzando 200 µ l di acido formico 0.1% tre volte. Eluire il campione con 100 µ l di acido formico al 50% acetonitrile/0.1% due volte in provetta di 0,5 mL di proteina bassa ritenzione.
Nota: Eluire il campione lentamente in un primo momento utilizzando gravitazione seguita da basso vuoto. - Evaporare l'eluato campione utilizzando concentratore e sia direttamente svolgere analisi di spettrometria di massa o negozio a-80 ° C fino all'utilizzo.
-
Analisi di spettrometria di massa
- Ricostituire ogni pastiglia (costituito da peptidi triptici) a 50 – 100 µ l e iniettare 1 µ l in spettrometro di massa.
Nota: Ottimizzare la ricostituzione e l'iniezione di volumi per ottenere la massima intensità di segnale LC/MS/MS. Nel nostro caso, il segnale massimo (totale corrente di ioni; TIC) nel cuore della scansione era nella gamma di 1E8 a 2E9. - Utilizzare una trappola colonna C18 (300 µm i.d. x 5 mm, 5 µm, 100Å) seguita dalla separazione del peptide utilizzando colonna C18 (75 µm i.d. x 250 mm, 2 µm, 100Å) con una regolazione della portata a 300 nL/min impostare la temperatura capillare di nano-fonte a 275 ° C e la tensione di spruzzo a 2 kV.
- Applicare una sfumatura lineare B 5 – 35% per 90 min, 35 – 95% B per 3 min, tenendo al 95% B per 7 min e l'equilibratura a 5% B per 25 min (r: 0,1% acido formico/acqua e b: 0,1% acido formico in acetonitrile). Acquisire spettri di MS2 per gli ioni di intensità massimi 15 da ogni scansione MS1 utilizzando modalità di CID. Spettrometria di massa di uso 3 replica per ogni campione analizzato.
Nota: Ottimizzare e utilizzare le condizioni sperimentali e i parametri che sono adatti per i vostri campioni sullo strumento particolare spettrometria di massa. Le condizioni o i parametri menzionati nella sezione 5.2. sono stati utilizzati e ottimizzati nel nostro laboratorio.
- Ricostituire ogni pastiglia (costituito da peptidi triptici) a 50 – 100 µ l e iniettare 1 µ l in spettrometro di massa.
-
Proteina identificazione/quantificazione
- Dopo l'analisi di spettrometria di massa, è possibile convertire i file raw spettri in mzXML compatibile file utilizzando software di MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Invia i file convertiti in motore di ricerca SEQUEST con i criteri di ricerca, ad esempio, i database del mouse UniProtKB/Swiss-Prot (più aggiornato recensione canonico); digest di semi-enzima utilizzando tripsina (dopo KR /-); fino a 2 perso fenditure; intervallo di massa precursore: 400 a 4.500 amu; modifica statica: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolleranza di massa del peptide: 50 ppm; frammento di massa tipo: monoisotopic.
Nota: Altre condutture di proteina database ricerca motori e dati possono essere utilizzati. Se utilizza database per es. ratto, che è meno completo rispetto ai database per mouse e umani, potrebbe essere necessario cercare contro mouse (e/o umani) database per aumentare la copertura del proteoma. In questo caso, ridondanza nei nomi di proteine dovrà essere rimosso. - Eseguire un'analisi post-ricerca. Impostare i filtri per visualizzare i dati. Ad esempio, impostare una probabilità di proteine minimo (soglia di proteina) come 95% o 99%, vale a dire, verranno visualizzate solo le proteine per cui un'analisi statistica implica 95% o 99% di probabilità di essere presenti nel campione. Impostare il filtro per la soglia del peptide (ad es., 95%), vale a dire, una probabilità minima che verrà utilizzato nella determinazione se un spettro identifica un peptide. Seleziona il numero minimo di peptidi che determinerà se una proteina è presente (2 peptidi come minimo per l'identificazione delle proteine è consigliato).
- Valutare le proteine identificate per quantità e qualità. Assicurarsi che proteotypic peptidi vengono utilizzati per la quantificazione. Se viene identificata la isoforma garantire che si basi sull'osservazione di un peptide triptico composto da una sequenza di amminoacido univoco per l'isoforma specifica. Qualsiasi "simile a" o ipotetiche proteine devono essere sottoposti a confronto per vedere se l'osservato peptidi corrispondono ad una proteina conosciuta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
analisi del mRNA
risultati di mRNA possono essere espressa come una distribuzione di un particolare mRNA in ogni frazione (Figura 3A); per la quantificazione, combinare polyribosomal traduzione frazioni e confrontarlo con la frazione non-tradurre (Figura 3B), che presentano un rapporto di abbondanza del mRNA nella traduzione al nontranslating frazioni. Ulteriori informazioni sono maturate esaminando le frazioni di alta efficienza polisoma separatamente dalle frazioni di basso-efficienza polisoma (e separata dalle frazioni nontranslating). Questo è particolarmente importante quando si analizzano i miRNA, che sono ricchi delle frazioni di basso-efficienza (dove interferiscono con la traduzione della proteina del loro mRNA bersaglio).
Rappresentante risultati per una particolare mRNA che modifiche sua distribuzione attraverso le frazioni di nontranslating e di traduzione dopo i cuori del mouse sono stati sottoposti ad ischemia e riperfusione/rispetto al sham sono mostrate in Figura 4.
analisi di miRNA array
Risultati rappresentativi da un'analisi di matrice miRNA sono illustrati nella Figura 5. Qui, un sottoinsieme di Mirna (piastra matrice personalizzati) sono stati analizzati in frazioni pesanti raccolte che indica che i 22 miRNA sono stati associati con polisomi durante l'ischemia, 9 miRNA durante ischemia e la riperfusione, con 7 che erano comuni a entrambe le condizioni. Ciò dimostra che l'associazione di Mirna è dinamico in risposta alle sollecitazioni di ischemia e riperfusione.
Analisi proteomica
Analisi delle frazioni pesanti, leggeri e non-traduzione di campione di sham (controllo):
881 delle proteine totali sono stati identificati mediante spettrometria di massa; 3, 46 e 208 proteine del totale erano uniche per frazioni pesanti, luce e non-trans, rispettivamente (Figura 6A). La maggior parte (88%) delle proteine ribosomali mitocondriali (28S e 39S) sono stata identificata in frazione leggera (36 su 41) e una maggioranza (88%) di proteine ribosomali citosoliche (anni ' 40 e ' 60) sono state identificate comunemente nelle frazioni leggeri e pesanti (53 su 60) confermando la proteomica e la separazione efficiente capacità di identificati più pesante citosolico vs accendino mitocondriale proteine ribosomiali. Il sottoinsieme di proteine ribosomali identificate citosoliche e mitocondriale è mostrato in Figura 6B.
Figura 1: profilo di assorbanza UV tipico delle frazioni polisoma su gradiente di saccarosio. Le prime tre frazioni rappresentano volume vuoto della tubazione. L'alta efficienza (alto peso molecolare, HMW) frazioni sono raccolti in frazioni 4-7, la bassa efficienza (basso peso molecolare, LMW) frazioni in 8-11 e la traduzione (e restanti citosolico materiale) sono raccolti in frazioni 12-15 ( nontranslating, NTR). La linea rossa indica la conducibilità e la traccia blu indica la capacità di assorbimento UV a 254 nm. Sulla destra è un fumetto di una provetta con saccarosio gradiente, mostrando di distribuzione di polisomi dopo la sedimentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi di controllo di integrità di RNA il Bioanalyzer. Numero di integrità di RNA (RIN) di RNA totale isolato da cuore intero lisato. RIN è calcolato secondo picchi 18S e 28S. Gamma RIN: 1-10 e RIN = 10 rappresenta una molto buona integrità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profilo rappresentativo della distribuzione di mRNA in gradiente di saccarosio. I cuori sono stati sottoposti a basale Langendorff aspersione o ischemia e riperfusione (I / R). (A) il cuore lisati sono stati risolti su gradiente di saccarosio e contenuto di mRNA per GAPDH (a sinistra) e COX4 (a destra) sono stati determinati in ogni frazione. Grafico mostra la relativa abbondanza di mRNA in ogni frazione (numero di frazione sull'asse x) per perfusione basale (sham, linea rossa e diamanti) e ischemia/riperfusione (I / R, linea blu e piazze). Sovrapposta la trama sono assorbanza UV che indica mRNA totale contenuto (curva di luce grigia) e conduttanza (dritto grigio linea di pendenza). Le caselle indicano come frazioni sono state riunite. (B) la trama di grafico a barre Mostra rapporto di abbondanza del mRNA nel tradurre le frazioni (polisomi) vs nontranslating (NT) per GAPDH (a sinistra) e COX4 (a destra) mRNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: risultati rappresentativi mRNA. Quantificazione di un mRNA in frazioni raccolte (HMW, LMW, NTR) che mostra i cambiamenti secondo il gruppo sperimentale. Frazionamento di polisoma di cuori del topo è stato effettuato dopo aspersione di Langendorff. Risultati sono tracciati come % del totale mRNA (pannello superiore) e come rapporto di polisomi (HMW + LMW) alla frazione nontranslating (NTR). Barre di errore rappresentano risultati da 5 cuori per ogni gruppo (sham, ischemia o / R). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: risultati rappresentante miRNA. Diagramma di Venn di un pathway concentrata miRNA analisi mostrando e downregulated miRNA nelle piscine di frazione pesante di campioni di topi dopo cuore ischemia o l'ischemia e la riperfusione. Valore di cut-off: 1,5 volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: proteine identificate mediante spettrometria di massa. (A) diagramma di Venn delle proteine comuni e uniche per frazioni pesanti, la luce e non-trans. (B) sottoinsieme delle proteine ribosomiali mitocondriale e citosoliche identificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: schematiche dei flussi di lavoro per i metodi di estrazione di proteine testato. I metodi di estrazione della proteina sono stati testati utilizzando campione di sham (controllo) e pesanti (polisomi ad alta efficienza) frazione con più alto contenuto di saccarosio. I numeri in rosso indicano il numero di proteine che sono state identificate mediante spettrometria di massa; Quando due numeri sono indicati, sono da due esperimenti separati. La descrizione dettagliata è riportata nel testo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| FRAZIONI | GENE Ct | LUCIFERASI Ct | ΔCt | 2ΔCt | SOMMA DI TUTTE LE FRAZIONI | % DI OGNI FRAZIONE | Rapporto di polisoma/NTR |
| Alta efficienza (HMW) | 28,75 | 22,79 | 5,96 | 0,016 | 0,046 | 34.64 | 2,77 |
| Bassa efficienza (LMW) | 28,43 | 22,63 | 5.80 | 0,018 | 38.81 | ||
| Non tradurre (NTR) | 29.12 | 22,77 | 6.35 | 0,012 | 26.55 | ||
| Polisoma/NTR Ratio = (HMW + LMW) / NTR |
Tabella 1: Analisi del mRNA di esempio. Metodo di analisi di un mRNA è indicato per le diverse frazioni raccolte (HMW, LMW, NTR) dopo PCR quantitativa. ΔCt = gene Ct - luciferasi Ct, e il 2ΔCt è 2ΔCt.
| Trovare il valore minimo di SCM: 22,77 | |||
| Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | |
| CT MOI | 22,92 | 22,36 | 22,58 |
| CT SCM | 22,81 | 22,77 | 22,9 |
| CT REF | 23,27 | 23,55 | 23.19 |
| Normalizzare tutti i valori SCM per questo minimo | |||
| Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | |
| CT SCM | 0.05 | 0 | 0.13 |
| Sottrarre questi valori dai valori Ct di MOI e REF | |||
| Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | |
| CT MOI | 22,87 | 22,36 | ore 22.45 |
| CT REF | 23,22 | 23,55 | 23.06 |
Tabella 2: esempio di calcolo di PCR in tempo reale per il confronto di espressione di miRNA in polisoma e frazioni nontranslating. Mirna di interesse (MOI) e gene di riferimento (REF) sono stati analizzati in frazioni pesanti raccolte dei topi dopo ischemia o ischemia/riperfusione. Il Ct valori in primo luogo sono stati normalizzati per il controllo di spike-a valore di Ct (SCM), quindi la formula 2-ΔCt è stato utilizzato per confrontare l'espressione dei miRNA.
| Metodo. | Volume di campione [mL] | n # di proteine identificate | Commenti |
| FASP | 1 | 227 | massa di saccarosio precipitato su filtro |
| precipitazione di acetone | 0.6 | 372 | viscoso fanghi di saccarosio nella parte inferiore del tubo; volumi di 4:1 (reagente: campione); Nessun pellet visibile della proteina |
| precipitazione di cloroformio/metanolo | 0,32 | 389 | viscoso fanghi di saccarosio nella parte inferiore del tubo; volumi di 8:1 (reagente: campione); Nessun pellet visibile della proteina |
| Precipitazione di TCA (a 4 ° C) | 0,5 | 405, 415 | nessuna precipitazione di saccarosio; volumi 0.12:1 (reagente: campione); a pellet visibile nella parte inferiore del tubo |
| ri-precipitazioni | 85, 60 | ulteriori precipitazioni TCA di supernatante dopo che è stato raccolto prima della pallina | |
| Precipitazione di TCA (a-20 ° C) | 0,5 | 440, 430 | nessuna precipitazione di saccarosio; volumi 0.12:1 (reagente: campione); a pellet visibile nella parte inferiore del tubo |
| ri-precipitazioni | 81, 55 | ulteriori precipitazioni TCA di supernatante dopo che è stato raccolto prima della pallina |
Tabella 3: Confronto di metodi di estrazione della proteina. FASP, precipitazione in acetone, cloroformio/metanolo pioggia e precipitazioni di TCA a 4 ° C e -20 ° C sono stati valutati. L'obiettivo era quello di massimizzare il numero di proteine identificate. Precipitazioni di TCA sono stati valutati su un secondo lotto di materiale per confermare la riproducibilità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analisi del profilo polisoma consente lo studio della traduzione della proteina analizzando lo stato traduzionale di un mRNA specifico o l'intero trascrittoma6,7. Inoltre è di grande aiuto quando traduzione locale deve essere studiato come sinaptosomi8. Tradizionalmente, questo metodo comporta la separazione di mono - e poliribosomi e i mRNAs associati su un gradiente di saccarosio che potrebbe essere accoppiato con genomica o tecniche di proteomica per ottenere i risultati desiderati6,9. Per esempio, un recente studio condotto dal nostro gruppo ha rivelato un meccanismo di regolazione post-trascrizionale, eseguito nel cuore dei pazienti che subiscono CPB, che imita l'ischemia/riperfusione. Approfittando dell'analisi del profilo polisoma, abbiamo dimostrato un aumento nella traduzione delle proteine mitocondriali codificate nel cuore dopo CPB procedura2.
L'approccio di profilatura polyribosomal dinamico proteoma qui presentato può rivelare cambiamenti nella popolazione di mRNA associato poliribosomi e le proteine che vengono tradotte attivamente. Come la traduzione di mRNA è governata in parte da Mirna, analisi di Mirna in queste frazioni può rivelare ulteriori approfondimenti. Infatti, parecchi studi hanno modificato questo metodo e dimostrato di essere un approccio adatto e affidabile per studiare il modo di miRNA di regolamento10,11.
Molti studi sono stati condotti nell'ultimo decennio, scavando nel ruolo dei miRNA, considerando la loro importanza in varie funzioni biologiche12,13. Poiché miRNAs agiscono attraverso l'appaiamento con controparte mRNAs in modo da li segnano per degradazione, analisi del profilo polisoma sono stata eseguita ed è stato mostrato che i miRNA si trovano infatti nelle frazioni polisoma, targeting per tradurre mRNA14, 15 , 16. miR-21 è un buon esempio dove è associato con una repressione bassa e debole polisomi vincolanti in cellule normali, mentre nelle cellule tumorali, l'associazione con polisomi è aumentato e l'effetto repressivo è molto più forte di17.
In questo studio, analisi Real-Time PCR è stata fatta utilizzando i valori di Ct dei miRNA di interesse (MOI), i valori di Ct dello spike-in miRNA (SCM) per ridurre le varianti tecniche e il valore di Ct di un gene di riferimento o di miRNA (REF) che è stabile tra i campioni di controllo. Il primo passo era quello di normalizzare i valori di Ct di MOI e l'arbitro per i valori di Ct di SCM. Poi ci fu una seconda normalizzazione di passaggio del MOI al Rif e il valore risultante è stato utilizzato per calcolare la formula 2-ΔCt . Questi valori o valori di piega-cambiamento possono essere utilizzati per dimostrare le differenze fra i gruppi.
Poiché l'estrazione delle proteine è difficile da frazioni polisoma, la maggior parte degli studi effettuati fino ad ora, hanno utilizzato le frazioni direttamente per l'analisi western blot. Essi semplicemente sedimento il contenuto proteico di ogni frazione e mescolare con SDS-caricamento del buffer da utilizzare per analisi SDS-PAGE8,18. Qui, abbiamo sviluppato un metodo che ci permette non solo estratto del mRNA e miRNA dopo frazionamento, ma anche di ottenere peptidi e proteine con un alta qualità di procedere con l'analisi di spettrometria di massa.
Questo approccio potrebbe essere esteso ulteriormente misurando attivamente le proteine recentemente sintetizzate mediante etichettatura metabolici quali biortogonali aminoacido omologo, come azidohomoalanine (AHA) per metionina19,20. AHA incorporazione seguita da clic chimica permette di inserimento di un tag di biotina seguito da streptavidina purificazione di tutte le proteine che incorporava AHA. In questo modo definitiva identificazione delle proteine di nuova sintesi — l'altra parte del proteoma dinamico. Rilevazione di Mirna che ridistribuire tra le frazioni di nontranslating e di traduzione in risposta ad uno stimolo (qui con I / R) permette di interrogatorio di regolazione dinamica della traduzione della proteina. Tuttavia, i fattori che reclutano miRNA nei pressi del mRNA associato a ribosoma rimangono per essere identificato e studiato sistematicamente.
Nel nostro studio, oltre alla precipitazione di TCA, abbiamo provato altri tre metodi per l'estrazione di proteine da frazioni polisoma:21i) FASP (preparazione del campione filtro-aided), precipitazione di acetone ii) e iii) cloroformio/metanolo precipitazioni. L'idoneità dei metodi è stata valutata in base a entrambi la capacità di elaborare le frazioni con alta concentrazione di saccarosio (fino al 50%) e il numero di proteine identificate mediante spettrometria di massa (Figura 7 e tabella 3).
Per metodo FASP, abbiamo seguito il protocollo di preparazione del campione dato da un Kit di digestione di proteine FASP che impiegate un unità di ultrafiltrazione con un massa molecolare relativo cut-off di 30 kDa. Questa unità filtro servita come uno strumento per la rimozione del detersivo, cambio di buffer, digestione delle proteine ed eluizione del peptide con la capacità di trattenere le sostanze ad alto peso molecolare (DNA e proteine) che altrimenti potrebbero interferire con separazione successiva del peptide 21. in breve, il campione è stato mescolato con contenenti urea nel buffer e caricato il filtro spin unità con passaggi di filatura come iodoacetamide soluzione, soluzione di tripsina e soluzione di cloruro di sodio (eluizione) successivamente sono stati aggiunti. Finale filtrato contenenti peptidi digeriti è stato acidificato da TFA, dissalato e memorizzato per analisi di spettrometria di massa. Utilizzando questo metodo, tuttavia, la maggior parte del saccarosio precipitato accumulato costantemente sulla parte superiore del filtro, rendendo la centrifugazione e fasi di lavaggio difficili.
Per precipitazione di acetone e cloroformio/metanolo precipitazione, più volumi di solventi sono stati necessari per precipitare le proteine da un singolo volume del campione. Questo limita la dimensione del volume di campione applicato quando la precipitazione è stata eseguita in tubi da 1,5 mL (proteina bassa ritenzione tubi). Pure, il fango viscoso di saccarosio accumulato nella parte inferiore dei tubi dopo precipitazione per entrambi i metodi e non c'erano nessun pellet visibile nella parte inferiore del tubo e all'interfaccia liquido dopo precipitazione di acetone e cloroformio/metanolo precipitazione, rispettivamente.
Tabella 3 e Figura 7 Visualizza il confronto di quattro metodi di estrazione di proteine che abbiamo utilizzato per ottimizzare il nostro flusso di lavoro sperimentale. I numeri rossi dati a ogni metodo (Figura 7) rappresentano il numero di proteine che sono state identificate mediante spettrometria di massa (Vedi sezione 5.2 e 5.3). Anche se i volumi di campione utilizzati per ogni metodo erano differenti, cloroformio/metanolo e TCA precipitazioni ha provocato più alto numero di proteine identificate. Tuttavia, a causa di svantaggi come sopra indicati (limitazione del volume di campione e precipitazione di saccarosio), abbiamo optato per precipitazione di TCA per esperimenti successivi.
Per trovare le condizioni ottimali per l'esempio di elaborazione, precipitazione di TCA è stato effettuato alle varie temperature e TCA concentrazioni22,23,24. Così, abbiamo effettuato una precipitazione con 10,7% TCA a 4 ° C e -20 ° C e precipitò ulteriormente i surnatanti con ulteriori 60 µ l di TCA (finale 19,4% TCA) dopo pellet sono stati raccolti. Ciò ha provocato quattro palline che sono stati analizzati separati mediante spettrometria di massa. Inoltre, abbiamo ripetuto l'intero protocollo due volte a garantire che i risultati ottenuti erano riproducibili. Il flusso di lavoro e il numero di proteine identificate in pellet alle condizioni sia 4 ° C e -20 ° C con due esperimenti ripetuti sono illustrati nella Figura 7 (numeri in rosso). Anche se l'analisi del pellet derivati da surnatanti ha prodotto un ulteriore numero di proteine (85 e 60 a 4 ° C; 81 e 55 a-20 ° C); una maggioranza delle proteine sono stati già identificati in pellet prima e così, abbiamo optato per utilizzare 10,7% TCA per tutti i successivi esperimenti. Anche se la precipitazione di cloroformio/metanolo ha provocato un numero simile di proteine identificate rispetto alla precipitazione di TCA, abbiamo preferito di precipitazione di TCA a causa di diversi vantaggi: i) piccolo volume di solvente necessario per precipitare le proteine (60 µ l del TCA vs 1,28 mL di cloroformio/metanolo/acqua) consentendo l'uso di grandi volumi di campione se necessario mentre comodamente utilizzando provette da 1,5 mL per precipitazione, ii) visibilità del pellet alla parte inferiore del tubo e iii) nessun accumulo di saccarosio durante passaggi di precipitazione.
Nonostante che offre informazioni approfondite funzionali per quanto riguarda lo stato traslazionale, un grave inconveniente di questo metodo è la necessità di materiale di partenza fresca e grande. Molti studi hanno cercato di ottimizzare le condizioni di utilizzo di piccolo volume di cellule o tessuti o aggiungere passaggi per aumentare l'efficienza di estrazione di RNA e proteine25. Ancora, tessuti ottenuti da animali diversi nelle stesse condizioni sperimentali potrebbero essere tirati insieme, se necessario.
In conclusione, questo protocollo consente l'analisi simultanea di mRNA, miRNA e di proteina dalle frazioni ottenute da polisoma profilatura per studiare i meccanismi regolatori coinvolti nella ischemia/riperfusione. Tuttavia, ulteriori studi sono richiesti per vedere se il traduzione di mRNA sono indotti dopo ischemia o riperfusione e se essi si spegne dopo la rimozione di stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
HL112730 NIH P01 (straccio, JVE), NIH R01 HL132075 (straccio, JVE), centro Barbra Streisand femminile del cuore (straccio, JVE), Dorothy ed E. Phillip Lione sedia in cardiologia molecolare (RAG), Erika Glazer dotato sedia in salute del cuore della donna (JVE) e Accademia Ceca delle scienze Sostegno istituzionale RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
